CN112272701A - 稳定化的纤维素酶变体 - Google Patents

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S.G.卡斯加尔德
F.W.拉斯穆森
R.A.帕赫
L.安德森
M.L.D.奥弗加尔德
T.A.波尔森
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Abstract

披露了具有改善的在蛋白酶存在下的稳定性的纤维素酶变体以及此类变体在洗衣中的用途。

Description

稳定化的纤维素酶变体
对序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及具有改善的稳定性、特别是在洗涤剂和/或蛋白酶存在下的稳定性的纤维素酶变体。此外，本发明涉及包含稳定化的纤维素酶变体的液体洗涤剂组合物。
背景技术
由于在洗衣过程中观察到的益处(如颜色澄清、防止再沉积、抗起球/去除绒球、和改善白度)，多年来一直将纤维素酶用于洗涤剂中。
在一些应用中使用了复合纤维素酶组合物，其中该组合物包含超过一种纤维素降解酶(选自使用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶)，而其他应用使用主要包含一种或多种使用的内切葡聚糖酶的组合物。
WO 1996/029397披露了用于洗涤剂用途的家族45内切葡聚糖酶。
大多数商业洗涤剂组合物包含改善许多常见菌株去除的蛋白酶。然而，蛋白酶也降低洗涤溶液中可获得的其他蛋白质，包括其他酶，如纤维素酶。
因此，令人希望的是提供具有增加的在蛋白酶存在下的稳定性的纤维素酶，如纤维素酶变体。
发明内容
本发明提供具有内切葡聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的变体，并且其中与具有SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的内切葡聚糖酶相比，在蛋白酶存在下的稳定性增加。
本发明进一步涉及多核苷酸和包含该多核甘酸的表达构建体；包含这些多核苷酸或表达构建体的宿主细胞，以及此类宿主细胞用于产生本发明的变体的用途。
还披露了组合物、特别是包含变体的洗涤剂组合物，以及此类组合物用于洗涤纺织品的用途。
定义
餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指旨在用于清洁盘子、餐桌用具、罐、锅、餐具的组合物和用于清洁厨房中硬表面区域的所有形式的组合物。本发明不限于任何特定类型的餐具洗涤组合物或任何特定的洗涤剂。
纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)。纺织品或织物可以处于针织品、机织物(woven)、牛仔布(denim)、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。纺织品可以是基于纤维素的，如天然纤维素制品，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、乙酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝，或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和/或含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如有污渍的家用衣物。当使用术语织物或衣服时，旨在还包括广义术语纺织品。
硬表面清洁：本文将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、餐具(如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
白度：术语“白度”在本文中定义为在不同区域和针对不同消费者具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用；不完全污渍去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。
“颜色澄清：在洗涤和穿着过程中，松动或破损纤维可以在织物的表面上积聚。一种后果是由于表面污染，织物的颜色看起来不太亮或不太强烈。从纺织品上去除松动或破损纤维将部分地恢复该纺织品的初始颜色和外观。如本文使用的，术语“颜色澄清”意指纺织品的原始颜色的部分恢复”。
“抗起球：术语“抗起球”表示从纺织品表面去除绒球和/或预防在纺织品表面上形成绒球”。
纤维素酶：术语“纤维素酶”意指具有催化纤维素中1,4-β-D-糖苷键水解的纤维素活性的酶。出于本发明的目的，根据材料与方法部分所述的程序确定纤维素活性。在一方面，本发明的变体具有亲本(或参考)肽，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的纤维素活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中片段具有纤维素活性。在一方面，片段含有至少260个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的氨基酸1至260)、至少240个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的氨基酸1至240)、或至少对应催化结构域的残基，例如210、211、212、或216个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸1至212或SEQ ID NO:1的氨基酸1至216、SEQ ID NO:2的氨基酸1至211或SEQ ID NO:2的氨基酸1至212、SEQ ID NO:3的氨基酸1至211或SEQ ID NO:3的氨基酸1至210氨基酸、SEQ ID NO:4的氨基酸1至211)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于在蛋白酶存在下的稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本纤维素酶：术语“亲本”或“亲本纤维素酶”意指具有纤维素活性的任何多肽，对其进行改变以产生本发明的酶变体。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代的具有纤维素活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸。本发明的变体具有亲本(或参考)肽，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的纤维素活性。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽用以确定另一种纤维素酶中的对应氨基酸残基。将另一种纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基对应氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种纤维素酶中的对应氨基酸残基的鉴别，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及纤维素酶变体，这些纤维素酶变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代：具有SEQ ID NO:1序列的多肽的4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219，其中该变体具有纤维素活性。
变体
本发明还提供纤维素酶变体，这些纤维素酶变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代：SEQ ID NO:1的4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219，其中该变体具有纤维素活性。
在实施例中，变体与亲本纤维素酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在一方面，在本发明的变体中的取代数目是1至20，例如1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在另一方面，变体包含在与以下位置对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代：4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。在另一方面，变体包含在与以下位置中任一个对应的两个位置处的改变：4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。在另一方面，变体包含在与以下位置中任一个对应的三个位置处的改变：4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。在另一方面，变体包含各自与以下位置中的一个对应的四、五、六、七、八、九、十个或甚至更多个位置处的改变：4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。
在另一方面，变体包含在与以下位置中的一个对应的位置处的取代，或由其组成：SEQ ID NO:1中的4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。在另一方面，在这个位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代。
以下取代是优选的：
位置4的氨基酸被Ala取代(X4A)；
位置6的氨基酸被Met、Asn、Trp、或Tyr取代(X6M、X6N、X6W、或X6Y)；
位置25的氨基酸被Gly取代(X25G)；
位置32的氨基酸被Ser取代(X32S)；
位置37的氨基酸被Trp取代(X37W)；
位置41的氨基酸被Thr取代(X41T)；
位置44的氨基酸被Asp取代(X44D)；
位置51的氨基酸被Asn取代(X51N)；
位置56的氨基酸被Ala取代(X56A)；
位置77的氨基酸被Asn取代(X77N)；
位置80的氨基酸被Lys或Leu取代(X80K或X80L)；
位置82的氨基酸被Ile取代(X82I)；
位置83的氨基酸被Asp取代(X83D)；
位置85的氨基酸被Asp、Ile、Lys、Met或Val取代(X85D、X85I、X85K、X85M或X85V)；
位置91的氨基酸被Phe取代(X91F)；
位置93的氨基酸被Met取代(X93M)；
位置94的氨基酸被Lys、Leu、Asn或Gln取代(X94K、X94L、X94N或X94Q)；
位置96的氨基酸被Ala、Phe、Arg或Val取代(X96A、X96F、X96R或X96V)；
位置98的氨基酸被Thr取代(X98T)；
位置100的氨基酸被Ala、Ser或Thr取代(X100A、X100S或X100T)；
位置101的氨基酸被Asp、Glu、His、Lys、Leu、Arg或Val取代(X101D、X101E、X101H、X101K、X101L、X101R或X101V)；
位置103的氨基酸被Ala、Leu、Met或Gln取代(X103A、X103L、X103M或X103Q)；
位置104的氨基酸被Ala、Asp、Ile、Lys、Leu、Met、Lys、Asn、Gln、Arg、Val或Tyr取代(X104A、X104D、X104I、X104K、X104L、X104M、X104K、X104N、X104Q、X104R、X104V或X104Y)；
位置114的氨基酸被Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Arg、Trp或Tyr取代(X114A、X114F、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114R、X114W或X114Y)；
位置117的氨基酸被Arg取代(X117R)；
位置118的氨基酸被Ile取代(X118I)；
位置132的氨基酸被Lys、Leu、Arg、或Val取代(X132K、X132L、X132R、或X132V)；
位置133的氨基酸被Tyr取代(X133Y)；
位置134的氨基酸被Asp取代(X134D)；
位置137的氨基酸被Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Met、Asn或Arg取代(X137A、X137D、X137E、X137G、X137K、X137M、X137N或X137R)；
位置146的氨基酸被Asp、Glu、Gly、Lys、Arg、Ser或Thr取代(X146D、X146E、X146G、X146K、X146R、X146S或X146T)；
位置147的氨基酸被Asp、Glu、Lys、Arg或Tyr取代(X147D、X147E、X147K、X147R或X147Y)；
位置148的氨基酸被Phe或Trp取代(X148F或X148W)；
位置152的氨基酸被Asp、Lys或Arg取代(X152D、X152K或X152R)；
位置156的氨基酸被Glu取代(X156E)；
位置159的氨基酸被Asp或Glu取代(X159D或X159E)；
位置162的氨基酸被Glu取代(X162E)；
位置166的氨基酸被Ser取代(X166S)；
位置169的氨基酸被Phe、Trp或Tyr取代(X169F、X169W或X169Y)；
位置179的氨基酸被Ser或Thr取代(X179S或X179T)；
位置183的氨基酸被Val取代(X183V)；
位置184的氨基酸被Ala、Leu或Met取代(X184A、X184L或X184M)；
位置186的氨基酸被Arg取代(X186R)；
位置194的氨基酸被Ser或Leu取代(X194S或X194L)；
位置201的氨基酸被Arg取代(X201R)；
位置202的氨基酸被Gly或Leu取代(X202G或X202L)；
