PT97110B - Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes - Google Patents

Description

DESCRIg^Q

Campo da I_n ven ção

A presente invenção pertence ao campo da produção de enzimas de interesse nas sementes de plantas transgénicas e à utilização das sementes assim produzidas em - processas industriais, sem necessidade ds extracção e/ou de isolamento das enzimas»

F.P.

X

Enquadramento Geral da Invenção

Cer t as i n d úst r i as uti1izam actualmente enzimas nos seus processos. Essas indústrias incluem «as indústrias de detergentes, têxteis, lacticínios, alimentares e de bebidas, alimentos para animais e outras indústrias»

Presentemente, as enzimas são produzidas à escala industrial por processas de fermentação ou são isoladas de fontes vegetais ou animais» As enzimas produzidas pela acção de micróbios incluem proteases, amilases, celulases, pectinases, fitases e outras» A produção é muito eficiente e pode atingir-se níveis de produção maiores do que 10 gramas por· litro de meio de cultura» □ á foi proposta a possibilidade de utilização de plantas transgénicas como sistema de produção de proteínas valiosas» Exemplos até ao presente são a produção de interferão em tabaco (Goodman ε col», 1937), enceíalinas em tabaco, Brassica napus e Arabi dopsi s thali ana (Vandekerckhove e col», 1989), anticorpos em tabaco (Hiatt e col», 1990) e albumina de soro humano em tabaco e em batata (Sijmons e col», 1990)»

Na prática, a transfarmação de um número crescente de espécies vegetais, especíalmente de espécies dicotiledóneas (por exemplo, tabaco, batata, tomate, Petúnia, Brassica), tornou-se um procedimento de rotina para os peritos no assunto (Klee e col», 1987§ Gasser S-i Fraley, 1989)» Estabeleceram-se estratégias para a expressão de genes estranhos em plantas (Gasser & Fraley, 1989)» Identificaram-se sequências de regulação de genes de plantas que se utilizam para a construção de genes quiméricos que podem ser funcionalmente expressos em plantas s em células vegetais»

Para a introdução de construções de genes em plantas, dispõe-se de diversas tecnologias, tais como transformação com Agrobacterium tumefaciens ou Agrabacterium rhizogenes» Empregando esta estratégia, explorou-se uma larga . variedade de tecidas vegetais, sendo a escolha principalmente ser·

dependente da espécie da planta e da sua possibilidade de levada até á cultura do tecido» Exemplos que obtiveram êxito são a transfarmação de protoplastas, microsporos ou pólen e explantes, tais como folhas, caules, raízes, hipocótilos e c ót i1 os. Além disso, ut i 1 i z am se m étod os p ar a i n tro d Lição directa de ADN em protoplastas ε células ou tecidos vegetais, tais como micro-injecção, electroporação, bombardeamento com partículas e absorção directa de ADN (Sasser & Fraley, 1989).

Podem p r aduz i r-se ρ r ot e ί n as em sementes de plantas utilizando uma variedade de sistemas de expressão»

Por exemplo.

a utilização de um promotor constitutiva corno o promotor 35S da Vírus de Mosaico da Couve-flor (CaMV) (Suilley e col

1982) tem como resultada a acumulação da proteína expressa na semente, entre outr-<

dê ρ1ant as t r an sg é n i c as„

Como variante, podem utilizar-se promotores de genes que codificam proteínas de armazenagem nas sementes» As proteínas de armazenagem nas sementes são expressas de maneira altamente específica do tecido e específico do estágio de desenvolvimento (Higgins, 1984? Shotwell §< Larkins, 1989), isto ê, os genes são expressos apenas na semente e apenas durante o estágio de desenvolvimento da semente»

Uma proteína de armazenagem nas sementes (revista em Higgins, 1984 5 Shotwell & Larkins, 1989) é definida como qualquer proteína que se acumula em quantidades significativas (até 90% da proteína total da semente) na semente em desenvolvimento e que, por germinação, se hidrolisa para proporcionar u.ma fonte nutritiva para os estágios precoces de desenvolvimento da plantícula» As proteínas estão contidas num compartimento intracelular chamada corpo de proteína ou vacúolo de armazenagem« Este corpo de proteína contém inibidores de protease e cria um ambiente isento de protease» as proteínas de armazenagem são dias depois da germinação (Larkins,

As proteases que degradam actividades três a seis 1981)„

Muitos genes de proteína de armazenagem em sementes foram isolados e caracterizados.

assi m como as suas regiões de -?lsnqueamento 5' e 3' (revisto por Casey & Domoney, 1987)« São exemplos para as globulinas e albuminas os genes de glicinina e de conglicinina de soja (Fischer e Goldberg, 1982? Harada & col., 1989), os genes de legumina e de vicilina de ervilha (Lycett e col», 1984? Higgins e col., 1988), o gene de -feijão do campo LLS ÍBaumlein e col,, 1986), o gene da faseolina 78 de phaseolus (Doyle e col., 1986), os genes de cruciferina e de napina de Brassica (Ryan e col „ , 1989? Scofield e Crough, 1987? Radke e col,, 1988), o gene de heliantina de girassol (Vonder Haar e col,, 1988? Jordano e col., 1989) e os genes de albumina 28 e de crucif erina de Arabi dopsis thal i ana (Vandekerckhove e col», 1989? pang e col,, 1988). Podem encontrar-se outros exemplos nos genes que codificam prolaminas e glutelinas (Casey e Domoney, 1987). Seralmente, as proteínas de armazenagem são codificadas por famílias de multigenes.

Ds genes de proteínas de armazenagem na semente foram transferidos para tabaco, petúnia e semente de colza (Dkamura e col,, 1986? Beachy e col., 1984? Sengupta-Gopalan e col., 985? Higgins e col., 1988? Eli is e col,, 1988? Baker e col», 1988? Vandekerckhove e col., 1989? Altenbach e col., 1989), Utilizou-se a região de regulação 5' de montante da beta-faseolina da ervilha para dirigir a expressão de beta-glucurodinase (Bustos e col., 1989), fito-hemaglutinins (Voelker e col,, 1989), luciferase (Riggs e col,, 1989) e zeína (Hoffman e col,, 1987) em tabaco. Utilizou-se o promotor do gene de albumina 2S de Arabi dopeis thali ana para dirigir a expressão de uma albumina 28 modificada da mesma espécie em tabaco, Brassica napus e Arabidopsis thaliana (Vandekerckhove e col., 1989). Ds genes acima mencionada foram expressos de uma maneira específica do tecida e regulada segundo o desenvolvimento, isto é, na semente, durante o desenvolvimento da semente. Os níveis de expressão em todos estes relatórios variaram, mas atingiram níveis tão elevados como 1,7% da proteína total da semente (Voelker e col», 1989). Descobriu-se que o cADN pode substituir o ADN genómico que contém intrões como base para se obter um mARN funcional e estável na

expressão heteróloga (Chee e col., 1986). Estes resultados demonstram que qualquer técnico perito no assunto da biologia molecular vegetal pode conceber estratégias para expressão especifica ds semente de um dado gene numa espécie vegetal pretendida que seja conseguida por tecnologia de transfarmação.

Durante o desenvolvimento das sementes das plantas dicoti1edóneas, grande parte da síntese da proteína, total é dirigida para o vacúolo ou para os corpos de proteínas de células de parênquima de armazenagem. Para regular este processo, as proteínas são geralmente sintetizadas como precursores» As proteínas precursoras estão equipadas com pêptidos de sinal hidrofófaico, geralmente na extremidade N, que são cortados em estágios específicos» Descreveu-se grande número de pêptidos de sinal de armazenagem de proteína (Doyle e col», 1986? pang e col», 1988? Vonder Haar e col», 1988? Iturriaga e col», 1939? Darei e col», 19S9? Voelker e cal», 1989? Hattori e col», 1985? Lycett e col», 1983? Smith e Raikher, 1939)» ft aplicabilidade geral dos pêptidos de sinal· em sistemas de expressões heterólogas (por exemplo, Sijmons e col», 1990? Vitale e Bollini 1986? Slightom e col», 1986? Della-Cioppa e col», 1987) parece suportar a ideia de que se pode utilizar uma fusão de um péptido de sinal com uma proteína passageira heteróloga para transportar e processar a proteína passageira» As referências sugerem que grande variedade de proteínas passageiras potenciais é candidata a esse sistema de expressão»

IMo entanto, a despeito da atracção e da viabilidade do uso das plantas como bio-reactores, o sistema, até ao presente, não é isento de dificuldades» Rara os exemplos acima descritos, a planta é usada como bio-reactor e a proteína de interesse é em seguida isolada do material transgénico da planta, isto é, os tecidos que contém os níveis mais altos da proteína de interesse» 0 isolamento da proteína de interesse das sementes em que é produz ida inerentemente introduz complicações, assim como custos adicionais (Krebbers e

Vandekerckhove, 1990)

Uma solução possível para resolver este problema pode ser evitar a necessidade de extrair a proteína expressa do material vegetal» A Patente de Invenção da Alemanha Oriental DD 275 704 descreve um construta para a expressão de uma beta-glucanase estável ao calor em sementes não -germinadas de plantas de cevada transformadas e a utilização das sementes nos processos de fabricação de cerveja» No entanto, um problema persistente na manipulação de culturas de cereais de pequenos grãos tem sido não só a transformação dos protoplastas das plantas transfarmadas que não são permitidas na memória descritiva da patente» Assim, não seria possível obter sementes contendo enzimas utilizando o processo que se descreve nessa publicação»

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se sementes que contém, pelo menos, uma enzima de interesse, que podem ser utilizadas em vários processos industriais ou na fabricação de alimentas e de produtos alimentares como catalisadores de reacções digestivas, sem necessidade de primeiro extrair e/ou de isolar as referidas ens i mas»

Proporcionam-se construtos de ADN para a transformação de plantas que, por sua vez, são capazes de expressar urna grande variedade de enzimas de interesse nas sementes» Os construtos empregam sequências de sinal sequência de ADN que codifica a. » Esses construtos estão sob o ão capaz de dirigir a expressão operavelmente ligadas a uma enzima que se pretende expressar controlo da sequência de regulaç das enzimas pretendidas nas sementes»

A presente invenção também proporciona a utilização das sementes de plantas transgénicas com uma forma de armazenagem estável e manipulável de enzimas» As enzimas são mantidas em ambiente seco que tem uma pequena actividade de protease e assim, ficam protegidas contra a

z.

u.»

degradação

Além disso, a utilização de sementes para a armazenagem de enzimas proporciona um veículo estável que é -facilmente embalado e transportado e -facilmente manipulada durante a utilização real.

