DE69333454T2

DE69333454T2 - Zellulosevarianten

Info

Publication number: DE69333454T2
Application number: DE69333454T
Authority: DE
Inventors: Martin Schülein; Henrik Fredholm; Mailand Carsten HJORT; Grethe Rasmussen; Egon Nielsen; Peter Rosholm
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1992-10-06
Filing date: 1993-10-06
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2013-10-07
Also published as: FI951629A; EP1431389A3; DE69333454D1; US6114296A; EP1431389A2; JP3681750B2; MX9306229A; KR100303619B1; KR100303622B1; WO1994007998A1; FI951629A0; US5792641A; KR100303621B1; EP0663950B1; EP0663950A1; JPH08501692A; ATE262035T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Endoglukanase-Varianten mit reduzierter Empfindlichkeit für Oxidation.
HINTERGRUND DER ERINDUNG
Enzyme, die Cellulase zersetzen können (im Folgenden als „cellulolytische Enzyme" oder „Cellulasen" bezeichnet) können bei der Papierzellstoffverarbeitung zum Entfernen von nichtkristallinen Celluloseteilen verwendet werden, womit das Verhältnis von kristalliner Cellulose im Zellstoff und in Tierfutter zur Verbesserung der Verdaulichkeit von Glucanen erhöht wird. Eine weitere wichtige Verwendung von cellulolytischen Enzymen besteht für die Textilverarbeitung, z.B. zum Reduzieren der Härte von baumwollhaltigen Stoffen (vgl. z.B. GB 1 368 599 oder US 4,435,307 ), zur Schmutzentfernung und Farbklärung von Stoffen (vgl. z.B. EP 220 016 ) oder zum Bereitstellen einer örtlich begrenzten Farbabweichung unter Erhalt von Stoffen mit einem „stone-washed" Erscheinungsbild (vgl. z.B. EP 307 564 ).
Die praktische Nutzung von cellulolytischen Enzymen wurde durch die Natur der bekannten Cellulase-Zubereitungen, die oftmals komplexe Gemische aus einer Vielzahl von einzelnen Cellulasebestandteilen sind und eine sehr geringe spezifische Aktivität aufweisen können, zum Teil zurückgestellt. Es ist schwierig, die Herstellung von einzelnen Bestandteilen in Mehrfach-Enzymsystemen zu optimieren und folglich eine industrielle kosteneffiziente Produktion von cellulolytischen Enzymen zu realisieren, und deren gegenwärtige Verwendung wurde durch Schwierigkeiten erschwert, die aus der Notwendigkeit entstehen, zum Erzielen der gewünschten Wirkung sehr große Mengen der Enzyme einzusetzen.
Die Nachteile der vorstehend vorgeschlagenen cellulolytischen Enzyme können durch Verwendung von Enzymen mit einem einzelnen Bestandteil, die für eine hohe spezifische Aktivität ausgewählt sind, behoben werden. Cellulasen mit einem einzelnen Bestandteil sind z.B. in WO 91/17243, WO 91/17244 und WO 91/10732 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Weitere Untersuchungen zeigten nun, dass reduzierte Empfindlichkeit für die Oxidation von Endoglukanase durch eine oder mehrere spezifische Mutationen in der eine spezifische Endoglukanase exprimierenden DNA-Sequenz erhalten werden kann.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung eine Endoglukanase-Variante einer mikrobiellen Stamm-Endoglukanase, wobei die Stamm-Endoglukanase die 43 kD Endoglukanase von Humicola insolens, dargestellt in 1 als 43 kdhum, oder eine Endoglukanase, wobei die Aminsäuresequenz davon zu mindestens 45% über die gesamte Länge identisch mit der 43 kDa Endoglukanase von Humicola insolens ist, wobei ein oder mehrere Tyrosine an einer Position, die der Position 8 und 147 der 43 kDa Stamm-Endoglukanase von Humicola insalens entspricht, durch ein Serin, Asparagin, Glutamin, Prolin, Phenylalanin, eine Glutaminsäure, ein Arginin oder Glycin substituiert ist/sind.
Weiterhin weisen die Endoglukanase-Varianten der Erfindung, wenn sie in Detergenz-Zusammensetzung verwendet werden, im Hinblick auf reduzierte Empfindlichkeit für Oxidation oder die Gegenwart von Peroxidase-Bleichsystemen verbesserte Eigenschaften auf.
Die Erfindung betrifft auch Detergenz-Zusammensetzungen, die eine Endoglukanase-Variante der Erfindung umfassen.
ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Sequenzaufreihung von 43 kD Cellulasen von Humicola insolens, Fusarium oxysporum bzw. Pseudomonas fluorescens.
2 zeigt den Aufbau von pCaHj 170.
3 zeigt die stellengerichtete Mutagenese des 43 k Gens.
4 zeigt den Aufbau von pCaHj 171.
5 zeigt den Aufbau von pCaHj 201.
6 zeigt den Aufbau von pCaHj 416 und pCaHj 417.
7 zeigt den Aufbau von Mutanten unter Verwendung von pCaHj 201 als Templat.
8 zeigt eine Standardkurve und das Ansprechen einer Probe in einem Dyed-Avicel-Versuch.
9 zeigt die Lagerstabilität einer 43 kD Cellulase-Variante (V221 S+N222S+Q223T) in einem flüssigen Detergenz.
10 zeigt die LAS- (lineares Alkylsulfonat) Hemmung bei pH 7,5.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
Beim Beschreiben der erfindungsgemäßen Endoglukanase-Varianten wird zur leichteren Bezugnahme die folgende Nomenklatur verwendet: Ursprüngliche Aminosäure(n) : Positionen) : substituierte Aminosäure(n)
Gemäß dieser Nomenklatur ist z.B. die Substitution von Serin für Valin in Position 221 als
V221S
ein Weglassen von Valin in derselben Position als
V221*
und eine Einfügung eines zusätzlichen Aminosäurerests wie Threonin als
V221ST
dargestellt.
Mehrfache Mutationen werden durch Pluszeichen getrennt, d.h. V221S + N222S + Q223T wodurch Mutationen in den Positionen 221, 222 und 223 dargestellt werden, in welchen Serin und Threonin für Valin, Asparagin bzw. Glutamin substituiert werden.
Im vorliegenden Kontext soll der Begriff „Cellulosebindungsdomäne" (im Folgenden mit CBD abgekürzt) eine Aminosäuresequenz (z.B. wie in Kraulis, P., Clore, G. M., Nilges, M. Jones, T. A. Pettersson, G., Knowles, J. und Gronenborn, A. M. Determination of the three-dimensional structure of the C terminal domain of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. A study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing., Biochemistry 28:7241-7257, 1989) bedeuten, die die Bindung einer Cellulase-Variante an ein Cellulosematerial bewirken kann.
Der Begriff „katalytisch aktive Domäne" (im Folgenden mit CAD abgekürzt) soll einen Kernbereich des Enzyms bedeuten, der die katalytische Stelle des Enzyms enthält, siehe z.B. Gideon et al.: Nature (1993) 365, S. 362-364.
Der Begriff „Verbindungsbereich" soll einen Bereich bedeuten, der an die CBD grenzt und sie an die CAD des Enzyms bindet. Die insofern identifizierten Verbindungsbereiche sind dadurch gekennzeichnet, dass sie überwiegend hydrophil und ungeladen sind und in bestimmten Aminosäuren unter Bildung von kurzen, wiederkehrenden Einheiten, die der Sequenz Flexibilität verleihen, angereichert sind. Es wird angenommen, dass die flexible Struktur des Verbindungsbereichs die Wirkung der katalytisch aktiven Domäne des an ein Cellulosesubstrat durch die CBD gebundenen Enzyms erleichtert. Beispiele für geeignete Verbindungsbereiche sind in N. R. Gilkes et al., Microbiol. Rev., 55, 1991, S. 303-315 dargestellt.
Der Begriff „Bindungseigenschaften" soll die Affinität, mit welcher sich die CBD an ein Cellulosesubstrat bindet, sowie die Weise, in welcher sich die CBD unter verschiedenen Bedingungen bindet, bedeuten. Zum Beispiel kann sich die CBD verschiedenartig bei verschiedenen pH-Werten binden. Dieses Verhalten unter verschiedenen Bedingungen kann z.B. durch Ändern der wie vorstehend angegebenen elektrostatischen Ladung der CBD modifiziert werden.
Der Begriff „eine andere CBD" soll eine CBD einschließen, die von einer anderen Cellulase abgeleitet ist; die zusätzliche CBD kann am N-terminalen Ende der katalytisch aktiven Domäne vorliegen, wenn die „ursprüngliche" CBD am C-terminalen Ende vorliegt, und umgekehrt. Es wird insbesondere angenommen, dass die Substitution durch Prolin die Wärme- und Proteasestabilität des Enzyms beeinflusst.
Die Stamm-Endoglukanase ist vorzugsweise eine mikrobielle Endoglukanase. Als solche kann die Endoglukanase aus Bakterien-Endoglukanasen, z.B. Pseudomonas oder Bacillus wie den in US, 822,516, US 5,045,464 oder EP 468 464 beschriebenen Bacillus-Stämmen oder aus Endoglukanasen von B. lautus (vgl. WO 91/10732) ausgewählt werden. Stärker bevorzugt können die Stamm-Cellulasen eine Pilz-Cellulase, insbesondere Cellulasen von Humicola, Trichoderma, Irpex, Aspergillus, Penicillium, Myceliophthora oder Fusarium sein. Beispiele für geeignete Stamm-Cellulasen sind z.B. in WO 91/17244 beschrieben. Beispiele für geeignete Trichoderma-Cellulasen sind diejenigen, die in T. T. Teeri, Gene 51, 1987, S. 43-52 beschrieben sind. Vorzugsweise ist die Stamm-Cellulase ausgewählt aus den Cellulasen, die in der Familie 45 eingeordnet sind, z.B. die Enzyme EG B (Pseudomonas fluorescens) und EG V (Humicola insolens), wie in Henrissat, B. et al., Biochem. J. (1993), 293, S. 781-788 beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Endoglukanase ist eine, die von einem Stamm von Humicola insolens abgeleitet ist, wie eine Endoglukanase von H. insolens, insbesondere eine wie in WO 91/17243 beschriebene 43 kD Endoglukanase von H. insolens oder ein Homologon davon.
Im vorliegenden Kontext soll der Begriff „Homologon" eine Cellulase, von welcher die Aminosäuresequenz mindestens zu 45% über die gesamte Länge identisch mit der 43 kD Endoglukanase ist, oder eine Cellulase, die sowohl dieselbe tertiäre oder dreidimensionale (3D) Gesamtfaltung wie die 43 kD Endoglukanase von H. insolens annimmt und zwei Säurereste aufweist, die an der Katalyse beteiligt und an der aktiven Stellenspalte platziert sind, und wobei gegebenenfalls ein zusätzlicher Säurerest an der Katalyse beteiligt und in der flexiblen Schleife, die gegenüber der aktiven Stellenspalte liegt, platziert ist, bedeuten.
Sequenzvergleiche können über bekannte Algorithmen wie demjenigen, der von Lipman an Pearson, Science 227, 1985, S. 1435, beschrieben ist, durchgeführt werden.
Das Gerüst eines Proteins kann in flexible und strukturell aufrechterhaltene Bereiche mittels Strukturanalyse und Sequenzanreihung homologer Proteine unterteilt werden. Die flexiblen Bereiche (FR) sind die Teile der Proteinfaltung, in welchen die Gerüstkonformation während der Entwicklung leicht zu ändern ist. Die aufrechterhaltenen Bereiche (SCR) sind die Teile der Proteinfaltung, in welchen die Gerüstkonformation größtenteils unverändert bleibt, d.h. es wird erwartet, dass sie in anderen Proteinen mit derselben Faltung aufrechterhalten werden. Zudem können SCRs bekannte katalytische oder andere Schlüsselreste spezifizieren.
Ein Protein A ist so definiert, dass es dieselbe Gesamtfaltung wie Protein B aufweist, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt werden:

