CN108699543B

CN108699543B - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽及其用途

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Publication number: CN108699543B
Application number: CN201680081893.4A
Authority: CN
Inventors: N·潘迪; R·R·博特; S·普莱斯鲁斯; A·萨昌; S·希普夫斯科夫; A·萨塔帕蒂
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: BR112018012020A2; US20180362946A1; WO2017106676A1; CN108699543A; US11946078B2; WO2018112123A1; EP3390625A1; EP3390625B1; US20210309983A1

Abstract

本文公开了纤维素酶变体或其活性片段，以及编码所述纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸，其中所述纤维素酶变体或其活性片段具有内切葡聚糖酶活性。本文还公开了组合物，所述组合物包含所述纤维素酶变体或其活性片段；载体和/或宿主细胞，所述载体和/或宿主细胞包含编码所述纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸；和方法，所述方法用于制备和/或使用所述纤维素酶变体或其活性片段和/或含有所述纤维素酶变体或其活性片段的组合物；其中所述纤维素酶变体或其活性片段具有内切葡聚糖酶活性。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽及其用途

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求于2015年12月18日提交的美国临时专利申请序列号62/269,678的优先权权益，将该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

以电子方式提交的序列表的引用

作为ASCII文本文件(名称：NB40768WOPCT_ST25；大小67.5KB；创建于2016年12月6日)与本申请一起以电子方式提交的序列表的内容形成本申请的一部分，并且通过援引以其全文并入本文。

本文公开了纤维素酶变体或其活性片段，以及编码所述纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸，其中这些纤维素酶变体或其活性片段具有内切葡聚糖酶活性。本文还公开了组合物，所述组合物包含所述纤维素酶变体或其活性片段；载体和/或宿主细胞，所述载体和/或宿主细胞包含编码所述纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸；和方法，所述方法用于制备和/或使用所述纤维素酶变体或其活性片段和/或含有所述纤维素酶变体或其活性片段的组合物；其中所述纤维素酶变体或其活性片段具有内切葡聚糖酶活性。

纤维素酶是糖苷水解酶，所述糖苷水解酶催化纤维素中β-1,4糖苷键的水解以将其分解成单糖或更短的多糖和寡糖。通常，纤维素酶含有被称为“接头”或“接头肽”的柔性间隔子分开的纤维素结合模块(CBM)和催化结构域。纤维素酶的催化结构域以酶学委员会(EC)和糖苷水解酶(GH)家族系统两者分类。

酶委员会已经鉴定了两类纤维素酶，即内切纤维素酶(其分类为EC3.2.1.4酶，并也称为内切葡聚糖酶)、和外切纤维素酶(其分类为EC3.2.1.91酶，也称为纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶)。内切葡聚糖酶在无定形位点处随机切割内部键，这产生新的链末端，而外切葡聚糖酶从由内切葡聚糖酶产生的暴露链的末端切割2至4个单位。另一方面，GH家族系统基于酶结构和功能对纤维素酶进行分组，产生许多GH家族，包括例如GH家族5、6、7、8、9、10、12、16、18、19、26、44、45、48、51、61和74。

已知纤维素酶可用于例如：洗涤剂组合物中；处理纺织品；作为动物饲料添加剂；在加工纸和纸浆中使纤维平滑，增强排水和脱墨；在食品工业中使从水果和蔬菜中提取和净化汁并使糖化；以及将生物质还原为葡萄糖，然后将该葡萄糖发酵并蒸馏以制备低CO₂纤维素乙醇。

纤维素酶用于纺织工业中通过例如去除绒毛(从纱线或织物表面突出的未缠结的纤维末端)和球粒(pill)(通过一根或多根纤维固定在织物表面上的缠结的纤维束或球)来改善含棉织物的触感和/或外观，并且还有助于防止通过随后的消耗洗涤和磨损循环形成使服装看起来磨损的球粒。该方法被称为“去球(depilling)”或“生物抛光”。纤维素酶还用于赋予含棉牛仔布例如受损的或“石洗的”外观。该方法被称为“生物打磨”，并且已经在很大程度上替代了用于生成消费者所希望的柔软褪色的牛仔布的打磨。

纤维素酶用于洗涤剂组合物中，例如，以增强污垢去除、去除球粒、增亮织物颜色和软化织物。添加纤维素酶的洗涤剂组合物通常还含有其他酶(例如像蛋白酶，使得纤维素酶在这些其他酶存在下稳定是重要的)和其他洗涤剂添加剂(例如像表面活性剂)。如果纤维素酶不稳定，例如蛋白酶将随时间降解纤维素酶，从而抵消与纤维素酶相关的洗涤益处。因此，本领域仍然需要在一种或多种其他酶存在下稳定的纤维素酶(例如像蛋白酶)和/或一种或多种其他洗涤剂组分(例如像表面活性剂)。

附图说明

图1提供了pTTT-pyr2-stce1的质粒图。

图2提供了截短的STCE1-WT纤维素酶的主链折叠的示意图，显示了β亚结构域(以黑色显示)、环亚结构域(浅色线)、α亚结构域(灰黑色)和C末端链。

图3提供了截短的STCE1-WT纤维素酶的表面绘制，显示了发现在β亚结构域(深色)和α亚结构域(中等色)之间形成的沟中存在的底物结合裂隙的视图。

图4提供了三种GH45纤维素酶家族酶结构的结构比较，其中截短的STCE1-WT的示意图以黑色显示，特异腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶的示意图以中灰色显示，以及热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶的示意图以浅灰色显示。

图5A-5C描绘了STCE1-A142P、STCE1-WT和基准纤维素酶在含有蛋白酶的洗涤剂中的长期稳定性。

图6A-6C提供了STCE1-WT纤维素酶及其变体与实例7中描述的其他GH45纤维素酶的MUSCLE多重序列比对。

图7提供了STCE1-WT纤维素酶及其变体与实例7中描述的其他GH45纤维素酶的系统发育树。

图8提供了以下GH45纤维素酶的催化结构域区域的MUSCLE多重序列比对：STCE-1(SEQ ID NO:5)、特异腐质霉(H.insolens)(SEQ ID NO:11)、粗糙脉孢菌(N.crassa)(SEQID NO:14)和太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)120H(SEQ ID NO:17)。

一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：(i)4、20、23、29、32、36、44、51、77、80、87、90、97、98、99、102、112、116、135、136、142、153、154、157、161、163、192、194、204、208、210、212,216、217、221、222、225、227和232；(ii)K4X、G/K20X、A/S23X、F29X、S32X、N/Q36X、K44X、S51X、S77X、N80X、G87X、E90X、P97X、V98X、A99X、T102X、G112X、T116X、S135X、P/S136X、A142X、G/H/S153X、Q154X、S157X、A161X、K163X、L192X、A194X、G204X、V208X、T210X、P212X、Q216X、S217X、S221X、S222X、S225X、K227X和S232X；(iii)X4V、X20N、X23L、X29W、X32D/Y、X36T、X44V、X51T、X77K/M、X80S、X87A、X90A、X97S、X98G、X99E/Y、X102K、X112S/T/V、X116V、X135T、X136E/K/S、X142D/E/P/Q、X153D、X154E、X157D、X161E/P、X163V、X192V、X194S、X204S、X208H/K、X210V、X212S、X216D/E/G/P/S/T/V、X217G/M、X221L/M、X222A、X225K、X227R和X232T；或(iv)K4V、G/K20L、A/S23L、F29W、S32D/Y、N/Q36T、K44V、S51T、S77K/M、N80S、G87A、E90A、P97S、V98G、A99E/Y、T102K、G112S/Y/V、T116V、S135T、P/S136E/K/S、A142D/E/P/Q、G/H/S153D、Q154E、S157D、A161E/P、K163V、L192V、A194S、G204S、V208H/K、T210V、P212S、Q216D/E/G/P/S/T/V、S217G/M、S221L/M、S222A、S225K、K227R和S232T，其中所述变体具有内切葡聚糖酶活性，并且其中所述变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及纤维素酶变体或其活性片段，其中所述变体包含与SEQ ID NO:5、11、14、17、22的氨基酸序列或SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少70％、75％、80％、82％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施例中，纤维素酶变体或其活性片段衍生自选自SEQ ID NO:5、11、14、17和22的亲本多肽或参比多肽。在仍又另一个实施例中，纤维素酶变体或其活性片段是GH45家族纤维素酶。

在一个实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段具有一种或多种改善的性质，所述一种或多种改善的性质选自改善的热稳定性、在一种或多种其他酶存在下的改善的稳定性和在一种或多种其他酶和一种或多种其他洗涤剂组分存在下的改善的稳定性。在另一个实施例中，所述其他酶是蛋白酶和/或所述其他洗涤剂组分是表面活性剂。在一些实施例中，当与亲本多肽或参比多肽相比时，所述改善的性质得到改善。在其他实施例中，该亲本多肽或参比多肽包含与SEQ ID NO:5、11、14、17、22的氨基酸序列或SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少70％、75％、80％、82％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍其他实施例中，亲本多肽或参比多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的氨基酸1-215。

另外的实施例涉及包含所述纤维素酶变体或其活性片段的组合物；包含所述纤维素酶变体或其活性片段的载体和/或宿主细胞；用于制备和/或使用所述变体或其活性片段和/或含有此类变体或其活性片段的所述组合物的方法；其中所述纤维素酶变体或其活性片段具有内切葡聚糖酶活性。

本文所述的纤维素酶变体的特征使其非常适用于洗涤剂组合物、纺织品加工、纸张和纸浆加工以及其他工业应用，例如像，来赋予污垢释放或织物护理益处和/或改善含棉织物的触感和/或外观。

为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。例如，本文未定义的技术和科学术语具有与普通技术人员通常理解的相同的含义(参见，例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第2版，约翰·威利父子出版公司，纽约州1994；和Hale和Marham，哈伯科林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)，哈珀永久出版社，纽约州1991)。

除非上下文另有明确指示，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数引用。

当与数值结合使用时，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围。例如，短语“约6的pH值”是指从5.4至6.6的pH值。

