CN107267485A

CN107267485A - 稳定化的α‑淀粉酶变体及其用途

Info

Publication number: CN107267485A
Application number: CN201710225211.9A
Authority: CN
Inventors: C.安德森; A-K.菲夫尔
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2017-10-20
Also published as: JP2018019680A; EP3228703B1; DK201600210A1; BR102017007291A2; US10519405B2; MX2017004617A; US11248193B2; AR108196A1; US20200071638A1; EP3228703A1; DK179660B1; CA2963670A1; US20170292095A1

Abstract

本发明涉及与亲本α‑淀粉酶相比具有改进的稳定性的α‑淀粉酶变体。本发明还涉及变体的用途、包含变体的组合物以及产生变体的方法。

Description

稳定化的α-淀粉酶变体及其用途

对序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及稳定化的α-淀粉酶变体、编码变体的多核苷酸、产生变体的方法以及使用变体的方法。

背景技术

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(alpha-1,4-glucan-4-glucanohydrolases)，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖(1,4-gluosidic oligo-and polysaccharide)的水解。

α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，所述应用如洗涤剂(detergent)、烘焙(baking)、酿造(brewing)、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。

要使用的第一种细菌α-淀粉酶之一是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作特妙淀粉酶(Termamyl)，其已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。芽孢杆菌淀粉酶如特妙淀粉酶和SP707形成已经在洗涤剂中得到应用的特定的一组α-淀粉酶。这些已知的细菌淀粉酶中的许多已经经修饰来改进其在具体应用中的功能。

已经完全研究了增加α-淀粉酶的热稳定性的方法。Suzuki等人(1989)公开了嵌合α-淀粉酶，其中已经用解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的规定区域替代地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域。以鉴定负责热稳定性的区域为目的，构建了嵌合α-淀粉酶。发现此类区域包括解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸残基177-186和氨基酸残基255-270。Igarashi等人1998显示了可以通过从环(F178至A184)中缺失两个氨基酸残基，R179-G180(AmyS编号)增加AmyS型淀粉酶的热稳定性。然而，Shiau等人(2003)显示了在相同的环中具有缺失的AmyS酶对于在高温下的玉米淀粉水解比亲本酶具有更低的比活性，否定了AmyS淀粉酶的主要优点之一。

在WO 2014/195356中，描述了α-淀粉酶变体，如芽孢杆菌TS-23α-淀粉酶具有改进的稳定性。该变体可以具有i)在两个或更多个位置处的缺失和ii)在选自列表的一个或多个位置处的改变。

出于环境原因，降低清洗，洗碗(dishwashing)和/或清洁过程中的温度已变得越来越重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有高于低温清洗中通常使用的温度的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物的关键酶，并且其使用对于洗衣清洗或洗碗期间淀粉污渍的去除变得越来越重要。因此，重要的是找到下述α-淀粉酶变体，其当温度降低时保持其洗涤性能，去污效果(stain removal effect)和/或活性。然而，尽管目前洗涤剂酶组合物的效率，存在许多难以完全除去的污渍。这些问题由于不断使用低(例如，冷水)清洗温度和较短的清洗循环而变复杂。因此，期望具有可在低温下发挥功能，同时保留或增加其它期望的特性如比活性(淀粉分解活性)，稳定性和/或清洗性能的淀粉分解酶。

因此，本发明的目的是提供当掺入洗涤剂组合物如液体洗涤剂中时，特别是在螯合剂，表面活性剂，蛋白酶和/或碱性条件的存在下展现出高水平的稳定性的α-淀粉酶变体。

本发明提供了α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体与其亲本和已知的α-淀粉酶变体相比具有改进的稳定性。

发明内容

在一个方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，该变体具有α-淀粉酶活性并与SEQID NO:1具有至少89％的序列同一性，其中该变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置处包含氨基酸基序FX1X2K；其中X1是R或S；并且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R时，则X2不是S，并且其中所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(Residual Activity，RA)。

在另一个方面，本发明涉及包含本申请的变体的组合物。

在另一个方面，本发明涉及洗涤剂添加剂，其包含本申请的变体，任选地以无尘颗粒(non-dusting granulate)，稳定化的液体，或受保护的酶的形式。

在另一个方面，本发明涉及手动或自动洗碗洗涤剂组合物，其包含本发明的变体，和任选地表面活性剂。

在另一个方面，本发明涉及手动或自动洗衣洗涤剂组合物，其包含本发明的变体。

在另一方面，本发明涉及本发明的变体的用途。

在一个方面，本发明涉及本发明的变体在洗衣、洗碗，如自动或手动洗碗，硬表面清洁(hard surface cleaning)，工业和机构清洁(industrial and institutionalcleaning)，纺织品退浆(textile desizing)，淀粉改性(starch modification)，淀粉液化(starch liquefaction)，糖化(saccharification)，饲料(feed)，烘焙或酿造中的用途。

在另一个方面，本发明涉及编码本发明的变体的多核苷酸。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的多肽的核酸构建体。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的多肽的表达载体。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的多肽的宿主细胞。

在另一个方面，本发明涉及产生本发明的α-淀粉酶变体的方法，其包括(a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

在另一个方面，本发明涉及用于获得α-淀粉酶变体的方法，其包括向亲本α-淀粉酶中引入选自对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的R180,S181,T182和G183的位置的两个氨基酸的缺失，提供氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；并且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R时，则X2不是S，所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(RA)，且其中所述变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。

定义

α-淀粉酶：如本文所使用的，术语“α-淀粉酶活性”指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据方法中所述的程序确定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的α-淀粉酶具有如下列出的SEQ ID NO:1，2或3的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性

SEQ ID NO:1

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYTFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAK

SEQ ID NO:2

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYTFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAK

SEQ ID NO:3

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAKTSNVTFTVNNATTTSGQNVYVVANIPELGNWNTANAIKMNPSSYPTWKATIALPQGKAIEFKFIKKDQAGNVIWESTSNRTYTVPFSSTGSYTASWNVP

SEQ ID NO:4

FX1X2K

α-淀粉酶活性：如本文所使用的，术语“α-淀粉酶活性”指α-淀粉酶的活性，其中根据方法中描述的程序确定该活性。可以根据使用实施例1中描述的Phadebas的方法确定α-淀粉酶活性。可以使用其它的α-淀粉酶活性测定法，例如EnzCheck或Amylazyme。

氨基酸：本文所使用的，术语“氨基酸”是指标准的20个遗传编码的氨基酸及其相应的“d”形式的立体异构体(与天然的“l”形式相比)、ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生化的氨基酸。一种或多种氨基酸的化学衍生物可以通过与功能侧基反应来实现。此类衍生化的分子包括例如其中游离氨基已被衍生化形成胺盐酸盐，对甲苯磺酰基，羧基苯甲氧基，叔丁氧基羰基，氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可被衍生化形成盐，甲基和乙基酯或其它类型的酯和酰肼。游离羟基可被衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。还包括作为化学衍生物的含有20个标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸，并且鸟氨酸可取代赖氨酸。衍生物还包括含有一个或多个添加或缺失的肽，只要维持必需的活性即可。其他包括的修饰是酰胺化，氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)，末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)和类似的末端修饰。

当明确列举氨基酸，如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，除非另有明确说明，否则该术语指l-丙氨酸和d-丙氨酸两者。其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分，只要多肽保留期望的功能特性。对于所示的肽，每个编码的氨基酸残基在适当的情况下由单字母名称表示，所述单字母名称对应于常规氨基酸的三字母名称。在一个实施方案中，本发明的多肽包含1-氨基酸或由1-氨基酸组成。

氨基酸基序：如本文中使用的，术语“氨基酸基序”或“基序”是指多肽的具体限定的氨基酸区段。因此，氨基酸基序涉及亲本多肽中氨基酸的短序列。根据本发明，氨基酸基序对应于SEQ ID NO:4，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置180至183。

cDNA：如本文中使用的，术语“cDNA”是指可以通过从真核或原核细胞获得的成熟的，剪接的mRNA分子的逆转录制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于对应的基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列步骤进行处理，包括剪接，然后作为成熟的剪接mRNA出现。

编码序列：如本文中使用的，术语“编码序列”是指直接规定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框来确定，其以起始密码子如ATG，GTG或TTG开始，并以终止密码子如TAA，TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA，cDNA，合成DNA或其组合。

控制序列：如本文中使用的，术语“控制序列”是指对于编码本发明变体的多核苷酸的表达必需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的(native)(即，来自相同的基因)或外源的(即，来自不同的基因)或彼此天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，转录和翻译终止信号。为了引入特定限制性位点，促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接，可以给控制序列提供接头。

对应于：如本文中使用的，术语“对应于”是指参考特定氨基酸序列，确定序列的特定氨基酸的方式。例如。为了本发明的目的，当参考特定的氨基酸位置时，本领域技术人员能够将另一个氨基酸序列与已经参考的所述氨基酸序列进行比对，以确定在所述另一个氨基酸序列中哪个特定氨基酸序列可以是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了将另一个氨基酸序列与例如，如SEQ ID NO:1，2或3所示的序列或本文所列的任何其它序列比对。可以使用备选比对方法，并且对于本领域技术人员来说是公知的。

洗碗组合物：如本文中使用的，术语“洗碗组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不限于任何特定类型的洗碗组合物或任何特定的洗涤剂。因此，在一个实施方案中，洗碗组合物是液体洗碗组合物，粉末洗碗组合物，其中组合物可任选地为单位剂量的形式。