1. Die 3D-Struktur von A überlappt mit den für B definierten SCRs mit einem mittleren Quadratwurzelunterschied von weniger als 4 Å, vorzugsweise weniger als 3 Å, stärker bevorzugt weniger als 2 Å. Die mittlere Quadratwurzel wird als euklidischer Abstand zwischen den mit den SCRs gleichwertigen Resten dividiert durch die Gesamtanzahl an Resten in den für B definierten Resten berechnet.
2. Die Aminosäuresequenz ist mit den die Faltung von B definierenden SCRs kompatibel. Zur Messung der Kompatibilität kann ein beliebiges der Verfahren zum Umkehrfaltungsproblem, beschrieben in Wodak, S. J. et al., Curr. Opin. Struc. Biol. 1993, 3, S. 247-259 und den darin offenbarten Querverweisen, verwendet werden.

Beispiele für Homologa sind die Cellulasen von Pseudomonas fluorescens, die von H. J. Gilbert et al., vorst. zit., beschrieben sind und die Cellulasen von Fusarium oxysporum, die in WO 91/17243 beschrieben sind, siehe die beiliegende 1, die eine Sequenzanreihung der drei Cellulasen zeigt.
Im vorliegenden Kontext bedeutet der Begriff „längliche Spalte" eine Spalte, die Maße aufweist, die gewähren, dass mindestens drei Glucoseeinheiten von poly meren β-1,4-Glucansubstraten auf die aktive Stelle zugreifen. Zum besseren Verständnis der im vorliegenden Kontext verwendeten Begriffe, wird ein Bezug zu einer spezifischen Stamm-Endoglukanase, von welcher die katalytisch aktive Domäne die vorstehend angegebene Gesamttopologie aufweist, d.h. zu der Endoglukanase, die in WO 91/17243 beschrieben und im Folgenden als EG V (Endoglukanase V) bezeichnet wird, gebildet. Es sollte jedoch klar sein, dass die vorliegende Erfindung in keinster Weise auf die Varianten dieser bestimmten Endoglukanase beschränkt ist.
Drei Kristallstrukturen wurden für EG V durch Röntgenkristallographie gelöst. Die drei Strukturen beschreiben das ursprüngliche Enzym (Gideon et al., Nature (1993) 365, S. 362-364), das ursprüngliche Enzym, das mit Cellobiose einen Komplex bildet (Gideon et al., vorst. zit.) und den Mutanten der aktiven Stelle D10N, der mit einem aus zwei Cellotrioseeinheiten bestehenden Produkt einen Komplex bildet (Gideon et al., persönliche Mitteilung).
Die Gesamtkonformation des Enzyms ist in allen drei Strukturen dieselbe, mit der Ausnahme der flexiblen Oberflächenschleife, die in der ursprünglichen Struktur unsichtbar ist, in offener Position in der Struktur mit Cellobiose und in geschlossene Position in der Struktur mit Cellotrioseprodukten fixiert ist.
In EG V weist die Spalte eine Länge von etwa 30 Å, eine Breite von etwa 9 Å und eine Tiefe von etwa 7 Å auf. Die Maße der Spalte sind ausreichend, um die Bindung von 7 Glucoseeinheiten von β-1,4-Glucanen zu gewähren. Diese Stellen sind mit A, B, C, D, E, F, G gekennzeichnet, wobei die Spaltung zwischen Stelle D und E erfolgt. In nachstehender Tabelle 1 sind die Atome in EG V definiert, die mit den Glucoseeinheiten an verschiedenen Stellen A-G zwischenwirken. Eine Analyse des Spaltungsmusters von EG V zeigte, dass die Bindung an den Stellen C-F für die Katalyse notwendig ist, und dass die Bindung der anderen Stellen die Katalyse verbessern. In der Struktur mit Cellotrioseprodukten ist eines der Produkte an die Stellen A-C und die andere an die Stellen E-G gebunden, wobei Stelle G eine schwache Bindungsstelle und nicht sehr gut definiert ist. Es ist möglich, eine Glucoseeinheit an Stelle D mit nur wenig sterischen Überlappungen zu gestalten. Es wird erwogen, dass das Enzym die normale Konformation der Glucoseeinheit an Position D während der Katalyse deformiert.
Ist kein Substrat gebunden, ist die aktive Stellenspalte an der Oberfläche offen, um ein Anlegen eines Glucanpolymers daran zu gewähren. Während des Anlegens verändert der flexible Oberflächenschleifenbereich, Rest 111-119, die Konformation, wodurch Leu115 etwa 13 Å von einem einer verdeckten Position ausgesetzten Lösungsmittel bewegt wird, so dass das Glucanpolymer in einem Tunnel am Spaltungspunkt zwischen Stelle D und E eingeschlossen ist.
Die aktive Stelle umfasst zwei Aspartamsäuren, Asp10 und Asp121.
Mechanische Studien und die Kristallstrukturen stützen die Theorie, dass EG V ein umkehrendes Enzym ist, wobei Asp10 als allgemeine Basis in der Katalyse wirkt. Zudem wurden Asp114 und His119 als für die Katalyse wichtig befunden. Asp114 ist an der Bindung der Glucoseeinheit an Stelle D beteiligt, und zusammen mit Ile131 schließt sie das Glucosepolymer ein und wandelt den Spalt in einen Tunnel um. Es wird erwogen, dass es der Zweck des Tunnels ist, Wasser aus der Umgebung von Asp121 zu verdrängen und damit den protonierten Sauerstoff von Asp121 zu stabilisieren. Es wurde gefunden, dass His119 an einem Wasserstoffbindungsnetzwerk durch Thr6 an den anderen Sauerstoff von Asp121 beteiligt ist. Dieses Wasserstoffbindungsnetzwerk kann auch bei der Stabilisierung der protonierten Form von Asp121 helfen. Ist His119 positiv geladen, kann es zusammen mit anderen nahe gelegenen positiv geladenen Oberflächenresten ein stark elektrostatisches Feld über Asp121 induzieren, wenn die aktive Stelle negativ geladen ist. Mit einer Glucanpolymerbindung kann dieses Feld eine Polymeri sation bewirken und damit die Spaltung der Bindung zwischen den Glucoseeinheiten erleichtern. Ein ähnliches elektrostatisches Feld ist über der entsprechenden aktiven Säure in Lysozym zu finden.
Es wird angenommen, dass der „Kanal", der von der Oberfläche zur Spalte führt (in diesem besonderen Fall gibt es zwei solcher Kanäle), dem Asp10 zur Hydrolyse des Glucanpolymer Wasser zuführt. Zudem kann der Kanal als Mittel zum Verdrängen von Wasser aus der Spalte während des Anlegens des Substrats verwendet werden.
Tabelle 1
In Tabelle 1 wird die PDB-Standardbezeichnung zur Benennung von Atomen verwendet (Bernstein et al. (1977): InsightII, Biosym Technologies, Inc.). Ein Bezug auf Wasserstoffatome wird durch die Schwere, mit welcher sie gebunden sind, gebildet, wenn keine Wasserstoffatome in der Struktur vorliegen. Die Analyse basiert auf einer Struktur mit Cellotriose, die an der Stelle A-C und E-G gebunden ist. Auf in der Struktur vorliegende Wassermoleküle, die an der Bindung teilnehmen, wird ausdrücklich (mit HOH) hingewiesen. Die Abstände sind in ÅngstrØm angegeben.
In den Anmerkungen von Tabelle 1 bedeutet „PI-Wechselwirkung" eine Wechselwirkung zwischen zwei aromatischen Ringen, bedeutet „durch Wasser" Fälle, in welchen kein Wasser in der Struktur vorliegt jedoch eine Wechselwirkung mit dem Substrat durch ein Wassermolekül erfolgen kann, bedeutet „möglich" Atome, die mit dem Substrat in anderen Bindungsmodi wechselwirken können, bedeutet „sterisch" keine andere sichtbare Wechselwirkung als diese, bedeutet „katalytisch" ein katalytischer Rest.
In der Ausführungsform, die eine Endoglukanase-Variante umfasst, welcher CBD am gegenüberliegenden Ende der katalytisch aktiven Domäne zugesetzt wurde, kann die zusätzliche CBD z.B. von einer der Cellulasen abgeleitet sein, die in WO 91/10732 oder WO 91/17244 oder von Penttila, M. E., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. und Knowles, J., Homology between cellulase genes of Trichoderma Reesei: complete nucleotide sequence of the Endoglukanase I gene. Gene 45:253-263, 1986, oder Saloheimo, M., Lehotovaara, P., Penttila, M. E., Teeri, T. T., Stahlberg, J., Johansson, G., Pettersson, G., Claessens, M. und Tomme, P., EG III, an new Endoglukanase from Trichoderma reesei. The Characerization of both gene and enzyme. Gene 63:11-23, 1988, oder Teeri, T. T., Lehtovaara, P., Kauppinen, S., Salovuori, I. und Knowles, J., Homologous domains in Trichoderma reesei cellololytic enzymes: gene sequence and expression of cellobiohydrolase II. Gene 51:43-52, 1987, oder Sims, P., James, C. und Bro da, P., The identification, molecular cloning and characterization of a gene from Phanerochaete chrysosporium that shows strong homology to the exocellobiohydrolase I gene from Trichoderma reesei. Gene 74:411-422, 1988, oder De Oliviera Alzvedo, M. und Radford, A., Sequence of CBH I of Humicola grisea var.
thermoidea. Nucleic Acid Research 18:668, 1990, oder Raguz, S., Yague, E., Wood, D. A. und Thurston, C. F. Isolation and Characterization of a Cellolose-Growth-Specific Gene from Agaricus-Bisporus. Gene 119:183-190, 1992, oder Koch, A. und Schulz, G., Cloning, Sequencing, and heterologous expression of a cellulase-encoding cdna (CBH1) from penicillium janthinellum. Gene 124:57-65, 1993 beschrieben wurden.
Die nachstehend dargestellten Bereiche I–X entsprechen den folgenden Positionen in der 43 kD Endoglukanasesequenz.