位置211的氨基酸被His、Lys、Leu、Asn、Pro、Val或Trp取代(X211H、X211K、X211L、X211N、X211P、X211V或X211W)；
位置213的氨基酸被Gln取代(X213Q)；或
位置219的氨基酸被Trp取代(X219W)。
在特别优选的实施例中，亲本纤维素酶是具有SEQ ID NO:1序列的多肽，并且是包含选自以下的一个或多个取代的变体：
位置4的氨基酸Ser被Ala取代(S4A)；
位置6的氨基酸Gln被Met、Asn、Trp、或Tyr取代(Q6M、Q6N、Q6W、或Q6Y)；
位置25的氨基酸Ala被Gly取代(A25G)；
位置32的氨基酸Ala被Ser取代(A32S)；
位置37的氨基酸Phe被Trp取代(F37W)；
位置41的氨基酸Ser被Thr取代(S41T)；
位置44的氨基酸Asn被Asp取代(N44D)；
位置51的氨基酸Gly被Asn取代(G51N)；
位置56的氨基酸Ser被Ala取代(S56A)；
位置77的氨基酸Ser被Asn取代(S77N)；
位置80的氨基酸Gly被Lys或Leu取代(G80K或G80L)；
位置82的氨基酸Ser被Ile取代(S82I)；
位置83的氨基酸Glu被Asp取代(G83D)；
位置85的氨基酸Ser被Asp、Ile、Lys、Met或Val取代(S85D、S85I、S85K、S85M或S85V)；
位置91的氨基酸Tyr被Phe取代(Y91F)；
位置93的氨基酸Leu被Met取代(L93M)；
位置94的氨基酸Thr被Lys、Leu、Asn或Gln取代(T94K、T94L、T94N或T94Q)；
位置96的氨基酸Thr被Ala、Phe、Arg或Val取代(T96A、T96F、T96R或T96V)；
位置98的氨基酸Gly被Thr取代(G98T)；
位置100的氨基酸Val被Ala、Ser或Thr取代(V100A、V100S或V100T)；
位置101的氨基酸Ala被Asp、Glu、His、Lys、Leu、Arg或Val取代(A101D、A101E、A101H、A101K、A101L、A101R或A101V)；
位置103的氨基酸Lys被Ala、Leu、Met或Gln取代(K103A、K103L、K103M或K103Q)；
位置104的氨基酸Thr被Ala、Asp、Ile、Lys、Leu、Met、Lys、Asn、Gln、Arg、Val或Tyr取代(T104A、T104D、T104I、T104K、T104L、T104M、T104K、T104N、T104Q、T104R、T104V或T104Y)；
位置114的氨基酸Gly被Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Arg、Trp或Tyr取代(G114A、G114F、G114H、G114I、G114K、G114L、G114M、G114R、G114W或G114Y)；
位置117的氨基酸Gly被Arg取代(G117R)；
位置118的氨基酸Ser被Ile取代(S118I)；
位置132的氨基酸Ile被Lys、Leu、Arg、或Val取代(I132K、I132L、I132R、或I132V)；
位置133的氨基酸Phe被Tyr取代(F133Y)；
位置134的氨基酸Asn被Asp取代(N134D)；
位置137的氨基酸Ser被Ala、Asp、Glu、Gly、Lys、Met、Asn或Arg取代(S137A、S137D、S137E、S137G、S137K、S137M、S137N或S137R)；
位置146的氨基酸Ala被Asp、Glu、Gly、Lys、Arg、Ser或Thr取代(A146D、A146E、A146G、A146K、A146R、A146S或A146T)；
位置147的氨基酸Gln被Asp、Glu、Lys、Arg或Tyr取代(Q147D、Q147E、Q147K、Q147R或Q147Y)；
位置148的氨基酸Tyr被Phe或Trp取代(Y148W或Y148F)；
位置152的氨基酸Ser被Asp、Lys或Arg取代(S152D、S152K或S152R)；
位置156的氨基酸Gln被Glu取代(Q156E)；
位置159的氨基酸Ser被Asp或Glu取代(S159D或S159E)；
位置162的氨基酸Ala被Glu取代(A162E)；
位置166的氨基酸Pro被Ser取代(P166S)；
位置169的氨基酸Gln被Phe、Trp或Tyr取代(Q169F、Q169W或Q169Y)；
位置179的氨基酸Asp被Ser或Thr取代(D179S或D179T)；
位置183的氨基酸Phe被Val取代(F183V)；
位置184的氨基酸Thr被Ala、Leu或Met取代(T184A、T184L或T184M)；
位置186的氨基酸Gln被Arg取代(Q186R)；
位置194的氨基酸Ile被Ser或Leu取代(I194S或I194L)；
位置201的氨基酸Lys被Arg取代(K201R)；
位置202的氨基酸Arg被Gly或Leu取代(R202G或R202L)；
位置211的氨基酸Phe被His、Lys、Leu、Asn、Pro、Val或Trp取代(F211H、F211K、F211L、F211N、F211P、F211V或F211W)；
位置213的氨基酸Pro被Gln取代(P213Q)；或
位置219的氨基酸Gly被Trp取代(G219W)。
在一些实施例中，变体在与以下位置对应的位置处包含2个或多个，例如3、4、5、6、7、8、9、或10个取代：具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的序列的多肽的位置4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219，其中该变体具有纤维素活性。
变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个另外的改变。
氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的纤维素活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contact site)氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的纤维素酶的催化残基被鉴定为Asp 12和Asp 122。变体可以由216-278个氨基酸组成，例如由216-240个氨基酸组成。
在实施例中，与亲本酶相比，变体具有改善的在蛋白酶存在下的稳定性。优选地，与亲本纤维素酶相比，变体具有改善的在蛋白酶和表面活性剂(如洗涤剂组合物)存在下的稳定性。
在蛋白酶存在下的稳定性
与亲本纤维素酶相比，本发明的变体具有改善的在蛋白酶存在下的稳定性。
在蛋白酶存在下的稳定性对在蛋白酶存在的条件下使用纤维素酶而言是有益的，因为它延长了纤维素酶发挥功能和活性的时间并且发挥其想要的功能。
本发明的变体的优选用途是在洗涤剂中，其中典型地包括蛋白酶以改善洗涤。本发明的变体的改善的稳定性意指，变体与亲本纤维素酶相比可以在洗衣过程期间可发挥更长时间的纤维素活性，并且因此与亲本纤维素酶相比提供了改善的洗涤益处。
对于液体洗涤剂组合物，本发明的变体进一步具有改善的在蛋白酶存在下的稳定性的益处，这意指包含蛋白酶且进一步包含本发明的变体的液体洗涤剂组合物与包含亲本纤维素酶的相同液体洗涤剂组合物相比，具有更长的保质期。
在蛋白酶存在下的稳定性可以通过以下确定：在蛋白酶存在下的限定条件下孵育给定的纤维素酶，测量孵育后的纤维素活性，并将其与未与蛋白酶孵育的纤维素酶样品进行比较。
另一种用于确定在蛋白酶存在下的稳定性的方法是：准备包含待测给定纤维素酶(其在包含蛋白酶的限定溶液中)的两个相同的试管，在高温(例如在30℃-60℃的范围(应激))下孵育一个试管，而在低温(例如在0℃-5℃的范围(非应激))下孵育另一个试管。在孵育后，分析两个样品的纤维素活性，并如下确定残余活性：
残余活性(％)＝(活性，应激/活性，非应激)*100。
根据本发明，优选确定含有0.166v/v-％蛋白酶的50％液体洗涤剂A中的残余活性，其中在确定活性之前，将这些样品在40℃(应激)下和5℃(非应激)下孵育16小时。如下确定残余活性：
残余活性(％)＝(在40℃下孵育的样品的活性/在5℃下孵育的样品的活性)*100
实例1中更详细地说明了本方法。
本发明的变体比亲本纤维素酶具有更高的残余活性。在一个实施例中，与亲本纤维素酶相比具有本发明的变体的至少10％更高的残余活性，例如与亲本相比至少20％更高的残余活性、例如至少30％更高的残余活性、例如至少40％更高的残余活性、例如至少50％更高的残余活性、例如至少60％更高的残余活性、例如至少70％更高的残余活性、例如至少80％更高的残余活性、例如至少90％更高的残余活性、或至少100％更高的残余活性。
将变体的稳定性与参考纤维素酶(典型地是亲本纤维素酶)比较时计算残余活性比(RAR)可能是方便的：
残余活性比(RAR)＝(变体的RA)/(参考的RA)
使用亲本纤维素酶作为参考，本发明的变体的RAR比1高，即该RAR高于1+测定的标准偏差，优选地高于1+测定的标准偏差的两倍。
以另一种方式表达，使用亲本纤维素酶作为参考，本发明的变体具有至少1.1，优选地至少1.2、优选地至少1.3、优选地至少1.4、优选地至少1.5、优选地至少1.6、优选地至少1.7、优选地至少1.8、优选地至少1.9、优选地至少2、或甚至更高的RAR。
亲本纤维素酶
亲本纤维素酶可以是具有纤维素活性并且与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:4的序列的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。
另一方面，亲本包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至212或SEQ IDNO:1的氨基酸1至216、SEQ ID NO:2的氨基酸1至211或SEQ ID NO:2的氨基酸1至212、SEQID NO:3的氨基酸1至211或SEQ ID NO:3的氨基酸1至210氨基酸、SEQ ID NO:4的氨基酸1至211。
在另一方面，亲本是含有至少200个氨基酸残基(例如至少216个以及至少240个氨基酸残基)的SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ IDNO:4的成熟多肽的等位基因变体。
多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽还可包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文中与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本是胞外分泌的。亲本可以是细菌纤维素酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)纤维素酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)纤维素酶。
在一方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)纤维素酶。
在另一方面，亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)纤维素酶。
在另一方面，亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)纤维素酶。
亲本可以是真菌纤维素酶。例如，亲本可以是酵母纤维素酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)纤维素酶；或丝状真菌纤维素酶，例如枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)纤维素酶。
在另一方面，亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)纤维素酶。
在另一方面，亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)纤维素酶。
在另一方面，亲本是土生梭孢壳纤维素酶，例如SEQ ID NO:1的纤维素酶或其成熟多肽。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center，NRRL)。