酶去垢性益处：如本文中使用的，术语“酶去垢性益处(enzyme detergencybenefit)”是指与不含酶的相同洗涤剂相比，酶可以添加到洗涤剂中的有利效果。可以由酶提供的重要的去垢性益处是污渍去除，其中在清洗和/或清洁之后没有或很少有可见的垢，防止或减少在清洗过程中释放的污垢的再沉积(也称为抗再沉积(anti-redeposition)的效果)，完全或部分地恢复原来是白色但经过反复使用和洗涤后已经获得了灰色或淡黄色外观的纺织品的白度(whiteness)(也称为增白的效果)。纺织品护理益处(其与催化性污渍去除或防止污垢再沉积无直接关系)对于酶去垢性益处也是重要的。此类纺织品护理益处的例子是防止或减少从一种织物到另一种织物或相同织物的另一部分的染料转移(也称为染料转移抑制或抗返染(anti-backstaining)的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球(pilling)倾向或去除已经存在的球或绒毛(也称为抗起球的效果)，织物柔软度的改进，织物的颜色澄清以及去除织物或服装的纤维中捕获的颗粒污垢。酶促漂白是进一步的酶去垢性益处，其中催化活性通常用于催化漂白组分如过氧化氢或其它过氧化物的形成。

表达：如本文中使用的，术语“表达”指涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：如本文中使用的，术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸与提供其表达的控制序列可操作连接。

片段：如本文中使用的，术语“片段”是指在SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如数个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO:1的至少200个连续的氨基酸残基，例如SEQ ID NO:1的至少300个连续的氨基酸残基，或至少350个连续的氨基酸残基，或至少400个连续的氨基酸残基，或至少450个连续的氨基酸残基。

硬表面清洁：如本文中使用的，术语“硬表面清洁”是指硬表面的清洁，其中硬表面可以包括地板，桌，壁，屋顶等，以及诸如汽车(汽车清洗)和盘(洗碗)等硬物体的表面。洗碗包括但不限于碟(plates)，杯，玻璃器皿(glasses)，碗，餐具(cutlery)如勺，刀，叉，服务用具，陶瓷，塑料，金属，瓷器，玻璃和丙烯酸类。

宿主细胞：如本文中使用的，术语“宿主细胞”是指易于用含有本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化，转染，转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何后代。

强度值：可以以亮度测量清洗性能，所述量度表示为当用白光照亮时从样品反射的光强度。当样品被染污时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量清洗性能，其中较高的强度值与较高的清洗性能相关。使用专业平板式扫描仪(flatbed scanner)(Kodak iQsmart,Kodak)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获清洗的纺织品的图像。为了从扫描图像中提取光强度的值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

改进的特性：如本文中使用的，术语“改进的特性”是指与亲本相比改进的与变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能和储存条件下的稳定性。改进的特性可以是本文定义和描述的那些中的任一种，如稳定性。

分离的：如本文中使用的，术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性例子包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中取出的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质认为修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：如本文中使用的，术语“成熟多肽”是指翻译和任何翻译后修饰(如N端加工，C端截短，糖基化，磷酸化等)后的最终形式的多肽。本领域中已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：如本文中使用的，术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

修饰：在本发明的多肽的语境中，术语“修饰”表示参考氨基酸序列(即SEQ ID NO:1，2或3)中的一个或多个氨基酸通过用不同的氨基酸取代，通过氨基酸的插入或通过缺失而改变。此外，突变可以对应于在参考氨基酸序列内插入一个或多个额外的氨基酸。术语“修饰”，“改变”和“突变”可以互换使用，并构成相同的含义和目的。

核酸构建体：如本文中使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或以下述方式修饰为含有核酸区段，使得否则不会存在于自然界中，或者是合成的，其包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：如本文中使用的，术语“可操作地连接”是指其中将控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适当位置使得控制序列指导编码序列的表达的构造。

亲本或亲本α-淀粉酶：如本文中使用的，术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”是指SEQID NO:1，2或3的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1，2或3的多肽中的任一项具有至少89％的序列同一性的任意α-淀粉酶。亲本α-淀粉酶也可以是包含SEQ ID NO:1，2或3的片段的多肽，即亲本α-淀粉酶可以是具有α-淀粉酶活性的融合多肽，如本文其它地方定义的。

残留活性(RA)：如本文中使用的，术语“残留活性(RA)”是指在一定温度下孵育一定时间后，根据本发明的变体和/或酶保留的活性。可以如实施例1所述，通过使用例如Phadebas测定法确定RA。

淀粉改性：如本文中使用的，术语“淀粉改性”是指在造纸业中生产纸浆时淀粉降解的过程。纸浆脱浆可用于造纸业工艺中，以获得纸浆的最佳粘度。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”描述。

为了本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如在EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，TrendsGenet.16：276-277)的Needle程序中实施，优选版本5.0.0或更高版本。使用的参数可以是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOS版本)替代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用no-brief选项获取)作为百分比同一性，并且计算如下：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中的缺口总数)

或者，使用的参数可以是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用no-brief选项获取)作为百分比同一性，并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的缺口总数)

子序列：如本文中使用的，术语“子序列”是指在成熟多肽编码序列的5'和/或3'末端不存在一个或多个(例如数个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。

纺织品：纺织品样品CS-28(棉上的稻淀粉)获得Center For Testmaterials BV,P.O.BoX120,3133KT Vlaardingen,the Netherlands。

纺织品护理益处：如本文中使用的，术语“纺织品护理益处”定义为不与催化污渍去除或防止污垢的再沉积直接相关，对于酶去垢性益处也是重要的。此类纺织品护理益处的例子是防止或减少从一种纺织品到另一种纺织品或相同纺织品的另一部分的染料转移(也称为染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的球或绒毛(也称为抗起球的效果)，纺织品柔软度的改进，纺织品的颜色澄清以及去除纺织品的纤维中捕获的颗粒污垢。酶促漂白是进一步的酶去垢性益处，其中催化活性通常用于催化漂白组分如过氧化氢或其它过氧化物或其它漂白种类的形成。

变体：如本文中使用的，术语“变体”是指具有α-淀粉酶活性的多肽，其相对于SEQID NO:1的“亲本”α-淀粉酶在一个或多个(例如数个)位置处包含突变，即取代，插入和/或缺失。取代是指用不同的氨基酸替换占据位置的氨基酸；缺失是指去除占据位置的氨基酸；而插入是指在占据位置的氨基酸附近和直接之后添加氨基酸。本发明的变体具有SEQ IDNO:1，2或3的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％。

野生型α-淀粉酶：如本文中使用的，术语“野生型α-淀粉酶”是指由天然存在的微生物，例如天然存在的细菌，酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。

变体命名规则

具有α-淀粉酶活性的本发明的多肽对应于源自芽孢杆菌的α-淀粉酶的变体，如SEQ ID NO:1，2或3所示。

SEQ ID NO:1

本发明多肽中的变体(即突变)氨基酸通过参考SEQ ID NO:1(其对应于芽孢杆菌属种TS-23的成熟蛋白质TS23)的氨基酸编号来定义。相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列差异以粗体，下划线显示。除了SEQ ID NO:2的突出显示的位置X1和X2之外，SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列是相同的。

SEQ ID NO:2

为了本发明的目的，使用SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶多肽中的相应氨基酸残基。然而，本领域技术人员将理解也可以使用SEQ ID NO:2的序列来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽比对，且基于比对，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定对应于SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽中的任意氨基酸残基的氨基酸位置编号，如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序中实施的，优选5.0.0版或更新版本。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOS版本)替代矩阵。

在另一种α-淀粉酶中对应的氨基酸残基的鉴定可通过使用几种计算机程序的多种多肽序列的比对来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(对数预期的多序列比较；版本3.5或更新的版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新的版本；Katoh and Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059-3066；Katoh et al.,2005,Nucleic Acids Research 33:511-518；Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh et al.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新的版本；Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)，应用其各自的默认参数。

当其他α-淀粉酶已经与SEQ ID NO:1的成熟多肽趋异，使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。可以使用搜索程序在基于序列的搜索中获得更大的灵敏度，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生谱并且能够检测远距离同源物(tschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可实现更大的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin and Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化潜力(solvationpotential))作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。继而，可以使用这些比对产生多肽的同源性模型，并且使用为了该目的而开发的多种工具评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，数种工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，SCOP蛋白质超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm and Sander,1998,Proteins 33:88-96)或者组合扩展(Shindyalov and Bourne,1998,Protein Engineering 11:739-747)比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的执行用感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。

在描述本发明的α-淀粉酶变体中，为了方便参考而改编以下所述的命名法。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，例如在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)用精氨酸(R)取代和丝氨酸(S)用苯丙氨酸(F)取代。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置181处的甘氨酸缺失表示为“Ser181*”或者“S181*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Ser181*+Thr182*”或“S181*+T182*”。

插入：对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，例如在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。指定多个氨基酸的插入[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上例子中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多个改变。包含多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”，代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别用酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变。当在一个位置可以引入不同的改变时，不同的改变用逗号分隔，例如“Arg170Tyr，Glu”表示用酪氨酸或谷氨酸取代位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，所述变体具有α-淀粉酶活性并且与SEQ ID NO:1具有至少89％的序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置处包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；并且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，并且其中所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(RA)。