当与洗涤剂或织物护理组合物结合使用时，术语“辅助成分”意指为所希望的特定类型的洗涤剂或织物护理组合物以及产品形式(例如液体、颗粒状、粉末、棒状、糊状、片剂、凝胶、单位剂量、薄片或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选地与用于该组合物中的纤维素酶变体或其活性片段相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“紧密”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。

术语“纤维素酶变体”是指通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸衍生自亲本多肽或参比多肽的重组多肽。纤维素酶变体与亲本多肽可以相差少量的氨基酸残基并且可以通过它们与亲本多肽的一级氨基酸序列同源性/同一性的水平来定义。例如，纤维素酶变体与亲本(或参比)多肽具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。

术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”是指旨在用于洗涤介质(用于清洁弄脏的物体)中的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/配制品可以包括例如：一种或多种表面活性剂、水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、遮蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂、螯合剂、聚合物、泡沫调节剂、香料和增溶剂。

术语“衍生自”涵盖术语“起源于”、“获得自”、“可获得自”、“分离自”和“产生自”，并且通常表示一种指定的材料在另一种指定的材料中找到其起源或具有可以参考另一种指定的材料来描述的特征。

当与纤维素酶变体或其活性片段结合使用时，术语“有效量”是指在特定的应用或洗涤剂或织物护理组合物中实现所希望的内切葡聚糖酶活性水平所需要的纤维素酶变体或其活性片段的量。此类有效量由本领域的普通技术人员容易地确定的，并且是基于许多因素的，例如所使用的具体的纤维素酶变体或其活性片段、应用、清洁组合物的具体组成(包括其中含有的特定蛋白酶)、以及是否需要液体或干的(例如颗粒状、棒状、粉末、固体、液体、片剂、凝胶、糊状、泡沫、薄片或单位剂量)组合物。

术语“内切葡聚糖酶”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖、混合的β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β-1,4键、以及包含纤维素组分的其他植物材料中的1,4-β-D-糖苷键的内切水解。可以根据实例中描述的程序确定内切葡聚糖酶活性。

术语“表达载体”是指包含编码特定多肽的DNA序列的DNA构建体，并且有效地连接至能够在合适的宿主中实现多肽表达的合适的控制序列。这样的控制序列包括影响转录的启动子，控制这种转录的任选的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化入合适的宿主中，载体可以独立于宿主基因组复制和起作用，或者在某些情况下可以整合入基因组本身。

术语“织物”是指例如机织物、针织物和非机织材料，以及可以转化成例如纱线和机织物、针织物和非机织材料的短纤维和长丝。该术语涵盖从天然的以及合成的(例如制造的)纤维制成的材料。

术语“织物护理组合物”或“织物护理配制品”是指当被添加到洗涤介质中时，将从织物上去除球粒和/或绒毛；增亮织物颜色；和/或软化织物的含有本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的组合物/配制品。

术语“GH45家族”是指一种多肽，所述多肽根据以下文献被分类为糖苷水解酶家族45：Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列相似性对糖基水解酶进行分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating thesequence-based classification of glycosyl hydrolases[更新基于序列的糖基水解酶分类],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，并且基于碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database，CAZy，URL:http://afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html)中的结构和功能关系CM进行分类。

术语“宿主细胞”通常是指用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。经转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达所希望的蛋白质变体。在编码蛋白质变体预成型(pre-form)或形式(pro-form)的载体的情况下，当表达时，这些变体典型地从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。

术语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据杂交在其下测量的条件的“严格”度来分类。严格度可以是基于例如结合复合物或探针的核酸的解链温度(T_m)。例如，“最大严格”典型地发生在约T_m-5℃(低于探针的T_m 5℃)；“高严格”发生在低于T_m约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的T_m约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于T_m约20℃-25℃。可替代地，或另外地，杂交条件可以基于杂交的盐或离子强度条件，和/或一次或多次严格洗涤，例如：6X SSC＝非常低严格；3X SSC＝低至中严格；1X SSC＝中严格；以及0.5X SSC＝高严格。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常希望使用相对严格的条件来形成杂交(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。

在将核酸序列插入细胞中的背景下，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化手段包括本领域已知的原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA等等。(参见，Chang和Cohen[1979]，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]168:111-115；Smith等人，[1986]，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]51:634；以及Ferrari等人在Harwood，Bacillus[芽孢杆菌属]，普莱南出版公司，第57-72页，1989中的评论文章)。

当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸和细胞)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸和细胞)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(以摩尔计)。优选地，将感兴趣的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。

术语“其他洗涤剂组分”是指添加到洗涤剂组合物或配制品中的非酶组分，所述非酶组分例如表面活性剂、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、遮蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂、螯合剂、聚合物、泡沫调节剂、香料和增溶剂。

术语“其他酶”是指添加到洗涤剂组合物中的第二、第三、第四等酶，其中第一酶是本文所述的纤维素酶变体或其活性片段。其他酶的实例包括例如：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、短梗霉多糖酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、第二纤维素酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木糖苷酶、及其组合。

术语“多核苷酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码特定的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5'至3'取向呈现。

术语“多肽”是指包含通过肽键连接的多个氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地使用。蛋白质可以任选地被修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊二烯化和磺化)以增加功能性。当此类氨基酸序列展现出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基-至-羧基端取向(即N→C)表示的氨基酸序列。

术语“重组”是指例如像通过以下被修饰以改变其序列或表达特征的遗传材料(即核酸、它们编码的多肽、以及包含此类多核苷酸的载体和细胞)：使编码序列突变以产生改变的多肽，将编码序列融合到另一基因的编码序列，将基因置于不同启动子的控制下，在异源生物体中表达基因，以降低或升高的水平表达基因，和以与其天然表达谱不同的方式有条件地或组成地表达基因。通常，基于此的重组核酸、多肽和细胞已被人为操纵，这样使得它们与自然界中发现的相关的核酸、多肽和/或细胞不相同。

术语“第二纤维素酶”是指添加到洗涤剂组合物中的第二纤维素酶，其中第一纤维素酶是本文所述的纤维素酶变体或其活性片段。该第二纤维素酶包括例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶及其组合。

术语“信号序列”是指与多肽的N末端部分结合的并且促进成熟形式的蛋白质从细胞中分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。

术语“表面活性剂”是指在本领域中通常被认为具有表面活性质量的任何化合物。表面活性剂可以包括例如阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物，其在本文中进一步描述。

术语“热稳定性(thermostability)”和“热稳定的(thermostable)”是指在清洁、纺织品处理或其他过程期间盛行的条件下，例如当暴露于升高的温度时，暴露于升高的温度经给定的时间段之后，纤维素酶变体保留指定量的内切葡聚糖酶活性。在一些实施例中，在暴露于升高的温度(例如至少约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃)经给定的时间段(例如至少约10分钟、约30分钟、约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)之后，一种或多种纤维素酶变体保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的内切葡聚糖酶活性。

术语“变体多核苷酸”是指编码纤维素酶变体、与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。例如，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性。

关于多肽，术语“野生型”或“亲本”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“野生型”或“亲本”是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。

术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如多肽或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和多肽序列或野生型序列的修饰)。

关于多肽，术语“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多肽，以及在一个或多个氨基酸位置处包括一个或多个人造的取代、插入或缺失的天然存在的或合成的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“参比”是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸，以及在一个或多个核苷处包括一个或多个人造的取代、插入或缺失的天然存在的或合成的多核苷酸。例如，编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。

本文所述的氨基酸取代使用一个或多个以下命名法：位置或起始氨基酸:位置:一个或多个取代的氨基酸。对仅一个位置的提及涵盖可以存在于参比多肽、亲本或野生型分子中在该位置处的任何起始氨基酸，以及此类起始氨基酸可以被其取代的任何氨基酸(即，氨基酸取代排除了此类参比多肽、亲本或野生型分子的起始氨基酸)。对经取代的氨基酸或起始氨基酸的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干个经取代的氨基酸或若干个起始氨基酸。例如，X130A/N-209-213代表三个氨基酸取代组合，其中X是在位置130处的可以被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)取代的任何起始氨基酸；209代表任何起始氨基酸可以被不是起始氨基酸的氨基酸取代的位置；并且213代表任何起始氨基酸可以被不是起始氨基酸的氨基酸取代的位置。通过另外的实例，E/Q/S101F/G/H/T/V代表在位置101处的五个可能的取代，其中该起始氨基酸谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)可以被苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)取代。

可以使用已知的程序(如BLAST、ALIGN和CLUSTAL)使用标准参数确定序列同一性。(参见，例如，Altschul等人，[1990]J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410；Henikoff等人，[1989]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89:10915；Karin等人，[1993]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90:5873；和Higgins等人，[1988]Gene[基因]73:237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information(NCBI))公开获得。也可以使用FASTA(Pearson等人，[1988]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444-2448)来搜索数据库。两种多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽实质上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。另一个用于比较多个蛋白质序列的有用的算法是来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))的MUSCLE程序(Robert C.Edgar，MUSCLE:Multi sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多重序列比对]，Nucleic Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)。