A presente invençSo proporciona ainda uma solução viável para o processo dispendioso e problemático da extracção de enzimas de interesse de sementes em que elas são produzidas. As enzimas mantêm-se estáveis dentro da semente e, portanto, podem ser uti1izadas, como substituição das enzimas puras. Este benefício, acoplado com o baixa custo do desenvolvimento de plantas que produzem sementes, proporciona uma -fonte económica dessas enzimas. Assim, a presente invenção permite a redução dos custos associados com a produção, armazenagem e utilização de uma larga variedade de enzimas.

Desc r i ç gp d as Fig ur as i-igura 1 ·- Estratégia para a clonação de cADN de fitase.

Figura 2 - Vector binário pM0G23.

Figura 3 - Sequência genômica do gene da proteína de armazenagem em sementes de cruciferina de Brassica n-apus.

Figura 4 -· Duplexes de oligonucleótidos sintéticos usados em > várias construções.

Figura 5 - Plasmídio pM0G429. Vector binário pM0G23 contendo a

parte de cADN
	madura a	jusante
	péptido	de sinal
Figura ò	Efei tos	da adiç
	fitase	sobre a
	partir de fitato.
Figura 7 -	Sequênci	a genómi
	Bac i11us	lechenif

vector pPR0M54 de fitase que codifica a enzima da sequência de ADN que codifica o da cruci -f erina.

ão de sementes moídas contendo libertação de fósforo inorgânico a ca do gene de alfa-ami1 ase de ormi s tal como está presente no

Figura 8 - Plasmídio pM0S29. Plasmídio pUC'j.8 que contém uma cassete cie expressão para expressão constitutiva em plantas e uma sequência que codifica um péptido de sinal de tabaco, z

Figura 9 - Plasmídio pM0G227» Vector binário que contém a parte do gene de alfa-amilase que codifica a enzima madura a jusante de uma sequência de tabaco que codifica um péptido de sinal numa cassete de expressão para expressão constitutiva»

Figura 10 - Relação dose-resposta de fitase de Aspergi! 1 us num modelo de digestão in vitro.

Figura 11 - Relação dose-resposta de fitase de Aspergi 11us e de fitase contida em sementes de tabaco num modelo de digestão in vitro»

Figura 12 - Comparação dos modelos de ol igossacáridos obtidos por hidrólise de amido de batata, usando A) sementes de tabaco transformadas com o gene que codifica alfa-amilase de Bac i 13. us 1 i chen i for mi s; B) alfa-amilase de Bacillus 1 ichenif ormiSjj e C) alfaami1 ase de Bacillus amy1 o1i quef ac i ens»

Figura 13 - Comparação de modelos de oligossacáridos obtidos a partir de hidrólise de amido de milho usando A) sementes de tabaco transformadas com o gene que codifica alfa-amilase Bacillus 1ichenifarmis; B) alfa-amilase de Baci11us 1icheniformis; e C) alfa-amilase de Bac i11us amy1oli quef ac i ens.

Descrição Pormenorizada de Formas de Realização Preferidas

As enzimas de interesse que podem ser produzidas pelo processo de acordo com a presente invenção incluem quaisquer enzimas que sejam capazes de utilização num processo industrial»

As enzimas de interesse incluem enzimas que são heteróIogas para a planta Cisto é, não são naturais na espécie vegetal) em que são produzidas» Também (isto έ,

estão incluídas as enzimas, homólogas das plantas naturais nas espécies vegetais) em gue são produzidas, caso sejam sobre-expressas por intermédio de técnicas de ADN recombinante»

Estas enzimas são escolhidas de tais como proteases, lipases, j pululanases e quitinases? liases, tal como pectinila.se?, e isomerases, tal como glucose-isomerase»

As enzimas preferidas são fitase, a1f a-ami1 ase, celobi o-hi d r o1ase, en d ogluc an ase, end ox i1anase» hidrolases, celulases, hemi celulases ^:osf atases, endogalactanase, pectinases, amilases, lisózimas, al fa-gal actosi dase, arahi nanase,

-proteases, quimosina, papaína, lipases gástricas, -1i ase e g1ucose-i somerase.

No que respeita aos ser 3. na— pecti naproces-aos industriais, pretende-se processos em que as enzimas extraídas e/ou isolada* são normal mente incluídas numa mistura

reaccional, quer in vivo quer in vitro, contendo pelo menos um substrato, em que as enzimas são capazes ds catalisar essa reacção do substrato, ou substratos ds maneira a produzir os efeitos ou produtos pretendidos»

Exemplos desses processos industriais incluem - mas não se limitam a - processos in vitro, tais como a utilização de fitasss no processamento de soja ou em processos industriais tais como moagem em húmido ou para a produção de inositol ou fosfatos de inositol a partir de fitato» As hemicelulases e celulases podem também ser utilizadas como enzimas de degradação da parede das células, em geral» Igual mente, as alfa-ami1 ases podem ser utilizadas na indústria de panificação para melhorar a consistência dos produtos de panificação? a alfa-ami1 ase, a amiloglucosidase, as xilanases e/ou a glucose-isomerase podem ser utilizadas na liquefação de amido? as ligninases e/ou as xilanases podem ser utilizadas na indústria de papel? as glucanasss, pectinases e/ou as celulases podem ser utilizadas na indústria alimentar e de bebidas, em processos de fermentação ou de fabricação de cerveja, por exemplo»

3»

« psrtθ a acção acirna mencionada das enzimas nos processos in vitro, as enzimas armazenadas em sementes podem ser utilizadas para catalisar reacções digestivas in viva, Desta maneira, as enzimas facilitam a libertação de nutrientes de géneros alimentares, que, de outra forma, não seriam -facilmente disponíveis para o animal que os i ngere»

As enzimas a utilizar nestes processos in vivo incluem — mas não se limitam a — -fitases, celulases, hemicelulases, pectinases e amilases. As enzimas provocam também uma melhor digestão dos produtos alimentares» As enzimas como auxiliares digestivos podem também ser utilizadas em seres humanos, por exemplo, em pacientes que sofrem de fibrose cística ou outras causas de insuficiência pancreática. As lipases, proteases e celulases contidas nas sementes podem ser utilizadas como agentes aditivos terapêuticos para aliviar problemas digestivos associados a essas doenças»

De acordo com a presente invenção, a enzima pretendida é produzida nas sementes de plantas transgénicas» As sementes assim produzidas são, por sua vez, utilizadas num processo industrial que necessita da enzima nelas contida, sem necessidade de extraí-la e/ou de isolá-la p r i me i r amen t e» é facilmente compreendida pelos peritos no assunto que as sementes que contém enzimas par, utilização industrial podem ser processos ou podem primeiramente directamente usadas nestes ser preparadas para essa utilização por moagem até à consistência pretendida,

Em qualquer dos casos as sementes inteiras ou moídas podem ser alimentadas tal como se encontram ao processo pretendido sem necessidade de posterior extraeção e/ou de isolamento da enzima e também sem perda de actividade das enzima»

As plantas transgénicas, tal como se definem no contexto da presente invenção, incluem plantas ou a sua progénie que foram geneticamente modificadas de modo a provocar ou a melhorar a produção de pelo menos uma enzima de

interesse nas suas sementes» A produção das enzimas de interesse é assim aumentada em relação ao nivel que se encontra na variedade da planta do tipo natural»

No contexto da presente invenção, a expressão sementes contendo uma quantidade reforçada de enzimas refere-se especificamente a um número estatisticamente significativo de sementes que, em média, contém uma quantidade estatisticamente significativa maior de uma enzima em

comparação com a quantidade média de enzimas num número igual de sementes não modificadas»

Os gêneros de plantas capazes de produzir enzimas de interesse nas suas sementes através da. prática da presente invenção incluem - mas não se limitam a Nicotiana (por exemplo, tabacum), Brassica (por exemplo, napus e o3,eracea) , Arabídopsis, 01 ycine (por exemplo, max 3 , Zea (por exemplo, roays), Amaranthus, Hordeum (por exemplo, vulgarum3 e Pisum (por exemplo, sativum), Juglans (por exemplo, regia), Arachi s (por exemplo, hypogeae), Medicago (por exemplo, sativa), Phaseolus (por exemplo, vulgaris)» Pi sum (por exemplo, sativum), Triticum (por exemplo, aestivum), Panicum L», Helianthus (por exemplo, annus), Avena (por exemplo, sativa) e

Qryza (por exemplo, sativa)

Pref eri velmente, esp ê c i e esc olhi d a

deve ter uma grande produção de sementes por planta e por ano e as propriedades químicas e físicas da semente devem ser compatíveis com o processo industrial para o qual a enzima é produzida» Por exemplo, em alguns casos, quando estas sementes (depois da transformação da planta parente) devem ser incluídas em substãnci as ali mentici as, pode escolher-se uma espécie vegetal que produza sementes com pequenos níveis de taninos ou de outros factores antinutricionais» Em outros casos, a capacidade das sementes transgénicas para poderem ser moídas até è consistência pretendida pode ser o critério de escolha quando as sementes são utilizadas como aditivos, por exemplo, em farinhas» Ainda de acordo com uma outra forma de realização, as sementes que contém as enzimas de interesse podem ser aplicadas directamente ao processo pretendido (por exemplo, em li substâncias alimentares), per se, opcional mente precedidas pelo descasque e/ou secagem depois da colheita.

A escolha da espécie vegetal mais apropriada pode basea·—se em experiências de reconstituição. A enzima de interesse pode ser adicionada conjuntamente com sementes de tipo natural ao processo industrial para o qual as sementes transgénicas são eventualmente produzidas.

A modificação genética das plantas que produzem sementes acima descritas tem como objectivo introduzir um construto de expressão contendo um gene que codifica uma enzima de interesse na planta pretendida. Este construto de expressão pode incluir um gene, heterólogo em relação à planta, que fica sob o controlo do promotor e das regiões de interrupção capazes de regular a expressão do gene que codifica a enzima de interesse nas sementes da planta. Também se pretende incluir um gene, homólogo para a planta que se encontra sob o controlo de uma região de regulação capaz de efectuar a sotareprodução da enzima de interesse. Por “sobreprodução, entende-se a produção da enzima de interesse a níveis acima dos quais se encontra na variedade da planta de tipo natural.

Dispõe-se de diversas técnicas para a introdução do construto de expressão contendo uma sequência de ADN que codifica uma enzima de interesse em plantas que se pretende modificar. Essas técnicas incluem - mas não se limitam - a transformação de protoplastas usando o método do cálcio/polietilenoglicol, electroporação e mi cro-j. n jecção ou bombardeamento de partículas (revestidas) CPotrykus, 1990).

Em adição aos assim chamados métodos d:i. rectos de transf ormação de ADN, os sistemas de transf ormação que envolvem vectores estão largamente disponíveis, tais como vectores de virus (por exemplo, do Virus do Mosaico da Couve-flor (CaMV)> e vectores bacterianos (por exemplo, do género Agrobacterium) CPotrykus, 1990). Depois da escolha e/ou da selecção, os protoplastas, células ou partes de plantas que foram transfarmadas podem ser regenerados de modo a obterem-se plantas completas, usando métodos conhecidos na técnica CR. B.