本发明提供了亲本α-淀粉酶的变体，已经显示所述变体与已知的同源α-淀粉酶变体(即与SEQ ID NO:1具有小于89％序列同一性的主链的变体，且其中该变体具有与本发明相似的基序)相比具有显著改进的稳定性。特别地，如从实施例2(与远距离α-淀粉酶(SP722)中相似变体的比较数据)可以看出，本发明的变体具有显著改进的稳定性。因此，不受理论的束缚，认为预期缺失变体，如本发明的缺失变体不能显示与例如SP722的已知缺失变体相同的稳定性模式。

在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO:1具有至少89％，如90％，如91％，如92％，如93％，如94％，如95％，如96％，如97％，如98％，如99％，但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:2的X2是S，G或T。因此，在一个实施方案中，X2是S，G或T。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO:2的X1是R，则SEQ ID NO:2的X2是G或T。因此，在一个实施方案中，当X1是R时，X2是G或T。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO:2的X1是S，则SEQ ID NO:2的X2是S，G或T。因此，在一个实施方案中，当X1是S时，X2是S，G或T。

在另一个具体实施方案中，SEQ ID NO:2的X1为R，且SEQ ID NO:2的X2为G。因此，在一个具体实施方案中，X1为R，且X2为G。

在另一个具体实施方案中，SEQ ID NO:2的X1为R，且SEQ ID NO:2的X2为T。因此，在一个具体实施方案中，X1为R，且X 2为T。

在另一个具体实施方案中，SEQ ID NO:2的X1为S，且SEQ ID NO:2的X2为T。因此，在一个具体实施方案中，X1为S，且X2为T。

在另一个具体实施方案中，SEQ ID NO:2的X1为S，且SEQ ID NO:2的X2为G。因此，在一个具体实施方案中，X1为S，且X 2为G。

本发明的变体还可以包括在一个或多个(例如数个)其它位置的一个或多个另外的修饰。

氨基酸变化可以具有次要的性质，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常为1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基；高达20至25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能促进纯化的小延伸(如多组氨酸段，抗原性表位或结合结构域)。

保守取代的例子为在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且描述于例如H.Neurath and R.L.Hill,1979,于,The Proteins,Academic Press,New York。常见的取代是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸变化具有使得改变多肽的物理化学特性的性质。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham andWells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的[酶]活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶活性位点或其他生物学相互作用也可以通过对结构进行物理学分析来进行确定，如通过以下技术，如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变相结合来进行确定。参见，例如de Vos et al.,1992,Science 255:306-312；Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver et al.,1992,FEBS Lett.309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断必需氨基酸的身份。

因此，本发明的变体可以包括进一步的修饰，如取代，插入和/或缺失。本发明的变体可以包括此类进一步的修饰以获得具有改进的性能的变体，如改进的清洗性能，改进的液化特性和改进的脱浆特性。

在一个实施方案中，本发明的变体中的进一步修饰的数目为1至30，例如，1至20，例如1至10和1至5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个修饰。

因此，在一个实施方案中，修饰的数目为1至20，如1至10，如1至5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个修饰。

认为本发明的变体可以通过进一步的修改进一步稳定化和/或增强性能。特定的修饰可能与本发明的变体的稳定性有关。在具体的实施方案中，变体进一步包含在对应于Y242和F266的至少一个位置的取代，其中根据SEQ ID NO:2编号。

在具体实施方案中，位置Y242的取代为Y242F，而位置F266的取代为F266Y。在一个实施方案中，变体包含Y242F和F266Y取代两者。在具体实施方案中，除了本文描述的基序之外，本发明的变体还由取代Y242F或F266Y，或取代Y242F和F266Y两者组成。

本发明的变体还可以包含在对应于SEQ ID NO:2的S243和G475的位置中的至少一个取代。具体地，取代可以是S243Q和G475K。因此，在一个实施方案中，本发明的变体包括以下修饰或由以下修饰组成：

T182*+G183*+Y242F+S243Q+F266Y+G475K，

S181*+T182*+Y242F+S243Q+F266Y+G475K，

R180*+T182*+Y242F+S243Q+F266Y+G475K，或者

R180*+G183*+Y242F+S243Q+F266Y+G475K，

其中根据SEQ ID NO:2编号。

在一个方面，亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO:1的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个。

在一个方面，亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO:2的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个。

在一个方面，亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO:3的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差多达10个氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个。

在一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列组成。

在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至485或由SEQ IDNO:1的氨基酸1至485组成。

在另一方面，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段，其含有至少100个氨基酸残基，例如至少200个，至少300个，至少400个和至少450个氨基酸残基。

在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的多肽的等位变体。

在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至485或由SEQ IDNO:2的氨基酸1至485组成。

在另一方面，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其含有至少100个氨基酸残基，例如至少200个，至少300个，至少400个和至少450个氨基酸残基。

在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:2的多肽的等位变体。

在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。在另一方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至485或由SEQ IDNO:3的氨基酸1至485组成。

在另一方面，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:3的成熟多肽的片段，其含有至少100个氨基酸残基，例如至少200个，至少300个，至少400个和至少450个氨基酸残基。

在另一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:3的多肽的等位变体。

可以根据本领域公知的方法使用SEQ ID NO:1的多肽或其片段设计核酸探针，以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本α-淀粉酶的DNA。具体地，遵循标准Southern印迹法程序，此类探针可以用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以比整个序列短得多，但长度应该是至少15个，例如至少25个，至少35个，或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针为至少100个核苷酸的长度，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。可以使用DNA和RNA探针两者。通常标记探针用于检测相应的基因(例如，用³²P，³H，³⁵S，生物素或亲合素(avidin))。此类的探针包括在本发明中。

可以对从此类其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术分离来自此类其它菌株的基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可以转移并固定在硝酸纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，该载体材料用于Southern印迹。

多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域融合于另一种多肽的区域的N末端或C末端。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于本发明的多肽的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在读码框中，且融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的控制下。也可以使用内含肽(intein)技术构建融合多肽，其中翻译后创建融合多肽(Cooper et al.,1993,EMBOJ.12:2575-2583；Dawson et al.,1994,Science 266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌时，该位点被切割，从而释放出两种多肽。切割位点的例子包括但不限于在以下文献中公开的位点：Martin et al.,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina et al.,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson et al.,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward et al.,1995,Biotechnology 13:498-503；and Contreras et al.,1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton et al.,1986,Biochemistry 25:505-512；Collins-Racie et al.,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter et al.,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；和Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48。

亲本α-淀粉酶可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如本文中结合给定的来源使用的，术语“从...获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，亲本α-淀粉酶是细胞外分泌的。

亲本α-淀粉酶可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属α-淀粉酶。

在一个方面，亲本是芽孢杆菌属种TS-23α-淀粉酶，例如SEQ ID NO:1，2或3的α-淀粉酶。

SEQ ID NO:1，2和3的α-淀粉酶以及其变体可以通过本领域已知的方法人工制造。

在一个方面，变体具有与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列至少89％，如至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％同一性，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但小于100％的序列同一性。

本发明的变体可以具有与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列至少89％的序列同一性，并且包含许多修饰，如1至20个修饰，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个。具体地，修饰的数目可以是1至10，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个修饰。修饰的数目可以是1至5，如1，2，3，4或5个修饰。

从实施例可以看出，与亲本α-淀粉酶相比，本发明的变体已经显示出具有改进的特性。

在一个实施方案中，相对于所述亲本α-淀粉酶，该变体具有改进的稳定性，如储存稳定性，热稳定性，洗涤剂中的稳定性和螯合剂稳定性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比变体具有改进的化学稳定性。

如本文中所使用的，术语“化学稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在包含化学组分的组合物中时α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定化学稳定性，即将α-淀粉酶变体或亲本在包含化学组分的组合物中在特定温度，例如40摄氏度下孵育给定的一段时间，例如4小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改进的氧化稳定性。

如本文中所使用的，术语“氧化稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在包含氧化组分的组合物中时α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定氧化稳定性，即将α-淀粉酶变体或亲本在包含氧化组分的组合物中在特定温度，例如40摄氏度下孵育给定的一段时间，例如4小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改善的pH稳定性。

如本文中所使用的，术语“pH稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在具有与可以作为α-淀粉酶的最适pH的pH相比改变的pH的组合物中时，α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定pH稳定性，即将α-淀粉酶变体或亲本在具有与可以作为α-淀粉酶的天然pH的pH相比改变的pH概貌的组合物中在特定温度，例如40摄氏度下孵育给定的一段时间，例如4小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改进的比活性。

如本文中所使用的，术语“比活性”是指通过使用如实施例中所述的α-淀粉酶比活性测定法测定的α-淀粉酶变体或亲本的活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体在储存条件下具有改善的稳定性。

如本文中所使用的，术语“储存稳定性”和“储存条件下的稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在制剂中时α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定储存稳定性，即将组合物中的α-淀粉酶变体或亲本在特定温度，例如25摄氏度下孵育给定的一段时间，例如2小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改善的底物稳定性。

如本文中所使用的，术语“底物稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本α-淀粉酶在组合物，如洗涤剂组合物中时，α-淀粉酶变体或亲本α-淀粉酶的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定底物稳定性，即将组合物中的α-淀粉酶变体或亲本在特定温度，例如60摄氏度下孵育给定的一段时间，例如2小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改善的热活性。

如本文中所使用的，术语“热活性”是指当α-淀粉酶变体或亲本α-淀粉酶暴露于例如热应激或热变化时，α-淀粉酶变体或亲本α-淀粉酶的活性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定热活性，即将α-淀粉酶变体或亲本在升高的温度，例如60摄氏度下孵育给定的一段时间，例如2小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改善的热稳定性。