可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有纤维素活性的变体的方法，这些方法包括：(a)向亲本纤维素酶中引入在与以下位置对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代：SEQ IDNO:1的成熟多肽的4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219，其中该变体具有纤维素活性；以及(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即多核苷酸，其由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加到转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区域，该编码区域编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导该变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992,同上)描述。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得该多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge,UK[英国剑桥])。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法检测该变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑,VCHPublishers[纽约VCH出版社],1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生变体。变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有变体的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或进料的质量，例如，改善营养价值、可口性以及流变特性，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，例如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(例如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)以及十字花科植物(十字花科)(例如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模式生物体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，例如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，例如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达变体来确定对调节序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如Tague等人,1988,Plant Physiology[植物生理学]86:506描述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(Franck等人,1980,Cell[细胞]21:285-294；Christensen等人,1992,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689；Zhang等人,1991,Plant Cell[植物细胞]3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito等人,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24:863-878)的启动子，种子特异性启动子，例如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等人,1998,Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等人,1998,J.Plant Physiol.[植物生理学杂志]152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人,1998,Plant CellPhysiol.[植物与细胞生理学]39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人,1993,PlantPhysiol.[植物生理学]102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等人,1995,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]248:668-674)、或伤口诱导型启动子(例如马铃薯pin2启动子)(Xu等人,1993,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:573-588)。同样地，该启动子可以通过例如温度、干旱或盐度变化等非生物处理来诱导，或通过外源地应用使该启动子活化的物质(例如，乙醇；雌激素；植物激素，例如乙烯、脱落酸及赤霉酸；及重金属)来诱导。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，Xu等人,1993,同上，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因及表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser等人，1990，Science[科学]244:1293；Potrykus，1990，Bio/Technology[生物/技术]8:535；Shimamoto等人，1989，Nature[自然]338:274)。
根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，尽管对于这些植物可以使用其他转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(Christou,1992,Plant J.[植物杂志]2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评]5:158-162；Vasil等人,1992,Bio/Technology[生物/技术]10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人,1993,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文并入本文)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已结合了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了此类植物的子代。如本文使用的，子代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后代。此类子代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过将起始系用供体植物系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化工艺生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别子代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的子代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；以及(b)回收该变体。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
在一个实施例中，本发明涉及ADW(自动餐具洗涤)组合物，该组合物包含与一种或多种另外的ADW组合物组分相结合的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所描述配制该组合物。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，将其通过引用而特此并入。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或兼性离子型、或其混合物。在特别的实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约5％至60％(如约5％至约50％、或约10％至约50％、或约20％至约50％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择该一种或多种表面活性剂，并且该一种或多种表面活性剂可以包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约5％至约60％(如从约5％至约40％，包括从约10％至约25％)的一种或多种阴离子表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸的二酯和单酯或脂肪酸盐(皂)或脂肪酸、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0.1％至约10％(例如从约0.1％至约5％)的阳离子型表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约60％(例如从约1％至约40％，特别是从约5％至约20％、从约3％至约15％)的非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、甲酯乙氧基化物(MEE)、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0,1％至约10％的半极性型表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物以及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0,1％至约10％的兼性离子型表面活性剂。兼性离子型表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱，如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
溶剂系统：为了溶解表面活性剂和其他洗涤剂成分，需要溶剂系统。溶剂典型地是水、醇、多元醇、糖和/或其混合物。优选的溶剂是水、甘油、山梨醇、丙二醇(MPG、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇)、二丙二醇(DPG)、聚乙二醇家族(PEG300-600)、己二醇、肌醇、甘露醇、乙醇、异丙醇、正丁氧基丙氧丙醇、乙醇胺(单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)、蔗糖、右旋糖、葡萄糖、核糖、木糖以及相关的单和二吡喃糖苷和呋喃糖苷。
溶剂系统典型地按重量计以全部地5％-90％、5％-60％、5％-40％、10％-30％存在。
包在PVA膜中的单位剂量的含水量典型地在1％-15％、2％-12％、3％-10％、5％-10％的范围内。
包在PVA膜中的单位剂量的多元醇含量典型地在5％-50％、10％-40％、或20％-30％的范围内。
在实施例中，表面活性剂是非天然存在的表面活性剂。
水溶助剂
水溶助剂是如下化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)，然而水溶助剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon和Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体及界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示在形成胶束、薄层或其他明确界定的中间相(meso-phase)的表面活性剂和脂质中所见的临界浓度(高于此浓度则发生自聚集)。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以含有按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以含有约0-65％、0-20％、或0.5％-5％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是10％-65％、特别是20％-40％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。非限制性实例是柠檬酸盐、碳酸钠、碳酸氢钠、和柠檬酸钠。磷酸盐的实例包括1-羟基亚乙基-1,1-二磷酸(HEDP，依替磷酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)(DTPMP)、乙二胺四(亚甲基磷酸)(EDTMPA)、氨基三(亚甲基磷酸)(ATMP)、次氮基三亚甲基磷酸(NTMP)、2-氨乙基磷酸(AEPn)、二甲基甲基磷酸酯(DMPP)、四亚甲基二胺四(亚甲基磷酸)(TDTMP)、六亚甲基二胺四(亚甲基磷酸)(HDTMP)、磷酸丁烷-三羧酸(PBTC)、N-(磷酰甲基)亚氨基二乙酸(PMIDA)、2-羧乙基磷酸(CEPA)、2-羟基磷酰羧酸(HPAA)、和氨基-三-(亚甲基-磷酸)(AMP)。L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐(GLDA).、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)。助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
在实施例中，助洗剂或共助洗剂是非天然存在的助洗剂或共助洗剂。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―脲(1:1)、预成型过酸及其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐、二过氧二羧酸、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白系统，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
Figure BDA0002728219320000431
(iii)及其混合物，
其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
在实施例中，漂白系统是非天然存在的漂白系统。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0％-10％(例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧酸酯(如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