一个实施例涉及一种包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，所述氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：(i)4、20、23、29、32、36、44、51、77、80、87、90、97、98、99、102、112、116、135、136、142、153、154、157、161、163、192、194、204、208、210、212,216、217、221、222、225、227和232；(ii)K4X、G/K20X、A/S23X、F29X、S32X、N/Q36X、K44X、S51X、S77X、N80X、G87X、E90X、P97X、V98X、A99X、T102X、G112X、T116X、S135X、P/S136X、A142X、G/H/S153X、Q154X、S157X、A161X、K163X、L192X、A194X、G204X、V208X、T210X、P212X、Q216X、S217X、S221X、S222X、S225X、K227X和S232X；(iii)X4V、X20N、X23L、X29W、X32D/Y、X36T、X44V、X51T、X77K/M、X80S、X87A、X90A、X97S、X98G、X99E/Y、X102K、X112S/T/V、X116V、X135T、X136E/K/S、X142D/E/P/Q、X153D、X154E、X157D、X161E/P、X163V、X192V、X194S、X204S、X208H/K、X210V、X212S、X216D/E/G/P/S/T/V、X217G/M、X221L/M、X222A、X225K、X227R和X232T；或(iv)K4V、G/K20L、A/S23L、F29W、S32D/Y、N/Q36T、K44V、S51T、S77K/M、N80S、G87A、E90A、P97S、V98G、A99E/Y、T102K、G112S/Y/V、T116V、S135T、P/S136E/K/S、A142D/E/P/Q、G/H/S153D、Q154E、S157D、A161E/P、K163V、L192V、A194S、G204S、V208H/K、T210V、P212S、Q216D/E/G/P/S/T/V、S217G/M、S221L/M、S222A、S225K、K227R和S232T，其中所述变体具有内切葡聚糖酶活性，并且所述变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:5的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及一种包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，所述氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：(i)4、20、23、29、32、36、44、51、77、80、87、90、97、98、99、102、112、116、135、136、153、154、157、161、163、192、194、204、208、210、212、217、221、222、225、227和232；(ii)K4X、G/K20X、A/S23X、F29X、S32X、N/Q36X、K44X、S51X、S77X、N80X、G87X、E90X、P97X、V98X、A99X、T102X、G112X、T116X、S135X、P/S136X、G/H/S153X、Q154X、S157X、A161X、K163X、L192X、A194X、G204X、V208X、T210X、P212X、S217X、S221X、S222X、S225X、K227X和S232X；(iii)X4V、X20N、X23L、X29W、X32D/Y、X36T、X44V、X51T、X77K/M、X80S、X87A、X90A、X97S、X98G、X99E/Y、X102K、X112S/T/V、X116V、X135T、X136E/K/S、X153D、X154E、X157D、X161E/P、X163V、X192V、X194S、X204S、X208H/K、X210V、X212S、X217G/M、X221L/M、X222A、X225K、X227R和X232T；或(iv)K4V、G/K20L、A/S23L、F29W、S32D/Y、N/Q36T、K44V、S51T、S77K/M、N80S、G87A、E90A、P97S、V98G、A99E/Y、T102K、G112S/Y/V、T116V、S135T、P/S136E/K/S、G/H/S153D、Q154E、S157D、A161E/P、K163V、L192V、A194S、G204S、V208H/K、T210V、P212S、S217G/M、S221L/M、S222A、S225K、K227R和S232T，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且其中该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。

另一个实施例涉及纤维素酶变体或其活性片段，其中所述变体包含与SEQ ID NO:5、11、14、17、22的氨基酸序列或SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少70％、75％、80％、82％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

另一个另外的实施例涉及一种包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，所述氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：(i)142和216；(ii)A142X和Q216X；(iii)X142D/E/P/Q和X216D/E/G/P/S/T/V；或(iv)A142D/E/P/Q和Q216D/E/G/P/S/T/V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在选自142和216的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。另一个仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在选自A142X和Q216X的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：X142D、X142E、X142P、X142Q、X216D、X216E、X216G、X216P、X216S、X216T和X216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。又甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在选自以下的一个或多个位置处的取代：A142D、A142E、A142P、A142Q、Q216D、Q216E、Q216G、Q216P、Q216S、Q216T和Q216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。仍甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置(i)142、(ii)216、或(iii)142和216处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。

另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置142处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置142X处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:5的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置X142D、X142E、X142P或X142Q处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。又甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置A142D、A142E、A142P或A142Q处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。

另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置216处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置Q216X处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:5的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置X216D、X216E、X216G、X216P、X216S、X216T或X216V处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。又甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置Q216D、Q216E、Q216G、Q216P、Q216S、Q216T或Q216V处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。

在另一个实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置A142X和Q216X处的取代，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置142选自X142D、X142E、X142P和X142Q，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置216选自X216D、X216E、X216G、X216P、X216S、X216T和X216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:5的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍又另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的纤维素酶变体或其活性片段，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置142选自A142D、A142E、A142P和A142Q，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。在又另一个实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置216选自Q216D、Q216E、Q216G、Q216P、Q216S、Q216T和Q216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。在另外的实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置142选自X142D、X142E、X142P和X142Q，并且位置216选自X216D、X216E、X216G、X216P、X216S、X216T和X216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。在仍另外的实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含在位置142和216处的取代，其中位置142选自A142D、A142E、A142P和A142Q，并且位置216选自Q216D、Q216E、Q216G、Q216P、Q216S、Q216T和Q216V，其中该变体具有内切葡聚糖酶活性，并且该变体或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相对应来编号。

在另一个实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自选自SEQ IDNO:5、11、14、17和22的亲本多肽或参比多肽。在另外的实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自选自SEQ ID NO:11、14、17和22的亲本多肽或参比多肽。在又另一个实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自SEQ ID NO:5的亲本多肽。在仍另外的实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自SEQ ID NO:5的氨基酸1-215的参比多肽。在甚至仍另外的实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自SEQID NO:11的亲本多肽。在仍另一个实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自SEQ ID NO:14的亲本多肽。在又仍另一个实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段衍生自SEQ ID NO:17或22的亲本多肽。

在另外的实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段具有一种或多种改善的性质，所述一种或多种改善的性质选自改善的热稳定性、在一种或多种其他酶存在下的改善的稳定性和在一种或多种其他酶和一种或多种其他洗涤剂组分存在下的改善的稳定性。在另一个实施例中，所述其他酶是蛋白酶和/或所述其他洗涤剂组分是表面活性剂。在一些实施例中，当与亲本多肽或参比多肽相比时，所述改善的性质得到改善。在其他实施例中，该亲本多肽包含与SEQ ID NO:5、11、14、17或22的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、82％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍其他实施例中，该亲本多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施例中，该亲本多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在又另外的实施例中，该亲本多肽包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍另外的实施例中，该亲本多肽包含与SEQ ID NO:17或22的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在又其他实施例中，该参比多肽包含与SEQID NO:5的氨基酸1-215具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍其他实施例中，该亲本多肽包含SEQ ID NO:5。在又其他实施例中，该亲本多肽包含SEQ ID NO:11。在仍其他实施例中，该亲本多肽包含SEQ ID NO:14。在甚至仍其他实施例中，该亲本多肽包含SEQ ID NO:17或22。在又仍其他实施例中，该参比多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-215。

在其他实施例中，该改善的性质是改善的热稳定性，并且该变体或其活性片段具有大于1或1.1的热PI。在仍其他实施例中，该改善的性质是在一种或多种蛋白酶存在下的改善的稳定性，并且当在所述蛋白酶存在下测试所述变体或其活性片段的稳定性时，所述变体或其活性片段具有大于1、1.1、1.5或2.0的PI。在甚至另外的实施例中，该改善的性质是在一种或多种蛋白酶和一种或多种其他洗涤剂组分存在下的改善的稳定性，并且其中当在所述蛋白酶和所述其他洗涤剂组分存在下测试所述变体或其活性片段的稳定性时，所述变体或其活性片段具有大于1、1.1、1.5、2.0或2.5的PI。在又另外的实施例中，PI根据实例1的纤维素酶活性测定进行测量。

在一个其他实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列或SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少70％、75％、80％、82％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施例中，该述纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性，条件是所述取代不是A142P或Q216T，并且进一步的条件是(i)当所述取代是Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含CN 103343111-0003、CN 103343111-0005、AGY80101、US 20150299682-0004或WO2007071818-0012；或(ii)当所述取代是Q216G时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 2014138983-0859。在又另外的实施例中，该纤维素酶变体或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性，条件是所述取代不是A142P并且不是Q216T，并且进一步的条件是(i)当所述取代是Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含CN 103343111-0003、CN 103343111-0005、AGY80101、US 20150299682-0004或WO 2007071818-0012；或(ii)当所述取代是Q216G时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 2014138983-0859。在仍另外的实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列同一性，条件是(i)当所述取代是A142P时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 2012089024-0002、WO 9804663-AAW46618、GB 2479462-AZN28533、WO2007071820-0019、CN 103343111-0005、CN 103343111-0003、US 20150299682-0004、AGY80101、KOP50759或CAD56665；ii)当所述取代是Q216T时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 9743409-0066；或iii)当所述取代是Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含CN 103343111-0005、CN 103343111-0003、US 20150299682-0004或AGY80101。在又仍另一个实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，条件是(i)当所述取代是A142P时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 2012089024-0002、WO 9804663-AAW46618、GB 2479462-AZN28533、WO 2007071820-0019或CN 103343111-0005；或ii)当所述取代是Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含CN 103343111-0005。在甚至仍另外的实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另外的实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少82％的氨基酸序列同一性，条件是(i)当所述取代是A142P时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含US 20150299682-0004、CN103343111-0005、AGY80101、WO 2012089024-0004、WO 2012089024-0002、WO 2004053039-0003、XP_003651003、CDF76465或XP_001903789；ii)当所述取代是A142G时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含XP_001226436；iii)当所述取代是Q216T时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含WO 9743409-0066；或iv)当所述取代是Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含US 20150299682-0004、CN 103343111-0005或AGY80101。在仍另外的实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少85％的氨基酸序列同一性，条件是(i)当所述取代是A142P或Q216S时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含US 20150299682-0004、CN 103343111-0005或AGY80101；或ii)当所述取代是A142G时，所述纤维素酶变体或其活性片段不包含XP_001226436。在又甚至仍另外的实施例中，该纤维素酶变体其活性片段包含与SEQ ID NO:5的氨基酸1-215具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段是GH45家族纤维素酶。在一些实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段是分离的。

另外的实施例涉及编码本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包含在表达载体中，该表达载体包含在异源生物体中。该多核苷酸可以有效地连接至调控元件(例如，启动子、终止子和增强子)以辅助表达本文所述的编码的纤维素酶变体或其活性片段。在一些实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段在异源生物中表达为分泌的多肽，在这种情况下，组合物和方法涵盖用于在异源生物体中将变体或其活性片段表达为分泌多肽的方法。

编码本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的DNA可以从公开的序列化学合成或直接从具有该基因的宿主细胞(例如通过cDNA文库筛选或PCR扩增)中获得。