Horsch e col., 1985). A escolha das técnicas de transformação e/ou de regeneração não é critica para a presente invenção.

Para as plantas dicotiledóneas, uma forma de realização preferida da presente invenção utiliza o princípio do sistema de vector binário (Hoekema e col., 1983p SchiIperoort e col., 1984), em que se utilizam estirpes de Ag r obac t er i um que contém um plasmídio vi r com genes de virulência e um plasmídio compatível contendo o construto do gene e ser transferido. Este vector pode replicar-se tanto em

E. coli como em Agrob a c t e rium e é derivado do vector binário B:i.nl9 (Bevan, 1984), que é alterado em pormenores que não são relevantes para a presente invenção. Os vectores binárias como se utilizam neste exemplo contém, entre as sequências da margem esquerda e da margem direita do T-ADN, um gene MPTII idêntico que codifica a resistência à canamicina (Bevan, 1984) e um sítio de clonação múltipla para clonar· nos construtos dos genes pretendidos»

A transformação e a regeneração ds culturas monocotiledóneas não é um procedimento estandardizado. No entanto, o progresso científica recente mostra que, em princípio, as plantas monocotiledóneas podem ser levadas à transfarmação e que se podem regenerar plantas transgénicas férteis a partir de células transformadas» 0 desenvolvimento de sistemas de cultura de tecidos reprodutíveis destas culturas, em conjunto com os métodos poderosos para a introdução de material genético em células de plantas facilitou a transformação. Presentemente, os métodos de escolha para a transformação de plantas monocotiledóneas são o bombardeamento com micro-projêcteis de explantes ou células em suspensão e a absorção directa de ADN ou a electroporação dos protoplastas» Por exemplo, obtiveram-se com êxito plantas de arroz transgénicas usando o gene bacteriano hph, que codifica a resistência à higromicina como marcador de selecção» 0 gene foi col., 1989). introdução do que codifica inactiva o introduzido por electroporação CShimamoto e Obtiveram-se plantas ds milho transgénicas por gene bar de St rep t omyc es h ygr osc op i c us, f osfi notr i c i na-acet i1-transf erase C enzi ma que

herbicida fosf inotricina) em células embriogénicas de uma cultura em suspensão de milho por bombardeamento de micropartícuias CSordon-Kamm e col„, 1990),, A introdução de material genética em prataplastas aleurónicos de outras culturas monocoti 1 edóneas, tais como trigo e cevada, -foi também descrita (Lee e col», 1989)« Regeneraram-se plantas de trigo a partir de cultura em suspensão smbriogénica escolhendo apenas os tecidos compactos envelhecidos e de calo embriogénica nodular para estabelecimentos das culturas em suspensão embriogénica (Vasil e col», 1990)« A combinação com sistemas de transiarmação para estas culturas permite a aplicação da presente invenção ãs plantas monocoti1edóneas. Estes métodos podem também ser aplicados na transformação e na regeneração de plantas dicoti1edóneas,

A expressão de genes recombinantes em plantas envolve pormenores tais como a transcrição do gene por polimerases vegetais, a translação de mARN, etc», que são conhecidos pelos peritos nas técnicas de ADN recombinante» Apenas os pormenores relevantes para a compreensão clara da presente invenção serão referidos mais abaixo»

As sequências regulatórias que são conhecidas ou que se sabe provocarem suficientemente uma elevada expressão (para a -finalidade da aplicação específica como se refere mais adianta) do ADN recombinante em sementes podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção» Essas sequências regulatórias podem ser obtidas a partir de plantas ou de vírus de plantas ou sintetizadas quimicamente» Estas sequências de regulação são promotores activos para dirigirem a transcrição em sementes» Incluem - mas não se limitam a promotores de genes específicos das sementes, espeeialmente os de genes de proteínas de armazenagem, tais como o promotor cruA de B^-assica napus (Ryan e col», 1989) ou os promotores ds genes constitutivamente expressados, tais como o promotor 35S de CaMV (Vírus de Mosaico da Couve-flor) (Guilley e col», 1982). Outras sequências de regulação são sequências terminadoras e sinal de poli-adenilação, incluindo todas as sequências que funcionam . como tal em plantas; são exemplas a região de flanqueamento 3'

do gene da nopal ina-sintase de Agrobacterium tumefaciens ou a região de f 1 anqueamento 3' do gene cruA de Brassica napus·, As sequências regulatórias podem também incluir sequências reforçadoras, tais como as que se encontram no promotor 35S de CaMV e as sequências estabilizadoras de mARN, tais como a sequência líder do Vírus de Mosaico da Al falta (A1MV), ARN4 CBrederode e col», Í9S0) ou quaisquer outras sequências que -funcionem como tal»

A proteína de interesse deve encontrar-se num ambiente que permita a estabilidade óptima da maturação proteína durante a camparti mentos celulares, en d op1âsm ico, vac úo1 o, periplásmico, pode ser semen te.

A escolhi de criar esse ambiente estável..

da tais corpo da proteína ou espaço ut i1i sad a na p r esent e i nvenção p ar a como citosol dependendo dos retículo parâmetros biofísicos da proteína de interesse» Esses parâmetros incluem mas não se limitam - pH óptimo, sensibilidade a proteases ou sensibilidade a molar-idade do comparti mento preferido» Muito embora as sequências de sinal homólogas sejam preferidas, as sequências de sinais heterólogos podem ser igual mente utilizadas» São especialmente preferidos as sequências de sinal obtidas a partir de proteínas de armazenagem de sementes..

As proteínas de armazenagem de sementes podem dividir—se em quatro classes principais baseadas nas suas caracter ísti cas ds solubi1i dade§ í« Albuminas - solúveis em água e subdivididas em duas classes principais (12S e 2S)» A classe 12S inclui lectinas isoladas de ervilha e vários feijões, por exempla, albuminas 2S de Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Ricinus communis (semente ds rícino), Ber t h ο11 et i a ex celsa (castanha-do-maranhão), ervilha, rabanete e girassol»

2» G1obulina - solúveis em soluç^_es salinas e que podem ser da classe 7-QS, como as fassolinas de Phaseolus, as vicilinas da ervilha, as conglicininas da

3» Prolaminas

soja, as vicilinas de aveia ε as globulinas 7S de outras espécies ou da classe i1-145, como as leguminas da ervilha, as glicininas da soja, as heiiantinas do girassol, as cruciíerinas da colza ou. as proteínas 11-145 de outras espécies, tais como A rabi dopsi s e -feijão» solúveis em álcool aquoso, por exemplo, zeínas do milho, as hordeínas da cevada, as gliadinas isoladas do trigo e as cari-finas do sogro»

4» Slutelinas --- solúveis em soluções acídicas ou que podem ser isoladas de trigo» alcalinas e

Muito embora haja excepções, as proteínas mais importantes de armazenagem na semente de plantas dicotiledôneas são as globulinas e as das plantas monocoti1edóneas são as prolaminas e as glutelinas.

construtos de ADM estabiIi zação, de presente i n venç So i odas (promotores?

sinal ou podem serás partes sequências termi nadoras? mod i -f i c ad as, relevante dos d e r e g u 1 a ç So, d e de acordo com s caso assim ss pretenda, para efectuar--'.!.hes as carácterísticas de controlo, utilizando métodos conhecidos pelos peritos no assunto» A quantidade de proteína recombinante (o nível de expressão) necessária na semente deve ser suficientemente elevada para usar a semente transgénica como aditivo mínimo (em volume, em peso ou em custo) em todas as formas de realização preferidas da presente invenção»

Pode empregar-se um certo número de métodos par-a se obterem plantas transgênicas cujas sementes contêm mais do que uma enzima de interesse» Eles incluem, mas não se limitam as a» Fertilização cruzada de plantas transgênicas que expressam uma ou mais enzimas de interesse»

b. Transformação de plantas cora um -Fragmento de ADN ou com um plasmídio que contêm genes múltiplos que codificam as enzimas de interesse, usando as sequências de regulação necessárias» c» Transformação de plantas com diferentes fragmentos de ADN ou plasmídios simultaneamente, contendo cada um um gene para uma enzima de interesse, usando as sequências de regulação necessári as„ d» Transformação sucessiva de plantas, usando de cada vez um fragmento de ADN ou um plasmídio que codifica uma enzima de interesse diferente sob o contraio das sequências de r eg u1 a ç ão necessári as„

e. Combinação dos métodos acima mencionados» método realmente utilizado para obter sementes contendo mais do que uma enzima de interesse não é crítico relativamente aos objectivos da presente invenção.

Assinale-se que as sementes que contêm maiores quantidades de enzimas se podiam obter por processos conhecidos pelos peritos no assunto, diferentes dos processos recombinantes acima mencionados, desde que esses processos tenham como resultado a obtenção de sementes com quantidades reforçadas de enzimas em comparação com as sementes de tipo natural. F^:'or exempla, pode ser possível obter essas sementes por meio de técnicas de variação somoclonal» Além disso, estas técnicas também poderiam ser utilizadas em si próprias ou em combinação com técnicas de cultivo que empregam o conceito de esterilidade masculina citoplãsmica CCms) ou esterilidade masculina nuclear CNms) (Mariani e cal„, 1990). Técnicas tais como a variação somoclonal e o cultivo cruzado que envolvem a utilização de Cms ou de Nms poderiam também ser utilizadas em combinação com as tecnologias recombinantes acima mencionadas a- fim de aumentar ainda mais as quantidades relativas de enzimas presentes nas sementes. No que diz

respeito às técnicas não recombinantes que poderiam ser utilizadas para aumentar a quantidade de enzimas presentes nas sementes, faz-se referência á Patente de Invenção Norte-Americana Número 4 378 655, concedida em 7 de Abril de 1983, que se incorpora na presente descrição como referência para mencionar essas técnicas» Chama-se a atenção para o facto de existirem numerosas publicações que descrevem as técnicas de cultivo que envolvem a esterilidade masculina citoplásmica, que foi descoberta por P» LeClercq em 1986 e os correspondentes genes de restauração da fertilidade (Rf), que foram descobertas por M» 1.» Kinmar e col» em 1970» Recentemente,, a utilização da esterilidade masculina nuclear foi descrita por Mariani e col» em 1990» Descrição mais generalizada que se referem ao cultivo de plantas são referidas por James R. Welsh em Fundamentais of Plant Senetics and Breeding, 1981, assim como por J»M»Poehlman em Breeding Field Crops, 1959»

Numa forma de realização da presente invenção, prepara-se um cADN de duplo cordão que codifica fitase a partir de mARN isolado de Aspergi11us ficuum (Van o de tal no

Sorcom e col» ,	1991)» 0 c on st r ut o de	ADN
controlo de	sequências	regulatór:	as
armazenagem de	proteínas 128	a partir	de
construto é z	»egui damente	subcIonado	num

é colocado sob da cruc i f er i na Brassica napus» como pMQG23 (na estirpe DHSalfa de E,coli K-12, depositado Centraal Bureau voar Schimmelcultures, Baarn, Holanda, em 29 de

Janeiro de 1990, sob o número de acesso CBS 102.90)

Este vector é introduzido em Aqrobacterium tumefaoiens que contém um pasmídio Ti desarmado» Cocullivaram-se células de bactérias que contém este construta com tecidos de tabaco ou de plantas de Brassi ca e escolheram-se as células das plantas transformadas por meios nutrientes que contêm antibióticos e são induzidas a regenerarem-se em plantas diferenciadas com esses meios» As plantas resultantes produzem sementes que contêm e expressam o construto de ADN»

Numa outra forma de realização da presente invenção, o construta de ADN que codifica fitase é colocada sob o controlo de sequências de regulação do promotor

35S do Vírus de Mosaico da Couve-flor (CaMV). 0 construto é seguidamente subclonado num vector binário. Este vector é em seguida introduzido em Agrobacterium tumefaciens que contêm o plasmídio Ti desarmado, As células de bactérias que contêm este construto são cocultivadas com tecidos de plantas de tabaco ou

Brassi ca e escolhem-se as células das plantas transformadas por meios nutrientes que contêm antibióticos e que são induzidas a regenerarem-se em plantas diferenciadas sobre esses meios. As plantas resultantes contêm e expressam o construto ADN constitutivamente.

