CN102766614A

CN102766614A - 内切葡聚糖酶stce和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品

Info

Publication number: CN102766614A
Application number: CN2012100356572A
Authority: CN
Inventors: 古贺仁一郎; 马场裕子; 中根公隆; 花村聪; 西村智子; 五味修一; 洼田英俊; 河野敏明
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2012-11-07
Also published as: US20070111278A1; EP1700917A1; CN1902315A; EP1700917A4; EP1700917B1; ES2575526T3; DK1700917T3; JP4547335B2; JPWO2005054475A1; WO2005054475A1; US7595182B2; CN1902315B

Abstract

公开Staphylotrichum coccosporum来源的新的内切葡聚糖酶、编码上述内切葡聚糖酶的多核苷酸、以及含有上述内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物。上述内切葡聚糖酶或纤维素酶配制物可用于含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化、起毛的减少、肌肤触感和外观的改善、色彩的局部性变化、以降低硬化等为目的的洗涤用，以及纤维加工用途。

Description

内切葡聚糖酶STCE和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品

本申请为分案申请，原申请的申请日为2004年10月22日，申请号为200480036105.7(PCT/JP2004/015733)，发明名称为“内切葡聚糖酶STCE和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品”。

技术领域

本发明关于内切葡聚糖酶STCE(Endoglucanases STCE)和含有内切葡聚糖酶的纤维素配制品，以及利用它们对含有纤维素的纤维进行处理的方法。

背景技术

以往，对于含有纤维素的纤维，为赋予纤维所期望的特性，采用纤维素酶对其进行处理。例如，在纤维产业中，为改善含有纤维素的纤维与皮肤的触感和外观，或者为使染色后的含有纤维素的纤维具有色泽局部性变化的“石磨”外观，采用纤维素酶进行处理【欧洲专利第307,564号说明书(专利文献1)】。

此外已知，染色后的含有纤维素的纤维，在反复清洗后，会起毛，染色布料的色泽也变得不鲜明。因此，通过在洗涤剂中含有纤维素酶，除毛或者使其不再起毛，可使得染色布料的色泽鲜明，即，使其澄澈化【欧洲专利第220,016号说明书(专利文献2)、国际公开第95/02675号小册子(专利文献3)、国际公开第97/30143号小册子(专利文献4)、国际公开第98/08926号小册子(专利文献5)】，含有纤维素酶的洗涤剂主要在欧洲销售。

对于洗涤中使用的纤维素酶，已知在洗涤剂中，腐质霉属(Humicola)来源的纯化的43kD内切葡聚糖酶成分(EGV)的澄澈化活性(除去布料中起的毛，使布料色泽鲜明的活性)是以往的由多种纤维素成分混合而成的纤维素配制品的约30倍【国际公开第91/17243号小册子(专利文献6)】。此外已知，通过使来源于腐质霉属的内切葡聚糖酶NCE5(以下有时简称为NCE5)在洗涤剂中发生反应，也可达到染色布料澄澈化的效果【国际公开第01/90375号小册子(专利文献7)】。进而已知，在洗涤剂中，根霉属(Rhizopus)来源的内切葡聚糖酶RCEI(以下有时简称为RCEI)表达增强的Humicola insolens培养液的澄澈化活性是RCEI表达未增强的Humicola insolens培养液的20倍以上【国际公开第00/24879号小册子(专利文献8)】。

像这样，尽管已知有多种内切葡聚糖酶具有使染色布料澄澈化活性，然而实际和欧美洗涤剂配合使用时，能够充分发挥活性的内切葡聚糖酶却很少。这被认为是由于欧美洗涤剂中含有大量阴离子表面活性剂、增效组分等，抑制了酶的活性。

此外，欧美洗涤用自来水一般硬度较高，含有大量的Ca²⁺、Mg²⁺等2价阳离子。这些2价阳离子可显著降低洗涤剂中的表面活性剂的洗涤能力，因而，为吸附这些2价阳离子，洗涤剂中配合有增效组分【Fragrance Journal，1995年，11卷，p.33-55(非专利文献1)】。此外，由于自来水的硬度因地域而差别很大，在洗涤剂中配合的增效组分的种类和添加量上，也根据地域不同颇费工夫。此外，已知不仅洗涤剂的洗涤能力，而且纤维素酶的活性也受到这些2价阳离子的影响【Mansfield，S.D.等人，Enzyme Microb.Technol.，23，1998年，p133-140(非专利文献)、Jenkins，C.C.AND Suberkropp，K.，FreshwaterBiology，33卷第2号，1995年，p245-253(非专利文献3)】。因而，产生了纤维素酶的活性因水的硬度受到抑制，无法取得满意的澄澈化效果的问题，反之会出现纤维素酶活性增强使布料的强度降低的问题。

由于增效组分本身会影响纤维素酶的活性，因而，通过添加增效组分来缓和水的硬度对纤维素酶澄澈化活性的影响是很难的。所以人们需要不易受到自来水硬度的影响，并且具有稳定的澄澈化活性的纤维素酶。

以往，尽管可以使用多种纤维素酶成分的混合物处理含有纤维素的纤维，但对于含有纤维素的纤维而言，为取得满意的效果需要配合使用大量纤维素酶，因而其实用性受到限制。因此，大多数情况下，提供的纤维素酶配制物中含有大量高活性内切葡聚糖酶。其制造方法已知有，采用基因重组技术，在宿主细胞中大量表达高活性的目的内切葡聚糖酶成分的方法【国际公开第91/17243号小册子(专利文献6)、国际公开第98/03667号小册子(专利文献9)、国际公开第98/11239号小册子(专利文献10)】。

作为这些方法中优选的宿主细胞，可以举出属于不完全菌类的丝状菌，例如，曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属、木霉属(Trichoderma)的丝状菌等。进而，在生产洗涤剂中使用的纤维素酶时，因洗涤剂中的pH为碱性，较之生产酸性纤维素酶的木霉属丝状菌而言，以生产中性纤维素酶的曲霉属和腐质霉属的丝状菌为宿主，更为适宜。尤其考虑到生产工业化酶时，生产性高的腐质霉属丝状菌是更优良的宿主【国际公开第01/90375号小册子(专利文献7)】、国际公开第98/03640号小册子(专利文献11)】。

然而，将异源基因在腐质霉属丝状菌中表达时，因其碱基序列上的特性差异(基因密码子使用频率不同)等原因，表达常常受到抑制。因而，有必要对异源基因进行改变的操作。例如，为使属于接合菌类的根霉属来源的内切葡聚糖酶RCEI在Humicola insolens中大量表达，必须将编码RCEI的基因最适化，以适合宿主细胞的密码子使用频率【国际公开第00/24879号小册子(专利文献8)】。但是，尽管这样进行了最适化，可以预想，得到和通常同种基因同等程度的表达量是很难的。并且，在实际表达时，由宿主产生的目的酶在培养过程中可被培养液中的蛋白酶分解，从而获得分解物或部分分解物。

专利文献1：欧洲专利第307,564号说明书

专利文献2：欧洲专利第220,016号说明书

专利文献3：国际公开第95/02675号小册子

专利文献4：国际公开第97/30143号小册子

专利文献5：国际公开第98/08926号小册子

专利文献6：国际公开第91/17243号小册子

专利文献7：国际公开第01/90375号小册子

专利文献8：国际公开第00/24879号小册子

专利文献9：国际公开第98/03667号小册子

专利文献10：国际公开第98/11239号小册子

专利文献11：国际公开第98/03640号小册子

非专利文献1：Fragrance Journal，1995年，11卷，p33-55

非专利文献2：Mansfield，S.D.等人，Enzyme Microb.Technol.，23，1998年，p133-140

非专利文献3：Jenkins，C.C.AND Suberkropp，K.，FreshwaterBiology，33卷第2号，1995年，p245-253

发明内容

发明要解决的问题

以往，为用于纤维用·洗涤用途，从腐质霉属、木霉属、根霉属、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)等多种丝状菌分离纤维素酶，再分离出编码这些纤维素酶的基因。然而，在含有大量阴离子表面活性剂和增效组分的欧美型洗涤剂中仍具有高澄澈化活性，并且不易受到自来水的硬度影响，并且具有稳定的澄澈化活性的酶，目前尚未见报道。

进而，若发现在优良宿主腐质霉属丝状菌中可大量表达，并且基因未经过改变的异源丝状菌来源的纤维素酶基因，其产业上的应用价值将不可估量，然而，目前尚未见这样的基因报道。

解决问题的手段

在此，本发明人发现并提供了来自以往分离纤维素酶或纤维素酶基因的报告中从未提到的圆孢霉属(Staphylotrichum)的微生物的、具有高内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质和其基因。

本发明人发现，本发明的从圆孢霉属微生物分离得到的具有高内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质，在欧美洗涤剂中，对含有纤维素酶布料显示出极强的澄澈化活性。例如，Staphylotrichum coccosporum来源的本发明的内切葡聚糖酶，尤其是其中的内切葡聚糖酶STCE1(以下有时简称为STCE1)，在代表性欧洲洗涤剂中具有高澄澈化活性，约为已知的具有澄澈化活性的洗涤用纤维素酶-内切葡聚糖酶NCE5(以下有时简称为NCE5)(国际公开第01/90375号小册子)的16倍，内切葡聚糖酶RCEI(国际公开第00/24879号小册子)的80倍以上。

进而，惊奇地发现该内切葡聚糖酶STCE1的活性不受到自来水的硬度影响，具有稳定的澄澈化活性。例如，已知的对含有纤维素的纤维具有高绒毛去除活性的内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)、NCE5(国际公开第01/90375号小册子)的澄澈化活性随自来水的硬度的增加而增加，而内切葡聚糖酶RCEI(国际公开第00/24879号小册子)的澄澈化活性则随自来水的硬度的增加而降低。然而，本发明的内切葡聚糖酶STCE1不受自来水的硬度影响，具有稳定的澄澈化活性。到目前为止，没有任何有关在欧美洗涤剂中具有高澄澈化活性，并且不受自来水硬度的影响，并具有稳定活性的纤维素酶的了解。

更令人惊叹的发现是，Staphylotrichum coccosporum来源的内切葡聚糖酶STCE1在以与Staphylotrichum coccosporum不同的菌株Humicola insolens为宿主的转化体中，在不用对内切葡聚糖酶STCE1基因进行任何改变操作的情况下就能大量表达。