另外的实施例涉及生产本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的方法，这些方法包括：用包含编码纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸的表达载体稳定地转化宿主细胞；在合适的条件下培养该经转化的宿主细胞，以产生纤维素酶变体或其活性片段；和回收该纤维素酶变体或其活性片段。

在其他实施例中，将本文所述的纤维素酶变体或其活性片段融合至信号肽用于指导变体或其活性片段的胞外分泌。例如，在某些实施例中，信号肽是本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的天然信号肽。在其他实施例中，信号肽是非天然信号肽，例如枯草芽孢杆菌AprE信号肽。

在一些实施例中，宿主细胞，其中本文所述的纤维素酶变体或其活性片段在异源生物体(即除了是大孢圆孢霉属(Staphylotrichum)物种之外的生物体)中表达。示例性异源生物体包括例如：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus(先前为芽孢杆菌属)stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(S.lividans)、鼠灰链霉菌(S.murinus)、荧光假单孢菌(P.fluorescens)、施氏假单胞菌(P.stutzerei)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、富养罗尔斯通菌(R.eutropha)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、乳酸乳球菌(L.lactis)、大肠杆菌(E.coli)、酵母(例如像酵母菌属物种(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)，卢克诺文思金孢子菌(C.lucknowense)和丝状真菌例如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、灰腐质霉(H.grisea)、特异腐质霉和里氏木霉(T.reesei.)。用于将核酸转化到这些生物体中的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如EP 238023中。用于转化木霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人，2011,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121。

在一些实施例中，该多核苷酸编码如下纤维素酶变体或其活性片段，该纤维素酶变体或其活性片段与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，将多核苷酸密码子优化用于在不同宿主中表达，突变以引入克隆位点，或另外改变以添加功能性。

在一些实施例中，表达载体可以在异源宿主细胞中提供，该异源宿主细胞适合用于表达本文所述的纤维素酶变体或其活性片段或者适合用于在将该表达载体引入合适的宿主细胞之前繁殖该表达载体。在一些实施例中，通过标准分子克隆技术将多核苷酸包含在表达盒中和/或克隆到合适的表达载体中。此类表达盒或载体含有辅助转录起始和终止的序列(例如启动子和终止子)，并且通常含有可选择标记。

在一些实施例中，编码纤维素酶变体或其活性片段的多核苷酸在特定的杂交条件下与SEQ ID NO:3的多核苷酸或其互补序列杂交。术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。术语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据杂交在其下测量的条件的“严格”度来分类。严格度可以是基于例如结合复合物或探针的核酸的解链温度(T_m)。例如，“最大严格”典型地发生在约T_m-5℃(低于探针的T_m 5℃)；“高严格”发生在低于T_m约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的T_m约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于T_m约20℃-25℃。可替代地，或另外地，杂交条件可以基于杂交的盐或离子强度条件，和/或一次或多次严格洗涤，例如：6X SSC＝非常低严格；3X SSC＝低至中严格；1X SSC＝中严格；以及0.5X SSC＝高严格。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常希望使用相对严格的条件来形成杂交(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。

另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种纤维素酶变体或其活性片段的组合物。在另一个实施例中，该组合物选自酶组合物、洗涤剂组合物和织物护理组合物。在一些实施例中，该组合物是酶组合物。在其他实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。在仍其他实施例中，该组合物是织物护理组合物。在又其他实施例中，该洗涤剂组合物是衣物洗涤剂。在仍其他实施例中，该衣物洗涤剂选自重垢液体(HDL)衣物洗涤剂和重垢干燥(HDD)颗粒状衣物洗涤剂。

在一些另外的实施例中，该组合物呈选自以下的形式：粉末、液体、颗粒状、棒状、固体、半固体、凝胶、糊状、乳剂、片剂、胶囊、单位剂量、薄片和泡沫。在甚至另外的实施例中，该组合物呈选自以下的形式：液体、粉末、颗粒状固体、片剂、薄片和单位剂量。在一些实施例中，本文所述的组合物以单位剂量形式提供，包括片剂、胶囊、药袋、小袋、薄片和多室袋。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供成分的控制释放。合适的单位剂量和控释形式是本领域已知的(参见例如EP 2100949、EP2100947、WO 02/102955、WO 04/111178、WO 2013/165725、以及US 4,765,916和4,972,017)。在一些实施例中，单位剂量形式由用水溶性膜或水溶性小袋包裹的片剂提供。

在又甚至另外的实施例中，该组合物含有磷酸盐或不含磷酸盐和/或含有硼或不含硼。在仍其他实施例中，该组合物含有磷酸盐。在又仍其他实施例中，该组合物不含磷酸盐。在甚至仍另外的实施例中，该组合物含有硼。在又甚至仍另外的实施例中，该组合物不含硼。

在又其他实施例中，该组合物进一步包含(i)一种或多种其他酶，该一种或多种其他酶选自：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、软骨素酶、角质酶、内切β-甘露聚糖酶、外切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、短梗霉多糖酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、第二纤维素酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；(ii)一种或多种表面活性剂；(iii)一种或多种选自钙和锌的离子；(iv)一种或多种辅助成分；(v)一种或多种稳定剂；(vi)从约0.001％至约5.0重量％的本文所述的维素酶变体或其活性片段；(vii)一种或多种漂白剂；或(viii)它们的组合。

在仍另外的实施例中，该组合物包含一种或多种其他酶。在又仍另外的实施例中，该一种或多种其他酶选自：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、软骨素酶、角质酶、内切β-甘露聚糖酶、外切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、短梗霉多糖酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、第二纤维素酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另外的实施例中，本文所述的组合物进一步包含蛋白酶、甘露聚糖酶和/或淀粉酶。

在一些实施例中，该组合物进一步包含一种或多种表面活性剂。在一些其他实施例中，该表面活性剂选自非离子、两性的、半极性、阴离子、阳离子、两性离子及其组合和混合物。在又仍其他实施例中，该表面活性剂选自阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物。在一些实施例中，该组合物包含按组合物的重量计从约0.1％至约60％、约1％至约50％或约5％至约40％的表面活性剂。示例性表面活性剂包括但不限于十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4、月桂醇醚硫酸钠(例如Steol CS-370)、氢化椰油酸钠、C₁₂乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如Nacconol 90G)、及其组合和混合物。阴离子表面活性剂包括但不限于直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。非离子表面活性剂包括但不限于醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如，如WO 92/06154中所述)、脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如TWEEN)、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、聚氧乙烯醚(例如TRITON和BRIJ)、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对-叔辛基苯酚或辛基苯基-环氧乙烷缩合物(例如NONIDET P40)、环氧乙烷与脂肪醇的缩合物(例如LUBROL)、聚氧乙烯壬基酚、聚亚烷基二醇(SYNPERONIC F108)、糖基表面活性剂(例如吡喃葡萄糖苷、硫代吡喃葡萄糖苷)、及其组合和混合物。

在另外的实施例中，本文公开的洗涤剂组合物进一步包含表面活性剂混合物，包括但不限于5％-15％阴离子表面活性剂、<5％非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、膦酸酯、皂、酶、香料、丁基苯基甲基丙酸酯、香叶醇、沸石、聚羧酸酯、己基肉桂醛、柠檬烯、阳离子表面活性剂、香茅醇和苯并异噻唑啉酮。

在其他实施例中，该组合物进一步包含一种或多种钙离子和/或锌离子。

在仍其他实施例中，该组合物进一步包含一种或多种辅助成分。在又其他实施例中，辅助成分选自：漂白活化剂、漂白催化剂、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构弹性剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、溶剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、香料、颜料和pH控制剂(参见例如US 6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014；和5,646,101)。

在另一个实施例中，该组合物进一步包含一种或多种稳定剂。在另一个实施例中，该稳定剂选自钙和/或镁离子的水溶性来源；多糖；和无机二价金属盐，包括碱土金属，如钙盐。在一些实施例中，本文使用的酶通过在成品组合物中存在以下这些来稳定：锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。适合的低聚糖和多糖(例如糊精)的实例是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，根据需要还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛来进一步改善稳定性。

在又另一个实施例中，该组合物进一步包含有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段。在一些实施例中，纤维素酶变体或其活性片段的有效量是按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。在其他实施例中，纤维素酶变体或其活性片段的有效量是从约0.001％至约5.0重量百分比的组合物。在仍其他实施例中，纤维素酶变体或其活性片段的有效量是从约0.001％至约4.5重量百分比的组合物。在仍又其他实施例中，纤维素酶变体或其活性片段的有效量是从约0.001％至约4.0重量百分比的组合物。在又甚至其他实施例中，纤维素酶变体或其活性片段的有效量是从约0.001％至约3.5、3.6、3.7、3.8或3.9重量百分比的组合物。

在甚至仍另外的实施例中，该组合物进一步包含一种或多种漂白剂。在又另一个实施例中，该漂白剂选自一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可以包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，但是在一些其他实施例中，该盐被包被。合适的盐包括例如描述于EP 2100949中的那些。

在一些实施例中，本文所述的组合物进一步包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系、络合剂、聚合物、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、荧光增白剂、织物调理剂和香料。

在一些实施例中，本文所述的组合物进一步包含按组合物的重量计从约1％、从约3％至约60％或从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂可以包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；连同聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinicacid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸及其可溶性盐。

在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾等)。任何适合的助洗剂可用于本文所述的组合物，包括本领域已知的那些(参见例如EP 2100949)。

在甚至另外的实施例中，组合物的pH为中性至碱性。典型地本文所述的衣物组合物被配制使得在水性条件下使用期间，洗涤水将具有从约3.0至约11的pH。液体产品典型地被配制成具有从约5.0至约9.0的净pH。颗粒状产品典型地被配制成具有从约8.0至约11.0的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。

