ES2358092T3 - Variantes de proteasa. - Google Patents
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Abstract
Proteasa con un porcentaje de identidad de los aminoácidos 1 a 188 de una proteasa progenitora que consiste en SEC ID n.º 2 de al menos 60%, que exhibe una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa progenitora por determinación de actividad residual tras la incubación durante cuatro horas a 65ºC con pH 6 o pH 4 en un tampón Na2HPO4 0,2M y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: N47D, Q54R, N92K, y/o T127R, donde cada posición corresponde a una posición de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2; con la condición de que la proteasa no sea: los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2 con la sustitución T87A, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 4, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 6, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 8, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 10, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 22, y no las partes maduras de las proteasas que tienen las secuencias de SEC ID n.º 23, SEC ID n.º 24, SEC ID n.º 25, SEC ID n.º 26, SEC ID n.º 27 y SEC ID n.º 28 y donde el grado de identidad entre secuencias se determina por el programa "align" usando la matriz de puntuación BLOSUM50, la penalización para el primer residuo de un espacio es -12 y las penalizaciones para otros residuos de un espacio son - 2.
Description
Variantes de proteasa.
La presente invención se refiere a una
estructura tridimensional de la proteasa nueva, al igual que
variantes de una proteasa progenitora, en particular, variantes de
propiedades enmendadas, tales como termoestabilidad mejorada y/o
perfil de actividad de temperatura enmendada. La invención también
se refiere a secuencias de ADN que codifican tales variantes, su
producción en una célula huésped recombinante, al igual que métodos
de uso de las variantes, en particular, en el campo de pienso para
animales y detergentes. La invención además se refiere a métodos de
generación y preparación de variantes de proteasa de propiedades
enmendadas. Las proteasas progenitoras preferidas son proteasas de
Nocardiopsis, tales como proteasas que comprenden las partes de
péptido maduro de SEC ID n.^{os}: 2, 4, 6, 8, 10 y 21.
Las secuencias de proteasa derivadas de cepas de
Nocardiopsis se describen en WO 88/03947, WO 01/58276 y DK 1996
00013 ("Proteasa 10", SEC ID n.^{os}:
1-2).
JP 2003284571-A describe, como
las SEC ID n.^{os}: 2 y 1, la secuencia de aminoácidos y la
secuencia de ADN correspondiente, respectivamente, de una proteasa
derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM
P-18676). Las secuencias han sido introducidas en
la base de datos GENESEQ como GENESEQP n.º ADF43564 y GENESEQN n.º
ADF43563, respectivamente.
JP 2-255081-A
describe una proteasa derivada de la cepa Nocardiopsis sp.
OPC-210 (FERM P-10508), no
obstante, sin información de secuencia. La cepa ya no está
disponible, puesto que el depósito fue retirado.
DD 200432 8 describe una preparación
proteolítica derivada de la cepa Nocardiopsis dassonvillei
ZIMET 43647, no obstante, sin información de secuencia. La cepa
parece ya no estar no disponible.
Se describen secuencias de proteasa de
Nocardiopsis adicionales en PCT/DK04/000433 ("Proteasa 08" SEC
ID n.^{os} 9-10 en el presente documento);
PCT/DK04/000434 ("Proteasa 11", SEC ID n.^{os}:
5-6 en el presente documento); PCT/DK04/000432
("Proteasa 18", SEC ID n.^{os} 3-4 en el
presente documento); y PCT/DK04/000435 ("Proteasa 35", SEC ID
n.^{os} 7-8 en el presente documento).
Es un objeto de la presente invención
proporcionar proteasas alternativas, en particular, para el uso en
pienso para animales y/o detergentes, en particular, variantes de
proteasa mejoradas y nuevas, preferiblemente de propiedades
enmendadas, tales como termoestabilidad mejorada y/o una temperatura
óptima más alta o inferior.