因而，本发明提供圆孢霉属微生物来源的具有内切葡聚糖酶活性的新的蛋白质及其基因，并提供含有上述蛋白质、具有良好特性的纤维素酶配制物。本发明还提供以编码上述蛋白质的基因转化的宿主细胞，以及培养上述宿主细胞并收集目的蛋白的方法。进一步提供通过本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的方法。

即，本发明包含以下发明。

(1)来源于圆孢霉属微生物，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

(2)具有以下(A)和(B)特性的(1)中记载的蛋白质：

(A)具有内切葡聚糖酶活性、

(B)N末端氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

(3)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中记载的蛋白质：

(A)具有内切葡聚糖酶活性、

(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列

(C)以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)测定的平均分子量为49kD。

(4)具有以下(A)、(B)和(C)特性的(2)中记载的蛋白质：

(A)具有内切葡聚糖酶活性

(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列、

(C)以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)测定的平均分子量为45kD。

(5)来源于Staphylotrichum coccosporum的(1)-(4)中任一项记载的蛋白质。

(6)选自下述的蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质，

(b)包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，以及

(c)包含与含有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85％同源的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质。

(7)编码(1)-(6)中任一项记载的蛋白质的多核苷酸。

(8)选自下述的多核苷酸：

(i)包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基序列的多核苷酸，

(ii)包括在包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个碱基所得的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及

(iii)包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基序列的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。

(9)包含(7)或(8)中记载的多核苷酸的表达载体。

(10)(9)中记载的表达载体转化的宿主细胞。

(11)宿主是酵母或丝状菌的(10)中记载的宿主细胞。

(12)(11)中记载的宿主细胞，所述的酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia)的微生物。

(13)(11)中记载的宿主细胞，所述的丝状菌为腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、圆孢霉属(Staphylotrichum)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)或顶孢霉属(Acremonium)的微生物。

(14)(13)中记载的宿主细胞，所述的丝状菌为Humicola insolens或绿色木霉(Trichoderma viride)。

(15)蛋白质的制造方法，其包含培养(10)-(14)中任一项记载的宿主细胞的步骤以及从前述培养所得的宿主细胞或其培养物收集(1)-(6)任一项记载的蛋白质的步骤。

(16)以(15)中记载的方法生产的蛋白质。

(17)包含(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质的纤维素酶配制物。

(18)包含(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质，或(17)中记载的纤维素酶配制物的洗涤组合物。

(19)含有纤维素的纤维的处理方法，其包含：使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(20)降低含有纤维素的纤维起毛速度或者减少含有纤维素的纤维的起毛的方法，其包含：使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(21)为改善含有纤维素的纤维的肌肤触感和外观的减量加工方法，其包含：使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(22)使染色后的含有纤维素的纤维的色泽澄澈化的方法，其包含：使染色后的含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(23)使染色后的含有纤维素的纤维的色泽具有局部性变化的方法，其包括：使染色后的含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(24)降低含有纤维素的纤维开始变硬的速度或减小含有纤维素的纤维的硬度的方法，其包含：使含有纤维素的纤维和(1)-(6)以及(16)中的任一项记载的蛋白质、(17)中记载的纤维素酶配制物、或(18)中记载的洗涤组合物接触的步骤。

(25)(19)-(24)任一项记载的方法，其中所述的纤维素处理是通过将纤维浸渍、清涤或洗涮进行的。

(26)旧纸脱墨的方法，其特征在于，在通过旧纸脱墨化学品处理来脱墨的步骤中，使用(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物。

(27)改善纸浆的滤水性的方法，其包含：以(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。

(28)改善动物饲料的消化能力的方法，其包含：以(1)-(6)以及(16)中任一项记载的蛋白质、或(17)中记载的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的步骤。

发明的效果

本发明的蛋白质，尤其是内切葡聚糖酶STCE1，可用于洗涤、纤维加工用途，可使含有纤维素的纤维色泽澄澈，起毛减少，肌肤触感改善，色泽局部变化，硬度降低等。

具体实施方式

具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质

本说明书中的“内切葡聚糖酶”指的是具有内切葡聚糖酶活性的酶，即，指的是内切-1，4-β1-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，上述酶水解β-1，4-葡聚糖的β-1，4-吡喃葡萄糖苷键。此外，本说明书的“β-1，4-葡聚糖酶活性”指的是CMC酶活性。“CMC酶活性”指的是水解羧甲基纤维素(CMC，东京化成工业株式会社生产)的活性，测定被检蛋白质和CMC溶液孵育一定时间后游离出的还原糖量，将生成相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个单位。

内切葡聚糖酶活性，例如可通过如下方法测定。首先，将含有被检蛋白质的溶液0.5mL添加于溶解有2％CMC的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)0.5mL中，50℃孵育30分钟。接着，以3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)定量。即，在反应30分后的反应液中添加DNS试液3.0mL，在沸腾水浴中孵育5分钟后，以蒸馏水8.0mL稀释，测定540nm的吸光度。利用分段稀释的葡萄糖溶液制成检测线，以葡萄糖换算确定酶反应液中生成的还原糖量。以1分钟内生成相当于1μmol葡萄糖的还原糖的酶量作为1个单位，计算出活性。DNS试剂可依据文献(例如，《生物化学试验法1-还原糖的定量法》，p19-20，福井作藏著，学会出版中心)中的记载配制，例如，可采用如下顺序配制。首先，在4.5％氢氧化钠水溶液300mL中，添加1％3，5-二硝基水杨酸溶液880mL，和罗氏盐255g(溶液A)。另外，在1.0％氢氧化钠溶液22mL中添加结晶酚10g，再添加水溶解成为100mL(溶液B)。在溶液B 69mL中添加碳酸氢钠6.9g使其溶液，再注入溶液A，搅拌混合直至罗氏盐充分溶解，放置2天后，过滤。

本发明的蛋白质可从丝状菌类，具体而言，圆孢霉属微生物，优选Staphylotrichum coccosporum，更优选Staphylotrichum coccosporumIFO 31817株获得，也可以是其变异株。

进而，本发明的蛋白质，典型地，其N末端的氨基酸序列具有以SEQ ID NO.1所示的序列。N末端的氨基酸序列，例如，可由后述实施例2表示的方法确定。

根据本发明，提供来源于圆孢霉属并具有以下特性的蛋白质：

(A)具有内切葡聚糖酶活性，

(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列，

(C)由SDS-PAGE测定的平均分子量为49Kd。

进而提供具有以下特性的蛋白质：

(A)具有内切葡聚糖酶活性，

(B)N末端氨基酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列，

(C)由SDS-PAGE测定的平均分子量为45Kd。

此处，由SDS-PAGE测定的平均分子量可由实施例1所示的方法确定。

本发明的其他实施方式，提供包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质，以及其修饰蛋白质或其同源蛋白质。

“包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质”包括，例如，由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列构成的蛋白质，在由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中添加信号肽序列构成的蛋白质，以及由在SEQ IDNO.3表示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加适当标记序列而得的氨基酸序列构成的蛋白质。

信号肽，例如，在SEQ ID NO.2所示的碱基序列中，是由第1-3位的ATG开始到第61-63结束的核苷酸序列编码的21个氨基酸残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO.33)。作为上述标记序列，例如，可以使用有助于容易地进行多肽的表达确认、细胞内局部确认的序列，例如，使用FLAG标记、六个组氨酸标记、血球凝集素标记或myc表位等。

本发明中的“修饰蛋白质”指的是，包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个(优选1个或几个)氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处，与“缺失、取代、插入或添加”等修饰相关的氨基酸的数目，优选为1-30个，更优选为1-10个，尤其优选为1-6个。此外，进行修饰的氨基酸，只要是能够维持或提高内切葡聚糖酶活性，就没有特殊限定，例如，可以修饰催化区域、接头或结合区域中的氨基酸。

进而，修饰蛋白质包括，例如，包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中，有1个或多个氨基酸残基被保守性取代的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处，“保守性取代”指的是，在不实质性改变蛋白质活性的条件下，将1个或多个氨基酸残基以化学上类似的其它氨基酸取代。例如可举出，将某疏水性残基以其它疏水性残基取代的情形，将某极性残基以具有相同电荷的其它极性残基取代的情形。

可进行这种保守性取代的功能类似的氨基酸，在各氨基酸相应的技术领域都是公知的。具体而言，作为非极性(疏水性)氨基酸，可以举出，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以举出，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷(碱性)的氨基酸，可以举出，精氨酸、组氨酸、赖氨酸等，此外，作为负电荷(酸性)氨基酸，可以举出，天冬氨酸、谷氨酸等。

本发明中的“同源蛋白质”指的是，包含和SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％以上同源性(序列同一性)的氨基酸序列，并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。此处所示同源性数值，表示的是在本领域技术人员所公知的同源性检索程序FASTA3【Science，227，1435-1441(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988)；http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html】中采用默认(初期设定)参数而计算出的数值(同一性；identity)。

作为本发明蛋白质的具体例子，可以举出，内切葡聚糖酶STCE1或内切葡聚糖酶STCE3。本发明中，将这些统称为“内切葡聚糖酶STCE”。

本发明的内切葡聚糖酶STCE是，如后述实施例2所示，属于家族45的内切葡聚糖酶。作为属于家族45的公知的内切葡聚糖酶，例如可以举出，腐质霉属来源的内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)或NCE5(国际公开第01/90375号小册子)、或根霉属来源的内切葡聚糖酶RCEI(国际公开第00/24879号小册子)。

图1和图2显示的是，本发明的内切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列【信号肽(SEQ ID NO.33)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.3)】与属于家族45的公知内切葡聚糖酶NCE4【信号肽(SEQ ID NO.34)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.35)以及NCE5【信号肽(SEQ ID NO.36)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.37)】的各氨基酸序列比较的结果。

图1表示的是前半部(N末端侧)结果，图2表示的是后半部(C末端侧)结果。图1和图2中，记号“＊”表示的是和STCE1共有的氨基酸。

如图1和图2所示，属于家族45的内切葡聚糖酶，共有区域为催化区域(catalytic domain)(1位到207位)，根据情况，有时还具有接头(Linker)(208位-258位)以及或纤维素结合区域(cellulose-bindingdomain；CBD)(259位-295位)。各区域后括号内显示的序号，是内切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)中的氨基酸号。