Bereich Reste

I 2–21

II 44–48

III 55–60

IV 65–67

V 72–75

VI 95–103

VII 109–123

VIII 128–136

IX 142–148

X 175–185
Zur Reduzierung der Empfindlichkeit der Endoglukanase-Variante für Oxidation oder die Gegenwart von Bleichmitteln werden einer oder mehrere Aminosäurereste auf der Oberfläche der CAD durch einen oder mehrere Aminosäurereste, die für Oxidation oder die Gegenwart eines Peroxidase-Bleichsystems weniger empfindlich sind, substituiert, wobei die CAD eine die katalytisch aktive Stelle enthaltende längliche Spalte, mindestens einen Kanal, der von der Oberfläche des Cellulasemoleküls zu der Spalte führt und der Spalte zur Hydrolyse von Cellulose an der aktiven Stelle Wasser zuführt, und einen positiv geladenen Oberflächenbereich in der Umgebung mindestens eines Aminosäurerests der aktiven Stelle umfasst.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Tyrosin für die Gegenwart von Bleichmitteln wie Peroxidase-Systeme empfindlich ist, was zur Inaktivierung des Enzyms führt. Im vorliegenden Kontext soll der Begriff „Peroxidase-System" ein Bleichsystem bedeuten, das eine Peroxidase, ein Substrat für die Peroxidase und einen wie z.B. in WO 89/09813 oder WO 91/05839 beschriebenen Bleichbeschleuniger umfasst. Es wurde weiterhin gefunden, dass dieses Problem durch geeignete Substitutionen durch weniger empfindliche Aminosäurereste, z.B. Serin, Asparagin, Glutamin, Prolin, Phenylalanin, Glutaminsäure oder Glycin behoben werden kann.
In einer Ausführungsform der 43 kD Endoglukanase-Variante oder einer homologen Cellulase von H. insolens wird erwartet, dass die Oberflächenkonformation des Enzyms durch Substituieren von einem oder mehreren Tyrosinen in Position 8 und/oder 147 oder in einer entsprechenden Position in einem Homologon davon modifiziert werden kann.
Insbesondere werden ein oder mehrere Aminosäurereste wie folgt substituiert

Y8F
Y147F,H,S,Q,N,E,D.

Verfahren zur Herstellung der Endoglukanase-Varianten der Erfindung
Verschiedene Verfahren zum Einbringen von Mutationen in Gene sind auf dem Fachgebiet bekannt. Nach einer kurzen Erörterung des Klonens von Endogluka nase-kodierenden DNA-Sequenzen werden Verfahren zum Bilden von Mutationen an spezifischen Stellen in der Endoglukanase-kodierenden Sequenz erörtert.
Klonen einer eine Endoglukanase kodierenden DNA-Sequenz
Die eine Stamm-Endoglukanase kodierende DNA-Sequenz kann von einer beliebigen Zelle oder einem beliebigen Mikroorganismus, die/der die fragliche Cellulase erzeugt, durch verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert werden. Zuerst sollte eine genomische DNA- und/oder cDNA-Genbank unter Verwendung von Chromosomen-DNA oder Boten-RNA von dem Organismus, der die zu untersuchende Endoglukanase erzeugt, konstruiert werden. Ist die Aminosäuresequenz der Endoglukanase bekannt, können dann homologe, markierte Oligonukleotidsonden synthetisiert und zum Identifizieren von Endoglukanase-kodierenden Klonen von einer genomischen Genbank von Bakterien-DNA oder einer Pilz-cDNA-Genbank verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform könnte eine markierte Oligonukleotidsonde, die zu Endoglukanase homolog ist, von einem anderen Bakterien- oder Pilzstamm als Sonde zum Identifizieren von Endoglukanase-kodierenden Klonen unter Verwendung von geringer strengen Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden.
Noch ein anderes Verfahren zum Identifizieren von Endoglukanase-erzeugenden Klonen würde das Einfügen von Fragmenten von genomischer DNA in einen Exprimierungsvektor wie ein Plasmid beinhalten, wodurch Endoglukanase-negative Bakterien mit der erhaltenen genomischen DNA-Genbank transformiert und die transformierten Bakterien auf ein Substrat aus Endoglukanase enthaltenden Agar aufgestrichen werden. Diejenigen Bakterien, die ein Endoglukanase-tragendes Plasmid enthalten, erzeugen Kolonien, die aufgrund des Aufschlusses des Substrats durch sekretierte Cellulase von einem Hof aus klarem Agar umgeben sind.
In einer anderen Ausführungsform kann die das Enzym kodierende DNA-Sequenz durch etablierte Standardverfahren, z.B. durch das Phosphoamiditverfahren, das von S.L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859-1869, beschrieben wurde oder das Verfahren, das von Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, S. 801-805 beschrieben wurde, synthetisch hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamiditverfahren werden Oligonukleotide, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesizer synthetisiert, gereinigt, gehärtet, gebunden und zu entsprechenden Vektoren geklont.
Schließlich kann die DNA-Sequenz gemischten genomischen und synthetischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Usprungs durch Binden von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet) hergestellt werden, wobei die Fragmente den verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz gemäß Standardtechniken entsprechen. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern z.B. wie in US 4,683,202 oder R. K. Saiki et al., Science 239, 1988, S. 487-491 beschrieben hergestellt werden.
Stellengerichtete Mutagenese der Endoglukanase-kodierenden Sequenz
Wurde die Endoglukanase-kodierende DNA-Sequenz isoliert und sind erwünschte Stellen zur Mutation identifiziert, können Mutationen unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden eingebracht werden. Diese Oligonukleotide enthalten Nukleotidsequenzen, die an die gewünschten Mutationsstellen grenzen, wobei Mutantnukleotide während der Oligonukleotidsynthese eingefügt werden. In einem speziellen Verfahren wird eine einzelstrangige DNA-Spalte, die die Endoglukanase-kodierende Sequenz verbrückt, in einem das Endoglukanase-Gen tragenden Vektor gebildet. Dann wird das die Mutation tragende, synthetische Nukleotid zu einem homologen Teil der Einzelstrang-DNA gehärtet. Die verbleibende Spalte wird dann mit DNA-Polymerasen I (Klenow-Fragment) gefüllt und das Konstrukt unter Verwendung von T4-Ligase verbunden. Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren ist in Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:646-639) beschrieben. U.S.-Patent-Nr. 4,760,025 von Estell et al., erteilt am 26. Juli 1988 offenbart das Einbringen von Oligonukleotiden, die mehrfache Mutationen unter Durchführung von geringen Abweichungen der Kassette kodiert, jedoch kann eine noch größere Verschiedenheit an Mutationen zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch das Morinaga-Verfahren eingebracht werden, da eine Vielzahl an Oligonukleotiden mit verschiedenen Längen eingebracht werden kann.
Ein anderes Verfahren zum Einbringen von Mutationen in Endoglukanasekodierende Sequenzen ist in Nelson und Long, Analytical Biochemistry 180, 1989, S. 147-151, beschrieben. Es beinhaltet die 3-stufige Bildung eines PCR-Fragments, das die gewünschte Mutation enthält, die unter Verwendung eines chemisch synthetisierten DNA-Strangs wie eines des Primers in die PCR-Reaktionen eingebracht wurde. Aus dem PCR-gebildeten Fragment kann ein die Mutation tragendes DNA-Fragment durch Spaltung mit Grenzendoglukanasen isoliert und wieder in ein Exprimierungsplasmid eingebracht werden.
Aufbau eines Systems für stellengerichtete Mutagenese von Carezym (43 kD Cellulase von H. insolens)
Ein Plasmid (pSX 320) das die Exprimierung der 43 kD Endoglukanase von Humicola insolens (Karyosom) in Aspergillus oryzae ermöglicht, wurde in einem früheren Patent (PCT/DK 91/00123) beschrieben. Das Gen-kodierende Karyosom wurde von pSX 320 in pUC 19 (C. Yanisch-Perron et al. (1985), Gene 33, 103-119) wie in 2 beschrieben subgeklont.
Eine CIa-I-Grenzstelle wurde in pCaHj 170 im 43 K Gen als stille stellengerichtete Mutation in Position 537 eingebracht.
Stellengerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des PCR-Verfahrens von Nelson und Long (R. M. Nelson, G. L. Long (1989), Anal. Biochem. 180, 147-151) durchgeführt. Die Einzelheiten sind in 3 angegeben. Die Plasmide pCaHj 171 und pCaHj 201 wurden aus pCaHj 170 wie in 4 und 5 dargestellt aufgebaut.
Zwei Plasmide, pCaHj 416 und pCaHj 417, die die Verwendung von pCaHj 201 zum Mutantaufbau ermöglichen, wurden aus dem Aspergillus-Exprimierungsplasmid pHD 414 hergestellt. Der Aufbau dieser Plasmide ist in 6 zusammengefasst.
pCaHj 201 wurde zum Aufbau von Mutanten wie in 7 dargestellt verwendet.
Die die mutierten 43 K Gene beherbergenden Exprimierungsplasmide wurden in Aspergillus oryzae IF0 4177 unter Verwendung von Selektion über Acetamid durch Kotransformation mit pToC 90 wie in der Patentanmeldung (PCT/DK/00123) beschrieben transformiert.
Aufbau der Mutanten CC234 und CC248
Der aus V221S, cN222S, Q223T bestehende Mutant CC234 wurde unter Verwendung des Oligonukleotids 4214 aufgebaut.
Die Mutationen wurden wie in 6 beschrieben durch Subklonen des mutierten Fragments Hind III – Sal I in pCaHj 416 eingebracht.
Der aus A162P bestehende Mutant CC248 wurde unter Verwendung des Oligonukleotids 4271 aufgebaut.
Die Mutationen wurden wie in 6 beschrieben durch Subklonen des mutierten Fragments BamH I – Hind III in pCaHj 417 eingebracht.
Im Folgenden werden die beiliegenden 2–7 weiter erklärt:
2, Aufbau von pCaHj 170:

pSX 320 wurde mit Acc I aufgeschlossen. Der Aufschluss wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion, Ausfällung mit Ethanol und Trocknen im Vakuum beendet. Ausgesparte 3'-Enden wurden unter Verwendung der Klenow-Polymerase gefüllt, und die Reaktion wurde wie vorstehend beschrieben beendet. Die DNA wurde wieder gelöst und mit BamH I aufgeschlossen. Das das Kanosom-Gen enthaltende Fragment 920 by wurde aus einem Agarosegel isoliert.
pUC 19 wurde mit Sal I aufgeschlossen, ausgesparte 3'-Enden wurden mit der Klenow-Polymerase gefüllt, und die DNA wurde dann mit BamH I wie vorstehend beschrieben aufgeschlossen. Das gebildete Fragment 2675 by wurde aus einem Agarosegel isoliert.

Das Fragment 920 by pSX 320 wurde an das Fragment 2675 by pUC 19 gebunden und in E. coli MT 172, einen durch herkömmliche Verfahren zu r-m+ gemachten Stamm von E. coli MC 1000 (Casadaban und Cohen (1980), J. Mol. Biol., 138, 179-207) transformiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pCaHj 170 bezeichnet.
3, stellengerichtete Mutagenese des 43 K Gens:
Die Plasmide pCaHj 170, pCaHj 171 oder pCaHj 201 wurden als Template verwendet, die von der fraglichen Mutation abhängen. Das Templat der Wahl wurde unter Verwendung eines mutagenen Primers (dargestellt als Pfeil mit Sternchen) und des Primers 2834, ein Primer aus 42 Nukleotiden, der dem Templat am 3'–
Ende (21 Nukleotide) entspricht und dem Templat am 5'-Ende (21 Nukleotide) nicht entspricht, amplifiziert:
Das Temperaturkreislaufprofil wurde in der Abbildung unter Verwendung von Taq-Polymerase von Perkin-Elmer Cetus (Amplitag^TM) den Herstelleranweisungen folgend angezeigt.
Das 1. PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel isoliert und in einem PCR-Umläufer unter Verwendung desselben Templats wie vorstehend erweitert. Das Temperaturprofil wurde in der Abbildung unter Verwendung von Amplitag^TM und PCR-Standardbedingungen angezeigt. Nach der Erweiterung wurden die PCR-Primer 2833 und 2832 direkt zu dem Erweiterungsgemisch zugesetzt, und das in der Abbildung angezeigte Temperaturkreislaufprogramm wurde gefahren und das erhaltene, die Mutation beherbergende PCR-Fragment aus einem Agarosegel isoliert.
Der PCR-Primer 2833 entsprach dem 5'-Ende von 2834:
Der Primer 2832 entsprach dem Templat:
4, Aufbau von pCaHj 171:
Eine stille Mutation im 43 K Gen (G bis A in der dritten Position eines Arg-Kodons) wurde in das 43K-Gen unter Verwendung von pCaHj 170 als Templat und des mutagenen Primers 2831 eingebracht:
Das mutierte PCR-Fragment wurde mit Nco I und Xho I aufgeschlossen und an mit Nco I und Xho I aufgeschlossenes pCaHj 170 gebunden. Das Verbindungsgemisch wurde in E. coli MT 172 transformiert. Die Einfügung Nco I – Xho I wurde von einem rekombinanten Plasmid unter Verwendung des Sequenase^TM-Bausatzes von United States Biochemicals den Herstelleranweisungen folgend sequentiert. Die Sequenz war mit der Sequenz von pCaHj 170 außer für die gewünschte Mutation identisch. Dieses Plasmid wurde als pCaHj 171 bezeichnet.
5, Aufbau von pCaHj 201:
Eine stille Mutation im 43 K Gen (G bis A in der dritten Position eines Pro-Kodons) wurde in das 43 K Gen unter Verwendung von pCaHj 171 als Templat und des mutagenen Primers 847 eingebracht:
Das mutierte PCR-Fragment wurde mit Cla I und Xho I aufgeschlossen und an mit Cla I und Xho I aufgeschlossenes pCaHj 171 gebunden. Das Verbindungsgemisch wurde in E. coli MT 172 transformiert. Die Einfügung Cla I – Xho I wurde von einem rekombinanten Plasmid unter Verwendung des Sequenase^TM-Bausatzes von United States Biochemicals den Herstelleranweisungen folgend sequentiert. Die Sequenz war mit der Sequenz von pCaHj 171 außer für die gewünschte Mutation identisch. Dieses Plasmid wurde als pCaHj 201 bezeichnet.
6, Aufbau von pCaHj 416 und pCaHj 417:
Aufbau von pCaHj 416: pCaHj 201 wurde mit BamH I und Hind III aufgeschlossen und das Fragment 612 bp an mit BamH I und Hind III aufgeschlossenes pHD 414 gebunden.
Aufbau von pCaHj 417: pCaHj 201 wurde mit Hind III und Sal I aufgeschlossen und das Fragment 317 bp an mit Hind III und Xho I aufgeschlossenes pHD 414 gebunden.
7, Aufbau von Mutanten unter Verwendung von pCaHj 201 als Templat:
Die stellengerichtete Mutagenese wurde wie in 2 beschrieben durchgeführt. Wenn Abweichungen stromaufwärts der Stelle Hind III (Pos. 1-612) lokalisiert wurden, wurde das PCR-Fragment mit BamH I und Hind III aufgeschlossen und das gebildete Fragment 612 bp an mit BamH I und Hind III aufgeschlossenes pCaHj 417 gebunden, wodurch ein Exprimierungsplasmid für das mutierte Gen erhalten wurde.
Wenn Abweichungen stromabwärts der Stelle Hind III (Pos. 612-928) lokalisiert wurden, wurde das PCR-Fragment mit Hind III und Sal I aufgeschlossen und das gebildete Fragment 316 bp an mit Hind III und Xho I aufgeschlossenes pCaHj 416 gebunden, wodurch ein Exprimierungsplasmid für das mutierte Gen erhalten wurde. Die Plasmidgröße und die Grenzstellenpositionen entsprechen nur den Substitutionen. Im Falle von Weglassungen oder Einfügungen unterscheiden sich Größe und Stellenpositionen von den dargestellten Abbildungen.
Exprimierung von Endoglukanase-Varianten
Erfindungsgemäß kann eine mutierte Endoglukanase-kodierende Sequenz, die durch das vorstehend beschriebene Verfahren oder ein beliebiges anderes auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren hergestellt wurde, in Enzymform unter Verwendung eines Exprimierungsvektors hergestellt werden, der typischerweise Kontrollsequenzen, die einen Promoter, Operator, eine Ribosombindungsstelle, ein Translationshemmungssignal und gegebenenfalls ein Repressorgen oder verschiedene Aktivatorgene enthält. Zum Gewähren der Sekretion des exprimierten Proteins können eine „Signalsequenz" kodierende Nukleotide vorher in die Cellulase-kodierende Sequenz eingefügt werden. Zur Exprimierung unter Anleitung der Kontrollsequenzen wird durchführbar ein erfindungsgemäß zu behandelndes Zielgen an die Kontrollsequenzen in angemessenem Ableserahmen gebunden. Promotersequenzen, die in Plasmidvektoren eingebracht werden und die Transkription des Mutant-Cellulasegens unterstützen können, schließen den prokaryotischen β-Lactamase-Promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) und den Tac-Promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere Bezugnahmen können auch in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94, gefunden werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird B. subtilis durch einen die mutierte DNA tragenden Exprimierungsvektor transformiert. Soll die Exprimierung in einem sekretierenden Mikroorganismus wie B. subtilis erfolgen, kann eine Signalsequenz dem Translationsinitiierungssignal folgen und der DNA-Sequenz von Bedeutung vorausgehen. Die Signalsequenz wirkt für den Transport des Exprimierungsprodukts zu der Zellwand, wo sie von dem Produkt über Sekretierung abgespalten wird. Der wie vorstehend definierte Begriff „Kontrollsequenzen" soll eine Signalsequenz, falls vorhanden, einschließen.
In einem gegenwärtig bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Endoglukanase-Varianten der Erfindung wird ein Fadenpilz als Wirtsorganismus verwendet. Der Fadenpilz-Wirtsorganismus kann günstigerweise einer sein, der früher als Wirt für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wurde, z.B. ein Stamm von Aspergillus sp. wie A. niger, A. nidulans oder A. oryzae. Die Verwendung von A. oryzae bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen ist ausführlich z.B. in EP 238 023 beschrieben.
Zur Exprimierung von Endoglukanase-Varianten in Aspergillus geht der die Endoglukanase-Variante kodierenden DNA-Sequenz ein Promoter voran. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die eine starke Transkriptionsaktivität in Aspergillus zeigt und von einem Gen abgeleitet ist, das ein extrazelluläres oder intrazelluläres Protein wie eine Amylase, eine Glucoamylase, eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase oder ein glycolytisches Enzym kodiert.