如本文中所使用的，术语“热稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在特定的高温，如60摄氏度下测试或保留时，α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定热稳定性，即将组合物中的α-淀粉酶变体或亲本在升高的温度，如60摄氏度的温度下孵育给定的一段时间，例如24小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，变体具有改善的洗涤剂中的稳定性。

如本文中所使用的，术语“洗涤剂中的稳定性”是指当α-淀粉酶变体或亲本在洗涤剂组合物或制剂中时α-淀粉酶变体或亲本的稳定性。可以以与实施例中所示的相似的方式测定该稳定性，即将洗涤剂组合物中的α-淀粉酶变体或亲本在特定温度，例如25摄氏度下孵育给定的一段时间，例如2小时，然后通过使用α-淀粉酶活性测定法确定残留活性。

在一个实施方案中，与亲本α-淀粉酶相比，该变体具有改善的螯合剂稳定性。

因此，在一个实施方案中，变体具有改善的稳定性，其中通过Phadebas测定法测定稳定性。因此，可以通过包括以下步骤的测定法来确定改进的稳定性：在100mM Britton-Robinson缓冲液中稀释变体，并通过620nm处的分光光度法测量所得蓝色溶液。

本发明的变体的制备

本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，包括向亲本α-淀粉酶中引入选自对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的R180，S181，T182和G183的位置的两个氨基酸的缺失，提供氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)，其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R时，则X2不是S，所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(RA)，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变方法制备变体，如定点诱变，合成基因构建，半合成基因构建，随机诱变，改组(shuffling)等。

定点诱变是下述技术，其中将一个或多个(例如数个)突变引入编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸的一个或多个限定位点。

可以通过涉及使用包含期望的突变的寡核苷酸引物的PCR体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变体外进行定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后在多核苷酸中连接包含突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，Scherer and Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton et al.,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；Storici et al.,2001,Nature Biotechnol.19:773-776；Kren et al.,1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano and Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

任何定点诱变方法可用于本发明。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian et al.(2004,Nature 432:1050-1054)所述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由Reidhaar-Olson and Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625所公开的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al.,1986,Gene 46:145；Ner et al.,1988,DNA 7:127)。

可以组合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness et al.,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。可以自宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的各方面来实现半合成基因构建。半合成构建以与PCR技术组合的下述方法为典型，所述方法利用合成的多核苷酸片段。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后，可以对多核苷酸子序列进行改组。多核苷酸

本发明还涉及编码本发明变体的分离的多核苷酸。因此，本发明涉及编码具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性的变体的多核苷酸，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

核酸构建体

本发明涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个控制序列，该控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)，其中所述多核苷酸可操作地连接到一个或多个控制序列，该控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式操纵该多核苷酸以提供变体的表达。根据表达载体，多核苷酸在其插入载体中前的操纵可以是期望的或必需的。采用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域公知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

适合于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的启动子的例子是从下列各项获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦α-淀粉酶(maltogenic alpha-amylase)基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse and Lereclus,1994,MolecularMicrobiology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon et al.,1988,Gene 69:301-315)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶(agarase)基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert etal.,1980,Scientific American 242:74-94；以及Sambrook et al.,1989，同上。串联启动子的例子公开于WO 99/43835中。

适合于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的启动子的例子是从下列各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶(Aspergillus nidulansacetamidase)、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖α-淀粉酶(glucoalpha-amylase)(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKAα-淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性例子包括来自黑曲霉中性α-α-淀粉酶的基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型、截短型、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从下列各项的基因获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos et al.,1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。将终止子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌(Escherichia coli)核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从下列各项的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA α-淀粉酶以及尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。Romanos et al.,1992,同上描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是启动子下游且基因的编码序列上游的mRNA稳定剂区(mRNAstabilizer region)，其增加基因的表达。

合适的mRNA稳定剂区的例子从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue et al.,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471)。

控制序列还可以是前导序列，一种对宿主细胞的翻译而言重要的非翻译mRNA区域。将前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA α-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适合于酵母宿主细胞的前导序列以下各项的基因中获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列，即可操作地连接至变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列从以下各项的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA α-淀粉酶以及尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列描述于Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路中。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。或者，编码序列的5’末端可包含对于编码序列异源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地包含信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837生麦α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米曲霉TAKA α-淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶以及米赫毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽可以获自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos et al.,1992，同上描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于变体的N末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从多肽原转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。

还可以期望添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的例子是响应于化学或物理刺激而使基因的表达开启或关闭的那些调节系统，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖α-淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-α-淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖α-淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的表达载体，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译停止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的表达载体，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK；启动子，转录和翻译停止信号的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制性位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。或者，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，编码序列位于该载体中，使得编码序列与用于表达的合适的控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是当导入宿主细胞中时整合到基因组中并且与染色体一起复制的载体，所述载体已经整合到所述染色体中。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(其共同包含待导入宿主细胞基因组的完整DNA)，或转座子。

载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂(biocide)或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌性选择性标志物的例子是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶(acetamidase))、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyltransferase))、bar(草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase))、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中以不依赖于基因组的方式自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的载体的任何其他元件。或者，载体可以包含额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置整合入宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制基因(replicator)。术语“复制起点”或“复制基因”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的例子是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的例子是AMA1和ANS1(Gems et al.,1991,Gene 98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过以下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或通过包含可扩增的选择性标志物基因及多核苷酸，其中可通过在适当的选择剂的存在下培养细胞来选择包含选择性标志物基因的扩增拷贝，且由此包含多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域技术人员而言是公知的(参见，例如Sambrook et al.,1989，同上)。

宿主细胞

本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸的宿主细胞。因此，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的宿主细胞，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的编码本发明变体的多核苷酸，所述控制序列指导本发明的变体的产生。因此，本发明涉及宿主细胞，其包含编码变体的多核苷酸，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)，其中所述多核苷酸可操作地连接到指导变体产生的一个或多个控制序列。

将包括多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中，使得将构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)以及浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

将DNA导入芽孢杆菌细胞中可以通过以下方式实现：原生质体转化(参见例如，Chang and Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Youngand Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829,或Dubnau and Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见例如，Koehler and Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278)。将DNA导入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580))或电穿孔(参见例如，Dower et al.,1988,Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)。将DNA导入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong et al.,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier et al.,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。将DNA导入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi et al.,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo and Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可以通过天然感受态(参见例如，Perry and Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt and Jollick,1991,Microbios 68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley et al.,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或者接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436))实现将DNA导入链球菌细胞中。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA导入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文中使用的，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)、以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中定义的)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文中使用的，“酵母”包括产子嚢酵母(ascosporogenous yeas)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如Biology and Activities ofYeast(Skinner,Passmore,and Davenport,editors,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9,1980)中所述的进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)细胞，例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth et al.,1995,见上文所定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞菌属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)的细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌(Fusarium cerealis)、库威镰孢菌(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢菌(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢菌(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的过程以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023,Yeltonet al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474,和Christensen et al.,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢菌属物种的适合方法由Malardier etal.,1989,Gene 78:147-156,和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to YeastGenetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito et al.,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen etal.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，其包括：(a)在适合于变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收变体。因此，本发明涉及产生变体的方法，其包括(a)培养包含编码变体的多核苷酸的宿主细胞，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)；并且(b)回收变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料-分批发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序在合适的营养培养基中发生培养，所述营养培养基包含碳和氮源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则可以从培养基中直接回收变体。如果变体不被分泌，则可以从细胞裂解物中回收它。

可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来确定变体的活性。

可以使用本领域已知的方法回收变体。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦、以及尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如Protein Purification,Janson and Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。

在一个替代方面，不回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

本发明的组合物

本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。因此，本发明涉及包含变体的组合物，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

优选地，组合物富含此类变体。术语“富集”意指组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如以1.1的富集因子增加。

组合物可包含变体作为主要酶促组分，例如单组分组合物。或者，组合物可以包括多种酶促活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶(carbohydrase)、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶(alpha-glucosidase)、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶(phytase)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。另外的酶可以通过例如属于以下属的微生物产生：曲霉属，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢菌属，例如杆孢状镰孢菌(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾本科镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌或镶片镰孢菌；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈次木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。

可以通过加入含有一种或多种酶的单独的添加剂或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合添加剂)可以配制成例如颗粒，液体，浆体等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体或浆体。因此，本发明还涉及洗涤剂添加剂，其包含本发明的变体，任选地为无尘颗粒，稳定化的液体或受保护的酶的形式。因此，本发明涉及包含变体的洗涤剂添加剂，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)，任选地，其中洗涤剂添加剂是无尘颗粒，稳定化的液体或受保护的酶的形式。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的变体与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的洗涤剂组合物。因此，本发明涉及包含变体的洗涤剂组合物，所述变体具有α-淀粉酶活性且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

另外的组分的选择在技术人员的技术范围内，并且包括常规的成分，包括以下列出的示例性的非限制性组分。

对于纺织品护理，如洗衣，组分的选择可以包括考虑有待清洁的纺织品的类型、染污的类型和/或程度、进行清洁的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性通过通用标题对以下提及的组分进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如技术人员将理解的，组分可以包括另外的功能性。

因此，本申请还涉及组合物，其为清洁组合物。

根据本发明的组合物还可以包含洗涤剂组分，如表面活性剂，增洁剂，漂白系统，漂白活化剂，聚合物(polymers)和织物调色剂(fabric hueing agent)。