La presente invención se refiere a una variante
de una proteasa progenitora, que comprende una sustitución en al
menos una posición de al menos una región seleccionada del grupo de
regiones que consisten en: 6-18,
22-28, 32-39, 42-58,
62-63, 66-76,
78-100, 103-106,
111-114, 118-131,
134-136, 139-141,
144-151, 155-156,
160-176, 179-181 y
184-188 donde
(a) la variante tiene actividad de la proteasa;
y
(b) cada posición corresponde a una posición de
aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 y
(c) la variante tiene un porcentaje de identidad
con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 de al menos 60%.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican la variante
de proteasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células
huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos al
igual que métodos para producir y usar las variantes de la
proteasa.
La figura 1 es una alineación múltiple de la
proteasa 10, la proteasa 18, la proteasa 11, la proteasa 35 y la
proteasa 08 (las partes de péptido maduro de SEC ID n.^{os} 2, 4,
6, 8 y 10, respectivamente), que también incluye una variante de la
proteasa de la invención, es decir, la proteasa 22 (aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 21);
La figura 2 proporciona las coordenadas de la
estructura tridimensional nueva de la proteasa 10 (aminoácidos 1 a
188 de SEC ID n.º 2) derivada de Nocardiopsis sp. NRRL
18262.
La estructura de la proteasa 10 fue resuelta
conforme a los principios para los métodos cristalográficos de
rayos X según se ofrecen, por ejemplo, en X-Ray
Structure Determination, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley
& Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la
estructura cristalina con una resolución de 2.2 A usando el método
de sustitución isomorfa se presentan en la figura 2 en formato de
PDB estándar (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory,
Brookhaven, CT). El archivo PDB de la figura 2 se refiere a la
parte de péptido maduro de la proteasa 10 correspondiente a los
residuos 1-188 de SEC ID n.º 2.
Las simulaciones de la Dinámica Molecular (DM)
son una indicación de la movilidad de los aminoácidos en una
estructura de proteína (véase McCammon, JA y Harvey, SC., (1987),
"Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University
Press). Tal dinámica de las proteínas es frecuentemente comparada
con los factores B cristalográficos (véase Stout, GH y Jensen, LH,
(1989), "X-ray structure determination",
Wiley). Al ejecutar la simulación de DM a, por ejemplo,
temperaturas diferentes, se simula la movilidad relacionada con la
temperatura de los residuos. Las regiones que tienen la movilidad o
la flexibilidad máxima (en este caso, fluctuaciones isotrópicas) se
pueden sugerir para mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la
alta movilidad encontrada en áreas determinadas de la proteína
puede ser térmicamente mejorada substituyendo estos residuos.
Usando los programas CHARMM (Accelrys) y NAMD
(Universidad de Ilinois en Urbana-Champaign), la
estructura de la proteasa 10 anteriormente descrita fue sometida a
DM a 300 y 400 K. Empezando a partir de las coordenadas de la
figura 2, se construyó hidrógeno y átomos pesados faltantes usando
los procedimientos de CHARMM HBUILD e IC BUILD, respectivamente.
Luego, la estructura fue minimizada usando el procedimiento de
minimización de Gradientes conjugados CHARMM (CONJ) para un total
de 200 pasos. La proteína luego fue colocada en una caja de 70 X 70
X 70 Angstrom y disuelta con moléculas de agua TIP3. Se agregó un
total de 11124 moléculas de agua y luego fueron minimizadas,
manteniendo fijas las coordenadas de proteína, usando el
procedimiento de minimización Adopted Basis Newton Raphson (ABNR)
de CHARMM para 20000 pasos. El sistema luego fue calentado a la
temperatura deseada a razón de 1 K cada 100 pasos usando el
software NAMD. Después de un equilibrado de 50 picosegundos, se
realizó una DM de conjunto NVE durante 1 nanosegundo. Ambos pasos se
realizaron con el software NAMD. Se utilizó un corte de 12 Angstrom
para las interacciones no ligadas. Las condiciones límites
periódicas se utilizaron después del paso de disolución y para
todos los posteriores. La fluctuaciones isotrópicas de valor medio
cuadrado (VMC) se calcularon con el procedimiento COOR DYNA de
CHARMM.
Las siguientes regiones para mutagénesis
sugeridas surgen de simulaciones de DM: del residuo 160 al 170, del
residuo 78 al 90, del residuo 43 al 50, del residuo 66 al 75, y del
residuo 22 al 28.