术语“颗粒状组合物”是指离散的固体、宏观颗粒的聚集物。由于其小的颗粒尺寸，粉末是特殊类别的颗粒状材料，这使它们更具有粘性并更容易悬浮。

全世界典型的洗涤溶液中的洗涤剂组合物的浓度从洗涤剂组合物的小于约800ppm(“低洗涤剂浓度地理位置”)(例如在日本为约667ppm)变化至在约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度地理位置”)(例如在美国为约975ppm和在巴西为约1500ppm)，变化至大于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”)(例如在欧洲为约4500ppm至约5000ppm，在高泡沫磷酸盐助洗剂地理位置为约为6000ppm)。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物可以在从约10℃至约60℃、或从约20℃至约60℃、或从约30℃至约60℃、从约40℃至约60℃、从约40℃至约55℃、或在10℃至60℃内的所有范围的温度下被利用。在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物在“冷水洗涤”中在从约10℃至约40℃、或从约20℃至约30℃、从约15℃至约25℃、从约15℃至约35℃、或在10℃至40℃内的所有范围的温度下使用。

作为另外的实例，不同的地理位置典型地具有不同的水硬度。通常按照颗粒/加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份/百万份(将份/百万份转化为颗粒/美国加仑是将ppm#除以17.1等于颗粒/加仑)的硬度矿物。

表II.水硬度水平

水	颗粒/加仑	份/百万份
			软	小于1.0	小于17
略硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			非常硬	大于10.5	大于180

典型地，欧洲水硬度大于约10.5(例如约10.5至约20.0)颗粒/加仑混合的Ca²⁺/Mg² ⁺(例如约15颗粒/加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺)。典型地，北美水硬度大于日本水硬度、但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在约3至约10颗粒之间、约3至约8颗粒或约6颗粒。典型地，日本水硬度低于北美水硬度，通常小于约4，例如约3颗粒/加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含蛋白酶。在一些实施例中，组合物包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％的蛋白酶。在另一个实施例中，清洁组合物包含按组合物的重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一些实施例中，蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，蛋白酶是是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，蛋白酶是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性的另外的蛋白酶包括但不限于描述于以下中的那些：WO 9221760、WO 9523221、WO 2008010925、WO 09149200、WO09149144、WO 09149145、WO 10056640、WO 10056653、WO 20100566356、WO 11072099、WO201113022、WO 11140364、WO 12151534、WO 2015038792、WO 2015089447、WO 2015089441、WO 2015/143360、WO 2016 061438、WO 2016069548、WO 2016069544、WO 2016069557、WO2016069563、WO 2016 069569、WO 2016069552、WO 2016145428、WO 2016183509、美国公开号20080090747、US 5801039、US 5340735、US 5500364、US 5855625、RE34606、US 5955340、US 5700676、US 6312936、US 6482628、US 8530219、美国临时申请号62/331282、62/332417、62/343618和62/351649、以及国际申请号PCT/US 2016/038245，以及描述于以下文献中的金属蛋白酶：WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO 1999 034003、WO2007044993、WO 2009058303、WO 2009058661、WO 2014071410、WO 2014 194032、WO2014194034、WO 2014194054和WO 2014 194117。示例性蛋白酶还包括但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛起源的)和描述于WO 8906270中的镰刀菌属(Fusarium)蛋白酶。

示例性商业蛋白酶包括但不限于

MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、

OXP、PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM、PREFERENZ^TM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZ^TM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZ^TM蛋白酶(例如P1000)、/>

和PURAFAST^TM(杜邦公司(DuPont))；/>

ULTRA、

16L、

ULTRA、/>

DURAZYM^TM、

LIQUANASE

PROGRESS/>

和

(诺维信公司)；BLAP^TM和BLAP^TM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGY^TMPRO 104L(BASF)、和KAP(嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶(花王公司))。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含合适的淀粉酶。在一个实施例中，该组合物包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包含在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于描述于以下中的淀粉酶：GB 1296839、WO 91 00353、WO 9402597、WO 94183314、WO 9510603、WO 9526397、WO9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO 9623874、WO 9630481、WO 9710342、WO 9741213、WO9743424、WO 98 13481、WO 9826078、WO 9902702、WO 9909183、WO 9919467、WO 9923211、WO9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO 9943794、WO 9946399、WO 0029560、WO 0060058、WO00 60059、WO 0060060、WO 0114532、WO 0134784、WO 0164852、WO 0166712、WO 0188107、WO0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO 0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO2005001064、WO 2005003311、WO 2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO2006002643、WO 2006012899、WO 2006012902、WO 2006 031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO 2006136161、WO 2008 000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO 2008112459、WO 2009 061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO 2009149419、WO 2010 059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO 2010 115021、WO 10115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO 2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO2011082429、WO 2011087836、WO 2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO 2014164777和WO 2015077126。示例性商业淀粉酶包括但不限于

AMPLIFY/>

BAN^TM、/>

ULTRA、

STAINZYME/>

STAINZYME/>

和STAINZYME

(诺维信公司)；EFFECTENZ^TMS 1000、POWERASE^TM、PREFERENZ^TMS 100、PREFERENZ^TMS110、EXCELLENZ^TMS 2000、/>

和/>

P(杜邦公司)。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含合适的果胶降解酶。如本文所使用的，“一种或多种果胶降解酶”涵盖阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切-聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切-聚-α-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)、果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)、果胶酯酶(EC 3.2.1.11)、果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)、外切-聚半乳糖醛酸裂合酶(EC 4.2.2.9)和半纤维素酶(如内切-1,3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、木聚糖-1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)。果胶降解酶是上文提及的酶活性物的天然混合物。因此，果胶酶包括水解果胶甲酯键的果胶甲基酯酶、切割半乳糖醛酸分子之间的糖苷键的聚半乳糖醛酸酶、以及对果胶酸起作用以带来α-1,4糖苷键的非水解性切割以形成半乳糖醛酸的不饱和衍生物的果胶反式消除酶(transeliminase)或裂合酶。

合适的果胶降解酶包括植物、真菌或微生物起源的那些。在一些实施例中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，果胶降解酶是碱性果胶降解酶，即在从约7.0至约12的pH具有其最大活性的至少10％、至少25％或至少40％的酶活性的酶。在某些其他实施例中，果胶降解酶是在从约7.0至约12的pH具有其最大活性的酶。碱性果胶降解酶由嗜碱微生物产生，这些嗜碱微生物是例如细菌、真菌和酵母微生物，如芽孢杆菌属物种。在一些实施例中，如JP 56131376和JP 56068393中所述，微生物是坚强芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。碱性果胶分解酶可以包括但不限于半乳糖醛酸-1,4-α-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、聚-半乳糖醛酸酶活性(EC 3.2.1.15)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)及其同工酶。可以通过欧文氏菌属(Erwinia)物种产生碱性果胶分解酶。在一些实施例中，如JP 59066588、JP 63042988和World J.Microbiol.Microbiotechnol.[世界微生物与生物技术杂志](8,2,115-120)1992中所述，碱性果胶分解酶由菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、梨火疫病病原菌(E.amylovora)、草生欧文氏菌(E.herbicola)和溶解肠杆菌(E.dissolvens)产生。在某些其他实施例中，如在JP 73006557和Agr.Biol.Chem.[农业生物化学](1972),36(2)285-93中所公开的，碱性果胶酶由芽孢杆菌属物种产生。在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的果胶降解酶。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含合适的甘露聚糖酶。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO 2016/007929；USPN 6,566,114、6,602,842、和6,440,991；以及2016年11月7日提交的国际专利申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于

(诺维信公司)和EFFECTENZ^TMM1000、/>

M 100、/>

和PURABRITE^TM(杜邦公司)。

在一些另外的实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含合适的第二纤维素酶。合适的第二纤维素酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。合适的第二纤维素酶包括但不限于特异腐质霉纤维素酶(参见例如US 4,435,307)。尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶(参见例如EP0495257)。可商购的第二纤维素酶包括但不限于

和

PREMIUM(诺维信公司A/S，丹麦)、/>

(杜邦公司)和KAC-500(B)^TM(花王公司)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N-末端的一部分缺失(参见例如US 5,874,276)。在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。

在仍另外的实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含合适的脂肪酶。在一些实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的，例如像：绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258068和EP 305216)；米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶(参见例如EP 238023)；假丝酵母属(Candida)脂肪酶，例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如，EP 214761)；假单胞菌脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP 218272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，(1993)Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260]；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶[参见例如，JP 64/744992]；以及短小芽胞杆菌(B.pumilus)脂肪酶[参见例如，WO 91/16422])。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(P.camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，[1991]Gene[基因]103:61-67)；白地霉(G.candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，[1989]J.Biochem.[生物化学杂志]，106:383-388)；以及各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，[1991]Gene[基因]109:117-113)；雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，[1992]Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719)和米根霉脂肪酶。其他类型的合适的脂肪分解酶包括角质酶，例如衍生自门多萨假单胞菌(P.mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和衍生自豌豆根腐镰孢菌(F.solanipisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASE^TM、LUMAFAST^TM和LIPOMAX^TM(杜邦公司)；

和/>

ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P^TM(天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd))。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)的组合。在一些替代性实施例中，氧化酶与氧组合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，该洗涤剂组合物还包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含另外的酶，包括但不限于过水解酶(参见例如WO 05/056782)。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂可以包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物的重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。

在一些仍另外的实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物(例如聚对苯二甲酸)、粘土例如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含至少一种抗再沉积剂。在一些实施例中，该抗再沉积剂是非离子表面活性剂，例如像描述于EP 2100949中。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物包含按组合物的重量计从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。

在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含一种或多种硅酸盐。在一些这样的实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物包含按组合物的重量计从约1％至约20％或从约5％至约15％的硅酸盐。

在又另外的实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含一种或多种分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。

在又另外的实施例中，本文所述的洗涤剂组合物进一步包含一种或多种漂白活化剂和/或漂白催化剂。漂白活化剂典型地是在60℃及以下的温度在清洁过程中增强漂白作用的有机过酸前体。适合本文使用的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子(尤其是从约2至约4个碳原子)的脂肪族过氧羧酸的化合物和/或任选地取代的过氧苯甲酸。合适的漂白活化剂包括例如描述于EP 2100949中的那些。漂白催化剂典型地包括例如，锰三氮杂环壬烷及相关络合物、和钴、铜、锰、和铁络合物，以及描述于以下中的那些：US 4,246,612、5,227,084、4,810,410；和WO 99/06521和EP 2100949。