上述各区域内，发现在催化区域和纤维素结合区域，有很多各内切葡聚糖酶间的保守氨基酸，而在接头未发现显著的保守区域。含有大量保守氨基酸的区域(例如，催化区域或纤维素结合区域，尤其是催化区域)，或者是包含在该区域中的共有氨基酸，因被认为是关系到本发明内切葡聚糖酶(例如，STCE1)的酶活性的重要区域或氨基酸，通过在其以外的区域或氨基酸中改变氨基酸(例如，缺失、取代、插入、以及/或添加，尤其是保守取代)，可高效率获得该酶活性得到维持的修饰蛋白质或同源蛋白质，而无需过度试验。

此外，在含有大量保守氨基酸的区域，即使将各内切葡聚糖酶间非共有氨基酸变为其它氨基酸(优选可保守取代的类似氨基酸)，其酶活性的维持可能性也很高，通过进行这种氨基酸改变，可高效率得到其酶活性得到维持的修饰蛋白质或同源蛋白质，而无需过度试验。

即使是含有大量保守氨基酸的区域内的共有氨基酸，改变为其它氨基酸时，有时也可维持其酶活性，尤其是改变为可保守取代类似氨基酸的时候，其可能性增高。本发明的修饰蛋白质或同源蛋白质，只有是具有内切葡聚糖酶活性(即，维持或提高改变前的内切葡聚糖酶活性)，可以是任意区域，例如催化区域、接头或纤维素结合区域所含的氨基酸改变的蛋白质。

本发明的蛋白质，例如可以通过如实施例1记载的从微生物中提取、纯化得到。此外，如后述利用基因重组技术，使编码本发明的蛋白质的多核苷酸在适当宿主中表达，分离、纯化产生的蛋白质，也可得到本发明的蛋白质。

编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸

根据本发明，提供编码包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质、其修饰蛋白质、以及同源蛋白质的多核苷酸。若提供了蛋白质的氨基酸序列，则很容易确定其编码碱基序列，由此，可选择编码本发明蛋白质的各种碱基序列。本说明书中，“多核苷酸”一词，DNA和RNA两者都包含，优选DNA。

本发明的多核苷酸，典型而言，选自由下述的组：

(i)包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-948位碱基序列的多核苷酸，

(ii)包含在SEQ ID NO.2所示的碱基序列的第64-948位碱基构成的序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个碱基而成的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及

(iii)与包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-948位碱基的序列的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。

在SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-948位碱基的序列中，可以缺失、取代、插入或添加的碱基数，优选为1-30个，更优选为1-18个，尤其优选为1-9个。

此处，上述(iii)中的“严紧条件”指的是控制在如下条件：使得包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-948位碱基序列的探针，和编码同源蛋白质的多核苷酸杂交，但该探针不和内切葡聚糖酶NCE5基因(国际公开第01/90375号小册子)杂交。

更具体而言，例如可举出如下条件，探针使用具有编码标记的内切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列的全长碱基序列的探针，通过ECL直接DNA/RNA水平检测系统(Amersham公司生产)附带的操作方法，42℃预杂交1小时后，添加上述探针，42℃杂交15分钟后，以添加有0.4％SDS和6mol/L尿素的0.4倍或0.4倍以下浓度的SSC(1倍浓度的SSC：15mmol/L枸橼酸三钠、150mmol/L的氯化钠于42℃反复清洗2次，每次20分钟，接着，以5倍浓度的SSC于室温清洗2次，每次10分钟。

本发明的多核苷酸，可以是天然来源的多核苷酸，也可以是全合成的多核苷酸，此外，也可利用天然来源的多核苷酸的一部分，合成得到。作为本发明的多核苷酸的典型获得方法，可以举出，从Staphylotrichum coccosporum的基因文库，采用基因工程学领域常用方法，例如，使用以部分氨基酸序列的信息为基础制成的适当DNA探针，进行筛选的方法等。

编码本发明的内切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列的典型碱基序列，具有SEQ ID NO.2所示的碱基序列中第64-948位碱基的序列。SEQID NO.2所示的碱基序列，具有从1-3位的ATG开始，到949-951位的TAA终止的开放阅读框。此外，64-66的核苷酸序列，对应于包含295个氨基酸残基的内切葡聚糖酶STCE1的成熟蛋白质的N末端氨基酸。

表达载体和转化微生物

本发明提供一种表达载体，其可使编码包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质，其修饰蛋白质和同源蛋白质的碱基序列(以下称为“本发明的多核苷酸”)在宿主微生物内复制，并且以可表达状态含有其碱基序列编码的蛋白质。本发明的载体是自我复制载体，即，作为独立体存在于染色体外，其复制不依赖于染色体的复制，例如，可由此构建质粒。此外，本发明的表达载体，在导入宿主微生物时，也重组到其宿主微生物的基因组中，和重组后的染色体一起复制。本发明的载体的构建顺序和方法，可使用基因工程学领域常用的方法。

本发明的表达载体，为将其实际导入宿主微生物，表达具有期望活性的蛋白质，优选除含有上述本发明的多核苷酸外，还含有调控其表达的碱基序列和用于选择转化体的基因标记等。作为调控表达的碱基序列，包含启动子、终止子以及编码信号肽的碱基序列等。启动于只要是可在宿主微生物中表现转录活性，就没有特殊限制，可得到调控编码和宿主微生物同种或异种任意蛋白质的基因表达的碱基序列。信号肽只要是在宿主微生物中提供蛋白质分泌作用即可，无特殊限制，可以由编码与宿主微生物同种或异种的任意蛋白质的基因的碱基序列获得。此外，本发明的基因标记，可以根据转化体的选择方法适宜选择，例如，可利用编码耐药性的基因、需要补充营养的基因。

进而，根据本发明，提供经表达载体转化的微生物。该宿主-载体系统，没有特殊限定，例如，可采用使用了大肠菌、放线菌、酵母、丝状菌等的系统，以及使用它们和其它蛋白质构成的融合蛋白质表达系统。这些表达载体对微生物的转化可使用本领域惯用的方法进行。

进一步，在适当的培养基种培养转化体，可以从宿主细胞或其培养物种分离本发明的蛋白质。因而，根据本发明的其它实施方式，提供上述本发明的新蛋白质的制造方法。转化体的培养及其条件，可以是和使用的微生物实质上等同的培养和培养条件。此外，转化体培养后，回收目的蛋白质的方法，可以使用在该领域惯用的方法。

根据本发明的优选实施方式，提供由本发明的多核苷酸碱基序列编码，表达内切葡聚糖酶的酵母细胞。作为本发明的酵母细胞，可举出例如，酿酒酵母属、汉逊酵母属、或毕赤酵母属的微生物，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，作为本发明种的新蛋白质的最适制造方法，提供在属于不完全菌类的丝状菌的表达方法。作为本发明中的较为适宜的宿主丝状菌，可举出腐质霉属、木霉属、圆孢霉属、曲霉属、镰孢霉属或顶孢霉属的丝状菌，更优选腐质霉属或木霉属。更具体而言，可举出，Humicola insolens、Humicolathermoidea、绿色木霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Staphylotrichum coccosporum、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)或纤维素分解顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)，更优选，Humicola insolens或绿色木霉。

纤维素酶的用途/纤维素酶配制物

本发明还涉及含有本发明蛋白质(例如，包含序号3表示的氨基酸序列的蛋白质，或其修饰蛋白质或同源蛋白质，或培养本发明的宿主细胞而得到的蛋白质)的纤维素酶配制物。

一般而言，所说的纤维素酶配制物，除纤维素外，还可含有例如，赋形剂(例如，乳糖、氯化钠、山梨醇等)、防腐剂、以及/或非离子表面活性剂等。此外，纤维素酶配制物的形态，可以是固态，也可以是液态，具体而言，可举出，粉剂、粒剂、颗粒剂、非粉尘化颗粒、或液体制剂。本发明的纤维素酶配制物中，除本发明的蛋白质外，也可含有其它纤维素酶，例如，纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、β-葡萄糖苷酶、以及/或本发明的内切葡聚糖酶以外的内切葡聚糖酶。

作为纤维素酶配制物的一种，非粉尘化颗粒(优选无飞散性颗粒状)，可使用通常的干式造粒法制造。即，将粉末状本发明蛋白质混合到选自不影响内切葡聚糖酶活性的中性无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠)、不影响内切葡聚糖酶活性的矿物质(例如，膨润土、蒙脱石)和中性有机物(例如，淀粉或粒状纤维素等)等的1种或多种中后，加入1种或多种非离子表面活性剂粉末，或微细悬浊的悬浊液，充分混合或混炼。根据情况，适当添加使固体粘着的合成高分子(例如，聚乙二醇等)或天然高分子(例如，淀粉等)，进而混炼后，进行圆盘造粒机(disc pelletizer)等挤出成形造粒，将成形物通过球形整粒机成形为球状后，干燥可制得非粉尘化颗粒。1种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特殊限定，但相对于本发明的纤维素酶配制物总体，优选为0.1-50重量％，更优选0.1-30重量％，尤其优选1-10重量％。此外，通过以聚合物对颗粒表面包衣，也可控制氧通透和水分通透。

另一方面，作为纤维素酶配制物的一种，液体制剂(优选，稳定化的液状)，可通过在包含本发明的蛋白质的溶液中，配合内切葡聚糖酶稳定化剂(例如，合成高分子，天然高分子等)，根据需要，添加无机盐类以及/或合成防腐剂，进行配制。此时，也可配合1种或多种非离子表面活性剂。1种或多种非离子表面活性剂的添加量没有特殊限定，但相对于本发明的纤维素酶配合物总体，优选为0.1-50重量％，更优选为0.1-30重量％，尤其优选为1-10重量％。

进而，本发明提供包含本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物的洗涤组合物。本发明的洗涤组合物也含有表面活性剂(可以是阴离子性、非离子性、阳离子性、两性或双性离子性或它们的混合物)此外，本发明的洗涤组合物，可含有本领域已知的其它洗涤成分，例如，增效组分、漂白剂、漂白活性剂、防腐剂、金属离子封闭剂、除污聚合物、香料、其它酶(例如，蛋白酶、脂酶、淀粉酶)、酶稳定剂、制剂化助剂、荧光增白剂、以及/或发泡促进剂等。代表性的阴离子性表面活性剂有，直链状烷基苯基磺酸盐(LAS)、烷基硫酸盐(AS)、α-烯基磺酸盐(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐(AES)、α-磺基脂肪酸酯盐(α-SFMe)、以及天然脂肪酸的碱金属盐等。作为非离子表面活性剂的例子，可以举出，聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、脂肪酸甲酯乙氧基化合物、蔗糖以及葡萄糖的脂肪酸酯、烷基糖苷、聚乙氧基化烷基糖苷的酯等。