Beispiele für geeignete Promoter sind diejenigen, die von dem Gen abgeleitet sind, das TAKA-Amylase von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile α-Amylase von A. niger, alkalische Protease von A. oryzae oder Triosephosphatisomerase von A. oryzae kodiert.
Insbesondere, wenn der Wirtsorganismus A. oryzae ist, ist ein bevorzugter Promoter zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung der TAKA-Amylasepromoter von A. oryzae, da er eine starke Transkriptionsaktivität in A. oryzae zeigt. Die Sequenz des TAKA-Amylasepromoters geht aus EP 238 023 hervor.
Die Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen können geeigneter von denselben Quellen wie der Promoter abgeleitet werden.
Die zum Transformieren einer Pilzwirtzelle verwendete Technik kann geeigneterweise wie in EP 238 023 beschrieben sein.
Zur Sicherstellung von Sekretierung der Endoglukanase-Variante von der Wirtzelle kann der die Endoglukanase-Variante kodierenden DNA-Sequenz eine Signalsequenz vorangehen, die eine natürlich vorkommende Signalsequenz oder ein funktioneller Teil davon oder eine synthetische Sequenz, die die Sekretierung des Proteins von der Zelle bereitstellt, sein kann. Insbesondere kann die Signalsequenz von einem Gen, das eine Amylase oder Glucoamylase von Aspergillus sp. kodiert, einem Gen, das eine Lipase oder Protease von Rhizomucor miehei kodiert, oder einem Gen, das eine Cellulase, Xylanase oder Lipase von Humicola kodiert, abgeleitet werden. Die Signalsequenz wird vorzugsweise von dem Gen, das TAKA-Amylase von A. oryzae, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile α-Amylase von A. niger oder Glucoamylase von A. niger kodiert.
Das zum Züchten der transformierten Wirtzellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das zum Wachsen von Aspergillus-Zellen geeignet ist. Die Transformanten sind gewöhnlich stabil und können in Abwesenheit von Selektionsdruck gezüchtet werden. Werden jedoch die Trans formanten als unstabil befunden, kann eine in die Zellen eingebrachte Selektionsmarkierung zur Selektion verwendet werden.
Das aus der Wirtzelle sekretierte reife Endoglukanaseprotein kann günstigerweise aus dem Kulturmedium durch bekannte Verfahren, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration und Ausfällen der proteinartigen Bestandteile des Mediums mittels eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatografischen Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dgl. gewonnen werden.
Erfindungsgemäß kann die Endoglukanase-Variante typischerweise als Bestandteil einer Detergenz-Zusammensetzung zugesetzt werden. Als solcher kann sie in der Detergenz-Zusammensetzung im Form eines nicht staubenden Granulats, einer Flüssigkeit, insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms beinhaltet sein. Nicht staubende Granulate können z.B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide an Novo Industri A/S) offenbart hergestellt und gegebenenfalls durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Enzymzubereitungen können z.B. durch Zugabe eines Polyols wie Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß den in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden. Die Detergenz-Zusammensetzung kann ferner ein oder mehrere andere, herkömmlich in Detergenzzusätzen beinhaltete Enzyme wie eine Protease, Lipase, Peroxidase, Oxidase oder Amylase, beinhalten.
Die Detergenz-Zusammensetzung der Erfindung kann in jeder beliebigen günstigen Form, z.B. als Pulver, Granulat oder Flüssigkeit vorliegen. Ein flüssiges Detergenz kann wässrig sein und typischerweise bis zu 90% Wasser und 0-20% organisches Lösungsmittel enthalten.
Die Detergenz-Zusammensetzung umfasst ein oberflächenaktives Mittel, das anionisch, nichtionisch, kationisch, amphoterisch oder ein Gemisch aus diesen Arten sein kann. Das Detergenz enthält gewöhnlich 0-50% anionisches oberflächenaktives Mittel wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfonat (AS), Alkoholethoxysulfat (AES) oder Seife. Es kann auch 0-40% nichtionisches oberflächenaktives Mittel wie Nonylphenolethoxylat oder Alkoholethoxylat enthalten. Weiterhin kann es ein oberflächenaktives Polyhydroxyfettsäureamid (z.B. wie in WO 92/06154 beschrieben) enthalten.
Die Detergenz-Zusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme wie eine Amylase, Lipase, Peroxidase, Oxidase, Esterase, Cellulase, Endoglukanase Typ II oder Protease umfassen.
Der pH-Wert (gemessen in wässriger Detergenzlösung) ist gewöhnlich neutral oder alkalisch, z.B. 7-11. Das Detergenz kann 1-40% eines Detergenz-Builders wie Zeolith, Phosphat, Phosphonat, Zitrat, NTA, EDTA oder DTPA, Alkenylbernsteinsäureanhydrid oder Silicat enthalten oder ohne Builder (d.h. im Wesentlichen frei von einem Detergenz-Builder) sein. Es kann auch andere herkömmliche Detergenzzusätze, z.B. Gewebeweichmacher, Schaumverstärker, Bleichmittel, z.B. Perborat, Percarbonat, Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS), Antikorrosionsmittel, Schmutzsuspensionsmittel, Maskierungsmittel, Mittel gegen Wiederablagerung von Schmutz, Stabilisierungsmittel für das (die) Enzym(e), Schaumunterdrücker, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller oder Parfums enthalten.
Besondere Formen der Detergenz-Zusammensetzung im Rahmen der Erfindung beinhalten:

a) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als Detergenzpulver formuliert ist und einen Phosphat-Builder, ein anionisches oberflächenaktives Mittel, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, Silicat, Alkali zur Einstellung des gewünschten pH-Werts bei Verwendung und neutrale anorganische Salze enthält.
b) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als Detergenzpulver formuliert ist und einen Zeolith-Builder, ein anionisches oberflächenaktives Mittel, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, acrylisches oder äquivalentes Polymer, Silcat, Alkali zur Einstellung des gewünschten pH-Werts bei Verwendung und neutrale anorganische Salze enthält.
c) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als wässrige Detergenzflüssigkeit formuliert ist und ein anionisches oberflächenaktives Mittel, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, ein Netzmittel, eine organische Säure, Ätzalkali mit einem pH-Wert bei Verwendung, der auf einen Wert zwischen 7 und 11 eingestellt ist, umfasst.
d) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als nichtwässrige Detergenzflüssigkeit formuliert ist und ein flüssiges nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das im Wesentlichen aus linearem alkoxyliertem primärem Alkohol besteht, einem Phosphat-Builder Ätzalkali mit einem pH-Wert bei Verwendung, der auf einen Wert zwischen 7 und 11 eingestellt ist, umfasst.
e) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als Detergenzpulver in Form eines Granulats mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l formuliert ist und ein anionisches oberflächenaktives Mittel und ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, wenige oder im Wesentlichen keine neutralen anorganischen Salze, einen Phosphat-Builder und Natriumsilikat enthält.
f) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als Detergenzpulver in Form eines Granulats mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l formuliert ist und ein anionisches oberflächenaktives Mittel und ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, wenige oder im Wesentlichen keine neutralen anorganischen Salze, einen Zeolith-Builder und Natriumsilikat enthält.
g) Eine Detergenz-Zusammensetzung, die als Detergenzpulver formuliert ist und ein anionisches oberflächenaktives Mittel, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, ein Acrylpolymer, eine Fettsäureseife, Natriumcarbonat, Natriumsulfat, Tonteilchen und Natriumsilikat enthält.
h) Ein flüssiges kompaktes Detergenz, enthaltend 6-65 Gew.-% oberflächenaktives Mittel, 0-50 Gew.-% Builder und 0-30 Gew.-% Elektrolyt.