在一些实施例中，相比于在被磨损之前不暴露于本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的弄脏的织物，将织物在被磨损之前暴露于本文所述的纤维素酶变体或其活性片段使得在第一次和/或随后的两次、三次或更多次洗涤循环中，随后粘附到织物上的污垢的去除得到改善。在其他实施例中，相比于随后不暴露于本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的弄脏的织物，将织物在被磨损之后暴露于本文所述的纤维素酶变体或其活性片段使得在第一次和/或随后的两次、三次或更多次洗涤循环中，随后粘附到织物上的污垢的去除得到改善。在仍另外的实施例中，本文所述的纤维素酶变体或其活性片段可用于洗涤剂组合物、纺织品整理加工或纸和纸浆加工。

又另一个实施例涉及增强触感和/或外观，和/或为含纤维素的纺织材料(例如像，棉、亚麻、苎麻、黄麻、粘胶、改性的粘胶纤维、莱赛尔纤维和铜氨纤维)提供颜色增强和/或石洗的外观，包括用有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段或包含有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的组合物来处理所述材料。仍另外的实施例涉及用于在有色织物的石洗期间减少颜色再沉积的方法，该方法包括使织物与有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段、或包含有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的组合物在足以赋予织物石洗的外观的条件下进行接触。在仍另一个实施例中，与未处理的含纤维素的纺织材料相比，用有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段、或包含有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的组合物处理的含纤维素的纺织材料基本上保留了全部的材料的拉伸强度。在又另一个实施例中，与未处理的含纤维素的纺织材料相比，用有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段、或包含有效量的本文所述的纤维素酶变体或其活性片段的组合物处理的含纤维素的纺织材料保留了50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的材料的拉伸强度。

本发明组合物和方法的其他方面和实施例将从前面的描述和以下实例中显而易见。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在实践本发明时采用超出本文所述的实施例的各种替代性实施例。因此，权利要求书，而不是本文描述的具体实施例，限定了本发明的范围，并且正因为如此，在权利要求书的范围内的方法和结构及其等同物因此被覆盖。

实例

提供了以下实例以便说明和/或解释本披露的某些方面，并且不应被解释为限制本披露或任何随后要求保护的发明的范围。

实例1

测定

以下测定是在下述实例中使用的标准测定。有时特定的方案要求偏离这些标准测定。在这些情况下，在实例中鉴定了与以下这些标准测定方案的偏离。

性能指数

酶的性能指数(PI)比较了在相同蛋白质浓度下，变体(测量值)与亲本多肽或参比多肽(理论值或测量值)的性能。可以使用从亲本酶标准曲线的Langmuir拟合提取的参数计算亲本多肽或参比多肽的理论浓度。PI大于1(PI>1)表明与亲本多肽或参比多肽相比，变体的性能得到改善，而PI为1(PI＝1)鉴定出与亲本多肽或参比多肽具有相同性能的变体，并且PI小于1(PI<1)鉴定出性能不如亲本多肽或参比多肽的变体。例如，如SEQ ID NO:5列出的STCE1野生型(STCE1-WT)成熟蛋白质是如SEQ ID NO:8所示的STCE1-A142P变体的亲本。

蛋白质测定分析(A280)

使用SpectraMax读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices)，美国)测量微量滴定板(Costar 3635，西格玛/奥德里奇公司(Sigma/Aldrich)，美国)中纯化的酶样品在280nm处的吸光度。使用STCE1-WT标准品(在50ppm至1000ppm的范围内的标准蛋白质)的响应绘制标准曲线。然后从这些图中插入变体样品的吸光度值。

蛋白质测定分析(HPLC)

对于高分辨率浓度确定，对蛋白质样品进行高效液相色谱法(HPLC)方法。使用配备有Zorbax C-3柱的安捷伦1290U(HPLC)进行蛋白质定量。使用在水中的0.1％三氟乙酸(TFA)和在乙腈中的0.07％TFA的梯度从柱洗脱样品。在220nm处测量吸光度，并使用ChemStation软件(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，美国)对峰进行积分。基于纯化的STCE1-WT成熟蛋白(SEQ ID NO:5)的标准曲线来计算样品的蛋白质浓度。

使用PAHBAH试剂的纤维素酶活性测定

使用4-羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)试剂在羧甲基纤维素(CMC)底物上测试纤维素酶的活性。该酶活性基于CMC底物水解成还原糖，然后通过PAHBAH试剂检测新的还原末端。将试剂PAHBAH储备溶液(西格玛/奥德里奇公司(Sigma/Aldrich)，美国)制备为在0.5N盐酸(HCL)中的5％溶液。将PAHBAH试剂在0.5M氢氧化钠(NaOH)中以1:4的比例进一步稀释，以占据最终的1％溶液。在以下三种不同的缓冲溶液之一中制备1％CMC底物：50mM HEPES缓冲溶液，pH 8.2；50mM乙酸钠(NaOAc)缓冲溶液，pH 5；和50mM CAPS缓冲溶液，pH 10.8。将调节至pH 5(4μL)、pH 8.2(6μL)或pH 10(8μL)的酶样品添加到含有40μL的1％CMC溶液的微量滴定板(MTP)中，并在40℃下在iEMS^TM微孔板培养箱/摇床HT(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific Inc)，美国)中孵育15min；然后将8μl酶-底物混合物转移到每孔含有20μl的1％PAHBAH的新MTP中，并在95℃下在热循环仪(Eppendorf^TM Mastercycler^TMpro PCR系统，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国)中孵育5min。最后，将20μl的每种反应溶液转移至新鲜MTP中，并使用SpectraMax读板仪在410nm下测量吸光度。

使用纤维素酶活性测定的稳定性测量

通过测量残余活性，在表1所示的各种应激条件下，在存在和不存在蛋白酶的情况下测试纤维素酶样品的稳定性。使用本文所述的纤维素酶活性测定来测量应激和非应激纤维素酶活性。用于测定的蛋白酶是可商购的BPN’-Y217L枯草杆菌蛋白酶，其作为SEQ IDNO:7在以下列出。

使用的稳定性测定条件描述于表1中。在稳定性测定中使用可商购的洗涤剂之前，通过在设定为100℃的水浴中加热洗涤剂样品2小时来使洗涤剂中含有的酶灭活。

/>

^*联合利华商业上销售的重垢液体衣物洗涤剂

对于非应激测试条件，在测定活性之前不孵育酶样品。

对于应激测试条件，将酶样品在PCR/MTP板中制备、密封、并在升高的温度和表1中描述的条件下使用以下来进行孵育：i)Eppendorf^TM 384MasterCycler^TM Pro热循环仪，以测量热稳定性、以及在蛋白酶存在下的稳定性，(ii)iEMS培养箱，以测量在洗涤剂和蛋白酶存在下的稳定性。在不同孵育期后，测定样品的纤维素酶活性。

通过上文所述的纤维素酶活性测定来测量应激和非应激活性。将在每次测定中测试的酶样品的残余活性计算为减去空白的三次重复的平均值。将每种酶样品的相对残余活性计算为残余活性与非应激活性之间的比率。通过将相对残余活性数目乘以100来计算相对残余活性百分比。将每种STCE1-WT变体的PI计算为变体的相对残余活性与STCE1-WT纤维素酶的相对残余活性之间的比率。

实例2

不同GH45纤维素酶及其变体的表达

选择编码STCE1-WT纤维素酶的基因(先前在以下出版物中被描述为家族45糖苷水解酶：Koga,J.,Y.Baba,A.Shimonaka,T.Nishimura,S.Hanamura和T.Kono(2008),“Purification and characterization of a new family 45endoglucanase,STCE1,fromStaphylotrichum coccosporum and its overproduction in Humicola insolens[来自大孢圆孢霉的新家族45内切葡聚糖酶STCE1的纯化和表征，及其在特异腐质霉中的过量生产]”Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]74(13):4210-4217)作为用于产生亲本纤维素酶及其变体的模板。还选择编码特异腐质霉-WT纤维素酶(登录号CAA01574.1)和粗糙脉孢菌-WT纤维素酶(登录号XP_957107.1)的基因作为用于产生亲本纤维素酶及其变体的模板。此外，还选择太瑞斯梭孢壳霉-WT纤维素酶(登录号XP_003651003.1)的一个氨基酸变体作为用于产生亲本纤维素酶及其变体的模板。修饰的太瑞斯梭孢壳霉纤维素酶在成熟纤维素酶蛋白质序列的位置120处具有组氨酸(H)，并且在此描述为太瑞斯梭孢壳霉120H。

编码野生型(WT)形式的蛋白质(在本文中称为亲本)的stce1(太瑞斯梭孢壳霉和粗糙脉孢菌)基因含有在编码DNA内的内含子，该内含子是使用本领域已知的分子生物学技术去除。使用标准试剂将所得基因亚克隆到表达载体pTTT-pyr2中。除了构巢曲霉(A.nidulans)pyrG基因被红褐肉座菌(H.jecorina)pyr2基因替代，pTTTpyr2载体类似于先前描述(例如，在WO 2011153449A1中)的pTTTpyrG载体。pTTT-pyr2表达载体含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域(允许感兴趣的基因的强诱导型表达)、构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记(赋予转化体在作为唯一氮源的乙酰胺上的生长)和里氏木霉端粒区域(允许在真菌细胞中非染色体质粒维持)。

含有stce1-WT纤维素酶基因(SEQ ID NO:3)的pTTT-pyr2(pTTT-pyr2-stce1)基的载体的图显示在图1中。制备类似地构建载体(pTTT-pyr2-特异腐质霉、pTTT-pyr2-粗糙脉孢菌和pTTT-pyr2-太瑞斯梭孢壳霉)用于表达特异腐质霉、粗糙脉孢菌和太瑞斯梭孢壳霉纤维素酶。