在实施例中，聚合物是非天然存在的聚合物。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或颜料，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index，C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO2005/03276和EP 1876226中所描述的(将其通过引用并入本文)。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
通常，一种或多种所选酶的特性应与所选的洗涤剂相容(即，最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、枝顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％同一性，或具有以下序列的家族44木葡聚糖酶，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％同一性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
甘露聚糖酶
合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森等人，蛋白质工程(Protein Eng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；以及描述于WO 89/06279中的迟缓枯草杆菌蛋白酶(subtilisinlentus)、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024和WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO95/23221中)及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中)。
金属蛋白酶的实例是如WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中所描述的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274，使用BPN’进行编号。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0002728219320000471
DuralaseTm、DurazymTm、
Figure BDA0002728219320000472
Ultra、
Figure BDA0002728219320000473
Ultra、
Figure BDA0002728219320000474
Ultra、
Figure BDA0002728219320000475
Ultra、
Figure BDA0002728219320000476
和
Figure BDA0002728219320000477
(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：
Figure BDA0002728219320000478
Figure BDA0002728219320000479
Purafect
Figure BDA00027282193200004710
PreferenzTm、Purafect
Figure BDA00027282193200004711
Purafect
Figure BDA00027282193200004712
Purafect
Figure BDA00027282193200004713
EffectenzTm、
Figure BDA00027282193200004714
Figure BDA00027282193200004715
以及
Figure BDA00027282193200004716
(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(示于US5352604的图29中的序列)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶：
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如在EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
仍其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：
可以与本发明的变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的合适的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他合适的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2进行编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(例如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、StainzymePlusTM、NatalaseTM和BANTM(来自诺维信公司(Novozymes A/S))、以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、PoweraseTM、Preferenz S1000TM Preferenz S110TM和PreferenzS100TM(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶：
根据本发明的过氧化物酶是由酶分类EC 1.11.1.7囊括的由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(IUBMB)规定的酶，或来源于其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中所描述的那些。
根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯离子形成次氯酸盐。
在实施例中，卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选的方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯离子来源组合。
已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，例如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已从细菌，例如假单胞菌属(例如吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中，卤代过氧化物酶可来源于弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)或不等弯孢，如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS 102.42；或如描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或来源于如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii、如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie、或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium属物种。
根据本发明的氧化酶特别包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或来源于其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌的合适实例包括可来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。
来自细菌的合适的实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是来源于拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是来源于灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或来源于嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。
无粉尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露地产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇，例如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。特别地，粉末洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,MarcelDekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]中。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地含有另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用合适用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选的是荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals andChemicals)供应。合适用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,第7章,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中详细描述的(通过引用并入本文)。此外，随机接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(通过引用并入本文)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP 1867808或WO 2003/040279中所描述的那些(将二者都通过引用并入本文)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
流变改性剂-是结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如，如在EP 2169040中所示。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、防皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、色素、抑泡剂、和溶剂。
蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂可以是使蛋白酶稳定或抑制蛋白酶以使得洗衣皂条中的蛋白酶或其他一种或多种酶不降解的任何化合物。蛋白酶抑制剂的实例是抑肽酶、贝他定(bestatin)、钙蛋白酶抑制剂I和II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮肽素、抑肽素、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硼酸、硼酸盐、硼砂、硼酸、苯基硼酸(如4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA))、肽醛或其次硫酸盐加合物或半缩醛加合物以及肽三氟甲基酮。可以存在一种或多种蛋白酶抑制剂，如5、4、3、2或1种抑制剂，其中至少一种是肽醛、其亚硫酸氢盐加合物或半缩醛加合物。
肽醛抑制剂
肽醛可以具有式P-(A)y-L-(B)x-B0-H，或其亚硫酸氢盐加合物或半缩醛加合物，其中：
i.H是氢；
ii.B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基；
iii.(B)x的x是1、2或3，并且B独立地是经由B氨基酸的C-末端连接到B0上的单一氨基酸
iv.L不存在或L独立地是式-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝S)-C(＝S)-或-C(＝S)-C(＝O)-的连接基团；
v.(A)y的y是0、1或2，并且A独立地是经由A氨基酸的N-末端连接到L上的单一氨基酸残基，其前提是如果L不存在，那么A不存在；
vi.P选自下组，该组由以下组成：氢和一种N-末端保护基团，其条件是如果L不存在，那么P是一种N-末端保护基团；
vii.R独立地选自下组，该组由以下组成：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
viii.R'独立地选自下组，该组由以下组成：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；以及
ix.R”是C1-6烷基基团。
x可以是1、2或3并且因此B对应地可以是1、2或3个氨基酸残基。因此，B可以代表B1、B2-B1、或B3-B2-B1，其中B3、B2、和B1各自代表一个氨基酸残基。y可以是0、1或2并且因此A可以不存在，或是对应地具有式A1或A2-A1的1个或2个氨基酸残基，其中A2和A1各自表示一个氨基酸残基。