Neben diesen Inhaltsstoffen beinhalten die Detergenz-Zusammensetzungen a)-h) eine Endoglukanase-Variante der Erfindung und gegebenenfalls ein oder mehrere andere wie vorstehend angegebene Enzyme.
Es wird gegenwärtig erwogen, dass in der Detergenz-Zusammensetzung der Erfindung die Endoglukanase-Variante in einer Menge zugesetzt werden kann, die 0,001-100 mg Enzym pro Liter Waschlauge entspricht.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sollen in keinster Weise als Beschränkung des Rahmens der Erfindung angesehen werden.
BEISPIEL 1
Wirkung von Abweichungen im Bindungsbereich auf Restaktivität
Die Restaktivität der Endoglukanase-Varianten nach Lagerung in Proteaseenzyme enthaltendem flüssigem Detergenz wurde mit zwei verschiedenen Versuchen bewertet.
Der S-CEVU-Versuch bestimmt die Menge der in der Probe vorliegenden katalytischen Aktivität durch Messen der Fähigkeit der Probe, die Viskosität einer Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC) zu reduzieren. Diese Aktivität bezieht sich nur auf den Enzymkern und ist von der Gegenwart oder Abwesenheit des Bindungsbereichs und des CBD-Bereichs nicht beeinflusst.
Der S-CEVU-Versuch wird bei 40°C, pH 7,5 unter Verwendung eines Bezugsenzymstandards zur Reduzierung der Viskosität des Substrats (CMC) durchgeführt. Das Verfahren ist von dem Anmelder als Nr. AF-302/2GB auf Anfrage erhältlich.
Der Dyed-Avicel-Versuch (DAA) bestimmt die Menge von Cellulase, die sich an unlösliche Cellulose binden kann und an der Oberfläche des gebundenen Cellulosepulvers gebundenen Farbstoff freisetzt. Cellulasen ohne den Bindungsbereich und den CBD-Bereich zeigen geringe Aktivität auf dieses Substrat, weshalb der Versuch zur Überwachung der proteolytischen Zersetzung von intaktem Endoglukanasekern verwendet werden kann.
Da die Waschleistung von Cellulasen ohne den Bindungsbereich und den CBD-Bereich geringer als diejenige für intakte Enzyme ist, entspricht der DAA in etwa dem Grad der Waschleistung von Endoglukanasen, die in Proteaseenzym(en) enthaltenden Detergenzien gelagert sind.
Die folgenden erfindungsgemäßen Endoglukanase-Varianten wurden auf Restaktivität getestet:

Variante I: V221 S+N222S+Q223T

Variante II: V240P+Q241P
Die in WO 91/17243 beschriebene 43 kD Endoglukanase von H. insolens wurde als Bezugs- (Stamm-) Endoglukanase verwendet.
DYED-AVICEL-VERSUCH (DAA)
Die enzymatische Reaktion einer Endoglukanase mit einem mit Remazol Brilliant Blue gefärbten Cellulosepulver setzt eine Menge an Farbstoff frei, die der Aktivität der Cellulase entspricht.

Reaktionsbedingungen:

pH-Wert:	7,50
Temperatur:	40°C
Substrat:	gefärbte mikrokristalline Cellulose
Puffer:	0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5 mit 1 g/l nichtionischen Tensiden (Berol 160)
Zeit:	60 Minuten
Probenkonzentration:	0,5 – 15 S-CEVU/ml

Herstellung von gefärbter Cellulose:
50 g Cellulosepulver des Typs Sigmacell 20 wurden zu 500 ml deionisiertem Wasser in einem Becherglas mit einem Volumen von 2000 ml gegeben, und dies wurde mit einem Magnetrührer gerührt. 4 g Farbstoff Ramazol Brilliant Blue R 19 (C.I. 61200 Reactive Blue 19) wurden in 350 ml deionisiertem Wasser gelöst.
Die Farbstofflösung wurde der Sigmacell-Suspension zugesetzt und dies auf etwa 55°C erwärmt. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, während 100 g wasserfreies Natriumsulfat langsam zugesetzt wurden. 20 g Trinatriumphosphatdodecahydrat wurden in 200 ml deionisiertem Wasser gelöst. der pH-Wert der Sigmacell/Farbstoff-Lösung wurde durch Zugabe von etwa 150 ml Trinatriumphosphatlösung auf 11,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei 55°C gerührt.
Das Gemisch wurde mittels eines Büchner-Trichters mit einem Volumen von 1000 ml und eines Filterpapiers des Typs Whatman Nr. 54 vakuumfiltriert. Der Filterkuchen wurde wiederholt mit deionisiertem Wasser bei 70-80°C gewaschen, bis die optische Dichte bei 590 nm (OD₅₉₀) des Filtrats (des Abfallwassers) unter 0,03 lag. Der Filterkuchen wurde mit 100 ml 50%igem Ethanol gespült, was zu einer weiteren Entfernung der blauen Farbe führte, und anschließend mit 100 ml 96%igem Ethanol gespült. Die Cellulose wurde aus dem Trichter entfernt und zum Trocknen (auf sauberem Arbeitstisch) stehengelassen.
VERSUCHSREAGENZIEN:

0,1 M Phosphatpuffer

NaH₂PO₄·2H₂O (Merck 6345.1000)	15,6 g
Deionisiertes Wasser	Zugabe 800 ml
Berol 160 (AEO)	1,0 g
NaOH, 4N	pH-Einstellung auf 7,5
Deionisiertes Wasser	Auffüllung auf 1000 ml
Prüfen des pH-Werts bei 7,5 + 0,3

Nichtionisiertes Unterbrechungsreagenz

Trinatriumphosphat (Merck 6578) 19 g Deionisiertes Wasser Zugabe 950 ml

Berol 160 20 g Rühren bis zur völligen Klarheit

Deionisiertes Wasser Auffüllen auf 1000 ml
Gefärbtes Cellulosesubstrat
Muss jeden Tag frisch hergestellt werden.
Das trockene Pulver wird abgewogen und eine 10%ige (G/G) Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (wie beschrieben) wird hergestellt. Mindestens 30-minütiges Rühren vor Beginn des Versuchs.
Enzymprobe, verdünnt in 0,1 M Puffer
Die Proben werden in 0,1 M Phosphatpuffer auf eine Konzentration von z.B. 4, 8, 12, 16 S-CEVU/ml verdünnt.
Enzymstandard
Ein geeigneter Enzymstandard oder die entsprechende nicht gelagerte Probe wurde in 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt, um eine Standardkurve zu bilden.
Konzentrationen des Standards: z.B. 0, %, 1, 2, 4, 8, 12, 16 S-CEVU/ml
APPARATUR

Wasserbad bei 40°C
Spektrophotometer (590 nm)
Variomag Telesystem HP 60 P, tauchfähiger Magnetrührplatte (60 Punkte)
Variomag Teströhrchenhalterung HP60, für Teströhrchen mit 16 mm
Teströhrchen, 16 mm Ø
Magnetrührstäbe, 3 × 8 mm
Filterpapier Ø 9 cm, Munktell 1F
Filtrationstrichter
Finnpipette 1-5 ml
Teströhrchen und Halterung zum Auffangen des Filtrats
Magnetrührplatte und Magnet für Substratsuspension