A actividade de enzima de fitase das sementes transgénicas pode ser determinado por uma variedade de métodos, não críticos para a presente invenção, tais como o ensaia de ELISA, de manchamento de Western ou os ensaios directos de enzimas usando técnicas colorimétricas ou ensaios em gel natural.

As sementes que contêm a fitase assim produzida podem ser utilizadas em processos industriais, tais como em aditivos de alimentas para não ruminantes, no processamento de soja ou na produção de inositol ou de fosfatas de inositol a partir de fitato» Caso isso seja necessária ou pretendido, as sementes podem ser primeiramente moídas até à consistência pretendida antes de serem utilizadas, dependendo da natureza do processo industrial, sem necessidade de posterior extracção e/ou de isolamento da fitase. Qualquer perito no assunto poderá determinar se essas operações preparatάrias são n ec essárias,

A fitase produzida nas sementes pode também ser utilizada num processo para a maceração de milho ou de sogro. As sementes podem ser moídas antes de se adicionarem ao milho de maceração, A fitase libertada das sementes pode actuar sobre a fitina, que está presente em muitas preparações à base de milho» A degradação da fitina na maceração do milho é benéfica para o valor comercial adicionado do liquido de maceração do milho, que é utilizado como alimento para animais ou como nutriente em fermentações microbianas. Além disso, a degradação da fitina pode evitar problemas relacionados com a

acumulação dos depósitos em filtros,, tubagens,, vasos de reacção,, etc. , durante a concentração, transporte e armazenagem do liquido de maceração do milho (Vaara e col. ,, 1989). A acção da fitase pode também acelerar o processo de maceração e os processos de separação envolvidos na moagem de milho em húmido.

De acordo ainda com uma outra, forma ds realização da presente invenção, coloca-se um fragmento de ADN genómico que codifica alfa-ami1 ase a partir de Baci11us 1icheniformis sob o controlo do promotor CaMV 35S e sequências de reforço, A sequência líder de estabilização de mARN de RNA4 de A1MV encontra-se incluída, assim como as sequências de sinal de terminação e de poli-adenilação do gene de nopalina-sintase cie Agrobacterium tumefaciens. □ construto inteiro é seguidamente subclonado num vector binário. Este vector é introduzido em Agrobacteri um tumef aci ens, que contém o plasmídio Ti desarmado. Coculti varam-se células bacterianas que contém este construto com tecidos de planta de tabaco e escolhem-se células das plantas transfarmadas nutrientes que contêm antibióticos e são regenerarem-se em plantas diferenciadas nesses meios. As plantas resultantes produzem sementes que contêm e expressam o construto de ADN,

A actividade da enzima alfa-ami1 ase por meios induzidas a das ementes transqénicas é determinada oor métodos não críticos para a presente invenção, tais como ensaios directos de enzimas usando técnicas colorimétricas ou ensaios com gel natural,

As sementes podem ser utilizadas como fonte da alfa-ami1 ase, que pode ser directamente usada em processos industriais, tais como preparação de xaropes de amido» Preferivelmente, as sementes são primeiramente moídas e a mistura inteira (moída) pode ser usada no processo, como pode ser determinado por conheci mentas correntes» qual quer perita no assunto.

Os ex emp 1 oí segui ntes apresentados de modo a proporeionar aos peritas no assunto uma descrição completa e uma referência completa da maneira como

•fazer e utilizar a presente invenção e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como a sua invenção» Fizeram-se esforços no sentido de garantir a exactidão relativamente aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, pH, etc»), mas pode haver alguns erros experimentais e desvios» A não ser que se indique outra unidade, a temperatura é expressa em graus Celsius e a pressão ê a atmosférica ou próxima da pressão atmosférica»

EXEMPLOS

Exemplo 1

Isolamento de Poli____A+ ARN de Aspergi 11us ficuum

Desenvolveu-se a estirpe NRRL. 3135 de Aspergi 11us ficuum num meio que contém 22,72 gramas /litro de farinha de milho (tratada com amilase a pH 7, a 85°C, durante quinze minutos), 9,36 gramas/litro de glucose, 2,9 gramas/1 itro de KNO-_S, 0,142 grama/litro de KC1, 0,142 grama/1itro FeSOzi. „ 7HhO » do micélia» de

MgS) , THsjO e 56»8 mi 1 i qramas/1 i tro de

Depois de decorridos seis dias,

-se a colheita

Congela-se o mi c é1i o grama) com azoto líquido e mói-se» Subsequentemente, o material é homogen e i zado num m i st ur ad or U11ra Tur rax ( ve1oc i d ade máx i ma s um minuto) a 0° C em Li Cl 3M e ureia 6M e mantém-se durante a noite a 4° C, como é descrito por Auffray e Rougeon (1980)»

Obtém-se ARN celular total depois de centrifugação a 16»000 x g, seguida de duas extracções sucessivas com fenols clorofórmios álcool iso-amílico (50s48s2)„ Precipita-se o ARN com etanol e redissolve-se em 1 ml de Tris-HCl 10 mM (ph 7,4), 0,5 SDS para a selecção de poli

A+, aquece-se a mistura total de ARN durante cinco minutos a seco (0,5

ARN durante cinco minutos

V

65° C , ajusta-se a NaCl 0,5 M e depois aplica-se a uma coluna de oligo (dt)-celulose. Depois de várias lavagens com uma solução contendo Tris 10 mM de ph 7,0, EDTA 1 mM e NaCl 0,1 mM, colecta-se o poli-A-i- ARM por eluição com Tris 10 mM cie ph 7,0 e EDTA 1 mM,

Exemplo 2

Preparaç&_{o e} Clonação de um cADN que Codifica Fitase

Para a síntese do primeiro cordão do cADN, dissolvem-se 5 microgramas de poli-A+ ARN, isolado de acordo com o exemplo 1, em 16,5 microlitros de H^O e adicionase os seguintes componentes; 2,5 microlitros de RNasina <30 U/microl i tro) , 10 microlitros de tampão que contém 50? mM de

Tris-HCl de pH 7, 6, 6 mM de MgCl» e 40 microlitros de KCl 1M, 5 microlitros de microlit.ro de oligo (dT) «-is <2,5 mg/nil) , 5 dNTP-mix S mM, 5 microlitros de BSA <1 mg/ml) e 2,5 microlitros de transcriptase inversa MLV Moloney <200? U/microlitros)» Incuba-se a mistura durante trinta minutos a 37°C e interrompese a reacção por adição de 10 microlitros de EDTA 0,2 M e de 50 microlitros de H_ao„ Realiza-se uma extraccão utilizando 110 mM de KCl, DTT 0,1 M, mi crolitros de microlitros de clorofórmio e cinco mi nut os, adiciona-se etanol absoluto (-20° C) , depois da centrifugação durante NS-UAc 5 M e 440 microlitros de à fase aquosa» Realiza-se a precipitação numa solução de gelo seco/etanol durante trinta minutas» Depois de centrifugação (dez minutos a 0° C), lava-se o pelete de cADN/mARIM com etanol frio e gelo a 70%, Seca-se o pelete e dissolve-se em 20 microlitros de H_so „ isolamento do cADN que codifica fitase efectua-se com a reacção em cadeia com polimerase (PCR) em d o i s f r ag mentos» Combi n am-se os dois f r ag men tos uti1i z ando o sitio de BamHI dentro do gene pez-a criar um cADN completo» A estratégia para realizar a clonação do cADN da fitase está representada na figura 1

sequenciamento do gene da fitase (Van Gopcoíií e col.,1991) revela a presença de um sitio de BamHI a aproximadamente SOO pares de base do codão de iniciação»A sequência de nucleótidos em volta deste sitio de BamHI, assim como a sequência de nucleótidos que precede o codão de iniciação e a sequência de nucleótidos depois do codão de interrupção do gene de fitase sSo utilizados para conceber □1igonucleótidos para a PCR ft reacção em cadeia de polimerase realiza-se de acordo com o fornecedor de Taq-polimerase CCetus) , usando 1,5 mi cro 1 i tros de sol ução que contém o produto da reacção da síntese do primeiro cordão e 0,5 microgramas de cada um dos oiigonucleótidos» A amplificação realiza—se num amplificador de ADN da firma Perkins Elmer/Cetus. Depois de 25 ciclos ds dois minutos a 94°C, dois minutos & 55°C e três minutos a 72°C, desproteiniza-se a mistura reaccional por extracções subsequentes com fenol e clorofórmio. Precipita-se o ADN e dissolve-se num tampão que contém Tris 10 mM, pH 7, e EDTA 0,1 mM e, subsequentemente, digere-se com enzimas de restri ç ão aprop r iad as.

Para a amplificação do fragmento que codifica a parte da extremidade N da proteína, usam-se os dois oligonuc1eóti dos segui ntes5

Oligo Is □LIGO amplificado e em Pharmacia)» seq uen c i amen t o

GGGTAGAATTGAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3'

AGTGACGAATTCGTGCTGGTGGAGATGGTGTCG 3^!

Digere-se com EcoRI o fragmento clona-se no sítio de EcoRI de pTZISR (adquirido □ mapeamento do sítio de restrição e o dos nucleótidos demonstra a autenticidade do fragmento» 0 plasmídio resultante é designado pGB925.