B0可以是具有L或D构型的单一氨基酸残基，它经由氨基酸的C-末端被连接到H上，其中R是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基侧链，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基或苄基，并且其中R可以任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代。特别实例是D-或L-形式的精氨酸(Arg)、3,4-二羟基苯丙氨酸、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、间酪氨酸、对酪氨酸(Tyr)以及缬氨酸(Val)。特别实施例是当B0是亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、对酪氨酸以及缬氨酸时。
经由B1氨基酸的C-末端连接到B0上的B1可以是脂肪族、疏水性和/或中性氨基酸。B1的实例是丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(GIy)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(VaI)。B1的特别实例是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸。特别实施例是当B1是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸时。
如果存在，经由B2氨基酸的C-末端连接到B1上的B2可以是脂肪族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。B2的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(capreomycidine，Cpd)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(GIy)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(VaI)。B2的特别实例是丙氨酸、精氨酸、卷须霉啶、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸以及缬氨酸。特别实施例是当B2是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸时。
经由B3氨基酸的C-末端连接到B2上的B3(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。B3的实例是异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(VaI)。B3的特别实例是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。
连接基团L可以不存在或选自下组，该组由以下组成：-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝S)-C(＝S)-或-C(＝S)-C(＝O)-。特别实施例是当L不存在或L是羰基基团-C(＝O)-时。
经由氨基酸的N-末端连接到L上的A1(如果存在)可以是脂肪族、芳香族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。A1的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(Cpd)、甘氨酸(GIy)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(VaI)。A1的特别实例是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及缬氨酸。特别实施例是当B2是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸时。
经由氨基酸的N-末端连接到A1上的A2残基(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。A2的实例是精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(VaI)。A2的特别实例是苯丙氨酸和酪氨酸。
N-末端保护基团P(如果存在)可以选自甲酰基、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、三氟乙酰基、甲氧基琥珀酰基、芳香族和脂肪族氨基甲酸乙酯保护基团，如芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲氧基羰基、(氟甲氧基)羰基、苄氧基羰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)以及金刚烷基氧基羰基；对甲氧基苄基羰基(Moz)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、对甲氧基苯基(PMP)、甲氧基乙酰基、甲基氨基羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、苄基磺酰基、甲基磷酰胺基(MeOP(OH)(＝O))以及苄基磷酰胺基(PhCH2OP(OH)(＝O))。
肽醛的通式还可以写成：P-A2-A1-L-B3-B2 B1-B0-H，其中P、A2、A1、L、B3、B2、B1、和B0如上文所定义。
在具有保护基团的三肽醛(即x＝2，L不存在并且A不存在)的情况下，P优选地是乙酰基、甲氧基羰基、苄氧基羰基、甲基氨基羰基、甲基磺酰基、苄基磺酰基以及苄基磷酰胺基。在具有保护基团的四肽醛(即x＝3，L不存在并且A不存在)的情况下，P优选地是乙酰基、甲氧基羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基以及甲基磷酰胺基。
合适的肽醛描述于WO 94/04651、WO 95/25791、WO 98/13458、WO 98/13459、WO98/13460、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 07/141736、WO 07/145963、WO 09/118375、WO10/055052以及WO 11/036153中。
更具体地说，肽醛可以是
Cbz-Arg-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N2-[(苯基甲氧基)羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Ac-Gly-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Cbz-Gly-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Cbz-Gly-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
Cbz-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
Cbz-Gly-Ala-Phe-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯乙基]-)，
Cbz-Gly-Ala-Val-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-甲基丙基]-)，
Cbz-Gly-Gly-Tyr-H(甘氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Cbz-Gly-Gly-Phe-H(甘氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯乙基]-)，
Cbz-Arg-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N2-[(苯基甲氧基)羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Cbz-Leu-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]-L-亮氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)
Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-亮氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-酪氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯乙基]-)，
Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N-乙酰基-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H(L-丙氨酰胺,N-乙酰基-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-(甲硫基)丙基]-)，
Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N-乙酰基-L-色氨酰基-L-亮氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-)，
MeO-CO-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(甲氧羰基)-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
MeNHCO-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(氨基甲基羰基)-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(甲氧羰基)-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H(L-丙氨酰胺,N-(甲氧羰基)-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯乙基]-)，
MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(甲磺酰基)-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
MeSO2-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(甲磺酰基)-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[羟基(苯基甲氧基)氧膦基]-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-(乙磺酰基)-L-苯丙氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[(苯甲基)磺酰基]-L-缬氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[羟基(苯基甲氧基)氧膦基]-L-亮氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，
PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H(L-丙氨酰胺,N-[羟基(苯基甲氧基)氧膦基]-L-苯并酰胺基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)，或
MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H；(L-丙氨酰胺，N-(羟基甲氧基氧膦基)-L-亮氨酰基甘氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-3-甲基丁基]-)。
优选实例是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H。
此类肽醛的另外的实例包括
α-MAPI(3,5,8,11-四氮杂十三酸,6-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-12-甲酰基-9-(1-甲基乙基)-4,7,10-三氧代-13-苯基-2-(苯甲基)-,(2S,6S,9S,12S)-
L-缬氨酰胺,N2-[[(1-羧基-2-苯基乙基)氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-,[1(S),2(S)]-；L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯基乙基]-(9CI)；SP-胰凝乳蛋白酶抑制剂B)，
β-MAPI(L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1R)-1-甲酰基-2-苯乙基]-L-缬氨酰胺,N2-[[(1-羧基-2-苯乙基)氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-,[1(S),2(R)]-)，
Phe-C(＝O)-Arg-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-(9CI))，
Phe-C(＝O)-Gly-Gly-Tyr-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,12-甲酰基-13-(4-羟基苯基)-4,7,10-三氧代-2-(苯甲基),(2S,12S)-)，
Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Phe-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,12-甲酰基-9-甲基-4,7,10-三氧代-13-苯基-2-(苯甲基)-,(2S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Tyr-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,12-甲酰基-13-(4-羟基苯基)-9-甲基-4,7,10-三氧代-2-(苯甲基)-,(2S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Leu-H(3,5,8,11-四氮杂十五酸,12-甲酰基-9,14-二甲基-4,7,10-三氧代-2-(苯甲基)-,(2S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Nva-H(3,5,8,11-四氮杂十五酸,12-甲酰基-9-甲基-4,7,10-三氧代-2-(苯甲基)-,(2S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Nle-H(3,5,8,11-四氮杂十六酸,12-甲酰基-9-甲基-4,7,10-三氧代-2-(苯甲基)-,(2S,9S,12S)-)，
Tyr-C(＝O)-Arg-Val-Tyr-H(L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-(4-羟基苯基)乙基]-(9CI))
Tyr-C(＝O)-Gly-Ala-Tyr-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,12-甲酰基-13-(4-羟基苯基)-2-[(4-羟基苯基)甲基]-9-甲基-4,7,10-三氧代-,(2S,9S,12S)-)
Phe-C(＝S)-Arg-Val-Phe-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,6-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-12-甲酰基-9-(1-甲基乙基)-7,10-二氧代-13-苯基-2-(苯甲基)-4-硫代-,(2S,6S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝S)-Arg-Val-Tyr-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,6-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-12-甲酰基-13-(4-羟基苯基)-9-(1-甲基乙基)-7,10-二氧代-2-(苯甲基)-4-硫代-,(2S,6S,9S,12S)-)，
Phe-C(＝S)-Gly-Ala-Tyr-H(3,5,8,11-四氮杂十三酸,12-甲酰基-13-(4-羟基苯基)-9-甲基-7,10-二氧代-2-(苯甲基)-4-硫代-,(2S,9S,12S)-)，
抗痛素(L-缬氨酰胺,N2-[[(1-羧基-2-苯乙基)氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[4-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-1-甲酰基丁基]-)，
GE20372A(L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1S)-1-甲酰基-2-苯乙基]-
L-缬氨酰胺,N2-[[[1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-,[1(S),2(S)]-)，
GE20372B(L-缬氨酰胺,N2-[[[(1S)-1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-[(1R)-1-甲酰基-2-苯乙基]-
L-缬氨酰胺,N2-[[[1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基]羰基]-L-精氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-,[1(S),2(R)]-)，
胰凝乳蛋白酶抑制剂A(L-亮氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-3,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-
L-亮氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-(9CI)；L-亮氨酰胺,L-2-(2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基)-N-[[(1-羧基-2-苯乙基)氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-，立体异构体)，
胰凝乳蛋白酶抑制剂B(L-缬氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-3,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-
L-缬氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-(9CI)；L-缬氨酰胺,L-2-(2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基)-N-[[(1-羧基-2-苯乙基)氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-，立体异构体)，以及
胰凝乳蛋白酶抑制剂C(L-异亮氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-3,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-
L-异亮氨酰胺,(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-(9CI)；L-异亮氨酰胺,L-2-(2-氨基-1,4,5,6-四氢-4-嘧啶基)-N-[[(1-羧基-2-苯乙基)氨基]羰基]甘氨酰基-N-(1-甲酰基-2-苯乙基)-，立体异构体)。
肽醛加合物
代替肽醛，蛋白酶抑制剂可以是肽醛的加合物。加合物可以是具有式P-(A)y-L-(B)x-N(H)-CHR-CH(OH)-SO3M的亚硫酸氢盐加合物，其中P、A、y、L、B、x以及R如上文所定义，并且M是H或碱金属、优选地Na或K。可替代地，加合物可以是具有式P-(A)y-L-(B)x-N(H)-CHR-CH(OH)-OR的半缩醛，其中P、A、y、L、B、x、和R如上文所定义。优选实施例是亚硫酸氢盐加合物，其中P＝Cbz，B2＝Gly；B1＝Ala；B0＝Tyr(因此R＝PhCH2，R’＝OH)，x＝2，y＝0，L＝A＝不存在并且M＝Na(Cbz-Gly-Ala-N(H)-CH(CH2-p-C6H4OH)-CH(OH)-SO3Na，L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[2-羟基-1-[(4-羟基苯基)甲基]-2-磺乙基]-,钠盐(1:1))。
肽醛的亚硫酸氢盐加合物的通式还可以写成P-A2-A1-L-B3-B2-B1-N(H)-CHR-CH(OH)-SO3M，其中P、A2、A1、L、B3、B2、B1、R、和M如上文所定义。
可替代地，肽醛的加合物可以是Cbz-Gly-Ala-N(H)-CH(CH2-p-C6H4OH)-CH(OH)-SO3Na((2S)-[(N-{N-[((苄氧基))羰基]甘氨酰基}-L-丙氨酰基)氨基]-1-羟基-3-(4-羟基苯基)丙烷-1-磺酸钠)或Cbz-Gly-Ala-N(H)-CH(CH2Ph)-CH(OH)-SO3Na((2S)-[(N-{N-[((苄氧基))羰基]甘氨酰基}-L-丙氨酰基)氨基]-1-羟基-3-(苯基)丙烷-1-磺酸钠)或“MeO-CO_Val-Ala-N(H)-CH(CH2CH(CH3)2)-CH(OH)-SO3Na((2S)-[(N-{N-[((苄氧基))羰基]甘氨酰基}-L-丙氨酰基)氨基]-1-羟基-3-(2-丙基)丙烷-1-磺酸钠)。
其他优选的肽醛亚硫酸氢盐是
Cbz-Arg-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na(L-丙氨酰胺,N-[(苯基甲氧基)羰基]甘氨酰基-N-[2-羟基-1-[(4-羟基苯基)甲基]-2-磺乙基]-,钠盐(1:1))，
Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH2Ph)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH(CH3)2)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Gly-Gly-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Gly-Gly-NHCH(CH2Ph)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Arg-Val-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Cbz-Leu-Val-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Leu-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Tyr-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2Ph)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Phe-Gly-Val-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2CH2SCH3)(SO3M)-H，其中M＝Na，
Ac-Trp-Leu-Val-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeO-CO-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeNCO-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeO-CO-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeO-CO-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2Ph)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeSO2-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeSO2-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
PhCH2O(OH)(O)P-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
EtSO2-Phe-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
PhCH2SO2-Val-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
PhCH2O(OH)(O)P-Leu-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
PhCH2O(OH)(O)P-Phe-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，
MeO(OH)(O)P-Leu-Gly-Ala-NHCH(CH2CH(CH3)2))C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na，以及
Phe-脲-Arg-Val-NHCH(CH2C6H4OH)C(OH)(SO3M)-H，其中M＝Na。
盐
条中所用的盐是一价阳离子与有机阴离子的盐。一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +。有机阴离子可以是例如甲酸根、乙酸根、柠檬酸根或乳酸根。由此，一价阳离子与有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乳酸钠、乳酸钾、乳酸铵、单柠檬酸钠、二柠檬酸钠、三柠檬酸钠、柠檬酸钠钾、柠檬酸钾、柠檬酸铵等。特别实施例是甲酸钠。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合用于容持组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许组合物从袋中释放出来。袋由水溶性膜制成，它包含内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包含可水解降解并且可水溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考：(US 2009/0011970A1)。
可以由水溶性袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分开。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
产生组合物的方法
本发明还涉及产生组合物的方法。
用途
本发明还针对用于使用其组合物的方法。
在洗涤剂中的用途。