本发明的含有纤维素的纤维的处理方法，通过使本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤组合物与含有纤维素的纤维接触来进行。由本发明的纤维处理方法改善的含有纤维素的纤维的性质，包含以下：

(1)绒毛被除去(起毛速度降低、起毛减少)

(2)减量而带来的纤维肌肤触感和外观的改善

(3)染色的含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化

(4)染色的含有纤维素的纤维的色彩产生局部变化，即，使染色的含有纤维素的纤维，更具代表性地，使斜纹布具有石磨样外观和风格。

(5)柔软化(开始出现硬化的速度降低、硬化减少)

本发明的纤维处理方法，具体而言，可通过将浸泡有纤维或纤维能够被浸泡的水中，添加本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤组合物来进行，例如，可通过纤维浸泡步骤、洗涤步骤或洗涮步骤进行。

接触温度或本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物的添加量等条件，可参考其它各种条件适当确定，例如，在降低含有纤维素的纤维的起毛速度或减少含有纤维素的纤维的起毛时，优选使用温度在10-60℃左右，蛋白质浓度为0.01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。

在用于改善纤维肌肤触感和外观的减量加工时，优选使用温度在10-60℃左右，蛋白质浓度为0.1-50mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。

此外，在用于提供染色后的含有纤维素的纤维的色彩的澄澈化作用时，优选使用温度在10-60℃左右，蛋白质浓度为0.1-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。

此外，在用于提供染色后的含有纤维素的纤维的色彩局部变化的时候，优选使用温度在20-60℃左右，蛋白质浓度为0.1-100mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。

此外，上述方法，在用于降低含有纤维素的纤维硬化开始出现的速度或减少含有纤维素的纤维的硬化时，优选使用温度在10-60℃左右，蛋白质浓度为0.01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物、或洗涤组合物。

进而，本发明关于旧纸脱墨的方法，其特征在于，在由脱墨化学品处理旧纸来脱墨的步骤中，使用本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物。

本发明的蛋白质或纤维素酶配制物，由于当作用于旧纸时，可提高脱墨效率，因而，在从旧纸制造再生纸的过程中是有用的。根据上述脱墨方法，因残留有墨的纤维大量减少，可提高旧纸的白色度。

上述脱墨化学品，只要是旧纸脱墨中常使用的化学品就可以，其它没有特殊限定，例如可以举出，氢氧化钠、碳酸钠等碱，硅酸钠、过氧化氢、磷酸盐、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或油酸等捕获剂等，作为助剂，可以举出，pH稳定剂、络合剂或分散剂等。

可适用于上述脱墨方法的旧纸，只有是通常被称为旧纸的纸就可以，其它没有特殊限定，例如可以举出，配合有机械浆和化学浆的新闻旧纸、杂志旧纸、低等-中等印刷旧纸、由化学浆构成的上等旧纸、它们的涂工纸等印刷旧纸。进而，也可以是通常被称为旧纸的纸以外的纸，只要是带有墨的纸，上述脱墨方法就可适用。

进而，本发明关于纸浆的透水性的改善方法，上述方法包含以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。

根据上述方法，在没有伴随出现强度显著降低的情况下，纸浆的透水性显著得到改善。可适用上述方法的纸浆没有特殊限定，例如可举出，旧纸浆、再循环板纸浆、工艺纸浆(craft pulp)、亚硫酸纸浆、加工热处理的其它高收率浆等。

进而，本发明关于改善动物饲料消化能力的方法，包含以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。

根据上述方法，因动物饲料中的葡聚糖被适度低分子化，可改善动物饲料的消化能力。

进而，通过在动物饲料中使用本发明的蛋白质，可改善饲料中的葡聚糖的消化能力。因而，根据本发明，提供改善动物饲料消化能力的方法，其包含以本发明的蛋白质或纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。

微生物的保藏

本发明的内切葡聚糖酶STCE来源的StaphylotrichumcoccosporumIFO 31817株，于1985年保藏于日本国内的财团法人发酵研究所，国内保藏号是IFO 31817。此外，于2004年(平成16年)9月28日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：

305-8566日本国茨城县筑波东1丁目1番地1中央第6)，国际保藏号为FERM BP-10135。进而，IFO 31817株现在保藏于独立行政法人配制品评价技术基础机构生物技术总部(

292-0818千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8かずさ学术园内)，保藏号为NBRC 31817。该菌株向第三者公开，处于可获得的状态的情况，依据与本说明书同时提交的证明文件【平成15年(2003年)11月19日付】是清楚的。

以在质粒pUC118的BamHI部位插入STCE1基因得到的质粒pUC118-STCEex转化得到的本发明的大肠菌(Esherichia coli)DH5α/pUC118-STCEex株，于2003年(平成15年)12月1日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自2004年(平成16年)9月15日转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的【】内是国内保藏号)是FERM BP-10127【FERM P-19602】。

可作为本发明的表达载体的宿主的Humicola insolens MN200-1株，于1996年(平成8年)7月15日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)6月13日起转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的【】内是国内保藏号)是FERM BP-5977【FERMP-15736】。

可作为本发明的表达载体的宿主的Humicola viride MC300-1株，于1996年(平成8年)9月9日国内保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(原保藏)，自1997年(平成9年)8月11日起转为国际保藏。国际保藏号(国际保藏号紧接的【】内是国内保藏号)是FERM BP-6047【FERM P-15842】。

实施例

以下，采用实施例更为具体地说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

《实施例1：从Staphylotrichum coccosporum分离纯化具有脱脂棉纤维游离活性的成分》

将Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在(T)培养基(2.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾)中，28℃振荡培养。培养10天后，去除菌体后，得到粗制纤维素酶配制液。

将该粗制纤维素酶配制液配制成最终浓度为1.5mol/L的硫酸铵溶液后，将其上样于事先以1.5mol/L硫酸铵液平衡的HiTrap^TMPhenylHP柱(Amersham生物科学社生产)，在去离子水中，以浓度分别为1.5mol/L、0.9mol/L、0.75mol/L、0.6mol/L、0.15mol/L、0mol/L的硫酸铵溶液梯度洗脱，分离。其中，当硫酸铵浓度为0.75mol/L和0mol/L时，发现洗脱的部分中脱脂棉纤维游离活性强。

接着，以Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生产)将硫酸铵0mol/L洗脱部分脱盐后，调整使其成为50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)，再上样于事先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科学社生产)。接着，相对于1mol/L氯化钠的从50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)到的50mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0)线性梯度洗脱法洗脱，分离。其结果是，当氯化钠浓度约为0.05mol/L时，发现得到的部分中的脱脂棉纤维游离活性强。将该部分作为STCE1分离。

此外，硫酸铵0.75mol/L的洗脱部分，也同样，使用Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生产)脱盐后，将其调整成为50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)，再上样于事先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)平衡的MonoS 5/5HR柱(Amersham生物科学社生产)。接着，相对于1mol/L氯化钠的从50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)到的50mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0)线性梯度洗脱法洗脱，分离。其结果是，当氯化钠浓度约为0.05mol/L时，发现得到的部分中的脱脂棉纤维游离活性强。将该部分作为STCE3分离。这些STCE1部分、STCE3部分，通过上述柱子数遍分离纯化，获得大量纯化样品。

该STCE1部分和STCE3部分，在SDS-PAGE中分别显示单一点，其平均分子量(MW)依次约为49kD和45kD。SDS-PAGE，使用SafetyCell Mini STC-808电泳槽(TEFCO公司生产)和预制胶10％-SDS-PAGEmini、胶厚1.0mm(TEFCO公司生产)，依据产品使用说明书进行电泳和染色。分子量标记使用精确(Precision)蛋白标准(Bio-RadLaboratories公司生产)。此外，STCE1部分和STCE3部分都具有CMC酶活性。

脱脂棉纤维游离活性，采用依据Neena Din等的方法(Neena Din等人，“Biotechnology”，9(1991)，p.1096-1099)的方法进行。即，使用洗涤牢固度测试仪，以下述条件反应后，在600nm吸光度下测定从脱脂棉游离出的绒毛量。

试验仪器：洗涤牢固度测试仪L-12(大荣科学精器制作所公司生产)

温度：40℃

时间：120分钟

反应pH：pH7(50mmol/L磷酸缓冲液)

处理液中，除洗脱液外，还适当添加不锈钢珠和脱脂棉。

《实施例2：Staphylotrichum coccosporum来源的内切葡聚糖酶STCE1和STCE3的部分氨基酸序列确定》

(1)STCE1和STCE3的N末端氨基酸序列的确定

将实施例1得到的STCE1部分和STCE3部分上样于SDS-PAGE后，电转移于PVDF膜problot^TM(Apraid生物系统公司生产)。接着，以CBS染色液(0.1％考马斯亮兰G250、30％甲醇、10％醋酸)染色后，脱色、干燥。从该膜分别切下分子量和STCE1部分和STCE3部分相当的约49kD和45kD的蛋白质(STCE1和STCE3)印迹的部分，以极少量甲醇润湿，再以还原用缓冲液(8mol/L胍盐酸盐、0.5mol/L tris、0.3％EDTA-二钠、5％乙腈)轻轻清洗该膜片，分别将膜片在微管中浸渍于100μL左右的还原用缓冲液。在其中添加二硫苏糖醇1mg，封入氮气后封闭，静置1小时以上。再添加4-乙烯基吡啶(Aldrich公司生产)1.5μL，避光，不停搅拌20分钟以上，进行蛋白质的半胱氨酸残基的吡啶乙基化。其后，以蒸馏水、2％乙腈水的顺序，清洗STCE1、STCE3膜片，然后供于蛋白测序仪Procise491(Apraid生物系统公司生产)，分别确定N末端氨基酸序列的25个残基。STCE1、STCE3的N末端25个残基的氨基酸序列相同，得到的序列如下。

STCE1和STCE3的N末端氨基酸序列：

Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn(25个残基)(SEQ ID NO：1)