Para amplificar o segundo'' fragmento, utiliza-se os dois oligonucleótidos seguintess

Oligo 3s 3' GAGCACCAAGCTGAAGGATCC 3'.

Oligo 4s 5' AAACTGCAGGCGTTGAGTGTGATT6TTTAAAGGG 3'

fragmento amplificado ê digerido com BamHI e PstI e subsequentemente clonado em pTZISR, que foi digerido com BamHI e PstI» 0 mapeamento dos sítios de restrição e o sequenciamento dos nucleótidos mostra que se isola o fragmento correcto» □ plasmidio resultante é designado pGB926»

A fim de isolar um cADN de comprimento completa, digere-se pGB925 com EcoRI e BamHI e isola-se o fragmento que contém o ADN que codifica a fitase» Este fragmento é clonado no plasmidio pGB926, que foi digerido com EcoRI e BamHI, obtendo-se como resultado o plsamídio pGB927» Este plasmídio contém um cADN de comprimento completo que codifica fitase, com o tamanho aproximado de 1,8 kbp»

Exemplo 3

Construção do Vector Binário pt*IQG25 construção depositado Janeiro de

Meste Exemplo, descreve-se a do vector binário pM0G23 (em E.___col i K.-12 DHalfa, no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, em 29 de 1990, sob o número de acesso CBS 102»90).

vector binário pMQG23 (Figura 2) é um derivado do vector Binl9 M.Bevan, 1984),, Para se obter o pM0B23, o vector Binl9 é modificado de uma maneira não essencial para a presente invenção, utilizando técnicas familiares aos peritos em biologia molecular»

Em primeiro lugar, as posições do rebordo esquerdo (LB) e do rebordo direito (RB) são comutadas com referência ao gene II (gene NPTI1) da neomicina-fosfotransferase» Em segundo lugar, inverte-se a orientação do gene ΝΡΤΙΪ dando transcrição no sentido de LB» Finalmente, substitui-se o poli-Íigador de Binl9 por um poli-Íigador com os seguintes sítios de reconhecimento por enzimas de restrição? EcoRI, Κηρ I, Smal, BamHI , Xbal, Sac I, Xhol e Hind III»

de Expressão para Expressão Constitutiva em Plantas

Talha-se o gene de fitase de Asperg i11us f icuum e clona-se num eonstruto de expressão para expressão constitutiva a jusante do promotor 3SB do Vírus de í Mosaico da Couve-flor» 0 eonstruto de expressão contém também a informação de codificação para uma sequência de péptidos de sinal de origem vegetal» cftDN de fitase é clonado ns eonstruto de expressão como se encontra presente no plasmídío pM0S29 ídescrito sob a)) ». Subsequentemente, introdus—se O eonstruto inteiro no vector binário pM0B29 © transfere-se par-a ! Agrobacter i um, tumefacíens, estirpe LBA4404.

aConstrução do Vector de Expressão pMQB29

Clona-se o eonstruto de expressão de RQKÍ ÍBaulcombe e col» , 1986) como um fragmento de

EcoRI/Hindi11 em pUCÍS» Este eonstruto contém o promotor 35S do Vírus de Mosaico da Couve—flor (CaMV) num fragmento de EcoRI/BamHI e o terminador de transcrição de nopalina-sintase ínos) num fragmento tíe BamHI/HindIXI« □ fragmento promotor consiste na sequência desde -SOO a -H do promotor 35S de CaMV» A posição +1, que é incluída, ê o sítio de iniciação da transcrição (Suilley e col», 1982)» A sequência a montante do sítio de Mcol na posição —5Ϊ2 é suprimida e este sítio é transformado num sítio de EcoRI» Isto faz—se cortando o eonstruto de expressão presente em pUCIS com Ncol, preenchendo nas extremidades de cordão único com polimerase de Klenow e ligação de um ligador EcoRI» 0 plasmídío resultante é cortado com EcoRi, obtendo-se como resultado a supressão do fragmento de EcoRi» q.ue contém as sequências do promotor 33S a montante do sítio original de Ncgl» 0 fragmento de BamHI/Hlnd III, è substituído por um fragmento de contendo o nos terminador,

ADN (oligonucleótido duplex A, Figura 4) que contém a sequência líder de- ARN4 do Vírus de Mosaico da Alfalfa CA1MV) (Brederode e col», .1980)_B Isto faz-se por clivagem com BamHI, seguida de clivagem com HindiXI e ligação do fragmento de ADN sintético» O sítio de BamHI e os três nucleótidos a montante são suprimidos por mufcagénese dirigida ao sítio», No plasmídio resultante, o fragmento de BamHI/Hi nd11X que contêm a sequência nos terminadora, é reintrodusido» 0 gene que codifica beta-glucoronidase (proveniente do plasmídio pRAJ275g ãefferson, 1987) foi ligado coma fragmento de Ncol/BamHI, resultando no plasmídio pM0S14« A partir da literatura, sabe-se que a duplicação da sequência entre -343 e -90 aumenta a actividade do promotor 355 (Kay e col», 1987)» Para se obter um fragmento promotor com uma sequência dupla chamada reforçador-, realizam— -se as seguintes operações, conhecidas pelos peritos no assunto;

A partir do plasmídio pM0814, isola-se o fragmento reforçador num fragmento de Accl/EcoRI s estremi dades com é introduzido em as extremidades subsequentemente insensibilizam-se as polimerase de Klenow» 0 fragmento obtido pMDG14 cortada com EcoRI e com insensibilizadas, para que a margem compreendida entre os sítios de EcoRI e Accl de margens insensibilizadas origine um novo sítio de EcoRI» □ plasmídio resultante ípMOSIS) contém o promotor 355 com uma sequência reforçadora dupla, a sequência líder de ARN4 a partir de A1MV e o terminador nos num construto de expressão ainda presente num fragmento de EcoRI/HindiII» Finalmente, o fragmento de Ncol/BamHI que codifica beta— -glucuronidase ê substituído por um fragmento de ADN sintático B (Figura 4), derivado do cADN PR0B12 (Cornelissen e col», 1.986)« Este fragmento B codifica a proteína PR do péptido de sinal' PR-S da sequência do tabaco Samsun NN, Cria-se Uffl sítio de Sphl no péptido de sínál que codifica a sequência de ADN modificando um nucleótido» Esta modificação não altera a sequência-de aminoácidos do péptido de sinal PR-S codificado» O plasmídio resultante é designado pMQB29 (Figura S)»

Ur <3

fe) Clonayãq do Gene de Fitase de Aspergi llus, -f içuum no Vector

Blnário ' oligonucleótido duplex C (Figura 4) é clonado no plasmídio pM0G29, e digere-se com Sphl e BamHI, obtendo-se como resultado o plasmídio ρΜ06407„ O duplex de oligonucleótidos contêm a informação que codifica os dois aminoâcidos finais do péptido de sinal PR-S,' seguido dos primeiros seis aminoâcidos da fitase madura» plasmídio pGB927, que contêm o cADN da fitase de comprimento completo, ê digerido com Xhol (parcialmente) e com PstΪ„ 0 fragmento de Xhol/Pstlque compreende as sequências de ADN que codificam a fitase madura a partir do aminoácido 6 para diante, é clonado no plasmídio pM0G4O7 linearizado com Xhol e PstI, obtendo-se como resultado o plasmídio pM0G417» □ construto completo, que contêm o gene de fitase quimérico, ê inserido como um fragmento de EcoRI/HindiII no vector binário pM0G23, linearizada com EcoRI e'Hindlll. 0 plasmídio binário resultante, pM0G413, ê mobilizado, num acasalamento triparental, com a estirpe RK2013) (Ditta e col», 1930), na estirpe LBA44O4 de Agrobacteríum tumefaciens que contém um plasmídio com genes de virulência necessários à transferência de T-ADN para a planta»

Exemplo 5

Expressão transiente de um Gene de Fitase Quimérico em

Protoplastas de Tabaco

Transformam-se protoplastas de tabaco com plasmídio ADN que transporta o gene de fitase quimérico sob regulação do promotor 35S do CaMV constitutivo» Depois de setenta e duas horas, os protoplastas tratados são ensaiados relativamente à expressão transiente do gene de fitase introduzido usando o ensaio da actividade de fitase.

Preparam—s© protoplastas a partir de

plantas de tabaco desenvolvidas axenicamente com a idade de um a dois meses Cfrlíçpfciarta tabacum SR1). A maneira de proceder completa é descrita por Rodenburg e col»,£1787), Para a transformação, electropora-se um número de 5» IO⁵³ protoplastas com 40 microgramâs tíe ADN do plasmídio pM0G4l7„ Depois da electraparação, os protoplastas são .ressuspensos em 3 ml de meio K3B» Para α ensaio da actividade de fitase, os protoplastas são peletizados e dialisam-se as 3 ml de sobrenadante durante a noite contra um excesso de água» Seca-se por congelação o produto da diálise e r-essuspends-se em 300 microlitros de acetato de sódio 25 mM de pH 5,5« Realiza-se então o ensaio como se descreve pormenor!zadamente no Exemplo 10, com a única excepção de que, em vez do tampão de glicina— -HCl 250 mM de pH 2,5, se usar um tampão de acetato de sódio 25 mM ds pH 5,5. Mestas esperiências, 1 unidade de fitase define-se como fosfato 1 mícromolar libertado de uma solução de fitato de sódio 1,5 mM por minuta a 37^<!C e pH 5,5«

Nos protoplastas não tratados, não se encontra qualquer actividade detestável. Ds protoplastas eleçtroporados com plasmídio pM0G417 mostram uma actividade de 0.26 PTli (unidades de fitase, veja-se o Exemplo 10) por miligrama de proteína no sobrenadante»

Exemplo &

Expressão,. Estável de um Gene, de Fitase Buimérico em. Plantas de

Tabaco, sob Controlo do Promotor 35S do CaMV

Transf or-ma-se tabaco por cocultização de tecido de plantas com a estirpe LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens contenda a vector binário pMDG413, com o gene de fitase quimérico sob regulação do promotor 358 do CaMV» A transfarmação realiza-se utilizando a Cocultívação de discos de folhas de tabaco (Nicotiana tabacum SEI), de acordo com Horsch e col» (1785). .

7< -w;7 7 ; 28 - 7-7/^ 7 ?

Regeneram-se as plantas transgénicas a partir de rebentos desenvolvidos em meio de selecção (100 mg/litro de canamicina), enraízam-se e transferem-se para o solo» Ensaiam-se as plantas de tenra idade relativamente ã actividade de NPTII (resistência à canamicina), desenvolvem—se até á maturidade e deixam—se autopolinízar e formar sementes,

Para determinar a actividade de fítase encontrada nas plantas transgénicas, fax-se uma amostra com 50 miligramas e homogeneiza-se com um pilão em almofariz arrefecido com gela em 1 ml de tampão de acetato de sódio e 25 mH de pH 5,5. Ds pois da centrifugação, ensaia-se o sobrsnadante como se descreveu nos ensaios transientes» Em trinta e duas plantas de tabaco transformadas, observou—se um nível máximo fitase igual a 0,4% da proteína total solúvel das sementes» Mão fo-i possível detectar qualquer actividade de fitase nas plantas não transformadas.

i ndependentemente de expressão de transgénicas, 413.25 e níveis de expressão de sementes.