Las regiones de residuos de aminoácidos, al
igual que las sustituciones de aminoácido individuales, fueron
sugeridas para mutagénesis sobre la base de la estructura
tridimensional de la figura 2 y la alineación de las cinco
proteasas conocidas (las cinco filas superiores de la figura 1),
principalmente, con el propósito de mejorar la
termoestabilidad.
Las siguientes regiones fueron sugeridas, cf.
reivindicación 1: 6-18, 22-28,
32-39, 42-58, 62-63,
66-76, 78-100,
103-106, 111-114,
118-131, 134-136,
139-141, 144-151,
155-156, 160-176,
179-181 y 184-188.
Al menos una de las siguientes posiciones de las
regiones anteriores son preferiblemente sometidas a mutagénesis,
cf. reivindicación 3, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 32, 33, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 103, 105, 106, 111,
113, 114, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 131, 134, 135,
136, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 155,
156, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,
172, 173, 174, 175, 176, 179, 180, 181, 184, 185, 186, 187 y/o
188.
Las variantes específicas contempladas se
presentan en las reivindicaciones, es decir, las variantes de la
proteasa 10, la proteasa 18, la proteasa 11, la proteasa 35, al
igual que la proteasa 08 en las reivindicaciones 4 y 15; las
variantes de la proteasa 10 en la reivindicación 16; las variantes
de la proteasa 18 en la reivindicación 17; las variantes de la
proteasa 11 en la reivindicación 18; la variantes de la proteasa 35
en la reivindicación 19 y las variantes de la proteasa 08 en la
reivindicación 20.
Los diferentes conceptos subyacentes de la
invención también se reflejan en las reivindicaciones de la
siguiente manera: La estabilización por puentes de disulfuro en las
reivindicaciones 5 y 6, la estabilización de prolina en las
reivindicaciones 7-8, la sustitución de residuos
neutros expuestos con residuos negativamente cargados en las
reivindicaciones 9-10; la sustitución de residuos
neutros expuestos con residuos cargados positivamente en las
reivindicaciones 11-12; la sustitución de residuos
pequeños con residuos más voluminosos en el interior de la proteína
en la reivindicación 13; y las regiones propuestas para mutagénesis
siguiendo las simulaciones de DM en la reivindicación 14.
El término "al menos uno" significa "uno
o más", es decir, por ejemplo en el contexto de las regiones:
uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho nueve, diez, once,
doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete; o, en el
contexto de posiciones o sustituciones: uno, dos, tres, cuatro,
cinco, etcétera, hasta, por ejemplo, noventa.
En una forma de realización particular, el
número de regiones propuesto y/o sometido a mutagénesis es al menos
uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho nueve, diez, once,
doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o, al menos,
diecisiete.
En otra forma de realización particular, el
número de regiones propuesto y/o sometido a mutagénesis es no más
de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho nueve, diez,
once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o no más de
diecisiete.
Los polipéptidos que tienen actividad de la
proteasa, o las proteasas, a veces también son llamados peptidasas,
proteasas, hidrolasas peptídicas o enzimas proteolíticas. Las
proteasas pueden ser del tipo exo que hidrolizan péptidos
comenzando en cualquier extremo de las mismas, o del tipo endo que
actúa internamente en cadenas de polipéptido (endopeptidasas). Las
endopeptidasas muestran actividad en sustratos de péptido bloqueado
N- y C-terminalmente que son pertinentes para la
especificidad de la proteasa en cuestión.
El término "proteasa" se define en la
presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Esta
definición de la proteasa también se aplica a la parte de proteasa
de los términos "proteasa progenitora" y "variante de
proteasa" según se utiliza en el presente documento. El término
"proteasa" incluye cualquier enzima del grupo enzimático EC
3.4 (incluidas cada una de las trece subclases del mismo). El número
EC se refiere a nomenclatura enzimática 1992 de
NC-IUBBM, Academic Press, San Diego, California,
incluidos los suplementos 1-5 publicados en Eur. J.
Bio-chem. 1994, 223, 1-5; Eur. J.
Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996,
237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250,
1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264,
610-650; respectivamente. La nomenclatura
habitualmente es suplementada y actualizada; véase, por ejemplo, la
página web http: //www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
Las proteasas son clasificadas basándose en su
mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas
(S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A),
metaloproteasas (M), y proteasas (U) desconocidas o aún sin
clasificar; véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N.
D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), en
particular, la parte de la introducción general.
En formas de realización particulares, las
proteasas progenitoras y/o las variantes de proteasa de la
invención y para el uso según la invención son seleccionadas del
grupo que consiste en:
(a) proteasas del grupo enzimático EC 3.4;
(b) serina proteasas del grupo S del manual
anterior;
(c1) serina proteasas de la familia de peptidasa
S2A; y
(c2) serina proteasas de la familia de peptidasa
S1E como se describe en Biochem. J. 290:205-218
(1993 y en la base de datos de proteasa MEROPS, publicación 6.20,
24 de marzo de 2003, (www.merops.ac.uk). La base de datos es
descrita en Rawlings, N. D., O'Brien, E. A. & Barrett, A. J.
(2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30,
343-346.
Para determinar si una proteasa determinada es
una serina proteasa, y una proteasa de la familia S2A, se hace
referencia al manual anterior y a los principios indicados en el
mismo. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos
de proteasas, ya sean de origen natural o proteasas de tipo salvaje;
o proteasas sintéticas o creadas genéticamente.
La actividad de la proteasa puede medirse usando
cualquier ensayo en el que se emplee un sustrato, que incluya
enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa
en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo
igualmente deben ser adaptados a la proteasa en cuestión. Ejemplos
de valores de pH del ensayo son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o
12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 80, 90 o 95ºC. Ejemplos de ensayos de proteasa
adecuados se describen en la parte experimental.
La proteasa progenitora es una proteasa de la
cual la variante de proteasa es, o, puede ser derivada. Para los
objetivos presentes, cualquier proteasa se puede usar como la
proteasa progenitora, siempre que la variante de proteasa
resultante sea homóloga a la proteasa 10, es decir, la proteasa
derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y que comprenda los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2.
En una forma de realización particular, la
proteasa progenitora también es homóloga a la proteasa 10.
En el presente contexto, homólogo significa que
tiene una de al menos 60% con SEC ID n.º 2, es decir, aminoácidos
1-188 de la parte de péptido maduro de la proteasa
10. La homología se determina como se describe generalmente a
continuación en la sección titulada Homología de aminoácidos.
La proteasa progenitora puede ser un polipéptido
de tipo salvaje o de origen natural, o una variante alélica del
mismo, o un fragmento del mismo que tiene actividad de la proteasa,
en particular, una parte madura del mismo. También ser una variante
del mismo y/o un polipéptido sintético o creado genéticamente.
En una forma de realización particular, la
proteasa progenitora de tipo salvaje es i) una proteasa bacteriana;
ii) una proteasa del filo Actinobacteria; iii) de la clase
Actinobacteria; iv) del orden Actinomycetales; v) de la familia
Nocardiopsaceae; vi) del género Nocardiopsis; y/o una proteasa
derivada de vii) la especie Nocardiopsis, tal como Nocardiopsis
alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis
dassonvillei, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila,
Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis
listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus,
Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis sp., Nocardiopsis
synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica,
Nocardiopsis umidischolae o Nocardiopsis
xinjiangensis.
Ejemplos de tales cepas son: Nocardiopsis
alba DSM 15647 (productor de tipo salvaje de la proteasa 08),
Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 (productor de tipo
salvaje de la proteasa M58-1 descrito en WO
88/03947), Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei
DSM 43235 (productor de tipo salvaje de la proteasa 18),
Nocardiopsis prasina DSM 15648 (productor de tipo salvaje de
la proteasa 11), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (productor
de tipo salvaje de la proteasa 35), Nocardiopsis sp. NRRL
18262 (productor de tipo salvaje de la proteasa 10),
Nocardiopsis sp. FERM P-18676 (descrito en JP
2003284571-A).
Las cepas de estas especies son accesibles al
público en un número de colecciones de cultivos, tal como American
Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor
Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent
Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), por
ejemplo, la Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei
DSM 43235 está disponible públicamente en DSMZ (Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig,
Alemania).