本发明的洗涤剂组合物可以例如针对包含本发明的酶与一种或多种另外的ADW组合物组分的组合的ADW(自动洗碗)组合物。另外的组分的选择在技术人员的技术范围内，并且包括常规成分，包括以下列出的示例性非限制性组分。因此，在一个方面，本发明涉及手动或自动洗碗洗涤剂组合物，其包含本发明的变体和任选地表面活性剂。

本发明的洗涤剂组合物可以例如配制为手动或机器洗衣洗涤剂组合物，其包括适合于预处理沾污的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或配制成用于一般家用硬表面清洁操作的用途的洗涤剂组合物，或配制用于手动或机器洗碗操作。因此，在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的变体的手动或自动洗衣洗涤剂组合物。

在一个具体的方面，本发明提供了包含本发明的α-淀粉酶多肽的洗涤剂浓缩物/添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它酶，如蛋白酶，脂肪酶，过氧化物酶，另一种淀粉分解酶，例如另一种α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，生麦淀粉酶，CGT酶和/或纤维素酶，甘露聚糖酶(例如，来自Novozymes，Denmark的MANNAWAY^TM)，果胶酶，果胶裂合酶(pectine lyase)，角质酶和/或漆酶。

通常，所选择的酶的性质应与所选择的洗涤剂相容(即，pH最佳，与其它酶和非酶促成分的相容性等)，并且酶应当以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。优选微生物起源。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)，特别是来源于芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如，猪或牛起源的)和WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。

有用的蛋白酶的例子是WO 92/19729，WO 98/20115，WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体：27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。优选的市售蛋白酶包括 (SEQ ID NO:3)，和(来自Novozymes A/S),MAXACAL,PURAFECT (Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(同物异名嗜热霉属)的脂肪酶，例如如EP 258 068和EP 305 216中所述的来自疏棉状腐质霉(疏棉状嗜热霉(T.lanuginosus))或如WO 96/13580中所述的来自特异腐质霉，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或拟产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌物种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131:253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。其它例子是脂肪酶变体，例如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407 225，EP 260 105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。

优选的市售脂肪酶包括LIPOLASE<^TM>和LIPOLASE ULTRA<^TM>(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌获得的α-淀粉酶，例如GB 1296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特殊菌株。有用的α-淀粉酶的例子是WO 94/02597，WO 94/18314，WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别是在以下一个或多个位置具有取代的变体：15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408,和444。市售的α-淀粉酶是DURAMYL<^TM>,LIQUEZYME^TM,TERMAMYL<^TM>,NATALASE<^TM>,Everest<^TM>,FUNGAMYL<^TM>和BAN<^TM>,Amplify<^TM>,Amplify Prime<^TM>,Stainzyme<^TM>,Stainzyme Plus<^TM>(Novozymes A/S),Preferenz S100,Preferenz S110,PreferenzS1000(SEQ ID NO:11),Excellenz S110,Excellenz S1000,Excellenz S2000,RAPIDASE<^TM>和PURASTAR<^TM>(来自Genencor International Inc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属，假单胞菌属，腐质霉属，镰孢菌属，梭孢壳属，顶孢霉属的纤维素酶，例如US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公开的特异腐质霉，嗜热毁丝霉和尖镰孢菌产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的例子是EP 0495257，EP 0531372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它例子是纤维素酶变体，如WO 94/07998，EP 0531315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些。

市售的纤维素酶包括和(Novozymes A/S)，和(Genencor International Inc.)和KAC-(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物，细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶，及其变体，如WO 93/24618，WO95/10602和WO 98/15257中描述的那些。市售的过氧化物酶包括(Novozymes A/S)。

卵磷脂酶(Lechinases)/β-葡聚糖酶：合适的卵磷脂酶包括细菌或真菌起源的那些。它们可以是化学修饰的或蛋白质工程化的。有用的β-葡聚糖酶的例子包括WO 2015/144824(Novozymes A/S)和WO 99/06516(Henkel KGAA)中描述的那些。

可以通过加入含有一种或多种酶的单独的添加剂或通过加入包含所有这些酶的组合添加剂将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合添加剂)可以配制成例如颗粒，液体，浆体等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆体。

无尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所公开的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包被。蜡质涂层材料的例子是平均摩尔重量1000至20000的聚(环氧乙烷)(poly(ethylene oxide))产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚(ethoxylated nonyl-phenol)；乙氧基化脂肪醇(ethoxylated fattyalcohol)，其中醇包含12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜涂层材料的例子在GB1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中公开的方法来制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如条(bar)，片剂(tablet)，粉末(powder)，颗粒(granule)，糊剂(paste)或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水性的。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包含在其中时，洗涤剂通常包含约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(alkylbenzenesulfonate)，α-烯烃磺酸盐(alpha-olefinsulfonate)，烷基硫酸盐(alkyl sulfate)(脂肪醇硫酸盐(fatty alcohol sulfate))，醇乙氧基硫酸盐(alcohol ethoxysulfate)，仲链烷磺酸盐(secondary alkanesulfonate)，α-磺基脂肪酸甲酯(alpha-sulfo fatty acid methyl ester)，烷基或烯基琥珀酸或皂(soap)。

当包含在其中时，洗涤剂通常包含约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物(alcohol ethoxylate)，壬基酚乙氧基化物(nonyl-phenol ethoxylate)，烷基多糖苷(alkylpolyglycoside)，烷基二甲基胺氧化物(alkyldimethylamine-oxide)，乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanol-amide)，脂肪酸单乙醇酰胺(fatty acid mono-ethanolamide)，多羟基烷基脂肪酸酰胺(polyhydroxy alkyl fattyacid amide)，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。

洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂增洁剂或络合剂如MGDA，GLDA，沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸盐(phosphonate)，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)，二乙烯三胺五乙酸(diethylenetri-aminepen-taacetic acid)，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(layered silicates)(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(poly(vinylpyridine-N-oxide))，聚(乙烯基咪唑)(poly(vinylimidazole))，聚羧酸盐(polycarboxylates)如磺化聚合物(sulfonated polymers)，聚丙烯酸酯(polyacrylates)，马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯(lauryl methacrylate)/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白系统，其可以包含H₂O₂源，如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂如漂白催化剂(例如基于Mn或基于Co的，四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸盐(nonanoyloxybenzenesulfonate))组合。或者，漂白系统可以包括过氧酸，例如酰胺，酰亚胺(imide)或砜型。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规的稳定剂来稳定化，例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且组合物可以如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，如例如织物调理剂(fabricconditioner)，包括粘土(clays)，泡沫增效剂(foam boosters)，抑泡剂(sudssuppressor)，防蚀剂(anti-corrosion agent)，污垢悬浮剂(soil-suspending agent)，抗污垢再沉积剂(anti-soil re-deposition agent)，染料，杀菌剂，荧光增白剂，助水溶剂(hydrotropes)，晦暗抑制剂(tarnish inhibitor)或香料(perfumes)。

助水溶剂是如下化合物，其在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而，助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如由Hodgdon and Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science 12:121-128综述的。助水溶剂并不显示临界浓度，高于所述临界浓度就会发生自聚集，如对表面活性剂以及脂质形成胶束、薄层或其他定义明确的中间相(meso-phase)找到的。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地，在从制药、个人护理、食品至技术应用的行业间使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中一样)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，如约5％至约50％的洗涤剂增洁剂或共增洁剂(co-builder)或其混合物。在洗碗洗涤剂中，增洁剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。增洁剂和/或共增洁剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的络合剂。可以利用本领域中已知的用于在洗衣/ADW/硬表面清洁洗涤剂中使用的任何增洁剂和/或共增洁剂。增洁剂的非限制性例子包括沸石(zeolites)、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐，如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠(sodiummetasilicate)、层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及(羧甲基)菊粉((carboxymethyl)inulin)(CMI)及其组合。

洗涤剂可以包含按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白系统。可以使用本领域中已知用于洗衣/ADW/硬表面清洁洗涤剂中的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―尿素(1:1)、预成型过酸(preformed peracid)及其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)及盐、二过氧二羧酸(diperoxydicarboxylic acid)、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸(peroxymonosulfuric acid)及盐(例如Oxone(R))及其混合物。漂白系统的非限制性例子包括基于过氧化物的漂白系统，其可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指与过氧化氢反应以经由过水解反应(perhydrolysis)形成过酸的化合物。如此形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的合适漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。合适的例子是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在所述家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(acetyl triethyl citrate，ATC)。ATC或短链甘油三酯(如三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为增洁剂起作用。或者，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(6-(phthalimido)peroxyhexanoic acid，PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施方案中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；

其中每个R¹独立地是包含从9到24个碳的支链烷基或包含从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R¹独立地是包含从9到18个碳的支链烷基或包含从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R¹独立地选自下组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化锌(sulfonated zinc)或酞菁铝(aluminium phthalocyanines)。

优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预成型的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共增洁剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或消泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物(polycarboxylate)，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)(poly(ethylene terephthalate))和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)(poly(oxyethene terephthalate))的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯(sulfonated polycarboxylates)、聚环氧乙烷(polyethylene oxide)和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐(diquaterniumethoxy sulfate)。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，如染料或色素，其当配制在洗涤剂组合物中时可以沉积在织物上，此时所述织物包括所述洗涤剂组合物的洗液接触，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少某种可见光。相比之下，织物调色剂改变表面的色彩，因为它们吸收可见光光谱的至少一部分。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物(conjugates)，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料：落入颜色直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物的索引(Colour Index)(C.I.)分类的染料，例如如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。合适的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