Escolheram—se duas linhas de plantas 413.32, com base nos seus elevados fitase (aproximadamente 0,4%) em

Exemplo 7

Clonaggo de cADN de Fitase de Asperqillus ficuUm num Construto de Expressão Específico das Sementes

Obtem-se um construto de expressão de tal maneira que se consiga -a expressão específica nas sementes, usando sequências de cruciferina do gene de proteína na armazenagem de 125 de Brassica napus CcruA; Ryan e col», 1959). Estas seuêncías podem ser substituídas pelas dos genes específicos das sementes semelhantes para se conseguir o mesmo objectivo que se pretende com a presente invenção»

Clona-se o cADN da fítase no construto de expressão. Final mente o construto inteiro é 'JC?

introduzido em Agrobacterium tumefaciens, utilizado para realizar a transformação. Mo caso de qualquer outra poteína de interesse, efectua-se a clonação do gene ou do cADM essencialmente da mesma maneira como se descreve na presente descrição para cADN da íitase#

Para todas as transformações de E, coli neste Exemplo, utiliza—se a estírpfe DHSalfa de E. coli K^aConstrução, do Construto de Expressão

Para construir o construto de expressão para expressão específica de sementes, sintetizam-se as sequências promotora e termínadora do gene da cruciferína A Ccr-uA) de Brassica napus cv, Jet Neuf, usando: a tecnologia de PCR com o ADN genómico isolado (1. d„ Mettler, Í9S7) como modelo# Este gene apresenta expressão específica das sementes e as suas sequências de codificação e de flanqueamento foram determinadas (Ryan e col., 1989).

Sintetizam—se dois conjuntos de oligonucleóyidos» Um deles serve para permitir a amplificação da região de flanqueamento 5' de cruA e parte da sequência que codifica o péptido de sinal como fragmento de EcoRl/ÍMcola

5* GTTCSSAATTCGSSTTCCSe 3' e 5' AACTBTTSASCTSTASASCC 3'«

A outra serve par-a a amplificação da sequência de flanqueamento 3' como um fragmento ds

BglII/HindlIIs ' . '

5' CTTAASATCTAACCCASTBA 3^Z e 5' CBSABAAGGTTBCATCTCBT 3'

Os oligonucleótidos são concebidos de maneira a conter sítios de restrição apropriados nas suas extremidades para- permitir a constituição do construto de expressão depois de digestão dos fragmentos com as enzimas de restrição,,

□ fragmento 5^Z do gene de eruA, que inclui cinquenta a quatr-α nocleótidos da sequência que codifica o péptido de sinal é danado no vector pM0G44S (oligonucleátido duplex E (Figura 43, clonado no vector pUCiSj linearizado com SstI e EcoRI), cortada com EcoRI e Ncol, resultando no vector pMDB424« 0 oligonucleátido duplex D sintético (Figura 4), compreendendo os tripletos de codificação finais 5 para a sequência de sinal da cruciferina de Brassica napus, a sequência que codifica os aminoácidos 1 a 6 da fitase madura β um sitio de clonação múltipla ê clonado no vector pMDB424 © cortado com Ncol © HindiII» 0 vector resultante é designad© pMQG425« 0 fragmento 3' de cr-uA PCR é clonado como um fragmento de BglII/HindIII em plO5425 digerido com BglII e HindlII» obtendo-se como resultado pMO©426.

b3 Clqnação do Gene de Fitase de Aspergillus .ficuum no Vector

Binârle* □ plasmídio pGB92T, contendo a sequência de codificação de comprimento completo da fitase ds Aspergi 11 us f içuum., é digerido com Xinol (pareialmente3 e coa Pst1. 0 fragmento de Xhol/Pstl, compreendendo as sequências de ADN que codificam fitase madura do aminoácido 6 em diante, é clonado no vector pN0G426, cortado com Xbol e PstI. Do vector. pMQS42S resultante, o construto completo contendo o gene de fitase quimérico, é inserida como um fragmenta de EcoRI/HindiII na vector binário pM0623 linearizado com EcoRI'e HindXIl» 0 vector binário resultante pM0G429 (Figura 55 é mobilizado, num ajustamento tripar-ental _s com a estirpe RK2ÔI2F de E» coli K-12 (contendo o plasmídio pRK2õl3) (Ditta e col», supra), para a estirpe LBA4404 de Agrobacterium (Hoekema e cok, 19Θ3, supra), que contém o plasmídio com os genes de virulência necessárias á transferência de T—ADN para a planta»

Exemplo 8

Expressão Especifica das Sementes Estável de Fitase ent Sementes de Tabaco sob o Controlo de'um Promotor de Grucxferína

A estirpe LBA4404 de Agrobaçterium, contendo o vector binário pM0B429 com o cADM dd fitase sob o controlo do promotor de crucifer-ina, é utilizado para as experiências de transformação» Realiza-se a transformação da tabaco (Nicotiana tabacum SRi) utilizando a cocultivação de discos da folha de acordo com a maneira de proceder descrita por Horch e cal» (1965)« As plantas transgénicas são regeneradas a partir de rebentos-que se desenvolvem em meio de selecção <100 mg/litro de canamícína)„ As plantas de tenra idade são ensaiadas rei ati vamente á actividade de NPTIl (resistência à canamícína), desenvolvidas até á maturidade e deixadas autopolinizar-se e desenvolver sementes» Reúnem—se as sementes de transformantes individuais e ensaia—se parte da amostra de sementes reiativamente á presença da fitase» A partir dos clones com os mais elevados níveis de expressão em comparação com as sementes de controlo não transformadas, germinamrse as sementes restantes em cãnamicina (200 mg/litro) (também transgénicas par-a a fitase) e seleccionam—se e Utilizam—se na propagação em massa de plantas capazes de produzir as quantidades máximas de fitase nas suas sementes» Estas podem então ser utilizadas, por exemplo, para experiências de digestão»

Para determinar a actividade de fitase encontrada nas sementes transgénicas, toma-se uma amostra de cerca de 50 mg de sementes e homogeneíza—se com um pilão num almofariz arrefecido com gelo em 1 ml de tampão tis acetato de sódio- 25 mM de pH 5,5» Depois da centrifugação ensaia-se o sobrenadante como se descreveu nos ensaios transientes» Em cinquenta e cinco plantas de tabaco transfarmadas independentemente, observou-se um nível de expressão máximo de fitase igual a 0,15% da proteína total da semente solúvel» Não se detectou actividade de fitase nos

caules, raízes e folhas das plantas transgênicas» Não foi possível detectar actividade de fitase nas plantas não transformadas»

Transformação de Semente de Colza

Neste Exemplo, descreve—se a transformação de semente de coisa por- cocultivação de tecido da planta com Agrobacterium tamefaciens, contendo um vector binário com o gene quimérico da fitase. As plantas transgênicas podem ser- escolhidas com base na resistência a antibiéticos» As plantas transgênicas podem qser ensaiadas relativamente á actividade de fitase» Podem analisar-se os expressores elevados mais cuídadosamente e estes serem usados em experiências posteriores»

Mobiliza-se o mesmo construto de fitase quimérico num vector- binário (pM0G429) na estirpe LBA4404 de de maneira’ semelhante á que se descreveu no Exemplo 7» Esta estirpe pode ser utilizada para transformar sementes de colza (Brassíca napus cv» Westar)» Par-a esse fim, segmentos do caule com a superfície esterilizada são retirados de plantas Com a idade de cinco a seis semanas, precisamente ántes da floração, são pré-condicionadas durante vinte e quatro horas em meio MS (Fr-y e col», 1987) com 1 mg/1 de BAP e, em seguida, são cocultivadas durante quarenta e oito horas com Agr-obacter-lum em chapas frescas com o mesmo meio» As plãntulas transgênicas pode ser regeneradas a partir da rebentos, que se desenvolvem em meio de selecção (500 mg/l de carbenicilina, 40 mg/1 de paromomicina) e depois analisadas como se descreveu no Exemplo S para o tabaco»

Exemplo 10

Ensaio__d_e Actividade de. t-ita.se

Moí-se um total de 25 miligramas de sementes da linha de plantas 413.25 de iMlcot 1 ana t abacttm, qus contêm na totalidade aproximadamente 0,25 F'TU. CF* * TU ^;= unidades de fitasej define—se uma unidade de fitase como a quantidade de enzima que liberta fósforo inorgânico de fítato de sódio 1,5 mM com a velocidade de 1 mi cremei e/minuto a 37° C e a pH 2,5)«

Incubam-se as sementes moídas num volume total de 50 ml de tampão de glicina/HCL 250 mM de pH

2,5, contenda 0,86 grama de fitato de sódio*lU-Wh Muito embora a fitase de AspergiIIus expresse a um pH óptimo igual a 2,5, assim como a 5,5, escolhe-se o valor de pH menor para excluir a actividade de fitase da planta.

Incuba—se a mistura resultante durante quinze e sessenta minutas a 37^<>C. Interrompe-se a reacção por adição de 5 ml do incubado em 5 ral de TCA Cácído tricloro-acético) a 10%« Em seguida, adicionam-se 10 mi de reagente indicador (3,66 gramas de FeSOs» ?HssO em 50 ml de solução de molibdato de amónio (2,5 gramas de (Nl-U)óMo-rOs^.* 4HaO e 8 ml de HaSCU concentrado, diluído até perfazer 250 ml com água deámxnerizatía)) à solução de enzimas interrompida. A intensidade da cor azul ê medida espectrofotometricamente a 700 nm.

D teor de fosfato inorgânico presente a T'» 0 serve como ensaio em branco.

í As determinações são indicativas da quantidade de fosfato libertado em relação com- uma curva de calíbração de fosfato na gama de 0 a 1 mM.

íhcdbajçâp (j_e Sementes de Mi cot lana tabacum Moídas com • Smbstârtcias Alimentares

Numa experiência típica, incuba-se

0,25 gramas de farinha de soja extraída com dissolventes com 25 mg de sementes de N i c ot ina t ab ac um (linha de plantas 413,25) contendo aproximadamente 0,25 PTU, como se descreveu acima, com a excepção de não se ter feito a adição de fitato de sódio. Neste caso, o agente de incubação adicionado consiste numa mistura de 410 ml de tampão e 90 ml de água.

A libertação de fosfato a partir de fitato na farinha de soja extraída com dissolvente está representada graficamente na Figura 6« Sem sementes moídas adicionadas, não se observa qualquer actividade.