(2)STCE1和STCE3内部氨基酸的确定

将实施例1得到的STCE1和STCE3以Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生产)脱盐，冷冻干燥。将冷冻干燥后的STCE1和STCE3约40μg加入到1.5mL容量的微管中，再加入500μL还原用缓冲液，溶解。在其中添加二硫苏糖醇1.4mg，封入氮气密闭，静置5小时。再添加碘代乙酸2.7mg，避光静置30分钟，进行蛋白质的半胱氨酸残基的吡啶乙基化。其后，使用Ultrafree/Biomax-5K(Milipore公司生产)脱盐浓缩。分别相对于约10μg的该还原羧甲基化的STCE1和STCE3，添加约1/100mol量的赖氨酸内肽酶(和光纯药公司生产)，在50μL 50mmol/L tris缓冲液(pH9.0)中，于37℃反应72小时。将该消化液供于173A Micro-blotter系统(Apraid生物系统公司生产)，STCE1、STCE3分别分离出7种肽，印迹到PVDF(poly(vinyllidenedifluoride))膜。得到的肽片段的氨基酸序列通过上述蛋白测序仪确定。

其结果是，STCE1内部氨基酸序列如下所示。

LE-1：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys(8个残基)(SEQ ID NO：4)

LE-2：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(9个残基)(SEQ ID NO：5)

LE-3：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg(10个残基)(SEQ ID NO：6)

LE-4：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys(10个残基)(SEQ ID NO：7)

LE-5：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe(7个残基)(SEQ ID NO：8)

LE-6：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr(7个残基)(SEQ ID NO：9)

LE-7：Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu(9个残基)(SEQ ID NO：10)

由这些N末端氨基酸序列和肽图谱得到的内部氨基酸序列的同源性检索显示，STCE1是属于家族45的新的内切葡聚糖酶。

另一方面，STCE3的内部氨基酸序列如下所示。

LE-8：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys(8个残基)(SEQ ID NO：11)

LE-9：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys(9个残基)(SEQ ID NO：12)

LE-10：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg(10个残基)(SEQ ID NO：13)

LE-11：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg(16个残基)(SEQ ID NO：14)

LE-12：

Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-Ala-Val-Asn-Asp-Asn(22个残基)(SEQ ID NO：15)

LE-13：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys(11个残基)(序列16)

LE-14：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn(16个残基)(序列17)

由这些N末端氨基酸序列和肽图谱得到的内部氨基酸序列的同源性检索显示，STCE也是属于家族45的内切葡聚糖酶。然而，因STCE1和STCE3对应的内部氨基酸序列完全一致，暗示STCE3可能是由STCE1生成的部分分解物。

《实施例3：纯化内切葡聚糖酶STCE1除去含有纤维素的纤维的毛羽的活性评价》

使用实施例1得到的粗制纤维素酶配制液和纯化内切葡聚糖酶STCE1，如下评价对绵织布料的绒毛去除活性。

将预先染色的蓝色绵织布料与表面活性剂和胶球一起置于大型洗衣机中，使其产生毛羽。其后，通过在下述条件下进行该已起毛的蓝色绵织布料的毛羽去除处理，计算当起的毛经目视评价大约有50％被除去所需的粗制纤维素酶配制液，和纯化内切葡聚糖酶STCE1的蛋白质浓度。

温度：40℃

时间：60分钟

反应pH：pH6(5mmol/L磷酸缓冲液)

处理液中，除内切葡聚糖酶液外，还适当添加胶球。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表1。

[表1]

《实施例4：评价纯化内切葡聚糖酶STCE1对靛蓝染色的含有纤维素的纤维的脱色活性》

使用实施例1得到的粗制纤维素酶配制液和纯化内切葡聚糖酶STCE1，在下述条件下对脱浆的12盎司蓝色牛仔裤进行脱色处理。

试验仪器：20kg洗衣机(三洋电机株式会社生产全自动洗衣机SCW5101)

温度：55℃

时间：60分钟

反应pH：pH6.2(6.7mmol/L磷酸缓冲液)

处理液量：15L

处理液中，除内切葡聚糖酶液外，还适当添加胶球。

使用分光测色计(Minolta公司生产，CM-525i)，测定Lab表示系的L值(明度)来确定脱色度。求出相对于对照(未处理纤维)的L值的增加值(白色度的增加)，即ΔL值，由该ΔL值评价脱色程度。即，在每个试验区测定10个点的ΔL值(n＝10)，算出其平均值。接着，算出为使ΔL值＝5所需的粗制纤维素酶配制液和纯化内切葡聚糖酶STCE1的蛋白质浓度。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表2。

[表2]

《实施例5：和洗涤剂配合使用时，纯化内切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5以及RCEI的绒毛去除活性(澄澈化活性)的比较评价》

使用实施例1得到的纯化内切葡聚糖酶STCE1、从Humicolainsolens培养液得到的纯化内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)、从Humicola insolens得到的纯化内切葡聚糖酶NCE5(国际公开第01/90375号小册子)、从在Humicola insolens中的大量表达产物中单一纯化得到的内切葡聚糖酶RCEI【使用纤维素结合区域缺失的RCEI-H4(25kD)(国际公开第02/42474号小册子)】，如下评价在欧美洗涤剂中对绵织布料的绒毛去除活性(澄澈化活性)。

将预先染色的蓝色绵织布料和表面活性剂以及胶球一起置于大型洗衣机中，使起毛。此后，通过在下述条件下，于洗涤剂中处理该已起毛的蓝色绵织布料，计算当起的毛经目视评价大约有50％被除去所需的纯化内切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5和RCEI的蛋白质浓度。

温度：40℃

时间：60分钟

处理液量：40mL

洗涤剂种类：NEW Persil(Performance Tablets biological)(LEVER公司生产：2002年3月于意大利得到。)

洗涤剂的添加量：0.8％

处理液：人工硬度水(25FH：将在去离子水中加入80mmol/L的氯化钙、20mmol/L的氯化镁得到的1000FH人工硬度水，以去离子水稀释制得。)

处理液中，除内切葡聚糖酶溶液外，还适当添加胶球。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表3。

[表3]

《实施例6：自来水的硬度对各种纯化内切葡聚糖酶的绒毛去除活性的影响》

使用实施例1得到的纯化内切葡聚糖酶STCE1、从Humicolainsolens得到的纯化内切葡聚糖酶NCE5(国际公开第01/90375号小册子)、从Humicola insolens培养液得到的纯化内切葡聚糖酶NCE4(国际公开第98/03640号小册子)、从在Humicola insolens中的大量表达产物中单一纯化得到的内切葡聚糖酶RCEI【使用纤维素结合区域缺失的RCEI-H4(25kD)(国际公开第02/42474号小册子)】，如下评价对人工硬度水中的绵织布料的绒毛去除活性。

将预先染色的茶色绵织布料和表面活性剂以及胶球一起置于大型洗衣机中，使起毛。此后，在各种硬度(0FH、5FH、10FH、20FH、40FH)的人工硬度水中，使用4种纯化内切葡聚糖酶溶液，在下述条件下处理该已起毛的茶色绵织布料。对于处理后的布料，计算当起的毛经目视评价大约有50％被除去所需的纯化内切葡聚糖酶STCE1、NCE4、NCE5和RCEI的蛋白质浓度，将该蛋白质浓度的倒数作为绒毛去除活性值。接着，求出当以0FH的硬度中的绒毛去除活性值为100时，各硬度下的绒毛去除活性相对值。

温度：40℃

时间：60分钟

处理液量：100mL

反应pH：pH6(5mmol/L磷酸缓冲液)

处理液中，除内切葡聚糖酶溶液外，还适当添加胶球。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表4。

[表4]

《实施例7：内切葡聚糖酶STCE基因的克隆》

实施例2确定的STCE1和STCE3的内部和N末端氨基酸序列，和同样属于家族45的Humicola insolens来源的内切葡聚糖酶NCE5(国际公开第01/90375号小册子)的氨基酸序列具有同源性。此处，为检索Staphylotrichum coccosporum的基因组DNA中的内切葡聚糖酶STCE基因，以NCE5基因为探针进行Southern杂交分析，进而分离出其同源性基因。

(1)Staphylotrichum coccosporum来源的基因组DNA的分离

将Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在T培养基(2.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾)中于28℃培养72小时，通过离心分离回收菌体。将得到的菌体冷冻干燥，以搅拌机(blender)细细破碎后，溶解于TE(10mmol/Ltris盐酸(pH8.0)、1mmol/L EDTA)缓冲液8mL中。在其中加入含有10％SDS的TE缓冲液4mL，60℃保温30分钟。此后，加入酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)12mL，激烈振荡。离心后，将水层移至别的容器，在其中加入5mol/L醋酸钾1mL，置于冰水中1小时以上。离心后，将水层移至别的容器，加入2.5体积的乙醇，使DNA沉淀。将沉淀物干燥后，溶解于5mL的TE缓冲液，加入10mg/mL核酶A(RNaseA)溶液5μL，37℃保温1小时后，再加入20mg/mL蛋白酶K(Proteinase K)溶液50μL，37℃保温1小时。其后，加入3mL的聚乙二醇溶液(20％PEG6000、2.5mol/L氯化钠)，使DNA沉淀。将沉淀物溶解于500μL的TE缓冲液中，酚∶氯仿∶异戊醇提取2次后，用乙醇沉淀。将沉淀物用70％乙醇清洗后，干燥，溶解于适量TE缓冲液中，得到基因组DNA试料。

(2)以Southern杂交检索NCE5同源性基因

将实施例7得到的Staphylotrichum coccosporum的基因组DNA约10μg，以多种限制性酶(EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI、NcoI等)分别切割后，用于0.8％琼脂糖凝胶电泳。将其转移到尼龙薄膜(HybondN+尼龙转移膜，Amersham公司生产)，以0.4N氢氧化钠将DNA固定后，以5倍浓度SSC(75mmol/L枸橼酸三钠、750mmol/L氯化钠)清洗，干燥，固定DNA。

探针是通过将含有NCE5基因的cDNA的质粒pJND-c5(国际公开第01/90375号小册子)以BamHI消化后，供于0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收约700bp的DNA片段得到。将其通过ECL直接DNA/RNA水平检测系统(Amersham公司生产)标记。依据上述试剂盒附带的说明书记载方法，将固定有基因组DNA的尼龙膜于42℃预杂交1小时后，添加标记化的NCE5探针，42℃杂交15小时。

杂交后的尼龙膜的清洗依据上述试剂盒附带的说明书记载的方法进行。首先，以添加0.4％SDS、6mol/L尿素的0.6倍浓度SSC(9mmol/L枸橼酸三钠、90mmol/L氯化钠)于42℃反复清洗2次，每次20分钟。接着，以5倍浓度SSC于室温清洗2次，每次5分钟。将经过清洗处理后的尼龙膜浸到试剂盒附带的检测溶液1分钟后，富士医疗X射线膜(富士写真膜公司生产)感光。