目前在洗涤剂组合物中考虑任何酶，特别是本发明的α-淀粉酶多肽，可以以对应于每升洗液0.01-100mg酶蛋白的量加入，优选每升洗液0.05-5mg的酶蛋白，特别是每升洗液0.1-1mg酶蛋白。

另外，本发明的α-淀粉酶多肽还可以掺入WO 2006/002643中公开的洗涤剂制剂中，其作为参考文献并入本文。

用途

本申请还涉及使用本发明的变体的方法。用途可以在洗涤剂中，具体是洗衣洗涤剂组合物和洗碗洗涤剂组合物中。因此，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体的用途，其中变体具有α-淀粉酶活性并且与SEQ ID NO:1具有至少89％序列同一性，其中变体在对应于SEQID NO:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；且X2可以选自A，R，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y和V，条件是当X1是R，则X2不是S，与含有基序FRSK的淀粉酶相比，所述变体具有改进的残留活性(RA)。

因此，本发明提供了本发明的亲本的变体或组合物在家用或工业清洁过程中的用途。具体地，本发明涉及根据本发明的变体在洗衣，洗碗，例如自动或手动洗碗，硬表面清洁，工业和机构清洁，纺织品退浆，淀粉改性，淀粉液化，糖化，饲料，烘烤或酿造中的用途。

在一个实施方案中，用途是织物的清洁，例如洗衣。

在另一个实施方案中，用途是陶瓷，塑料或玻璃材料的清洁，例如洗碗。

因此，本发明的α-淀粉酶多肽作为清洗、洗碗和硬表面清洁洗涤剂组合物中的组分(在家用或工业背景中)是适用的。

本发明的α-淀粉酶变体拥有允许多种其它工业应用的有价值的性质。例如，本发明的α-淀粉酶多肽可用于淀粉处理，尤其是淀粉转化，特别是淀粉的液化(参见例如US 3,912,590，EP专利申请号252 730和63 909，WO 99/19467，和WO 96/28567，所有参考文献通过引用并入本文)。还考虑了用于淀粉转化目的的组合物，除本发明的变体外，所述组合物还可以包含葡糖淀粉酶，支链淀粉酶(pullulanase)和其它α-淀粉酶。

此外，本发明的α-淀粉酶变体还特别有用于生产甜味剂和乙醇(参见例如美国专利号5,231,017，其通过引用并入本文)，例如来自淀粉或全谷物的燃料，饮用和工业乙醇。

本发明的α-淀粉酶变体还可用于纺织品，织物和衣物的脱浆(参见例如WO 95/21247，美国专利4,643,736，EP 119,920，其通过引用并入本文)，啤酒制造或酿造，纸浆和纸生产。

淀粉转化

例如在美国专利号3,912,590和EP专利公开号252,730和63,909(其通过引用并入本文)中描述了常规淀粉转化过程，如液化和糖化过程。

在一个实施方案中，将淀粉降解成较低分子量碳水化合物组分如糖或脂肪替代物(fat replacer)的淀粉转化过程包括脱支(debranching)步骤。

在将淀粉转化为糖的情况下，淀粉被解聚。此类解聚过程可以由预处理步骤和两个或三个连续的处理步骤(也就是液化过程，糖化过程，和依赖于期望的最终产物，任选地异构化过程)组成。

(i)天然(native)淀粉的预处理

天然淀粉由微观颗粒组成，所述微观颗粒在室温下不溶于水。当加热水性淀粉浆体时，颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在此“凝胶化(gelatinization)”过程中，粘度急剧增加。由于在典型的工业过程中固体水平为30-40％，必须使淀粉变薄或“液化”，以便其可以处理。现今这种粘度降低主要通过酶降解来获得。

(ii)液化

在液化步骤期间，α-淀粉酶将长链淀粉降解成支链和线性较短的单元(麦芽糖糊精(maltodextrins))。液化过程在105-110℃下进行5至10分钟，随后在95℃下进行1-2小时。pH位于5.5和6.2之间。为了确保在这些条件下的最佳酶稳定性，加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。在该处理之后，液化淀粉将具有10-15的“右旋糖当量”(dextrose equivalent，DE)。

(iii)糖化

在液化过程之后，通过加入葡糖淀粉酶(例如AMG)和脱支酶(debranchingenzyme)，如异淀粉酶(isoamylase)(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶(例如Promozyme^TM)(美国专利号4,560,651)，将麦芽糖糊精转化成右旋糖。在此步骤之前，将pH降低至低于4.5的值，保持高温(高于95℃)以使液化α-淀粉酶灭活以减少不能通过脱支酶适当水解的称为“潘糖前体”的短寡糖的形成。

将温度降至60℃，并且加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程进行24-72小时。

通常，当在液化步骤之后使α-淀粉酶变性时，约0.2-0.5％的糖化产物是不能被支链淀粉酶降解的支链三糖6<2>-α-葡糖基麦芽糖(潘糖)。如果在糖化期间存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即，不变性)，则该水平可高达1-2％，这是非常不希望的，因为它显著降低了糖化产率。

当使用淀粉酶时，糖化最佳地在约30℃至约75℃，例如45℃至75℃或47℃至74℃的温度范围进行。糖化可以在约pH 3至约pH 7，例如pH 3.0至pH 7.5，pH 3.5至pH 5.5，pH3.5，pH 3.8或pH 4.5的pH范围内进行。

(iv)异构化

当期望的最终糖产品是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以转化成果糖。在糖化过程之后，将pH增加到6-8范围内的值，优选pH 7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化的葡萄糖异构酶(例如Sweetzyme<^TM>IT)将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。

乙醇生产

一般而言，从全谷物的酒精生产(乙醇)可分为4个主要步骤

-研磨

-液化

-糖化

-发酵

(i)研磨

为了打开结构并允许进一步处理，研磨谷物。采用两种过程，湿法或干法研磨。在干法研磨中，研磨整个谷粒并用于过程的其余部分。湿法研磨给出胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白)的很好的分离，并且在平行生产糖浆的地方也有一些例外情况。

(ii)液化

在液化过程中，淀粉颗粒通过水解溶解成通常DP高于4的麦芽糖糊精。水解可以通过酸处理或通过α-淀粉酶酶促进行。在有限的基础上使用酸水解。原料可以是来自淀粉处理的侧流或研磨的全谷物。

酶促液化通常作为三步热浆体过程进行。将浆体加热至60-95℃，优选80-85℃，并加入酶。然后，将浆体在95-140℃，优选105-125℃之间进行喷射蒸煮，冷却至60-95℃，加入更多的酶以获得最终水解。液化过程在pH 4.5-6.5，通常在5至6之间的pH下进行。研磨和液化谷物也称为糊状物(mash)。

(iii)糖化

为了生产可被酵母代谢的低分子量糖DP1-3，必须进一步水解来自液化的麦芽糖糊精。通常通过葡糖淀粉酶酶促完成水解，或者可以使用α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶。完全的糖化步骤可持续长达72小时，然而，通常只进行典型地4小时的预糖化，然后完成发酵期间糖化(SSF)。糖化通常在30-65℃的温度，通常约60℃，和pH4.5下进行。

(iv)发酵

将通常来自酵母属种(Saccharomyces spp.)的酵母加入到糊状物中，发酵持续24-96小时，如通常35-60小时。温度在26-34℃之间，通常在约32℃，pH值为3-6，优选约pH4-5。

应注意最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)工程，其中没有糖化的保持阶段，意味着将酵母与酶一通添加。当进行SSF时，通常在发酵之前引入在50℃以上的温度的预糖化步骤。

(v)蒸馏

发酵后，蒸馏该糊状物以提取乙醇。

根据本发明的过程获得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用中性烈酒(potable neutral spirits)；或工业乙醇。

(vi)副产品

从发酵中留下的是谷物，其通常用于液体形式或干燥的动物饲料。

关于如何进行液化，糖化，发酵，蒸馏和乙醇回收的进一步细节是本领域技术人员所熟知的。

根据本发明的方法，糖化和发酵可以同时或分开进行。

纸浆和纸生产

本发明的碱性α-淀粉酶多肽也可用于木质纤维素材料的生产，如纸浆，纸和卡片(cardboard)，从淀粉强化的废纸和卡片，特别是在在pH高于7时发生再制浆的情况下以及在淀粉酶促进通过降解强化的淀粉来分解废料的情况下。本发明的α-淀粉酶特别可用于从淀粉包被的印刷纸生产造纸纸浆的方法。该方法可以如WO 95/14807中所述的那样进行，包括以下步骤：

a)分解纸以产生纸浆，

b)在步骤a)之前，期间或之后用淀粉降解酶处理，并且

c)在步骤a)和b)之后从纸浆中分离油墨颗粒。

本发明的α-淀粉酶在改性淀粉中也可以是非常有用的，其中将酶促改性的淀粉与碱性填料如碳酸钙，高岭土和粘土一起用于造纸。利用本发明的碱性α-淀粉酶，可以在填料的存在下改性淀粉，从而允许更简单的整合过程。