Numa i d ên t i c a, ob têm-se r esu11 ad os m i I h o a 3. i men t ad o c orno suta st r at o» experiência vi rtualmente semelhantes usando glúten de Os resultados obtidos estão representados graficamente na Figura 6,

Não se observa actividade na ausência de sementes moídas ou quando se adicionam sementes moídas que não contêm actividade fitase»

Exemplo 12

Ensaio In Vitro de Sementes Transgénicas que Contêm Fitase, sob

Condições que Simulam o Canal Digestivos de Frangos

Para se avaliar a eficácia da fitase produzida em sementes de tabaco transgénico, determina—se a actividade de fitase de Asp er g i 3.3. us n um modelo que imita as condições que se encontram no tubo digestivo de frangos.

Incuba-se primeiramente uma amostra de alimentação normalizada para frangos a 1 g/15 ml de água durante sessenta minutos a 39^C'C para simular as condições de desenvolvimento dos animais. Subsequentemente, adicionam-se 5 ml de uma solução de pepsina (Merk? 5,28 gramas/litro ph 3,0 ajustada com HC1), ajusta-se a ph igual a 3,0 com HC1 e continua-se a incubação durante mais noventa minutos à mesma temperatura, para simular as condições existentes no estômago.

Durante o periodo de incubação, retiram-se amostras a fim de determinar a quantidade de fosfato libertada a partir- do fitato presente na alimentação»

A acção da fitase de fungos é evidente a partir da Figura 10» Aumentando a dosagem de fitase de 250 para 1»000 PTU/Kg de alimento, obtêm—se como resultado uma libertação aumentada de fosfato a partir da amostra do ali mento»

Quando se adiciona uma amostra de sementes de tabaco transgénico (linhas 413.32; de fungos, obtém—se um aumento de libertação de fosfato semelhante (Figura 11)« As sementes de tabaco de controlo, que não contêm fitase, foram também ensaiadas» Não se observou a libertação de fosfato em comparação com o controlo de ensaio em branco»

A comparação dos resultados com 50 gramas de sementes de tabaco transgénico/qui1ograma de alimentação com os obtidos com 500 e 750 PTU/Kg de alimentação indica que i grama de sementes de tabaco é aproximadamente igual a 12 F^!TU neste modelo de digestão de frangos in vi tro

Ex emp1 o 13

Ensaio em animais

Realizaram-se ensaios com frangos para mostrar a eficácia da fitase expressada em sementes de plantas, bem assim como a ausência de quaisquer efeitos negativos das sementes de tabaco sobre os resultados zootécnicos»

Colhem-se sementes de tabaco que expressam fitase e sementes de controlo» Moem-se as sementes em quantidades de 100 gramas com um peneiro (Retch-mill ZM1) que tem poros de 500 micrómetros,tendo o cuidado de conservar as sementes arrefeci das»

Alojam-se pintos com a idade de um dia (Hybro) em gaiolas de criação com dois tabuleiros (0,45

íEaat»«wttHW«o m^).Mantém-se a temperatura ambiente igual a 32°C durante os primeiros dois dias e depois diminui-se de 4°C na primeira semana.Em cada semana seguinte, a temperatura é diminuída de 2°C»0s frangos são criados num regime de uma hora de luz e três horas de escuridão.

As aves são vacinadas contra a doença de New Castie quando têm um dia de idade, usando a vacina Clone 30. Durante as experiências, os frangos são alimentados com dietas . experimentais, todas com a forma de pasta e A vontade» Determina-se o crescimento e as proporções alimento/ganho de peso durante os períodos experimentais» Mede-se a disponibilidade aparente de fósforo total num período ds três dias, durante o qual se mede o consuma de alimentos como entrada de matéria seca e colectam-se os excrementos quanti tati vamente»

A disponibilidade aparente de fósforo é definida como a diferença entre a entrada de fósforo e a excreção de fósforo com os excrementos»

Utilizam-se as seguintes dietas de controlo sem adição de tases

Ca

P total

P de fitato

Dieta. <%) (%) (%

7a f

0,75 0»90

Não se adicionai fosfato ao alimento na dieta i (dieta de base)» As dietas 2 e 3 são suplementadas com cálcio e fósforo provenientes de uma mistura de fosfato dicálcico anidro e de fosfato de mono-amónio (proporção ~ 5sl). Todas as dietas experimentais são obtidas por adições à dieta de base (veja-se a Tabela D»

A dieta experimental 4 contém fitase de origem microbiana com a concentração de 400PTU/quilograma de alimento, (1991).

á dieta

preparada como é descrito por Van dorcom col

A dieta experimental 5 é semelhante adicionam-se sementes moídas de tabaco não transgênico á mistura de alimentação para se obter uma proporção -final igual a 3 kg/90 g de alimento.

A dieta experimental 6 é também semelhante à dieta 4, mas adicionam-se 3 quilogramas de sementes de tabaco transgênico moídas (linha 413.25) a uma mistura de 90 quuilogramas de alimento, para se obter uma concentração final de 400PTU/kg de alimento»

A experência é realizada com cento e setenta e seis frangos em dezasseis gaiolas de alojamento (onze por gaiola), até atingirem a idade de vinte e quatro dias» Os tratamentos (dietas) são repetidos duas vezes e são atribuídos ao acaso aos animais que se encontram dentro da. cada gaiola»

A disponibilidade ds fósforo é medida a partir de vinte e u.m a vinte e quatro dias de idade»

Os rssu11 ad os re1ati vamen t e à disponibilidade de -fósforo e ao crescimento dos animais a que se -forneceram as dietas 4,5 e ó mostram o efeito positivo da adição de fitase (Tabela 2)» A comparação das dietas 4,5 e 6 também demonstra que a inclusão das sementes de tabaco no alimento é compatível com a acção de -fitase microbiana no canal gastrintestinal dos animais domésticos, tais como -frangos, e não mostra quaisquer efeitos negativos sobre os resultadas zootécnicos»

Composição da Dieta de Base em Experiências com Frangos

X

TABELA

Ingredientes Milho amarelo

Sorgo (baixo teor de Tanino)

Farinha de semente de girassol (extraída com dissolvente)

Farinha de semente de soja (extraia com dissolvente, 48,8% proteína óleo de semente de soja Vitaminas

Matéria mineral

Calcário

Metronina sintética

Cr₂0g

Teores (g/Kg)

280.0

80,0

350,0

-j , u 15,0 i ₅ 0

1,0 0,5

ME (MJ/Kg)

Li si na

Metionina + cistina

Cálcio .

Fósforo total

Fósforo orgânico fítico

13,1

12,9

9,1

6,0 (6,0 - 6,6)** 4,5 (4,7 - 4,7)** 3,0 (3,1 - 3,1)**

Quantidade fornecida por kg de dietas 12000 UI de vitamina A§ 2000 UI de vitamina D₃; 5 UI de vitamina E? 1,5 mg de vitamina Κ^» 1 mg de tiamina? 5 mg de riboflavina? 1 mg de piridoxina? 30 mg de ácido nicotínico? 7,5 mg de ácido Dpantoténico? 0,015 mg de vitamina B_1Si§ o,5 mg de ácido fólico? 350 mg de cloreto de colina? 75 mg de etoxiquina?

9,5 g de CaCO^» 2,5 g de SMaCl ? 0,25 g de FeSO^; 0,24 g de MnSCU? 445 mg de CuSCU? 60 mg de ZnSCU? 105 mg de mistura de Kl, * Analisado para as experiências 1 e 2, respectivamente.

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Exemplo 14

Clonagão do Gene de Alfa-Amilase de Bacillus licheniformis numa

Cassete de Expressão para Expressão Constitutiva

Neste Exemplo, talha-se o gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis e clona-se numa cassete de expressão para a expressão constitutiva que também contém a informação do código para uma sequência de péptido de sinal de origem vegetal. Como operação final, clona-se o construto inteiro num vector binário, transfere-se para a estirpe LBA44O4 de Agrobacterium tumefaciens, que é utilizada para transformar a planta de interesse. Pode clonar-se qualquer outro gene ou cADN de maneira semelhante à que se descreve na presente descrição relativamente ao gene de alfa-amilase.

Todas as transf ormaç?íss deste Exemplo são realizadas na estirpe DH5-alfa de E. coli K-12*

a)

Talhe do Gene de Alfa-Ãmilase de Bacillus 1icheniformis

Digere-se o gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (Figura 7) presente no vector pPROM54 (depositado no Centraal Bureau voor Schimmelcultures em 5 de Novembro de 1985 sob o número de acesso CBS 696.85) com Xbal e Bell. Clona-se o fragmento de Xbal/BclI no plasmídio pOC18 linearizado com Xbal e BamHI, obtendo-se em resultado o plasmídio pMOG318. Sintetiza-se um fragmento de Sall/BamHI utilizando a tecnologia de PCR com pMOG318 como modelo que cria o sítio de BamHI por utilização de um primário de incompatibilidade (representado na Figura fragmento de Sall/BamHI obtido (Marsch e col., 1984) e digere-se com Sall e BamHI, obtendo-se como resultado o plasmídio pMOG319. 0 fragmento de Sall, que contém a extremidade 5' do gene de alfa-amilase, (usando o sítio de Sall presente em pUC18) pMOG319, linearizado com Sall. Obtêm-se como

7). Clona-se o por PCR no plasmídio pIC-19R de pMGG318 é clonado em resultado o plasmídio pMOG32O, que contém o gene de alfa-amilase completo.

b) Construção da Vector pMQG29

Constrói-se o vector pM0G29 como se descreveu no Exemplo 4 (a) .

cClonação do Gene de Alfa—Amilase de Bacillus 1icheniformis no Vector Bi nário

Digere-se o plasmídio pM0G320 com Hgal e BamHI. Clona-se o fragmento Hgal/BamHI, que codifica alfa-amilase madura do aminoácido 9 para diante, numa ligação de três vias com o oligonucleótido duplex sintético F (Figura 4) em pM0G29, linearizado com Sphl e BamHI, obtendo-se como resultado o plasmídio pM0G321» 0 ol igonucleótido duplex tem informação que codifica os dois aminoácidos finais do péptido de sinal PR-S e os primeiros nove aminoácidos de alfa-amilase madura» □ construto completo, contsndoo gene de alfa-amilase quimérico, é inserido como um fragmento de EcoRI/Hind111. 0 plasmídio binário resultante pM0G227 (Figura 9) é mobilizado, num ajustamento triparental, com a estirpe RK2013 de E. coli K-12 (contendo o plasmídio pRK2013) (Ditta e col», 1990), na estirpe LBA4404 de Ag r ob ac ter i um que contém um plasmídio com os genes de virulência necessários à transferência de T-ADN para a planta»

ExempJLo 15

Expressão Estável de Alfa-Amilase de Bacillus licheniformis em

Tabaco

Neste Exemplo, transforma-se tabaco por cocultivação do tecido da planta com Ag r ob ac t er i um tumefaciens contendo um vector binário com o gene de alfa-amilase quimérico, Seleccionam-se as plantas transgénicas com base na resistência a antibióticos» Ensaiam-se as sementes das • plantas transgénicas relativamente à actividade de alfaami1ase» cui dadosamente

Anali sam-se transformação, Ag r ob ac t er i um, tafaacum SRi)

os expressares elevados mais e utilizam-se em experiências posteriores,

Par a as ex p er i ên c i as d e utiliza-se a estirpe LBA44O4 CpM0S227) de Realiza-se a transformação de tabaco Nicotiana usando a cocultivação de discos de folhas de acorda com a maneira de proceder de Horsch e cal» (1985)» As plantas transgénicas são regeneradas a partir de rebentos que se desenvolvem em meio de selecção (100 mg/litro de canamicina)» Ensaiam-se as plantas de tenra idade relativamente à actividade de ΝΡ7ΪΪ, desenvolvem-se até â maturiadade e dei xam-se aut op o1i ni zar •ornecer sementes

Reunem-se as sementes de transformantes individuais e ensaia-se parte da amostra de sementes relativamente á presença da alfa-amilase.