VERFAHREN
Die Temperatur des Wasserbads muss 40°C betragen.
2 ml Probe- oder Standardlösung wurden in Halterungen angebrachten Teströhrchen gemessen. Als alle Röhrchen bereit waren, wurde die Halterung in ein Wasserbad gegeben. Ein Magnetrührstab wurde allen Röhrchen zugefügt und die Rührplatte mit 600 UpM gestartet. In einem 10-sekündigen Intervall wurden 2 ml gefärbtes Cellulosesubstrat unter konstantem Rühren während des Pipettierens zugesetzt. Nach 60-minütiger Reaktionszeit wurden 2 ml nichtionisches Unterbrechungsreagenz jedem Röhrchen zugesetzt. Die gut gemischte Probe wurde bei 40°C auf einen Papierfilter in einem Filtrationstrichter gegossen und das klare Filtrat aufgefangen. Die Filtration muss wiederholt werden, wenn das Filtrat nicht klar ist. Die Absorption bei 590 nm des Filtrats wurde gemessen. Die Absorption des Standards ohne Enzym, 0 S-CEVU/ml, wurde von der Absorption der Proben und anderen Standards subtrahiert. Die erhaltene Deltaabsorption bei 590 nm wurde gegen die Enzymaktivität in der in S-CEVU/ml gemessenen Probelösung grafisch aufgezeichnet. Die Dosisansprechkurve ist nicht linear (8), und die Aktivität der Probe in Bezug auf den Standard (oder einer gelagerten Probe in Bezug auf eine nicht gelagerte Probe) kann wie dargestellt berechnet werden.
VERSUCH, Lagerstabilität
2475 S-CEVU einer hoch gereinigten Endoglukanase wurde gefriergetrocknet. 1,65 g flüssiges Detergenz wurde zugesetzt und dies bis zum Lösen der Cellulase gerührt. 0,165 KNPU(S) Savinase^®-Protease wurden zugesetzt, und dies wurde gründlich gemischt. 100 μl Detergenz mit Enzymen wurde in (max.) sieben Nunc-Röhrchen mit einem Volumen von 1 ml pipettiert. Eines der Röhrchen wurde als Bezugsprobe sofort in den Tiefkühlschrank (–18°C) gegeben. Die übrigen (6) Röhrchen wurden bei 25°C und 35°C 1, 2 oder 5 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben auf Arbeitskonzentration verdünnt, und die Restaktivität der gelagerten Proben wurde in Bezug auf die nicht gelagerte Bezugsprobe im Dyed-Avicel-Versuch bestimmt. Die Restaktivität der Proben in Bezug auf die Bezugsprobe im Hinblick auf die Aktivität in S-CEVU/g wurde ebenso bestimmt.
ERGEBNISSE
9 zeigt ein Beispiel für Kurven des Dyed-Avecel-Versuchs mit Endoglukanase-Variante I.
BEISPIEL 2
Endoglukanase-Adsorption auf amorpher Cellulose
Avicel^® (Asahi Chemical Co., Ltd, Japan), amorphisiert durch Quellen in 85%iger Phosphorsäure wurde als Test-Adsorptionsmittel verwendet, siehe nachstehendes Beispiel s für weitere Einzelheiten.
Das Test-Adsorptionsmittel wurde als Suspension in destilliertem Wasser gelagert, wobei der Gehalt an trockener Cellulose (typischerweise 15 g/l) durch Trocknen und Abwiegen eines Aliquots in einem getrennten Versuch bestimmt wurde. Das Adsorptionsmittel wurde volumenmäßig (0 – 0,5 ml) in verschließbaren Kunststoffröhrchen dosiert, um einen Gehalt an Cellulosetrockenmasse im Bereich von 0-8 mg zu erhalten. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 0,5 ml eingestellt. Ariel Color, das ein im Handel erhältliches Kompaktpulverdetergenz ist, wurde zum Inaktivieren von im Pulverdetergenz vorliegenden Enzymen durch Inkubieren des Detergenzes in einem Mikrowellenofen für eine Dauer von 8 Min bei 85°C vorbehandelt. 0,3 ml der vorbehandelten Ariel Color Lösung (21,67 g/l) in 1 M Gly-NaOH-Puffer, pH 10, wurden jedem Röhrchen zugesetzt, gefolgt von einem Aliquot von 0,2 ml Enzym (5 IU/ml), um die anfängliche EG-Aktivität im Gemisch von etwa 1 IU/ml bereitzustellen.
Die Suspension wurde 60 Min. auf einem Mischer des Typs Swelab-Instrument 440 bei 20°C 1 Sek.^–1 geschüttelt und das Substrat mit adsorbiertem Enzym durch Zentrifugieren mit 2500 g, bei 20°C für eine Dauer von 5 Min. sedimentiert.
Der Überstand wurde auf ungebundene Endoglukanaseaktivität unter Verwendung einer herkömmlichen Technik wie Red-CMC-Versuch (Tikhomirov, D. F. et al., Biotechnologia (Moskau), übersetzt ins Englische von Plenum Press, 1989, Band 5, Nr. 4, S. 518-524) untersucht.
Enzymaliquote von 100 μl wurden zu 1 ml 1%igem Red-CMC-Substrat (Fermentas Co., Vilna, Litauen), pH 7,5 (0,05 M Tris-Puffer) in kleinen Glasröhrchen zugesetzt, und das Gemisch wurde in einen Wasserthermostaten bei 40°C 40 Min. gegeben. Ein zusätzliches Röhrchen mit Puffer anstelle des Enzymaliquots wurde als Blindprobe in den Thermostaten gegeben. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 80%igem Ethanol, enthaltend 0,1 M CaCl₂ und anschließendem kräftigen Schütteln unterbrochen. Das nicht hydrolysierte Substrat wurde durch Zentrifugieren derselben Röhrchen mit 4000 g für eine Dauer von 10 Min. abgetrennt und die Absorption des Überstands bei 490 nm gegen Wasser gemessen.
Der Adsorptionsgrad wurde in Bezug auf das A₀A_Über- Verhältnis gegen die Adsorptionsmittelkonzentration grafisch aufgezeichnet – ein gemäß Adsorptionseigenschaften homogenes Linearisierungsverfahren, das eine gerade Linie im Falle einer einzelnen, Endoglukanaseisoform bereitstellt (Klyosov, A. A. et al. Bioorgan. Chem. (Moskau), übersetzt ins Englische von Plenum Press, 1982, Band 8, Nr. 5, S. 643-651). Die Verteilungskonstante K_d = A_gebunden/(A_Über·[S]) kann aus dieser grafischen Aufzeichnung als Neigung der Linie bestimmt werden.
Die folgenden K_d-Werte wurden in Ariel Color erhalten:

Carezym 0,6 l/g

Y280F 2,9 l/g

R252F 4,3 l/g

Y280F+R252F 3,3 l/g
BEISPIEL 3
Waschversuche

A. Bedingungen

Apparatur:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	150 ml
Rühren:	100 Bewegungen/Min.
Waschzeit:	30 Min.
Spülzeit:	5 Min. in Leitungswasser
Waschtemperatur:	40°C

Stoff:	2 Stoffproben aus 100%iger, gealterter, schwarzer
Baumwolle 5	× 6 cm
Trocknung:	Leinentrocknung
Wiederholungen:	3
Vorbehandlung von im Handel erhältlichen
Detergenzien:	Inkubation in einem Mikrowellenofen zur eine Dauer von 8 Min. bei 85°C
Bewertung:	Ausschussmitglieder wurden zur Abgabe einer jeweiligen Bewertung der Oberflächen in einem Versuch in Bezug auf die Farbklarheit und den Fusselgrad befragt. Je höher die Zahl ist, desto besser ist das Erscheinungsbild.

1. Carezym gegen Y280F

Detergenz: Im Handel erhältliches Europäisches Kompakt-Color-Pulvergranulat, 6,5 g/l, pH 10,2

Wasserhärte: 3 mM Ca⁺⁺
Mittlere Ausschussbewertung (Bewertung 1-6)
Die Daten zeigen, dass die Variante unter den getesteten Bedingungen eine verbesserte Leistungsfähigkeit zeigt.
2. Carezym gegen

1) Y221S-N222S-Q223T
2) YSF
3) Del (5219-T235)

Detergenz :	Im Handel erhältliches US Heavy Duty-Kompaktpulvergranulat, 1 g/l pH 10
Wasserhärte:	1 mM Ca⁺⁺

Mittlere Ausschussbewertung (Bewertung 1-11)
Die Daten zeigen, dass alle drei Varianten eine verbesserte Leistungsfähigkeit unter den getesteten Bedingungen zeigen.

B. Bedingungen

Apparatur:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	800 ml
Waschzeit:	12 Min.
Spülzeit:	4 Min. in Leitungswasser
Waschtemperatur:	35°C
Stoff:	2 Stoffproben aus 100%iger, gealterter, schwarzer
Baumwolle	10 × 15 cm
Trocknung:	Trommeltrocknung
Wiederholungen:	11
Vorbehandlung von im Handel erhältlichen

Detergenzien:	Inkubation in einem Mikrowellenofen für eine Dauer von 8 Min. bei 85°C
Bewertung:	Ausschussmitglieder wurden zur Einstufung der Enzym-behandelten Oberfläche gegenüber ohne Enzym des visuellen Erscheinungsbildes (Farbklarheit und Fussel) gemäß einer bestimmten Skala befragt. Rangzahl:

1. Carezym gegen A162P

Detergenz: Im Handel erhältliches US Kompakt-Color-pulvergranulat, 1 g/l, pH 8,1

Wasserhärte: 1 mM Ca⁺⁺ & 0,35 mM Mg
Mittlere Ausschussbewertung

C. Bedingungen

Apparatur:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	800 ml
Rühren:	100 Bewegungen/Min.

Waschzeit:	30 Min.
Spülzeit:	10 Min. in Leitungswasser
Waschtemperatur:	40°C
Stoff:	2 Stoffproben aus 100%iger, gealterter, schwarzer
Baumwolle	10 × 15 cm
Trocknung:	Trommeltrocknung
Wiederholungen:	4
Vorbehandlung von im Handel erhältlichen
Detergenzien:	Inkubation in einem Mikrowellenofen für eine Dauer von 8 Min. bei 85°C
Bewertung:	Ausschussmitglieder wurden zur Einstufung der Enzym-behandelten Oberfläche gegenüber ohne Enzym des visuellen Erscheinungsbildes (Farbklarheit und Fussel) gemäß einer bestimmten Skala befragt. Rangzahl:

1. Carezym gegen W62E

Detergenz: Im Handel erhältliches Europäisches Kompaktpulvergranulat, 6,5 g/l, pH 10,2