纺织品，织物和衣物的脱浆

本发明的α-淀粉酶还可以在纺织品，织物或衣服脱浆中非常有用。在纺织加工业中，α-淀粉酶传统上用作脱浆过程中的助剂(auxiliaries)，以促进去除含淀粉的尺寸，其在织造过程中充当纬纱上的保护涂层。在编织后完全去除胶料涂层(size coating)对于确保后续过程中的最佳结果是重要的，其中洗擦，漂白和染色织物。酶促淀粉分解是优选的，因为它不涉及对纤维材料的任何有害影响。为了降低加工成本并增加研磨通量，脱浆处理有时与洗擦和漂白步骤组合。在此类情况下，通常使用非酶助剂如碱或氧化剂来分解淀粉，因为传统的α-淀粉酶与高pH水平和漂白剂不是非常相容的。淀粉胶料(starch size)的非酶促分解确实导致某种纤维损伤，因为使用相当活泼的化学品(aggressive chemical)。因此，期望使用本发明的α-淀粉酶，因为它们在碱性溶液中具有改进的性能。当脱浆含纤维素的织物或纺织品时，可以单独或与纤维素酶组合使用α-淀粉酶。

脱浆和漂白过程是本领域公知的。例如，此类过程描述于WO 95/21247，美国专利4,643,736，EP 119,920中，在此通过引用并入。

市售的用于脱浆的产品包括来自Novozymes A/S的和ULTRA。

啤酒制造

本发明的α-淀粉酶在啤酒制造过程中也可以非常有用；通常在打浆过程(mashingprocess)中添加α-淀粉酶。

通过以下实施例进一步描述本发明，不应将实施例解释为限制本发明的范围。

本文描述和要求保护的发明不限于本文公开的具体方面的范围，因为这些方面旨在说明本发明的若干方面。任何等同的方面都在本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从上述描述中变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

实施例

实施例1：用于α-淀粉酶活性的测定法

1.Phadebas测定法

可以通过使用片剂作为底物的方法来测定α-淀粉酶活性。Phadebas片剂(Amylase Test，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并成片。

对于每次单一测量，将一个片剂悬浮于含有5ml 100mM的Britton-Robinson缓冲液(100mM乙酸，100mM磷酸，100mM硼酸，0.1mM CaCl2，用NaOH将pH调节至感兴趣的值)的管中。测试在感兴趣的温度下在水浴中进行。将待测试的α-淀粉酶稀释在x ml的100mMBritton-Robinson缓冲液中。将1ml该α-淀粉酶溶液加入到5ml 100mM的Britton-Robinson缓冲液中。淀粉被α-淀粉酶水解，产生可溶性蓝色片段。在620nm下用分光光度法测量的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。

重要的是，在孵育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm处的0.2-2.0吸光度单位的范围内。在该吸光度范围内，活性和吸光度之间存在线性(Lambert-Beer定律)。因此，必须调整酶的稀释度以适应这一标准。在指定的条件设置下(温度，pH，反应时间，缓冲条件)，1mg给定的α-淀粉酶会水解一定量的底物，并产生蓝色。在620nm处测量颜色强度。测量的吸光度与给定条件设置下讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg的纯α-淀粉酶蛋白)成正比。

2.PNP-G7测定法

可以通过使用PNP-G7底物的方法来确定α-淀粉酶活性。PNP-G7(其是对-硝基苯基-α,D-麦芽庚糖苷的缩写(p-nitrophenyl-alpha,D-maltoheptaoside))是可被内切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim制造(cat.No.1054635)。

为了制备试剂溶液，按照制造商的推荐，将10ml底物/缓冲溶液加入到50ml酶/缓冲溶液中。通过将20微升样品转移到96孔微量滴定板并在25℃下孵育来进行测定。加入预平衡至25℃的200μl试剂溶液。将溶液混合并预孵育1分钟，并且在4分钟的时间里每30秒在ELISA读数器中在OD 405nm处测量吸光度。

在给定的条件设置下，时间依赖性吸收曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的活性成正比。

实施例2：本发明的α-淀粉酶的残留活性

通过标准定点方法在α-淀粉酶TS23-截短(SEQ ID NO:1)中引入两个氨基酸缺失。在所得的α-淀粉酶变体中，在R180-S181-T182-G183区域中引入两个氨基酸缺失的不同组合，如下表1所示。位置编号根据SEQ ID NO:1。将修饰的淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中转化并表达。将枯草芽孢杆菌培养基离心，并且分离含有淀粉酶的上清液并在Britton-Robinson缓冲液pH 7.3中稀释至少50倍，然后与具有0.3％EDTA的90％A型洗涤剂(Model Adetergent)混合。然后，将样品分成两个样品；一个储存在4℃，另一个在40℃下孵育4小时。之后，样品在100mM Britton-Robinson缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸，pH 7.3+0.12mM CaCl 2+0.01％Brij，pH调节至pH7.3)中稀释10倍，并且如方法中所述使用Phadebas淀粉酶测定法测量淀粉酶活性。残留活性计算为已经在40℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。

表1：在具有EDTA的洗涤剂中孵育后的α-淀粉酶变体的残留活性(RA)

变体好	淀粉酶变体	所得的基序	RA	改善因子(IF)	半衰期
						A	SEQ ID NO:1+R180+S181	FTGK	11	1	1.26
B	SEQ ID NO:1+T182+G183	FRSK	22	2	1.83
						C	SEQ ID NO:1+S181+T182	FRGK	22	2	1.83
D	SEQ ID NO:1+R180+T182	FSGK	32	2.9	2.43
						E	SEQ ID NO:1+R180+G183	FSTK	36	3.3	2.71
F	SEQ ID NO:1+R180+T182G+G183	FSGK	37	2.5	2.77
						G	SEQ ID NO:1+R180+T182T+G183	FSTK	34	2.3	2.55
H	SEQ ID NO:1+S181+T182C+G183	FRCK	37	2.6	2.79
						I	SEQ ID NO:1+S181+T182Y+G183	FRYK	32	2.2	2.42
J	SEQ ID NO:1+R180+T182I+G183*	FSIK	31	2.1	2.34
						K	SEQ ID NO:1+R180+T182L+G183	FSLK	54	3.7	4.45
L	SEQ ID NO:1+S181+T182L+G183	FRLK	47	3.3	3.71
						M	SEQ ID NO:1+R180+T182Q+G183	FSQK	34	2.3	2.58
N	SEQ ID NO:1+R180+T182S+G183	FSSK	61	4.2	5.54

该实施例证明了，通过缺失两个氨基酸，可以产生在具有EDTA的洗涤剂存在下具有增加的稳定性的α-淀粉酶变体，并且通过在氨基酸基序中保留丝氨酸，苏氨酸和/或甘氨酸清楚地观察到最大的效果。

实施例3：残留活性(RA)的比较数据

类似于实施例2，通过标准定点方法将两个氨基酸缺失引入α-淀粉酶SP722(SEQID NO:5)中。在所得的α-淀粉酶变体中，在R181-G182-D183-G184区域中引入两个氨基酸缺失的不同组合，如下表2所示。位置编号根据SEQ ID NO:5。将修饰的淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中转化并表达。将枯草芽孢杆菌培养基离心，并且分离含有淀粉酶的上清液并在Britton-Robinson缓冲液pH 7.3中稀释至少50倍，然后将它们与具有0.3％EDTA的90％A型洗涤剂混合。然后，将样品分成两个样品；一个储存在4℃，另一个在45℃下孵育4小时。之后，样品在100mM Britton-Robinson缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸，pH 7.3+0.12mM CaCl 2+0.01％Brij，pH调节至pH7.3)中稀释10倍，并且如方法中所述使用Phadebas淀粉酶测定法测量淀粉酶活性。残留活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。

表2：在具有EDTA的洗涤剂中孵育后的本领域中已知的α-淀粉酶变体的残留活性(RA)

实施例4：关于残留活性(RA)的比较数据

与实施例2和3类似，通过标准的定点方法在α-淀粉酶SP722(SEQ ID NO:5)中引入两个氨基酸缺失。与前两个实施例相比在略长的孵育后测定残留活性(RA)(将目前的变体孵育18小时而非4小时)。在所得的α-淀粉酶变体中，在R181-G182-D183-G184区中引入两个氨基酸取代的不同组合，如下文3中指示。位置编号根据SEQ ID NO:5。将修饰的淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中转化并表达。将枯草芽孢杆菌培养基离心，并且分离含有淀粉酶的上清液并在Britton-Robinson缓冲液pH 7.3中稀释至少50倍，然后将它们与具有0.3％EDTA的90％A型洗涤剂混合。然后，将样品分成两个样品；一个储存在4℃，另一个在45℃下孵育18小时。之后，样品在100mM Britton-Robinson缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸，pH7.3+0.12mM CaCl 2+0.01％Brij，pH调节至pH7.3)中稀释10倍，并且如方法中所述使用Phadebas淀粉酶测定法测量淀粉酶活性。残留活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。

表3：在具有EDTA的洗涤剂中孵育后的本领域中已知的α-淀粉酶变体的残留活性(RA)

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 稳定化的α-淀粉酶变体及其用途

<130> 14038-CN-NP

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌种

<400> 1

Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala

20 25 30

Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr

35 40 45

Lys Gly Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly

85 90 95

Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala Asp

100 105 110

Gly Thr Glu Phe Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn

115 120 125

Gln Glu Thr Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp

130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr

145 150 155 160

His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile

165 170 175

Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr

180 185 190

Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Leu Asp Met Asp

195 200 205

His Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Val

210 215 220

Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile

225 230 235 240

Lys Tyr Thr Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr

245 250 255

Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn

260 265 270

Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe

275 280 285

Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly

290 295 300

Tyr Phe Asp Met Arg Tyr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln

305 310 315 320

Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly

325 330 335

Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr

340 345 350

Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly

355 360 365

Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Gly Leu Lys Ser Lys

370 375 380

Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln

385 390 395 400

Arg Asp Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly

405 410 415

Ile Asp Thr Lys Pro Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly

420 425 430

Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys

435 440 445

Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn

450 455 460

Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile

465 470 475 480

Trp Val Ala Lys

<210> 2

<211> 482

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌种

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (180)..(180)