Dos clones com os níveis de expressão mais elevados, em comparação com sementes de controlo não transformadas, as sementes restantes são germinadas em canamicina (200mg/Iitro) (também transgénicas para alfa-amilase) e seleccionam-se e utilizam-se para a propagação em massa de plantas capazes de produzir sementes que contém as quantidades máximas de alf a-ami 3. ase, Observou-se um nível de expressão máximo de alfa-amilase de 0,4% da proteína total solúvel das sementes. Estas sementes podem então ser utilizadas, por exempla, para experiências de digestão.

Exemplo 16

Aplicação de Alfa-Amilase Formulada em Sementes para _a

Liquefação de Amido

Aplicou-se na liquefação de amido alfa-amilase de Bacillus licheniformis, expressada em sementes de tabaco, procedendo da seguinte maneiras

Colhem-se '100 gramas de sementes de tabaco que expressam alfa-amilase e sementes de controlo» Moem-se as sementes com um moinha dotado de um peneiro (Rstch

-mill ZMí) tenda paras de 250 micrómetros, tenda a cuidada de manter as sementes arrefeci das. Para determinar o seu teor de alfa-amilase, as sementes moídas foram extraídas com 10 volumes de tampão 0,5 M de glicina, pH 9,0, com CaCl_ia 10 mi-1, durante trinta minutos a 0°C. Utilizou-se o líquido sobrenadante para a d etermi nação d e a1f a-ami 1 ase ρ e 1 o métod o d e Ph ad eb as ( Ph ar mac ia Diagnostics). As unidades são referidas como TAU (unidades de a 3. f a-ami 1 ase ter most á vel).

Realizaram-se ensaios de liquefação procedendo da seguinte maneiras

Suspensão de amido (composiçãos 3,3 quilogramas de amido de milho ou de batata, D.S.(substância seca) 88% (2,904 quilogramas de amido); 5,45 litros de H_s0; D.S. da suspensão fica igual a 33%; corrigiu-se o pH para 6,5 com ácido sulfurónico 1 N ou com NaOH 1 N» es moídas ou a 4,4 TAU/g possível e Em seguida, temperatura

Adiei onaram-se ou sement alfa-amilase microbiana numa quantidade equivalente de D.S.) e aquece-se a 100°C o mais rapidamente mantém-se a esta temperatura durante dez minutos, aquece-se a suspensão até 95^C'C e mantém-se a esta durante duas horas. Em seguida, acidulam-se as amostras com

HjaSO^. para se obter um pH igual a 3,5 e colocam—se num banho de água à ebulição durante dez minutos a fim de interromper a actividade enzimática antes de se determinar a DE (equivalente de dextrose) e o modelo de hidrólise foi determinado por HPLC. Utilizou-se uma coluna Biorad HPX-42A para a análise de HPLC com água desmineralizada como eluente.

Obteve-se o modela de oli a partir de amido de batata e de milho usando plantas transformadas A); B) Maxamyl^R (alfa-ami1 ase licheniformis fornecida por Gist-Brocades N»

Holanda); e 0) Dexlo^CL (alfa-amilase de amy1 o1i quef ac i ens f ornec i da ρ or Gist-Brocades) e gossacárido sementes de de Baci11us V. Delft,

Bacillus comparam-se (Figuras 12 e 13). 0 modelo de oligossacárido obtidos a partir de sementes de plantas transformadas e de Maxamyl^R são idênticas, muito embora ambas difiram da obtida com Dexlo^R, confirmando que a alfa-amilase de Bacillus 1icheniformis é

produzida pelas sementes das plantas» Os valores de DE obtidos com as sementes das plantas (Tabela 3) estão dentro da gama comercialmente aceitável (DE 12, preferivelmente DE 16) (Reilley, 1985)»

TABELA 3

Valores Equivalentes de Dextrose (DE) Obtidos por Hidrólise de

Amido de Milho e de Batata

Amida de Γ5 <·?. L. c*t *C. <3.	Amido de Milho DE
	DE
Max amy1R WL7000		18	16
Sementes de	tabaco não	transformadas	16	13
Sementes de	tabaco transformadas	0	0
DexloR CL tenha sido	descrita	Muito embora com referência a	15 a presente formas de	IS i nvenção realização

específicas, os peritos no assunta sabem que podem fazer-se várias modificações e podem ser substituídos vários equivalentes sem afastamento do real espírito e âmbito da invenção» Além disso, podem fazei—se muitas modificações de maneira a adaptar-se o processo a uma situação particular, material, planta, semente, processo, operação de processo ou operações, ao objecto, espírito e âmbito da invenção» Todas essas modificações se pretende que fiquem incluídas dentro do 'ãmta i to das rei vi nd i cações segui ntes»

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Processa para catalisar reacçoes aceleráveis por enzimas, mediante adição ao meio reaccional de sementes de plantas transgênicas, caracterizado por, a um meio reaccional que contém um substrato em que a enzima de interesse é capaz de catalisar uma reacção enzimática do referido substrato na mistura reaccional, se adicionar as sementes obtidas a partir de plantas transgênicas as quais contém uma quantidade reforçada da enzima de interesse,

Processo dí acordo :om

Claims (1)

1. re i v i n d i c a ção 1 caracterizado pelo -facto de a mencionada enzima ser uma enzima heteróloga em relação a transgénica do'tipo bravio da planta» uma ^:onte não

   Processo de acordo com a r-eivindicação '1, caracterizado por- se moerem as sementes antes ds serem adicionadas à mistura reaccional»

   - 4ã FYocesso de acorda com a reivindicação 1, caracterizado pelo -Facto de a moagem se realizar depois da adição das sementes à mistura reaccional»

   Processo reivindicação 1, caracterizado pelo enzima, da classe das hidrolases» de acordo com facto de a enzima ser a

   uma óã Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a mencionada enzima da classe das hidrolases ser escolhida do grupo que consiste em proteases, celulases, hemicelulases, fosfatases, lipases, pectinases, amilases, 1:1. sóz imas, peiulanases e qui ti nases» ?a

   Processo de acordo com a reivindicação í, caracterizado pelo facto de a enzima ser uma 1i ase» reivindicação 7, ρectin i 1ase» reivindicação i, i somerase» q1uco-i somerase»

   Sã

   Processo de acordo caracterizado pelo facto de a

   9ã

   Processo de acordo com

   1 i ase :om a

   ser caracterizado pelo facto de -a enzima ser uma

   1 Oã

   Processo de acordo com a caracterizado pelo facto de a isomerase ser llã

   Processo de acordo com a caracterizado por se escolher a enzima do grupo que consiste em fitase, -amilase, eelobio-hidrolase, endog1ucanase, endoxi1anase, endogalactanase, -galactosi dade, arabinase, serínoproteases, quimosina, lipases gástricas, pec ti na-1i sases e g1ucose-i somer ases« r e i v i n d i c a ç ão 1

   Processo para provocar o aumento da absorção dos componentes nutritivos de um determinado alimento ou produto alimentar por um animal, caracterizado por se combinar com o referido alimento ou produto alimentar as sementes obtidas a partir de plantas transqénicas contendo uma quantidade reforçada de uma enzima de interesse a qual é capaz de catalisar as reacções de digerstão do alimento ou do produto alimentar, obtendo-se como resultado o aumento da absorção dos componentes nutritivos presentes no alimento pelo animal que ingere o alimento ou o produto alimentar»

   - 135 Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se escolher a enzima do grupo que consiste em fitase, celulases, hemicelulases, pectinases e ami1 ases»

   - 145 Processo para o tratamento de um animal que sofre de perturbações de funcionamento do aparelho digestivo, caracterizado por se administrar ao referido animal uma quantidade suficiente de sementes obtidas a partir de plantas transgénicas as quais contêm uma quantidade aumentada de uma enzima de interesse que ê capaz de catalisar as reacções da diqestão» ,15â

   Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se moerem as sementes antes de se efectuar a sua administração ao animal»

   X 02

   Processo paira catalisar reacções i_n vitro, caracterizado por se adicionar a uma mistura reaccional que contêm um substrato ou os substratos a ser catalisados, sementes obtidas a partir de plantas transgénicas as quais contêm uma quantidade reforçada ds pelo menos uma enzima de interesse, sendo a. enzima ou as enzimas de interesse capazes de catalisar a reacção do substrato ou dos substratos presentes na mistura reaccional.

   Processo para a preparação de composições, caracterizado por se incorporar na composição sementes obtidas a partir ds plantas transgénicas as quais contém uma quantidade reforçada duma enzima de interesse, directamente sem se efectuar a extracção nem a purificação da enzima de interesse»

   - 18ã Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se moerem as sementes incorporadas na sua formulação»

   19ã

   Processa para a obtenção de uma variedade de plantas transgénica que produz sementes em que expressam uma quantidade reforçada de uma enzima que interessa para utilização directamente num processo industrial, caracterizado por se transformar a planta com plasmídio pM0G413„

   - 20ã Processo para a obtenção duma variedade de plantas transgénica, caracterizado por se transformar a planta com plasmídio pMQG429» *lã variedade de

   Processo para obtenção duma ρ1antas transg éni ca c ar ac t e r i z ad ο ρ o r transformar a planta com plasmídio pM0G227«

   Plasmídios prara transfarmação de plantas hospedeiras e obtenção de plantas transgénicas que expressam maiores proporções de enzimas de interesse nas sementes, designados respectivamente, pM0B413, pM0B429 e pM0G227»

   A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente norte-americano apresentado em 23 de Março de 1990, sob o número de série 498#561» .isboa.