使用本领域已知的分子生物学技术，通过针对基础质粒pTTT-pyr2-stce1、pTTT-pyr2-特异腐质霉、pTTT-pyr2-粗糙脉孢菌和pTTT-pyr2-太瑞斯梭孢壳霉的所希望的氨基酸变化引入密码子序列，来设计stce1、特异腐质霉、粗糙脉孢菌和太瑞斯梭孢壳霉单个氨基酸取代。通过描述于美国专利号8,679,792中的基于PEG的方案转化合适的里氏木霉宿主菌株的原生质体。在转化体生长后，将来自每个孔的孢子合并，并使用含有乙酰胺作为唯一氮源的基本培养基重新修补。在孢子形成后，将孢子收获并用于接种于亚琛培养基中。将培养物在28℃、80％湿度和50mm振荡甩动下，在Multitron摇床培养箱(Infors，瑞士)中孵育6天。将培养液过滤以收集澄清的上清液，将其保存在-20℃下。

在pTTT-pyr2-STCE1载体中的stce1-WT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(951个碱基对)所示。stce1-WT基因的翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:4(316个氨基酸)所示，其中N-末端21个氨基酸构成信号肽。STCE1-WT蛋白质的成熟形式的氨基酸序列如SEQ IDNO:5(295个氨基酸)所示，其中C-末端37个氨基酸构成碳水化合物结合模块(CBM)。

将STCE1-WT和变体蛋白质通过硫酸铵沉淀，以1:1稀释度添加3M(NH₄)₂SO₄至澄清的培养肉汤，并使用在20mM KH₂PO₄(pH 6.0)中的Relisorb OC 400树脂(Resindon，意大利))进行纯化用20mM KH₂PO₄pH 6.0+0.5M(NH₄)₂SO₄缓冲液洗涤树脂，并将STCE1蛋白质在20mM KH₂PO₄(pH 6.0)缓冲液中洗脱并冷藏直至测定。

在pTTT-pyr2-特异腐质霉载体中的特异腐质霉-WT基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示。特异腐质霉-WT基因的翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。成熟特异腐质霉-WT纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

pTTT-pyr2-粗糙脉孢菌载体中的粗糙脉孢菌-WT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。粗糙脉孢菌-WT基因的翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。成熟粗糙脉孢菌-WT纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在pTTT-pyr2-太瑞斯梭孢壳霉载体中的太瑞斯梭孢壳霉-120H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。太瑞斯梭孢壳霉-120H基因的翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。成熟太瑞斯梭孢壳霉-120H纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

实例3

晶体结构确定和STCE1-WT纤维素酶的独特特征

STCE1-WT蛋白质的结晶

发现成熟STCE1-WT蛋白质(SEQ ID NO:5)难以结晶。通过木瓜蛋白酶来消化纯化的STCE1-WT蛋白质，该木瓜蛋白酶剪切在成熟STCE1-WT蛋白质(SEQ ID NO:5)的接头结构域中的G214位置后的蛋白质骨架。通过木瓜蛋白酶消化获得的剪切的STCE1-WT蛋白质(也称为截短的STCE1-WT)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6(214个氨基酸)所示。

将这种截短的STCE1-WT蛋白质使用悬滴法以在50mM MES(pH6.3)中的25.5mg/mL浓度从蛋白质储备液的溶液结晶。将2.5mL蛋白质储备液和2.5mL结晶溶液(1.79M硫酸铵、95mM Tris(pH 8.5)和91mM碘化钠)的等分试样在塑料盖玻片上混合并倒置并密封在在Linbro 6X 4培养板中含有结晶溶液的室中。晶体在具有如下单位晶胞尺寸的空间群P4₃2₁2中生长；

和/>

在天然晶体上收集数据至/>

的分辨率，并且使用相关蛋白质热白丝菌内切葡聚糖酶(pdb ID 1OA7)作为相位模型，通过分子替代来确定STCE1-WT的结构。针对STCE1-WT收集的晶体数据显示于表2中。/>

如Emsley等人(Emsley,P.,B.Lohkamp,W.G.Scott和K.Cowtan(2010).“Featuresand development of Coot.[Coot.的特征和发展]”Acta Crystallogr D BiolCrystallogr[晶体学报D辑]66(Pt 4):486-501)所述，使用程序COOT将模型拟合在所得的电子密度中。在拟合和重新拟合调节之后，使用具有CCP4软件套件中的标准默认值的REFMAC程序对坐标进行了细化。将结构模型的统计数据呈现于表3中。

截短的STCE1-WT的结构确定

图2描绘了截短的STCE1-WT纤维素酶的催化核心的结构。将催化核心可视化为由三个亚结构域组成：由属于残基1-9、61-121和180-185的链形成的扭曲的β桶状结构域；由残基125-172形成的α螺旋结构域；和由残基10-60形成的延伸的环结构域。C-末端区段(其延伸到全长分子中的接头和CBM)在β亚结构域上延伸，并且在本讨论的其余部分将被视为该β亚结构域的一部分。

图3显示了表面绘制，描绘了在β桶状亚结构域和α螺旋亚结构域之间形成的底物结合裂隙。发现底物结合裂隙发生在β亚结构域和α亚结构域之间形成的沟中。晶体结构包括将催化核心与CBM连接的接头结构域的一部分。这个部分接头在由残基100-107形成的中心β链上延伸，残基100-107本身是β桶状亚结构域的一部分。

截短的STCE1-WT纤维素酶的催化核心的结构与两种其他已知GH45家族酶(热白丝菌内切葡聚糖酶(pdb ID 1OA7)和来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶V(pdb ID 3ENG))的催化核心同源。如图4所示，三种结构中的总体蛋白质折叠高度相似，包括六个二硫键的分布。可以看出，即使STCE1-WT的催化核心与其他两种GH45纤维素酶的催化核心分别仅具有75.2％和80.8％的序列同一性，这些酶的总体折叠是高度保守的。

实例4

STCE1-WT纤维素酶中的蛋白酶不稳定位点的评估

为了鉴定蛋白酶不稳定位点，将STCE1-WT纤维素酶(SEQ ID NO:5)与可商购的BPN’-Y217L蛋白酶(10:1比例)在37℃下孵育。可商购的BPN’-Y217L的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

将经蛋白酶处理的纤维素酶样品在不同的时间点取出并测定纤维素酶活性。通过使用1N HCl终止孵育反应，并将样品过滤以收集可溶性级分。用胰蛋白酶进一步消化样品，以获得适当大小的片段用于质谱分析。使用Proxeon Easy-nano系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，佛罗里达州，美国)对胰蛋白酶消化物进行LC MS/MS。已知胰蛋白酶将多肽骨架C-末端切割成带正电荷的氨基酸残基，赖氨酸(K)或精氨酸(R)。除了由于对STCE1-WT(SEQ ID NO:5)的胰蛋白酶作用引起的预期的切割模式之外，BPN’-Y217L切割模式鉴定了A142和Q216处的切割位点。

鉴于上述，针对A142和Q216位点产生单个氨基酸变体，并且在不同条件下测定这些变体以测量对衣物纤维素酶有价值的性质的改善。具体地，在实例1中描述的测试条件下测量这些变体纤维素酶和STCE1-WT纤维素酶的稳定性，包括：热稳定性、在蛋白酶存在下的稳定性、以及在蛋白酶和洗涤剂存在下的稳定性。相对活性和稳定性性能结果显示在表4中，报告为变体与STCE1-WT(SEQ ID NO:5)的性能指数(PI)。这些结果表明，用选自D、E、P和Q的氨基酸替代位置142处的丙氨酸产生了具有改善的稳定性的变体。同样地，当与STCE1-WT(SEQ ID NO:5)相比时，用选自D、E、G、P、S、T和V的氨基酸替代位置216处的谷氨酰胺也产生具有改善的稳定性的变体。

实例5

STCE1-A142P变体纤维素酶的长期稳定性分析

测试STCE1-A142P变体(SEQ ID NO:8)在含有蛋白酶的不同液体洗涤剂中相对于其他两种纤维素酶(STCE1-WT亲本和商业基准纤维素酶(

4500L)(诺维信公司，丹麦))的长期稳定性。STCE1-A142P变体的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:8(295个氨基酸)所示。/>

在商业重垢液体(HDL)洗涤剂(奥妙彩色克莱因&克拉克蒂格(联合利华)，宝莹彩色凝胶(汉高公司(Henkel))和碧浪Actilift^TM Excel Gel(宝洁公司(Procter andGamble))中测试了STCE1-A142P变体的洗涤剂内稳定性。所有商业洗涤剂均于2014年在荷兰购买。对于宝莹和碧浪中的洗涤剂抗性稳定性测试，如实例1所述，将洗涤剂中存在的酶热灭活。将STCE1-A142P变体、STCE1-WT亲本或基准添加到冷却的洗涤剂中，以提供在洗涤剂中的200ppm的最终浓度。为了确定纤维素酶对蛋白水解灭活的抗性水平，将可商购的BPN’-Y217L枯草杆菌蛋白酶添加到含有洗涤剂的冷却的纤维素酶中，至在洗涤剂中1000ppm的终浓度。

另一个稳定性测试的子集在商业奥妙彩色克莱因&克拉克蒂格洗涤剂中进行，其中洗涤剂不是热灭活的，并因此含有已经存在于可商购的洗涤剂中的蛋白酶。将STCE1-WT亲本、STCE1-A142P变体或商业基准纤维素酶添加到该洗涤剂中，至在该洗涤剂中200ppm的终浓度。将所有洗涤剂样品在30℃下在培养箱中孵育。为了确定剩余的纤维素酶活性，将等分试样以不同的时间间隔从每个洗涤剂反应样品中去除，并使用AZCL-HE-纤维素底物(Cellazyme C片剂，麦格酶国际有限公司(Megazyme International))进行测试。简言之，将100μl样品添加到1.9ml的50mM乙酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES(pH 8.0)缓冲液中并充分混合。将500μl在底物中的样品在40℃下预孵育2min，然后添加Cellazyme C片剂并在40℃下再孵育10min。在该步骤之后，通过添加10ml的2％Tris(pH 12.0)溶液来终止反应。然后通过沃特曼(Whatman)编号#1滤纸来过滤所得溶液，并在SpectraMax板读数器中在590nm波长下测量吸光度。将所得数据计算为百分比剩余纤维素酶活性，将第0天活性认为是100％。结果显示在图5A-5C中。