<223> 其中X是R或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (181)..(181)

<223> 其中X是A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, R,

W, Y, 或V, 但当X1是R时X2不是S

<400> 2

Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala

20 25 30

Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr

35 40 45

Lys Gly Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly

85 90 95

Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala Asp

100 105 110

Gly Thr Glu Phe Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn

115 120 125

Gln Glu Thr Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp

130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr

145 150 155 160

His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile

165 170 175

Tyr Lys Phe Xaa Xaa Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Asn

180 185 190

Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro

195 200 205

Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Val Asn Thr

210 215 220

Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr

225 230 235 240

Thr Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr Gly Lys

245 250 255

Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn Lys Leu

260 265 270

His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe Asp Ala

275 280 285

Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly Tyr Phe

290 295 300

Asp Met Arg Tyr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Ser

305 310 315 320

Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser

325 330 335

Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe

340 345 350

Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr

355 360 365

Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Gly Leu Lys Ser Lys Ile Asp

370 375 380

Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Asp

385 390 395 400

Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ile Asp

405 410 415

Thr Lys Pro Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly

420 425 430

Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys Val Phe

435 440 445

Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp

450 455 460

Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp Val

465 470 475 480

Ala Lys

<210> 3

<211> 583

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌种

<400> 3

Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala

20 25 30

Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr

35 40 45

Lys Gly Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly

85 90 95

Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala Asp

100 105 110

Gly Thr Glu Phe Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn

115 120 125

Gln Glu Thr Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp

130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr

145 150 155 160

His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile

165 170 175

Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr

180 185 190

Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Leu Asp Met Asp

195 200 205

His Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Val

210 215 220

Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile

225 230 235 240

Lys Tyr Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr

245 250 255

Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn

260 265 270

Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe

275 280 285

Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly

290 295 300

Tyr Phe Asp Met Arg Tyr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln

305 310 315 320

Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly

325 330 335

Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr

340 345 350

Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly

355 360 365

Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Gly Leu Lys Ser Lys

370 375 380

Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln

385 390 395 400

Arg Asp Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly

405 410 415

Ile Asp Thr Lys Pro Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly

420 425 430

Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys

435 440 445

Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn

450 455 460

Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile

465 470 475 480

Trp Val Ala Lys Thr Ser Asn Val Thr Phe Thr Val Asn Asn Ala Thr

485 490 495

Thr Thr Ser Gly Gln Asn Val Tyr Val Val Ala Asn Ile Pro Glu Leu

500 505 510

Gly Asn Trp Asn Thr Ala Asn Ala Ile Lys Met Asn Pro Ser Ser Tyr

515 520 525

Pro Thr Trp Lys Ala Thr Ile Ala Leu Pro Gln Gly Lys Ala Ile Glu

530 535 540

Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Gln Ala Gly Asn Val Ile Trp Glu Ser

545 550 555 560

Thr Ser Asn Arg Thr Tyr Thr Val Pro Phe Ser Ser Thr Gly Ser Tyr

565 570 575

Thr Ala Ser Trp Asn Val Pro

580

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> 其中X是R或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 其中X是A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, R,

W, Y, 或V, 但当X1是R时X2不是S

<400> 4

Phe Xaa Xaa Lys

1

<210> 5

<211> 485

<212> PRT

<213> Bacillus halmapalus

<400> 5

His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser

20 25 30

Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp

35 40 45

Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly

85 90 95

Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp

100 105 110

Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn

115 120 125

Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp

130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr

145 150 155 160

His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg

165 170 175

Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp

180 185 190

Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met

195 200 205

Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr

210 215 220

Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His

225 230 235 240

Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala

245 250 255

Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu

260 265 270

Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val

275 280 285

Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly

290 295 300

Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys

305 310 315 320

His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro

325 330 335

Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala

340 345 350

Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr

355 360 365

Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala

370 375 380

Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr

385 390 395 400

Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu

405 410 415

Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp

420 425 430

Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly

435 440 445

Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile

450 455 460

Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser

465 470 475 480

Ile Trp Val Lys Arg

485

Claims

1.亲本α-淀粉酶的变体，所述变体具有α-淀粉酶活性并且与SEQ ID NO:1具有至少89％的序列同一性，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸180至183的位置处包含氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；并且X2可以选自A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V，条件是当X1是R时，则X2不是S，并且其中所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(RA)。

2.根据权利要求1的变体，其中X2是S，G或T。

3.根据权利要求1或2中任一项的变体，其中当X1是R时，X2是G或T。

4.根据权利要求1或2中任一项的变体，其中当X1是S时，X2是S、G或T。

5.根据权利要求1的变体，其中当X1是R时，X2是T。

6.根据权利要求1至3中任一项的变体，其中X1是R，且X2是G。

7.根据权利要求1、2或4中任一项的变体，其中X1是S，且X2是T。

8.根据权利要求1、2或4中任一项的变体，其中X1是S，且X2是G。

9.根据前述权利要求中任一项的变体，其中所述变体包含进一步的修饰，如取代，插入和/或缺失。

10.根据前述权利要求中任一项的变体，其中所述变体在对应于Y242和F266的位置的至少一处进一步包含取代，其中根据SEQ ID NO:2编号。

11.根据权利要求10的变体，其中位置Y242中的所述取代是Y242F，且位置F266中的所述取代是F266Y。

12.根据前述权利要求中任一项的变体，其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列具有至少89％，如至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性。

13.根据前述权利要求中任一项的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列组成。

14.根据前述权利要求中任一项的变体，其与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少89％，如至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但是小于100％的序列同一性。

15.根据前述权利要求中任一项的变体，其中修饰的数目为1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。

16.根据前述权利要求中任一项的变体，其具有相对于所述亲本α-淀粉酶的改进的稳定性，如储存稳定性，热稳定性，洗涤剂中的稳定性，和螯合剂稳定性。

17.根据权利要求14的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1，2或3的氨基酸序列组成。

18.根据权利要求16和17中任一项的变体，其中通过Phadebas测定法确定所述改进的稳定性。

19.组合物，其包含根据前述权利要求中任一项的变体。

20.根据权利要求19的组合物，其为清洁组合物。

21.根据权利要求19和20中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含洗涤剂组分，如表面活性剂，增洁剂(builder)，漂白系统，漂白活化剂，聚合物，和织物染色剂(fabrichueing agent)。

22.根据权利要求19至21中任一项的组合物，其中所述组合物配制为液体，固体，皂条，膜，单位剂量，或小袋洗涤剂组合物。

23.根据权利要求19至22中任一项的组合物，其进一步包含至少一种另外的酶，如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、葡聚糖酶、另一种淀粉水解酶和/或纤维素酶。

24.洗涤剂添加剂，其包含根据权利要求1至18中任一项的变体，任选地，以无尘颗粒，稳定化的液体，或受保护的酶的形式。

25.根据权利要求24的洗涤剂添加剂，其包含每克所述添加剂0.02-200mg酶蛋白质。

26.根据权利要求24和25中任一项的洗涤剂添加剂，其另外包含另一种酶，如蛋白酶，脂肪酶，过氧化物酶，葡聚糖酶，另一种淀粉水解酶和/或纤维素酶。

27.手动或自动洗碗洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项的变体，和任选地表面活性剂。

28.根据权利要求27的手动或自动洗碗洗涤剂组合物，其另外包含另一种酶，如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、葡聚糖酶、另一种淀粉水解酶和/或纤维素酶。

29.手动或自动洗衣洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项的变体。

30.根据权利要求29的手动或自动洗衣洗涤剂组合物，其另外包含另一种酶，如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、葡聚糖酶、另一种淀粉水解酶和/或纤维素酶。

31.根据权利要求1至18中任一项的变体的用途。

32.根据权利要求1至18中任一项的变体在洗衣，洗碗，如自动或手动洗碗，硬表面清洁，工业和机构清洁，纺织品退浆，淀粉改性，淀粉液化，糖化，饲料(feed)，烘焙或酿造中的用途。

33.多核苷酸，其编码根据权利要求1至18中任一项的变体。

34.核酸构建体，其包含根据权利要求33所述的多核苷酸。

35.表达载体，其包含根据权利要求33所述的多核苷酸。

36.宿主细胞，其包含根据权利要求33所述的多核苷酸。

37.产生根据权利要求1至18中任一项的α-淀粉酶变体的方法，其包括：

a.在适合于表达所述变体的条件下培养根据权利要求35的宿主细胞；并且

b.回收所述变体。

38.用于获得α-淀粉酶变体的方法，其包括向亲本α-淀粉酶中引入选自对应于SEQ IDNO:1的氨基酸序列的R180,S181,T182和G183的位置的两个氨基酸的缺失，提供氨基酸基序FX1X2K(SEQ ID NO:4)；其中X1是R或S；并且X2可以选自A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V，条件是当X1是R时，则X2不是S，所述变体与包含基序FRSK的淀粉酶相比具有改进的残留活性(RA)，且其中所述变体具有α-淀粉酶；并且回收所述变体。