其结果是，在以EcoRI、BamHI、XhoI、NcoI切割时，各自杂交到大小不同的2条条带，推测Staphylotrichum coccosporum基因组DNA上存在和NCE5具有同源性的2种基因。在以EcoRI切割基因组DNA进行的杂交中，检测到约10kbp和5kbp的2条条带。接着，将检测到的约10kbp条带的DNA克隆。

(3)基因组DNA文库的制备

将Staphylotrichum coccosporum的基因组DNA以EcoRI消化，使用SeaKemLE琼脂糖(FMC公司生产)，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。为包含10kbp附近DNA，依据常法提取、纯化约8-12kbp大小的DNA片段。将该DNA片段连接到噬菌体载体、Lambda DASH II载体(Stratagene公司生产)上。将其乙醇沉淀后，溶解于TE缓冲液，然后使用Gigapack III金包装试剂盒(Gigapack III Gold packaging kit)，将其包装入Lambda头部，得到的噬菌体感染大肠菌XL1-Blue MRA株。使用由该方法得到的5×10⁴个噬菌体文库，克隆目的基因。

(4)Plaque杂交筛选NCE5同源基因

接着，将依据实施例7(3)得到的基因组DNA文库(EcoRI文库)转移到尼龙薄膜(HybondN+尼龙转移膜，Amersham公司生产)，以0.4N氢氧化钠将DNA固定后，以5倍浓度SSC清洗，干燥、固定DNA。依据试剂盒方法，42℃预杂交1小时后，添加实施例7(2)中标记化的NCE5基因的探针，42℃杂交15小时。

杂交后的尼龙膜的清洗依据上述试剂盒附带的说明书记载的方法进行。首先，以添加0.4％SDS、6mol/L尿素的0.6倍浓度SSC于42℃反复清洗2次，每次20分钟。接着，以5倍浓度SSC于室温清洗2次，每次5分钟。将经过清洗处理后的尼龙膜浸到试剂盒附带的检测溶液1分钟后，富士医疗X射线膜(富士写真膜公司生产)感光，得到4个噬菌体克隆。

接着，用噬菌体感染大肠菌XL1-Blue MRA株，18小时后收集噬菌体颗粒。依据Grossberger方法(Grossberger，D.，“Nucleic Acids.Res.”，15，6737，1987)，以蛋白酶K和酚处理这些颗粒后，通过乙醇沉淀，分离噬菌体DNA。

(5)NCE5同源基因的亚克隆

将4种噬菌体DNA以多种限制性酶切割后，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。由Southern方法(Southern，E.M.，“J.Mol.Biol”，98，p.503-517)将DNA转移至尼龙薄膜，和实施例7(4)一样，进行杂交。其结果是，4种噬菌体DNA，即使经过多种限制性酶切割，仍都显示出共有的杂交图谱。此外，在以SalI切割4种噬菌体DNA，和实施例7(4)一样进行杂交后，都在约4.4kbp条带显示强信号，在约2.5kbp条带显示弱信号。由此认为，同源基因存在于约4.4kbp和约2.5kbpDNA之间，回收此2个大片段DNA，分别亚克隆到质粒pUC119的SalI位点。将亚克隆约4.4kbp的DNA得到的质粒称为pSTCE-Sal4.4，亚克东约2.5kbp的DNA得到的质粒称为pSTCE-Sal2.5。

《实施例8：NCE5同源基因的碱基序列的确定》

实施例7(5)亚克隆的NCE5同源基因的碱基序列分析如下进行。

碱基序列分析装置，使用的是A.L.F.DNA测序仪II(法玛西亚生物技术公司生产)。测序凝胶采用的是Hydro-link Long Range(FMC公司生产)可使用的聚丙烯酰胺载体。凝胶制备用各种试剂(N，N，N’，N’-四甲基亚乙基二胺、尿素和过硫酸铵)使用的是A.L.F.级试剂(法玛西亚生物技术公司生产)。碱基序列解读反应，使用的是自动读取测序试剂盒(法玛西亚生物技术公司生产)。凝胶制作条件、反应条件和点用条件等等，均参照试剂盒附带的各说明书设定。

这样，根据通常方法，确定质粒pSTCE-Sal4.4内的约4.4kbpDNA片段和质粒pSTCE-Sal2.5内的约2.5kbpDNA片段的碱基序列。进而，在将解读后的碱基序列翻译成氨基酸序列后，有一个阅读框和实施例2所示STCE1的N末端氨基酸序列以及内部氨基酸序列完全一致。这些结果提示，该NCE5同源基因是编码STCE1的基因。因此，以后将该NCE5同源基因作为STCE1基因记载。此外，根据该基因组DNA翻译得到的STCE1氨基酸序列可以判断，STCE1具有N末端侧催化区域(catalytic domain)、C末端侧纤维素结合区域(cellulose-bingdingdomain)，是属于家族45的内切葡聚糖酶。然而，因推断该DNA序列种含有内含子区域，因而采用RT(reverse transcriptase)-PCR，对STCE1基因的cDNA进行了分离。

《实施例9：RT-PCR分离STCE1基因的cDNA和碱基序列确定》

(1)由Staphylotrichum coccosporum分离mRNA

将Staphylotrichum coccosporum IFO 31817菌株在T培养基(2.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、2.0％玉米浆、1.0％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾)中于28℃培养72小时，通过离心分离回收菌体。将得到的菌体冷冻干燥，以搅拌机(blender)细细破碎。总RNA采用Isogen(和光纯药工业公司生产)分离。

首先，在菌体粉末中加入Isogen 5mL，30秒旋涡搅拌机搅拌后，于50℃保温10分钟。其后，室温放置5分钟。接着，加入0.8mL氯仿，激烈振荡。离心分离后，将水层移至别的容器，在其中加入4mol/L氯化锂2mL，混合后，于-70℃放置15分钟。其后，离心分离，去除上清液后，将沉淀物以1.6mL水溶解，接着，加入1.6mL异丙醇，混合后，于4℃放置30分钟。离心分离后，去除上清液，将沉淀物以75％乙醇清洗后，溶解在1.6mL水中。该液乙醇沉淀后，将沉淀物以75％乙醇清洗后，干燥，再溶解到0.4mL水中，得到总RNA。

接着，使用mRNA分离试剂盒(Stratagenene公司生产)，制备mRNA。首先，在上述配制的0.2mL总RNA中，添加稀释缓冲液10mL，再添加寡dT溶液5mL。去除上清液后，将该寡dT以高盐缓冲液清洗3次，低盐缓冲液清洗2次后，以事先加温至68℃的稀释缓冲液洗脱。将该溶液乙醇沉淀，沉淀物以75％乙醇清洗后，干燥，再溶解于15μL水中，将其作为mRNA部分。

(2)以RT-PCR分离STCE1基因的cDNA

使用Takara RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1，以RT-PCR方法从mRNA制备STCE1基因的cDNA。N末端侧的引物序列，参考STCE1的N末端氨基酸序列和由实施例8分析得到的基因组序列翻译得到的氨基酸确定，C末端侧引物序列，参考保守性很好的纤维素结合区域的信息(Hoffren，Annna-Marja.等人，“Protein Engineering”，8，p.443-450，1995)和由实施例8分析得到的基因组序列翻译得到的氨基酸确定。即，制备具有以下序列的寡核苷酸引物，以如上配制的mRNA中的1μL为模板，由PCR法仅扩增STCE1基因的cDNA。

STCE1-CN：5’-GCGGATCCATGCGTTCCTCCCCCGTC-3’(26mer)(SEQ ID NO：18)

STCE1-CC：5’-GCGGATCCTTAAAGGCACTGCGAGTACC-3’(28mer)(SEQ ID NO：19)

RT-PCR反应以下述条件进行。首先，添加C末端引物，在逆转录酶作用下，反应后，添加Taq聚合酶(重组Taq，宝酒造公司生产)、N末端引物，以如下条件重复30次：94℃1分钟、50℃2分钟、72℃2分钟，进行扩增。扩增后的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测结果是，是一个约1kbp的片段。将其亚克隆到pUC18(质粒pUC-STCE1)。

(3)STCE1基因的碱基序列确定

上述片段的碱基序列依据实施例8的方法确定。进而，将该序列和基因组碱基序列比较，确定内含子。该分析结果是，确定了Staphylotrichum coccosporum来源的STCE1基因的全长cDNA碱基序列(SEQ ID NO.2)。

基于得到的STCE1基因的cDNA的序列信息，分离处于内含子含有状态下的包含STCE1基因翻译区域的DNA片段。以混合有实施例7(5)中使用的4种噬菌体DNA的序列为末端，使用引物STCE-HNBam和STCE-HNBam，进行PCR。扩增后的片段经琼脂糖电泳分离纯化后，用BamHI切割，再次通过琼脂糖电泳分离纯化。

STCE-HNBam：

5’-GGG GGA TCC TGG GAC AAG ATG CGT TCC TCC CCC GTC CTC-3’(39mer)(SEQ ID NO：20)

STCE-HCBam：

5’-GGG GGA TCC GCT CAA AGG CAC TGC GAG TAC CAG TC-3’(35mer)(SEQ ID NO：21)

在质粒pUC118的BamHI部位，插入约1.1kbp的上述片段，得到质粒pUC118-STCEex(FERM P-19602)。进而，采用上述方法，确定该插入片段的碱基序列，确认STCE1基因的内含子和翻译区域的序列(SEQ ID NO.22)。PCR时，尽管因使用引物STCE-HCBam，终止密码子序列由TAA变为TGA，但生成的蛋白质的氨基酸序列没有变化。

《实施例10：STCE1基因在Humicola insolens中的表达》

Humicola insolens MN200-1株(FERM BP-5977)中的表达载体pJND-STCE1是在使得表达的蛋白质是NCE4的N末端16个氨基酸残基和STCE1的剩余氨基酸残基的融合蛋白的条件下制备的。即，利用质粒pJND-NCE4构建，质粒pJND-NCE4是通过在质粒pJD01(国际公开第00/24879号小册子)的BamHI部位连接上NCE4基因(国际公开第98/03640号小册子)制得的。

其理由在于，NCE4的N末端16个氨基酸残基和STCE1的N末端16个氨基酸残基一致，因而，即使将NCE4的N末端16个氨基酸残基和STCE1的剩余氨基酸残基融合，也可得到和STCE1一样的表达蛋白质。