Wasserhärte: 3 mM Ca⁺⁺
Mittlere Ausschussbewertung
BEISPIEL 4
Peroxidase-stabilisierte 43 kD Endoglukanase-Variante
Das für die Farbstofftransferhämmung (DTI) verwendete Peroxidasesystem (POD-System), umfassend eine Peroxidase von Coprinus cinereus (CiP, erhalten gemäß EP-Patentanmeldung 179,486), Wasserstoffperoxid und p-Hydroxybenzolsulfonat (pHBS) als Peroxidase-erhöhendes Mittel wurde in einem Britton-Robinson-Puffer, pH 8,5, simuliert.
[pHBS]: 50 μM, [H₂O₂]: 200 μM, [CiP]: 2 PODU/ml, [Cellulase]: 1,4 ECU(ml), 10 mM Britton-Robinson-Puffer, pH 8,5.
Die 43 kD Cellulase und die Cellulasevariante Y147S wurden mit dem POD-System 10 Min. bei 35°C inkubiert. Proben wurden entnommen und 5-fach mit eiskaltem Natriumphosphat, pH 7,0, verdünnt. Die Restaktivitäten der Cellulasen wurden durch das CMCU-Verfahren unter Verwendung des Hexacyanoeisen-Nachweisprinzips gemessen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargelegt, die zeigt, dass die Substitution von Y147S zu einer Cellulase-Variante führt, die gegen das POD-System stabil ist.
BEISPIEL 5
Bestimmung von alkalischer Endoglukanase-Aktivität auf amorphe Cellulose
Verfahren:
Substratzubereitung: 20 Gramm säuregequellte AVICEL^®-Stammlösung (siehe nachstehend für eine Zubereitung, die einen Monat gelagert werden kann), wurde 20 Min. mit 5000 UpM zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Sediment wieder in 30 ml Puffer suspendiert. Dann wurde 20 Min. mit 5000 UpM suspendiert, der Überstand abgegossen und das Sediment auf insgesamt 30 g wieder in Puffer suspendiert. Dies entspricht einer Substratkonzentration von 10 g AVICEL/Liter:
Puffer: 0,1 M Barbital mit pH 8,5 oder 0,1 M Glycin mit pH 10,0
Enzymlösung:
Die Enzyme wurden auf eine Aktivität von 0,5 S-CEVU/ml mit pH 8,5 oder 0,75 S-CEVU/ml mit pH 10,0 verdünnt.
Reagenzien:
2%ige NaOH, PHBAH-Reagenz: 1,5 g p-Hydroxybenzoesäurehydrazid und 5,0 g Natriumtartrat wurden in 100 ml 2%iger NaOH gelöst.
Das Substrat, der Puffer und die Enzymlösung wurden wie folgt gemischt:
Die Substrat/Puffer-Lösung wurde 5 Min. bei 40°C vorgewärmt. Dann wurde die Enzymlösung zugesetzt und die Lösung 5 Sek. aufgewirbelt, gefolgt von Inkubation für eine Dauer von 20 Min. bei 40°C.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 500 μl 2%iger NaOH-Lösung, gefolgt von Aufwirbeln für eine Dauer von 5 Sek., unterbrochen.
Die Proben wurden 20 Min. mit 5000 UpM zentrifugiert. 1000 μl Überstand wurden vom Teströhrchen in neue Teströhrchen überführt und diesen 500 μl PHBAH-Reagenz zugesetzt, gefolgt von Kochen für eine Dauer von 10 Min.
Die Teströhrchen wurden in Eiswasser abgekühlt.
Die Absorption der Proben wurde auf einem Spektrophotometer bei 410 nm gemessen.
Standardglucosekurve
Eine 300 mg/l enthaltende Stammlösung wurde auf 5, 10, 15 und 25 mg/l verdünnt.
1000 μl der verdünnten Standards wurden mit 500 μl PHBAH-Reagenz gemischt und wie die anderen Proben getestet, siehe vorstehend.
Aktivitätsbestimmung:
Die Freisetzung von reduzierendem Glucoseäquivalent wurde unter Verwendung der Standardkurve berechnet.
Die Enzymkonzentration wurde unter Verwendung der molaren Absorption von 61300 (e) für die 43 kD Endoglukanase berechnet. Der K_???, V_max und K_??? wurden aus einer grafischen Lineweaver-Burk-Aufzeichnung unter Verwendung von verschiedenen Substratkonzentrationen berechnet.
Die molare Absorption der Cellulase-Varianten mit substituierten Tyrosinen und Tryptophanen wurde demzufolge unter Verwendung eines Absorptionswerts für Tryptophan von 5690 (e) und für Tyrosin von 1280 (e) und für Cystein 120 (e) eingestellt.
Die Extinktionskoeefizienten (e) sind in Gill, S. C. und Hippel, P. H.: Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data; Analytical Biochemistry, Bd. 182, (319-326), (1989) offenbart.
Jede der getesteten Cellulase-Varianten wurde zu hoher Homogenität gereinigt, wodurch eine einzelne Bande in der SDS-PAGE-Analyse erhalten wurde (das Verhältnis A₂₈₀/A₂₆₀ wurde als über 1,5 überprüft).
Herstellung von säuregequellter Cellulose:
Materialien:

5 g Avicel^® (An. 2331 Merck)
150 ml 85%ige ortho-Phosphorsäure (Art. 573 Merck)
400 ml Aceton (An. 14 Merck)
1,3l deionisiertes Wasser (Milli Q)
1l Becherglas
1l Glasfiltertrichter
2l Saugflasche
Ultra Turrax Homogenisator

Verfahren:
Das Aceton und die Phosphorsäure wurden auf Eis gekühlt. 5 g Avicel^® wurde mit Wasser befeuchtet, diesem dann 150 ml eiskalte, 85%ige ortho-Phosphorsäure zugesetzt und das Gemisch auf ein Eisbad unter schwachem Rühren für eine Dauer von 1 Std. gegeben. 100 ml eiskaltes Aceton wurden unter Rühren zugesetzt, gefolgt von Überführen des Gemischs in einen Glasfiltertrichter, gefolgt von Waschen mit 3 × 100 ml eiskaltem Aceton und Trockensaugen nach jedem Waschen.
Der Filterkuchen wurde mit 2 × 500 ml Wasser gewaschen und nach jedem Waschen so trocken wie möglich gesaugt.
Der Filterkuchen wurde wieder auf ein Gesamtvolumen von 300 ml suspendiert und zur Homogenität (unter Verwendung des Ultra Turrax Homogenisators) gemischt.
Das erhaltene Produkt wurde in einem Kühlschrank gelagert.
Die folgenden Ergebnisse wurden mit der 43 kD Cellulase und den Varianten A162P bzw. W62E erhalten.
Wie aus der Tabelle ersichtlich, weisen beide Substitutionen eine erhöhte katalytische Aktivität auf das amorphe Avicel-Substrat unter alkalischer Bedingung (pH 10,0) auf.
BEISPIEL 6
LAS-Hemmung von Endoglukanase
Die Cellulase wurde mit verschiedenen Konzentrationen von LAS (lineares Alkylbenzolsulfonat, Nansa 1169/P) für eine Dauer von 10 Min. bei 40°C inkubiert.
Die Restaktivität wurde unter Verwendung des nachstehend beschriebenen CMCU-Verfahrens bestimmt.
LAS wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, verdünnt. Die folgenden Konzentrationen wurden verwendet: 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm und 10 ppm und kein LAS.
Die Endoglucanase wurde in den verschiedenen LAS-Puffern auf eine Endkonzentration von 0,2 S-CEVU/ml in einem Gesamtvolumen von 10 ml verdünnt und 10 Min. in einem temperaturregulierten Wasserbad inkubiert.
Dann wurde die Restaktivität doppelt unter Verwendung des CMCU-Substrats und Messen der reduzierenden Zucker bestimmt. Die zwei Proben von 0,5 ml Lösung wurden mit 1,5 ml 1%iger CMC-Lösung (Hercules 7 L), hergestellt in demselben Phosphatpuffer, gemischt, 20 Min. bei 40°C inkubiert und dann mit PHBAH, Natriumtartrat in 2%iger NaOH, unterbrochen.
Die ähnliche Blindprobe mit 0,5 ml wurde der CMC-Lösung nach Zugabe des Unterbrechungsreagenzes zugesetzt.
Die Proben wurden 10 Min. gekocht, und die Absorption wurde bei 410 nm gemessen.
Die Aktivität wurde nach Subtraktion der Blindprobe gemessen. Die Aktivität ohne LAS betrug 100%.
In 10 ist die Restaktivität der 43 kD Cellulase und der Cellulase-Varianten A162P bzw. R158E dargestellt. Die 43 kD Cellulase ist als „Wild" bezeichnet, die A162P-Variante ist als „248" bezeichnet und die R158E-Variante ist als „280" bezeichnet.
Wie aus der Abbildung ersichtlich, erhöht die Substitution von A162P oder R158E die Stabilität der Cellulase gegen LAS (anionisches oberflächenaktives Mittel).

Claims

Endoglukanase-Variante einer mikrobiellen Stamm-Endoglukanase, wobei die Stamm-Endoglukanase die 43 kDa Endoglukanase von Humicola insolens, dargestellt in 1 als 43kdhum, oder eine Endoglukanase, wobei die Aminsäuresequenz davon zu mindestens 45% über die gesamte Länge identisch mit der 43 kDa Endoglukanase von Humicola insolens ist, wobei ein oder mehrere Tyrosin(e) an einer Position, die der Position 8 und 147 der 43 kDa Stamm-Endoglukanase von Humicola insolens entspricht, durch ein Serin, Asparagin, Glutamin, Prolin, Phenylalanin, eine Glutaminsäure, ein Arginin oder Glycin substituiert ist/sind.
Endoglukanase-Variante nach Anspruch 1, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Y8F und Y147F,H,S,Q,N,E,D.
Endoglukanase-Variante nach Anspruch 1, wobei die Stamm-Endoglukanase eine Pilz-Endoglukanase ist.
Endoglukanase-Variante nach Anspruch 3, wobei die Stamm-Endoglukanase von einem Stamm von Humicola, Trichoderma, Myceliophthora, Penicillium, Irpex, Aspergillus oder Fursarium abgeleitet ist.
Endoglukanase-Variante nach Anspruch 4, wobei die Stamm-Endoglukanase eine Endoglukanase von Humicola insolens, vorzugsweise eine 43 kD Endoglukanase von Humicola insolens ist.
Detergenz-Zusammensetzung, umfassend eine Endoglukanase-Variante nach einem der vorangehenden Ansprüche und ein oberflächenaktives Mittel.
Detergenz-Zusammensetzung nach Anspruch 6, ferner umfassend ein oder mehrere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protease, Lipase, Peroxidase, Esterase, Cellulase, Endoglukanase Typ II, Oxidase und Amylase.
Detergenz-Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Detergenz-Zusammensetzung eine pulverförmige oder eine flüssige Zusammensetzung ist.