可以将本发明的多肽被添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
例如，本发明的洗涤剂组合物可以被配制为手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污渍的织物的衣物洗涤添加剂组合物和冲洗添加型织物软化剂组合物，或被配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或被配制以用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在一个特定方面，本发明提供了包含如本文所述的本发明多肽的洗涤剂添加剂。
实例
材料与方法
PCR、克隆、连接核苷酸等的通用方法是本领域普通技术人员熟知的并且可以例如发现于“Molecular cloning:A laboratory manual[分子克隆：实验室手册]”,Sambrook等人(1989),Cold Spring Harbor lab.[冷泉港实验室],冷泉港，纽约州；Ausubel,F.M.等人(编辑)；“Current protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]”,JohnWiley and Sons[约翰威立父子公司],(1995)；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编辑)；“DNACloning:A Practical Approach[DNA克隆：实用方法],第I和II卷”,D.N.Glover编辑(1985)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”,M.J.Gait编辑(1984)；“NucleicAcid Hybridization[核酸杂交]”,B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)；“A PracticalGuide To Molecular Cloning[分子克隆实用指南]”,B.Perbal,(1984))。
标准洗涤剂A的组合物(液体)
洗涤剂A的组合物(液体)：成分：12％LAS、11％AEO Biosoft N25-7(NI)、7％AEOS(SLES)、6％MPG(丙二醇)、3％乙醇、3％TEA、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有的百分数都是w/w)。
蛋白酶
用于实例的蛋白酶是Progress
Figure BDA0002728219320000671
101L(批次QHN00001，一种可商购的蛋白酶产品，可从巴格斯瓦德(Bagsvaerd)的诺维信公司(Novozymes A/S)获得，并且包含100PRMU-U/g的蛋白酶活性)，或Progress
Figure BDA0002728219320000672
101L(批次QIP00006，一种可商购的蛋白酶产品，可从巴格斯瓦德(Bagsvaerd)的诺维信公司(Novozymes A/S)获得，并且包含29PRMU-E/g的蛋白酶活性。
纤维素活性的测定
遵循制造商的说明书，使用由麦格酶公司(Megazyme)提供的纤维素酶测定试剂盒(CellG5方法)(爱尔兰威克洛市；产品代码：K-CellG5-4V)确定纤维素活性。
用于测量内切-纤维素酶(内切-1,4-β-葡聚糖酶)的CellG5测定试剂含有两个组分；
1)4,6-O-(3-酮基亚丁基)-4-硝基苯基-β-D-纤维五糖苷(cellopentaoside)(BPNPG5)和2)热稳定的β-葡糖苷酶。酮阻断基团通过BPNPG5上的β-葡糖苷酶预防任何水解作用。与内切-纤维素酶孵育产生非阻断比色寡糖，该寡糖被辅助β-葡糖苷酶快速水解。因此，4-硝基苯酚的形成速率直接与内切纤维素酶水解BPNPG5有关。
实例1：确定纤维素酶变体的稳定性
在含有蛋白酶的50％液体洗涤剂A中测量纤维素酶变体的稳定性。在孵育含有蛋白酶的酶-洗涤剂混合物之后，通过CellG5试剂盒测量变体的活性以评估洗涤剂中稳定性。
50％洗涤剂A中的温度/蛋白酶应激条件：
在96孔微板(聚苯乙烯)中，将60μL的酶溶液(在缓冲液(100mM Hepes；0.01％吐温-20；pH 7.5)中稀释的上清液或纯化酶)与含有蛋白酶(0.166v/v-％蛋白酶Progress
Figure BDA0002728219320000681
101L)的60μL洗涤剂A混合。
将15μL的酶/洗涤剂混合物转移到两个新的384孔微板并且密封。将两个相同的板中的一个在5℃下储存(参考)，而另一个在40℃(应激)下孵育16小时。孵育后，将60μL的测定缓冲液(100mM Hepes；0.01％吐温-20；pH 7.5)添加到两个板的样品中并且剧烈混合用于随后的活性测量。
纤维素分解活性的测定样品(CellG5试剂盒)：
通过在UV-透明384孔微板中，将20μL稀释的酶-洗涤剂混合物与10μL测定缓冲液(100mM Hepes；0.01％吐温-20；pH 7.5)以及10μL新鲜制备的底物溶液混合来测量酶活性。通过混合10μL的瓶#2与300μL瓶#1制备CellG5测定试剂盒的底物溶液。
使用酶标仪(Tecan；Infinite,M1000，专业版)动态地测量(每2分钟，持续44分钟)UV-吸光度(405nm)。将显示恒定吸光度增加的曲线部分用于计算样品的酶活性(mOD/min)。之后，将残余活性计算为在40℃下孵育16小时的样品的酶活性相对于在5℃下储存的对应样品的酶活性。
残余活性(％)＝(在40℃下孵育的样品的活性/在5℃下孵育的样品的活性)*100
残余活性比(RAR)
通过使用具有SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶作为参考来计算每种条件下的残余活性比。如上所述测试变体，并使用以下公式计算RAR：
残余活性比(RAR)＝(变体的RA)/(参考的RA)
实例2：通过定点诱变构建变体
定点变体是构建自土生梭孢壳纤维素酶(SEQ ID NO 1)。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],1989)。
对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如IDTDNA。为了测试本发明的变体，将包含本发明的变体的突变DNA通过同源重组而整合到感受态米曲霉菌株中，使用标准方案(基于酵母提取物的培养基，4-5天，30℃)发酵，并通过色谱法纯化。
实例3：变体的残余活性
使用实例1中描述的测定分析实例2中制备的变体的稳定性。
以下列出了与参考序列相比具有改善的稳定性的所有变体。
表1列出了与参考相比具有改善的稳定性的变体，其中变体的RAR与标准的平均值之差为标准偏差的至少2倍。
表1：具有两个标准偏差选择标准的最佳命中
将残余活性比(RAR)计算为百分比残余活性相对于标准的平均百分比残余活性。StdZ计算为RAR与标准的平均值之差除以RAR(标准)的标准偏差。基于StdZ大于2(StdZ>2)选择命中(hit)
Figure BDA0002728219320000691
Figure BDA0002728219320000701
Figure BDA0002728219320000711
Figure BDA0002728219320000721
表2列出了具有改善的稳定性的所有变体，其中将改善的稳定性确定为RAR值大于1.1。
表2：基于RAR大于1.1(RAR≥1.1)选择的命中
将残余活性比(RAR)计算为百分比残余活性相对于标准的平均百分比残余活性。将RAR值大于或等于1.1的变体选为命中。
Figure BDA0002728219320000722
Figure BDA0002728219320000731
Figure BDA0002728219320000741
Figure BDA0002728219320000751
Figure BDA0002728219320000761
实例4：通过定点诱变构建变体
定点变体是构建自特异腐质霉纤维素酶(SEQ ID NO:2)。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],1989)。
对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如IDTDNA。为了测试变体，将包含变体的突变DNA通过同源重组而整合到感受态米曲霉菌株中，使用标准方案(基于酵母提取物的培养基，4-5天，30℃)发酵，并通过色谱法纯化。
实例5：变体的残余活性
使用实例1中描述的测定分析实例4中制备的变体的稳定性，不同之处是蛋白酶的最终剂量(resulting dose)是：0.45v/v-％Progress Excel，并且将活性计算为在33.5℃(代替40℃)下孵育的样品的酶活性相对于在5℃下储存的对应样品的酶活性。
表3列出了亲本(SEQ ID NO:2)和变体的残余活性(如实例1中所描述的计算)，以及SEQ ID NO:2的亲本与用于进行编号的SEQ ID NO:1的位置对应。
表3：
Figure BDA0002728219320000771
Figure BDA0002728219320000781
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 稳定化的纤维素酶变体
<130> 14670-WO-PCT
<160> 4
<170> PatentIn3.5版
<210> 1
<211> 278
<212> PRT
<213> 土生梭孢壳
<400> 1
Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro
1 5 10 15
Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro Val Tyr Ala
20 25 30
Cys Asp Ala Asn Phe Gln Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val Gln Ser Gly
35 40 45
Cys Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala
50 55 60
Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly
65 70 75 80
Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr
100 105 110
Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly
115 120 125
Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ser Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asp Gln Cys Asp Ser Phe
145 150 155 160
Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln
165 170 175
Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Gln Val Gln Cys Pro Ala
180 185 190
Glu Ile Val Ala Arg Ser Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp Ser Ser Phe
195 200 205
Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Gly Thr Pro
210 215 220
Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Ser
245 250 255
Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp
260 265 270
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
275
<210> 2
<211> 283
<212> PRT
<213> 特异腐质霉
<400> 2
Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn
20 25 30
Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu
35 40 45
Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val
50 55 60
Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser
65 70 75 80
Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser
85 90 95
Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly
100 105 110
Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly
115 120 125
Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly
130 135 140
Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro
145 150 155 160
Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn
165 170 175
Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu
180 185 190
Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro
195 200 205
Ala Val Gln Ile Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln
225 230 235 240
Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly
245 250 255
Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys
260 265 270
Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu
275 280
<210> 3
<211> 295
<212> PRT
<213> 大孢圆孢霉
<400> 3
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Ser
20 25 30
Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp
35 40 45
Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Thr Asn His Phe Asp Leu Ala Met Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Pro Gln Phe Gly Gly Leu Ala Gly Asp
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Val
195 200 205
Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Ala Lys Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Lys Ala
225 230 235 240
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ser Ser Gln Thr Ser Ser Ser Thr Gly
245 250 255
Gly Gly Cys Ala Ala Gln Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe
260 265 270
Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Asn Lys Gln Asn
275 280 285
Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
290 295
<210> 4
<211> 277
<212> PRT
<213> 嗜热枝顶孢霉
<400> 4
Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser
1 5 10 15
Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys
20 25 30
Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys
35 40 45
Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val
50 55 60
Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser
85 90 95
Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly
100 105 110
Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly
115 120 125
Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly
130 135 140
Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro
145 150 155 160
Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn
165 170 175
Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu
180 185 190
Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro
195 200 205
Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr Thr Ser Thr Thr
210 215 220
Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr Gly Phe Thr Gly
245 250 255
Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Gln Asn Gln Trp
260 265 270
Tyr Ser Gln Cys Leu
275

Claims (20)

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的变体，其中该变体与具有SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶具有至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、例如至少95％序列同一性、例如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、例如至少98％序列同一性、例如至少99％序列同一性，并且其中与具有SEQ ID NO:1序列的内切葡聚糖酶相比，该变体在包含蛋白酶的水性组合物中具有改善的稳定性。
2.一种具有内切葡聚糖酶活性的变体，其中该变体与具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的内切葡聚糖酶具有至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、例如至少95％序列同一性、例如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、例如至少98％序列同一性、例如至少99％序列同一性，并且其中与具有SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4序列的内切葡聚糖酶相比，该变体在包含蛋白酶的水性组合物中具有改善的稳定性。
3.一种具有内切葡聚糖酶活性的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至212或SEQ ID NO:1的氨基酸1至216、SEQ ID NO:2的氨基酸1至211或SEQ ID NO:2的氨基酸1至212、SEQ ID NO:3的氨基酸1至211或SEQ ID NO:3的氨基酸1至210、SEQ ID NO:4的氨基酸1至211具有至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性、例如至少90％序列同一性、例如至少95％序列同一性、例如至少96％序列同一性、例如至少97％序列同一性、例如至少98％序列同一性、例如至少99％序列同一性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体具有残余活性比(RAR)，其中该RAR至少增加了测定的标准偏差的2倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体具有至少1.1的RAR。
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中与具有SEQ ID NO:1的多肽相比，该变体在与SEQ ID NO:1的以下位置对应的一个或多个位置处包含取代：4、6、25、32、37、41、44、51、56、77、80、82、83、85、91、93、94、96、98、100、101、103、104、114、117、118、132、133、134、137、146、147、148、152、156、159、162、166、169、179、183、184、186、194、201、202、211、213、或219。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中这些取代选自由以下组成的组：X4A、X6M、X6N、X6W、X6Y、X25G、X32S、X37W、X41T、X44D、X51N、X56A、X77N、X80K、X80L、X82I、X83D、X85D、X85I、X85K、X85M、X85V、X91F、X93M、X94K、X94L、X94N、X94Q、X96A、X96F、X96R、X96V、X98T、X100A、X100S、X100T、X101D、X101E、X101H、X101K、X101L、X101R、X101V、X103A、X103L、X103M、X103Q、X104A、X104D、X104I、X104K、X104L、X104M、X104K、X104N、X104Q、X104R、X104V、X104Y、X114A、X114F、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114R、X114W、X114Y、X117R、X118I、X132K、X132L、X132R、X132V、X133Y、X134D、X137A、X137D、X137E、X137G、X137K、X137M、X137N、X137R、X146D、X146E、X146G、X146K、X146R、X146S、X146T、X147D、X147E、X147K、X147R、X147T、X148W、X148F、X152D、X152K、X152R、X156E、X159D、X159E、X162E、X166S、X169F、X169W、X169Y、X179S、X179T、X183V、X184A、X184L、X184M、X186R、X194L、X194S、X201R、X202G、X202L、X211H、X211K、X211L、X211N、X211P、X211V、X211W、X213Q、X219W以及其组合。
8.根据权利要求7所述的变体，其中这些取代选自由以下组成的组：S4A、Q6M、Q6N、Q6W、Q6Y、A25G、A32S、F37W、S41T、N44D、G51N、S56A、S77N、G80K、G80L、S82I、E83D、S85D、S85I、S85K、S85M、S85V、Y91F、L93M、T94K、T94L、T94N、T94Q、T96A、T96F、T96R、T96V、G98T、V100A、V100S、V100T、A101D、A101E、A101H、A101K、A101L、A101R、A101V、K103A、K103L、K103M、K103Q、T104A、T104D、T104I、T104K、T104L、T104M、T104K、T104N、T104Q、T104R、T104V、T104Y、G114A、G114F、G114H、G114I、G114K、G114L、G114M、G114R、G114W、G114Y、G117R、S118I、I132K、I132L、I132R、I132V、F133Y、N134D、S137A、S137D、S137E、S137G、S137K、S137M、S137N、S137R、A146D、A146E、A146G、A146K、A146R、A146S、A146T、Q147D、Q147E、Q147K、Q147R、Q147T、Y148W、Y148F、S152D、S152K、S152R、Q156E、S159D、S159E、A162E、P166S、Q169F、Q169W、Q169Y、D179S、D179T、F183V、T184A、T184L、T184M、Q186R、I194L、I194S、K201R、R202G、R202L、F211H、F211K、F211L、F211N、F211P、F211V、F211W、P213Q、G219W以及其组合。
9.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的变体。
10.一种表达构建体，该表达构建体包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求9所述的多核苷酸或根据权利要求10所述的表达构建体。
12.一种产生根据权利要求1-8中任一项所述的变体的方法，该方法包括：在导致表达该变体的条件下生长根据权利要求11所述的宿主细胞。
13.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的变体。
14.根据权利要求13所述的组合物，该组合物进一步包含蛋白酶。
15.根据权利要求14所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下的一种或多种额外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的组合物，该组合物是洗涤剂组合物。
17.根据权利要求16所述的组合物，该组合物进一步包含选自表面活性剂、助洗剂、和共助洗剂的一种或多种化合物，以及聚合物。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，该组合物是液体洗涤剂组合物。
19.根据权利要求1-8中任一项所述的变体在清洁织物、纺织品、或硬表面中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，该用途包含根据权利要求13-18中任一项所述的组合物的用途。
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