质粒pJND-NCE4如下制备。首先，在NCE4基因(国际公开第98/03640号小册子)能够连接到质粒pJD01的BamHI位点的条件下，设计下述引物，使得含有起始密码子的紧邻上游的序列和终止密码子的紧邻下游的BamHI位点，依据国际公开第01/90375号小册子的实施例4(1)1)记载的方法，以质粒pCNCE4(国际公开第98/03640号小册子)为模板，采用PCR方法，导入变异，进行扩增。

NCE4-N-BamHI：

5’-GGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCC-3’(39mer)(SEQ ID NO：23)

NCE4-C-BamHI：

5’-GGGGATCCTGCGTTTACAGGCACTGATGGTACCAGTC-3’(37mer)(SEQ ID NO：24)

扩增后的DNA经BamHI消化后，亚克隆到质粒pJD01(国际公开第00/24879号小册子的实施例D1(2)(b))的BamHI位点，将得到的质粒称为pJND-NCE4。

(1)STCE1表达质粒的构建

以实施例9(2)得到的质粒pUC-STCE1为模板，STCE1-N-S9A4、STCE1-C-FokF为引物，进行PCR扩增，将扩增后的片段琼脂糖电泳分离纯化，以BamHI和FokI切断后，再次以琼脂糖电泳分离纯化。

STCE1-N-S9A4：

5’-GGGATCCTGCGTTTAAAGGCACTGCGAGTACCAG-3’(34mer)(SEQ ID NO：25)

STCE1-C-FokF：

5’-GGGATGCAAGCCGTCGTGCTCGTG-3’(24mer)(SEQ ID NO：26)

接着，以STCE1-N-FokR4、STCE1-C-BamF为引物，通过PCR扩增上述质粒pJND-NCE4，将扩增后的片段由琼脂糖电泳分离纯化，以BamHI和FokI切割后，再次以琼脂糖电泳分离纯化。

STCE1-N-FokR4：5’-GGGATGGGCCCAGCCGCACGAAG-3’(23mer)(SEQ ID NO：27)

STCE1-C-BamF：5’-GGGATCCTGGGACAAGATGC-3’(20mer)(SEQ ID NO：28)

在质粒pJD01的BamHI部位插入上述2个片段，得到质粒pJND-STCE1。进而，采用上述方法确定该插入片段的碱基序列，确认是和STCE1基因(SEQ ID NO.2)一样的序列。

(2)通过质粒pJND-STCE1制备Humicola insolens的转化体

将Humicola insolens MN200-1株在NS培养基(3.0％葡萄糖、2.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.03％氯化钙、0.03％氯化镁、pH6.8)中37℃培养24小时后，3000rpm离心10分钟，收集菌体。将得到的菌体以0.5mol/L蔗糖清洗，再混悬于经0.45μm滤膜过滤的原生质体化酶溶液(3mg/mL β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)、1mg/mL几丁质酶(Chitinase)、1mg/mL溶菌酶(Zymolyase)、0.5mol/L蔗糖)10mL中。30℃振荡60-90分钟，使菌系原生质体化。过滤该混悬液后，2500rpm离心分离10分钟，回收原生质体，以SUTC缓冲液(0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化钙、10mmol/Ltris盐酸(pH7.5)清洗。

将该原生质体混悬于SUTC缓冲液1mL，加入每100μL含有10μg质粒pJND-STCE1的溶液10μL，冰水中静置5分钟。接着，加入400μL的PEG溶液(60％PEG4000、10mmol/L氯化钙、10mmol/L tris盐酸(pH7.5)，在冰水中静置20分钟后，添加SUTC缓冲液10mL，2500rpm离心分离10分钟。将收集到的原生质体混悬于SUTC缓冲液1mL后，4000rpm离心分离5分钟，最终混悬于SUTC缓冲液100μL。

将该原生质体和YMG软琼脂一起层积于添加有潮霉素B(200μg/mL)的YMG培养基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.2％麦芽提取物、1％琼脂(pH6.8))上，37℃培养5小时，将形成的克隆作为转化体。

(3)pJND-STCE1转化体的培养和确定

(i)依据SDS-PAGE的评价

将质粒pJND-STCE1导入Humicola insolens MN200-1株，选出表现潮霉素B耐性的40株。将它们在(N)培养基(5.0％微晶纤维素、2.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.03％硫酸镁、pH6.8)中37℃培养4天，将得到的培养上清用SDS-PAGE电泳(预制小型凝胶(MiniGel)，14％-SDS-PAGEmini、胶厚1.0mm(TEFCO公司生产)分析。其结果是，在13个克隆中，能够确认推定为STCE1的分子量为45-49kD附近的蛋白质显著增强。

(ii)重组STCE1的N末端氨基酸的确定

(3)为确认(i)中大量表达的蛋白质来源于STCE1基因，确定N末端氨基酸序列。首先，用SDS-PAGE电泳分离培养上清，依据实施例2的方法电转移蛋白质于PVDF膜，将分子量45-49kD附近的蛋白质进行蛋白测序。其结果是，和内切葡聚糖酶STCE1的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)一致。

《实施例11：评价Humicola insolens表达的STCE1对含有纤维素的纤维的绒毛去除活性》

使用实施例10(3)的SDS-PAGE确认的表达分子量为45-49kD附近的蛋白质的13株中表达尤为显著的1株(4A-9株)的培养上清液，测定其对绵织布料的绒毛去除活性。使用来自非转化体母株的培养上清液作为对照。方法依据实施例3进行，即，通过在pH6、40℃的条件下，以各种培养上清液处理预先有毛羽的蓝色绵织布料1小时，去除毛羽，计算起的毛经目视评价大约100％被除去所需的培养上清液中的蛋白质浓度。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表5。

[表5]

《实施例12：评价Humicola insolens表达的内切葡聚糖酶STCE1对靛蓝染色的含有纤维素的脱色活性》

使用实施例10得到的STCE1大量表达株(4A-9株)和非转化体母株(MN200-1株)的培养上清液，在下述条件下对脱浆的12盎司蓝色牛仔裤进行脱色处理。

温度：55℃

时间：60分钟

反应pH：pH6.2(6.7mmol/L磷酸缓冲液)

处理液量：15L

处理液中，除培养上清液外，还适当添加胶球。

使用分光测色计(Minolta公司生产，CM-525i)，测定Lab表示系的L值(明度)来确定脱色度。求出相对于对照(未处理纤维)的L值的增加值(白色度的增加)，即ΔL值，由该ΔL值评价脱色程度。即，在每个试验区测定10个点的ΔL值(n＝10)，算出其平均值。接着，算出为使ΔL值＝7所需的粗制纤维素酶配制液和纯化内切葡聚糖酶STCE1的蛋白质浓度。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(BioRa公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表6。

[表6]

《实施例13：和洗涤剂配合使用时，Humicola insolens表达的内切葡聚糖酶STCE1的绒毛去除活性(澄澈化活性)的评价》

使用实施例10得到的STCE1大量表达株(4A-9株)和非转化体母株(MN200-1株)的培养上清液，，如下评价在欧美洗涤剂中对绵织布料的绒毛去除活性(澄澈化活性)。

将预先染色的茶色绵织布料和表面活性剂以及胶球一起置于大型洗衣机中，使起毛。此后，通过在下述条件下，于洗涤剂中处理该起毛的茶色绵织布料，计算当起的毛经目视评价大约有50％被除去所需的培养上清液中的蛋白质浓度。

温度：40℃

时间：60分钟

处理液量：40mL

洗涤剂的添加量：0.4％

处理液中，除培养上清液外，还适当添加胶球。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表7。

[表7]

《实施例14：自来水的硬度对Humicola insolens表达的内切葡聚糖酶的绒毛去除活性的影响》

使用实施例10得到的内切葡聚糖酶STCE1大量表达株(4A-9株)、NCE5大量表达的Humicola insolens转化体(国际公开第01/90375号小册子)、NCE4大量表达的Humicola insolens转化体(国际公开第98/03640号小册子)、RCEI(纤维素结合区域缺失的RCEI-H4(25kD))大量表达的Humicola insolens转化体(国际公开第02/42474号小册子)等4株的培养上清液，如下评价对洗涤剂中的各种硬度的水中的绵织布料的绒毛去除活性。

将预先染色的茶色绵织布料和表面活性剂以及胶球一起置于大型洗衣机中，使起毛。此后，在各种硬度(0FH、5FH、10FH、20FH、40FH)的人工硬度水中，使用4种培养上清液，在下述条件下处理该已起毛的茶色绵织布料。

温度：40℃

时间：60分钟

处理液量：100mL

洗涤剂的种类：NEW Persil(Performance Tablets biological)(LEVER公司生产：2002年3月于意大利得到。)

洗涤剂的添加量：0.4％

处理液：人工硬度水(25FH：将在去离子水中加入80mmol/L的氯化钙、20mmol/L的氯化镁得到的1000FH 人工硬度水，以去离子水稀释制得。)

处理液中，除培养上清液外，还适当添加胶球。

对于处理后的布料，计算当起的毛经目视评价大约有50％被除去所需的培养上清液量中的蛋白质浓度，将该蛋白质浓度的倒数作为绒毛去除活性值。接着，求出当以0FH的硬度中的绒毛去除活性值为100时，各硬度下的绒毛去除活性相对值。该结果示于表8。

[表8]

《实施例15：STCE1基因在绿色木霉中的表达》

(1)STCE1表达质粒STCE1N-pCB1的构建

STCE1基因，在起始密码子的上游序列预先含有SmaI，终止密码子的下游预先含有XhoI的状态下，设计如下变异导入用引物，以PCR法扩增。

STCE1-N-Smal：

5’-CAGCCCGGGGCGCATCATGCGTTCCTCCCCTCTCC-3’(35mer)(SEQ ID NO：29)STCE1-C-XhoI：

5’-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3’(33mer)(SEQ ID NO：30)

PCR反应，以质粒pJND-STCE1为模板，STCE1-N-SmaI、STCE1-C-XhoI这两个合成DNA为引物，使用TaKaRa LA Taq withGC buffer(宝酒造公司生产)进行。反应条件依据酶所附带的说明书中的条件。由琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，再以限制性酶SmaI和XhoI切割，得到约0.9kbp的基因片段STCE1-N。