正如图5A-5C显示，与STCE1-WT和基准纤维素酶相比，STCE1-A142P变体在所测试的洗涤剂中具有显著的稳定性。

实例6

纤维素酶在液体洗涤剂中的性能

性能测试在商业Kirkland Signature^TM液体洗涤剂(太阳产品公司(Sun ProductsCorp.)，美国)中进行。将洗涤剂在80℃下热灭活3小时，然后在冷却后添加1％硼酸、2％甘油和0.02％CaCl₂。将STCE1-WT、基准(

4500L)或STCE1-A142P变体纤维素酶中的任一个，与可商购的蛋白酶：BPN’-Y217L或/>

(杜邦公司，美国)蛋白酶一起添加到该洗涤剂稳定剂混合物中。将所有样品在37℃下在培养箱中孵育长达6周。将等分试样每隔几周取出，并测试对纤维素酶敏感性染色的洗涤性能。在Tergotometer(印度Tergotometer公司(India Tergotometer)，印度)中的每次洗涤循环中添加2g/L液体洗涤剂。向总共1.5L洗涤液中添加纤维素酶和可商购的BPN’-Y217L或/>

蛋白酶，使得它们在洗涤液中的终浓度各为3ppm。为了模拟去球性能，将六个预先填充的均匀尺寸(127mm X 127mm)的拉绒的双罗纹织物的布样添加到Tergotometer罐中，填充1.49L去离子水和7.5ml的总体250ppm水硬度的Ca²⁺Mg²⁺(4:1)液体。将洗涤循环在30℃的温度下进行90min。在单次洗涤循环后，将布样在流动水中漂洗10min并在滚筒洗衣机(博世(Bosch))中进行干纺。将布样冷却至室温，然后以面板单位分数(PUS)进行绒毛和球粒测量读数。

使用Multiray装置(视程仪公司(Videometer A/S)，丹麦)测量PUS，其中对每个布样取六个读数，并且每个布样使用三十六个读数的平均值作为PUS。这些读数基于通过用不同单位的纤维素酶处理预先填充的布样而产生的校准模型，以产生标准曲线，其中取决于织物表面上存在的绒毛和球粒，测量的读数在1至5个PUS之间。

PUS(3-5)越高，在蛋白酶存在下纤维素酶的性能越好或稳定性越持久；而低PUS(1-2)表明在蛋白酶存在下纤维素酶性能很低或没有改善。结果显示在表5中。如表6中所示的性能结果所指示，第0天洗涤结果显示，当与STCE1-WT和基准相比时，STCE1-A142P变体具有相似的去球性能。老化的样品的洗涤结果表明，当在两种通常在洗涤剂应用中使用的可商购的蛋白酶(BPN’-Y217L和

)存在下在37℃下储存时，与在KirklandSignature UltraClean HE液体衣物洗涤剂(Kirkland HDL，在美国好市多公司(Costco)购买)中的STCE1-WT和基准相比，STCE1-A142P变体保留了明显更高的去球性能。

实例7

STCE1-WT纤维素酶与相关分子的比较和同源纤维素酶的鉴定

使用成熟STCE1-WT蛋白质序列(SEQ ID NO:5)通过针对NCBI非冗余蛋白质数据库的BLAST搜索(如Altschul,S.F.，T.L.Madden，A.A.Schaffer，J.Zhang，Z.Zhang，W.Miller和D.J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs[缺口的BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]”Nucleic Acids Res[核酸研究]25(17):3389-3402中所述)来鉴定相关蛋白质，并且结果的子集显示在表6中。针对基因组查询专利(Genome Quest Patent)数据库，使用STCE1-WT纤维素酶(SEQ ID NO:5)的成熟蛋白氨基酸序列作为查询序列，将搜索参数设置为默认值进行类似的搜索，并且在表7中示出了一个子集。

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实例8

GH45纤维素酶与STCE1-WT的比对

以下纤维素酶的氨基酸序列的比对显示于图6A-C中：大孢圆孢霉_BAG69187.1(SEQ ID NO:1)、STCE1-WT(SEQ ID NO:5)、STCE1-A142P(SEQ ID NO:8)、足马杜拉分枝菌(NCBI登录号：KOP50759)(SEQ ID NO:2)、印尼柱顶孢霉(NCBI登录号：CDF76466.1)(SEQ IDNO:29)、嗜热毛壳菌(NCBI登录号：AGY80101.1)(SEQ ID NO:19)、热白丝菌(NCBI登录号：CAD56665)(SEQ ID NO:20)、特异腐质霉(NCBI登录号：CAA01574.1)(SEQ ID NO:10)、灰腐质霉(NCBI登录号BAA74956.1)(SEQ ID NO:23)、太瑞斯梭孢壳霉(NCBI登录号：XP_003651003.1)(SEQ ID NO:22)、鹅柄孢壳菌S mat+(NCBI登录号：XP_001903789；基因库登录号：CAP61565.1)(SEQ ID NO:25)、产黄支顶孢菌(NCBI登录号：KFH43153)(SEQ ID NO:26)、粗糙脉孢菌(NCBI登录号：XP_957107)(SEQ ID NO:13)、来自US20150299682(SEQ IDNO:18)的SEQ ID NO:4、来自WO 9743409(基因组查询识别符：CAB42308)(SEQ ID NO:21)的SEQ ID NO:66、来自US 7361487(基因组查询识别符：ACE10216.1)(SEQ ID NO:24)的SEQID NO:6、来自WO 9743409(基因组查询识别符：CAB42311)(SEQ ID NO:27)的SEQ ID NO:72、以及来自WO 9743409(基因组查询识别符：CAB42312)(SEQ ID NO:28)的SEQ ID NO:74。使用来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar.，MUSCLE:Multi sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对]，Nucleic Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对这些序列。使用Geneious树构建程序构建了图6中枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的系统发生树，并且示于图7中。

实例9

在多种条件下赋予改善的稳定性的在STCE-1纤维素酶中的另外的取代的鉴定

使用实例2中所述的方法产生STCE-1纤维素酶骨架上的另外的取代。与实例4中所述的评估类似，如实例1中所述来评估单个取代的纤维素酶变体的活性和稳定性。相对活性和稳定性性能结果显示在表8中，报告为变体与STCE1-WT(SEQ ID NO:5)的性能指数(PI)。

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实例10

在GH45纤维素酶中改善稳定性的突变的评估

图8提供了以下GH45纤维素酶的催化结构域的MUSCLE多重序列比对：STCE1-WT(SEQ ID NO:5)、特异腐质霉(H.insolens)(SEQ ID NO:11)、粗糙脉孢菌(N.crassa)(SEQID NO:14)和太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)120H(SEQ ID NO:17)。在相关GH45纤维素酶(特异腐质霉-WT(SEQ ID NO:11)、粗糙脉孢菌-WT(SEQ ID NO:14)和太瑞斯梭孢壳霉-120H(SEQ ID NO:17))中评估在对应于位置的位置(基于图8中所示的多重序列比对)处的单个氨基酸取代，其显示出改善STCE1-WT纤维素酶的稳定性(如实例9中所示)。在实例1中描述的测试条件下测量这些其他GH45变体纤维素酶和相关亲本的稳定性性能，结果显示在表10、11和12中，报告为变体与亲本的性能指数(PI)。在对应于改善STCE1-WT稳定性的位置的位置处在其他内切葡聚糖酶(例如，特异腐质霉、粗糙脉孢菌和太瑞斯梭孢壳霉)中的位置处取代氨基酸产生了许多具有改善的稳定性的GH45变体。

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Claims

1.一种亲本多肽的纤维素酶变体，其中所述亲本多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，所述变体为在亲本多肽上进行氨基酸取代获得，且所述变体的氨基酸取代选自A142D、A142E、A142P或A142Q。

2.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的纤维素酶变体。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物选自酶组合物、洗涤剂组合物和织物护理组合物。

4.如权利要求2或3所述的组合物，所述组合物进一步包含(i)一种或多种其他酶，所述一种或多种其他酶选自：淀粉酶、酯酶、脂肪分解酶、氧化酶、蛋白酶和还原酶；(ii)一种或多种表面活性剂；(iii)选自钙和锌的一种或多种离子；(iv)一种或多种辅助成分；(v)一种或多种稳定剂；(vi)从0.001％至5.0％重量的如权利要求1所述的纤维素酶变体；(vii)一种或多种漂白剂；或(viii)它们的组合。

5.如权利要求2或3所述的组合物，所述组合物进一步包含(i)一种或多种其他酶，所述一种或多种其他酶选自：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、软骨素酶、角质酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、短梗霉多糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、第二纤维素酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；(ii)一种或多种表面活性剂；(iii)选自钙和锌的一种或多种离子；(iv)一种或多种辅助成分；(v)一种或多种稳定剂；(vi)从0.001％至5.0％重量的如权利要求1所述的纤维素酶变体；(vii)一种或多种漂白剂；或(viii)它们的组合。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述甘露聚糖酶选自内切β-甘露聚糖酶或外切甘露聚糖酶。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述外切甘露聚糖酶为外切β-甘露聚糖酶。

8.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物是衣物洗涤剂。

9.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物呈选自以下的形式：液体、粉末、颗粒状固体或片剂。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述片剂是薄片。

11.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物呈单位剂量的形式。

12.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物含有磷酸盐或不含磷酸盐和/或含有硼或不含硼。

13.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的纤维素酶变体。

14.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求13所述的多核苷酸。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求14所述的表达载体。

16.一种用于生产如权利要求1所述的纤维素酶变体的方法，所述方法包括：(a)用如权利要求14所述的表达载体稳定地转化如权利要求15所述的宿主细胞；(b)在适合于(a)中获得的所述宿主细胞产生所述纤维素酶变体的条件下培养所述宿主细胞；和(c)回收所述纤维素酶变体。

17.如权利要求1的纤维素酶变体在酶组合物、洗涤剂组合物、织物护理组合物、纺织品整理加工或纸和纸浆加工中的用途。