另一方面，以限制性酶StuI和XhoI切割pCB1-M2(国际公开第98/11239号小册子)，回收7.3kbp的片段。使用TaKaRa DNA Ligation试剂盒ver.1(宝酒造公司生产)在上述片段上连接约0.9kbp的基因片段STCE1-N，制成质粒STCE1N-M2。

进而，在质粒STCE1-M2的XbaI位点插入PDH25(Cullen，D.，Leong，S.A.，Wilson，L.J.AND Henner，D.J.，“Gene”，57，p.21-26，1987)来源的潮霉素B耐性盒(resistance cassette)，构建质粒STCE1N-pCB1。酶等的反应条件，依据试剂盒附带的说明书中的条件。构建的质粒STCE1N-pCB可在宿主木霉内使用自身起始密码子表达STCE1蛋白质。

(2)融合STCE1表达质粒STCE1M-pCB1的构建

STCE1基因，在编码N末端的氨基酸(Ala)密码子的紧邻上游预先含有SphI，终止密码子的下游预先含有XhoI的状态下，设计如下变异导入用引物，以PCR法扩增。

STCE1-M-SphI：

5’-CCGCATGCGCTGATGGCAAGTCCACC-3’(26mer)(SEQ ID NO：31)STCE1-C-XhoI：

5’-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3’(33mer)(SEQ ID NO：32)

PCR反应，以质粒pJND-STCE1为模板，STCE1-M-SphI、STCE1-C-XhoI这两个合成DNA为引物，使用TaKaRa LA Taq withGC buffer(宝酒造公司生产)进行。反应条件依据酶所附带的说明书中的条件。由琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，再以限制性酶SphI和XhoI切割，得到约0.9kbp的基因片段STCE1-M。

另一方面，以限制性酶SphI和XhoI切割pCB1-M2(国际公开第98/11239号小册子)，回收7.3kbp的片段。使用TaKaRa DNA Ligation试剂盒ver.1(宝酒造公司生产)在上述片段上连接约0.9kbp的基因片段STCE1-N，制成质粒STCE1-M2。

进而，在质粒STCE1-M2的XbaI位点插入PDH25(Cullen，D.，Leong，S.A.，Wilson，L.J.AND Henner，D.J.，“Gene”，57，p.21-26，1987)来源的潮霉素B耐性盒，构建质粒STCE1N-pCB1。酶等的反应条件，依据试剂盒附带的说明书中的条件。构建的质粒STCE1M-pCB1可在宿主木霉内使用自身起始密码子，以和CBHI蛋白质的pre-pro序列和构成的融合蛋白的形式表达STCE1蛋白质。

(3)制备质粒STCE1N-pCB1、STCE1M-pCB1对木霉的转化体

将木霉MC300-1株(FERM BP-6047)在S培养基(3.0％葡萄糖、1.0％酵母提取物、0.1％多聚蛋白胨、0.14％硫酸铵、0.2％磷酸钾、0.03％硫酸镁、pH6.8)中28℃培养24小时后，3000rpm离心10分钟，收集菌体。将得到的菌体以0.5mol/L蔗糖清洗，再混悬于经0.45μm滤膜过滤的原生质体化酶溶液(5mg/mL Novozyme 234、5mg/mL纤维素酶Onozuka R-10、0.5mol/L蔗糖)中。30℃振荡60-90分钟，使菌系原生质体化。过滤该混悬液后，2500rpm离心分离10分钟，回收原生质体，以SUTC缓冲液清洗。

将该原生质体混悬于SUTC缓冲液1mL，加入每100μL含有10μgSTCE1N-pCB1或STCE1M-pCB1的DNA溶液10μL，冰水中静置5分钟。接着，加入400μL的PEG溶液(60％PEG4000、10mmol/L氯化钙、10mmol/L tris盐酸(pH7.5)，在冰水中静置20分钟后，添加SUTC缓冲液10mL，2500rpm离心分离10分钟。将收集到的原生质体混悬于SUTC缓冲液1mL后，4000rpm离心分离5分钟，最终混悬于SUTC缓冲液100μL。

将该原生质体和PD软琼脂(1.3％土豆葡萄糖琼脂、17.1％蔗糖)一起层积于添加有潮霉素B(20μg/mL)的土豆葡萄糖(PD)培养基(3.9％土豆葡萄糖琼脂、17.1％蔗糖)上，37℃培养5小时，将形成的克隆作为转化体。

《实施例16：STCE1基因的绿色木霉转化体培养液中的STCE1的确定和绒毛去除活性评价》

(1)HPLC评价

将质粒STCE1N-pCB1、STCE1M-pCB1导入绿色木霉MC300-1株，选出表现潮霉素B耐性的50个菌株。将它们在S培养基中37℃培养5天，得到的培养上清液以TSKgel TMS-250柱(4.6mmI.D.×7.5cm)(东so公司生产)进行HPLC分析，乙腈浓度为0％到80％的0.05％TFA(三氟乙酸)进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，在UV280nm处检测峰。其结果是，在STCE1N-pCB1转化体、STCE1M-pCB1转化体各自3株中，观察到野生绿色木霉MC300-1培养上清液没有的峰，因此，将这些峰分离，依据实施例2的方法确定N末端氨基酸，结果发现，和STCE1的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)一致。

(2)评价STCE1转化体培养液的绒毛去除活性

使用实施例16(1)中表达STCE1的2株和非转化体母株(MC300-1)的培养液上清，依据实施例3，通过在pH10(5mmol/L碳酸钠缓冲液)、40℃的条件下，以各种培养上清液对预先已起毛的蓝色绵织布料进行毛除去处理1小时，计算出起的毛经目视评价约有50％被除去所需的培养上清液中的蛋白质浓度。

蛋白质浓度的定量是使用蛋白质分析试剂盒)(Bio-RadLaboratory公司生产)，以牛血清白蛋白为标准进行定量的。该结果示于表9。

[表9]

产业上利用的可能性

本发明的新的内切葡聚糖酶STCE，可适用于例如，含有纤维素的纤维的处理、旧纸的脱墨、纸浆的透水性改善、动物试料消化能力的改善等用途。

以上，尽管通过特定的实施方式对本发明进行了说明，但对本领域技术人员而言显而异见的变形和改良也包含在本发明范围内。

附图说明

图1是显示，在本发明的内切葡聚糖酶STCE1的氨基酸序列【信号肽(SEQ ID NO.33)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.3)】与属于家族45的公知内切葡聚糖酶NCE4【信号肽(SEQ ID NO.34)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.35)以及NCE5【信号肽(SEQ ID NO.36)和成熟蛋白质(SEQ ID NO.37)】的各氨基酸序列比较的结果中，有关其N末端侧序列的结果的说明图。

图2是显示，图1所示比较结果中，有关C末端侧序列的结果的说明图。

序列表文本

以下序列表中的数字<223>中记载“人工序列”的说明。SEQ IDNO：18～21的序列表示的碱基序列是引物STCE1-CN，引物STCE1-CC，引物STCE-HNBam，以及引物STCE-HCBam，SEQ ID NO：23～32的序列表示的碱基序列是引物NCE4-N-BamHI，引物NCE4-C-BamHI，引物STCE1-N-S9A4，引物STCE1-C-FokF，引物STCE1-N-FokR4，引物STCE1-C-BamF，引物STCE1-C-SmaI，引物STCE1-C-XhoI，引物STCE1-M-SphI，以及引物STCE1-C-C-XhoI。

Claims

1.选自下述的蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列并且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，

(b)由在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，

(c)由在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸所得的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，

(d)由与含有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85％同源的氨基酸序列组成，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质，

(e)包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被保守性取代所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质。

(f)包含在SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的改变的蛋白质，以及

(g)包含与含有SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列的蛋白质至少85％同源的氨基酸序列，并且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质。

2.编码权利要求1的蛋白质的多核苷酸。

3.选自下述的多核苷酸：

(i)包含SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列并且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，

(ii)由在SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列缺失、取代、插入或添加1个或多个碱基而得的碱基序列组成，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，

(iii)包含在SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列缺失、取代、插入或添加1个或多个碱基而得的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸，以及

(iv)与由SEQ ID NO.2所示的碱基序列中的第64-第948位碱基的序列组成的多核苷酸在严紧条件下杂交，并编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。

4.包含权利要求2或3中记载的多核苷酸的表达载体。

5.权利要求4中记载的表达载体转化的宿主细胞。

6.权利要求5中记载的宿主细胞，其中所述的宿主是酵母或丝状菌。

7.如权利要求6所记载的宿主细胞，其中，所述酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、或毕赤酵母属(Pichia)的微生物。

8.如权利要求7所记载的宿主细胞，其中，丝状菌为腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、圆孢霉属、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)或顶孢霉属(Acremonium)的微生物。

9.如权利要求8所记载的宿主细胞，其中，丝状菌为Humicolainsolens或绿色木霉(Trichoderma viride)。

10.蛋白质的制造方法，其包含培养权利要求5的宿主细胞的步骤，以及从前述培养所得的宿主细胞或其培养物收集权利要求1的蛋白质的步骤。

11.以权利要求10中记载的方法生产的蛋白质。

12.纤维素酶配制物，其包含权利要求1的蛋白质。

13.洗涤组合物，其包含权利要求1的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物。

14.含有纤维素的纤维的处理方法，其包含：使含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

15.降低含有纤维素的纤维起毛速度或者减少含有纤维素的纤维的起毛的方法，其包含：使含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

16.为改善含有纤维素的纤维的肌肤触感和外观的减量加工方法，其包含：使含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

17.使染色后的含有纤维素的纤维的色泽澄澈化的方法，其包含：使染色后的含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

18.使染色后的含有纤维素的纤维的色泽具有局部性变化的方法，其包括：使染色后的含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

19.降低含有纤维素的纤维开始变硬的速度或减少含有纤维素的纤维的硬度的方法，其包含：使含有纤维素的纤维和权利要求1的蛋白质、权利要求12中记载的纤维素酶配制物、或权利要求13中记载的洗涤组合物接触的步骤。

20.权利要求14的方法，其中所述的纤维处理是通过将纤维浸渍、清涤或洗涮进行的。

21.旧纸脱墨的方法，其特征在于，在通过旧纸脱墨化学品处理来脱墨的步骤中使用权利要求1的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物。

22.改善纸浆的滤水性的方法，其包含：以权利要求1的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。

23.改善动物饲料的消化能力的方法，其包含：以权利要求1的蛋白质、或权利要求12中记载的纤维素酶配制物处理含有纤维素的纤维的步骤。