Además, tales polipéptidos se pueden identificar
y obtener de otras fuentes incluidos los microorganismos o ADN
aislado de al naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) usando
sondas adecuadas. Las técnicas para aislar microorganismos o ADN de
hábitats naturales se conocen en la técnica. La secuencia de ácidos
nucleicos puede entonces ser derivada seleccionando de manera
similar una genoteca de ADNc o genómico de otro microorganismo. Una
vez que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido ha sido detectada con la/s sonda/s, la secuencia puede
ser aislada o clonada utilizando técnicas conocidas por los expertos
en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989,
supra).
La proteasa progenitora puede ser una parte
madura de cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas
anteriormente. Una parte madura significa una secuencia de
aminoácidos madura y se refiere a esa parte de una secuencia de
aminoácidos que permanece después de que una parte del péptido señal
potencial y/o parte del propéptido ha sido cortada. Las partes
maduras de cada una de las proteasas 08, 10, 11, 18, 22 y 35 se
especifican en el listado de secuencias anexo.
La proteasa progenitora también puede ser un
fragmento de una secuencia de aminoácidos específica, es decir, un
polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados del término
amino y/o carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. En una forma
de realización, un fragmento contiene al menos 80, o al menos 90, o
al menos 100, o al menos 110, o al menos 120, o al menos 130, o al
menos 140, o al menos 150, o al menos 160, o al menos 170, o al
menos 180, o al menos 185 residuos de aminoácidos.
La proteasa progenitora también puede ser una
variante alélica, alélica refiriéndose a la existencia de dos o más
formas alternativas de un gen que ocupa la misma localización
cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de
mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones.
Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el
polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen
secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un
\hbox{polipéptido es un polipéptido codificado por una
variante alélica de un gen.}
En otra forma de realización, la proteasa
progenitora puede ser una proteasa creada genéticamente, por
ejemplo, una variante del tipo salvaje o proteasas progenitoras
naturales mencionadas anteriormente comprendiendo una sustitución,
deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos. En otras palabras:
la proteasa progenitora puede en si misma ser una variante de
proteasa, tal como la proteasa 22. La secuencia de aminoácidos de
tal proteasa progenitora puede diferir de la secuencia de
aminoácidos específica por una inserción o deleción de uno o más
residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de
aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Los cambios de
aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor o más importante.
Los cambios de aminoácidos de una naturaleza más importante son, por
ejemplo, aquellos que dan como resultado una proteasa variante de
la presente invención con propiedades enmendadas. En otra forma de
realización particular, los cambios de aminoácidos son de una
naturaleza menor, es decir, sustituciones conservadoras de
aminoácidos que no afectan significativamente el pliegue y/o la
actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a
aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones de carboxilo o amino
terminal pequeñas, tales como un residuo de metionina amino
terminal; un pequeño péptido de enlace de hasta
20-25 residuos aproximadamente; o una pequeña
extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u
otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo
antigénico o un dominio de enlace.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están en
el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina),
aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico),
aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos
hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos
(fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños
(glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones
de aminoácido que generalmente no alteran la actividad específica
se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H.
Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New
York. Los intercambios que ocurren con mayor frecuencia son
Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile,
Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, al igual que estos de forma inversa.
Otros ejemplos de proteasas progenitoras creadas
genéticamente son proteasas sintéticas, diseñadas por el hombre,
cuya existencia en la naturaleza es imprevista. EP 897985 describe
un proceso de preparación de una proteína de consenso. Las
proteasas redistribuidas son otros ejemplos de proteasas
progenitoras sintéticas o creadas genéticamente, que se pueden
preparar como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo por
mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR con la
mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la
PCR), o por mutagénesis aleatoria. Incluido en el concepto de una
proteasa sintética también está cualquier proteasa quimérica o
híbrida, es decir, una proteasa que comprende una combinación de
secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos
proteasas. La transposición de genes es descrita generalmente en,
por ejemplo, WO 95/22625 y WO 96/00343. La recombinación de genes de
proteasa puede realizarse independientemente de la secuencia
específica de los progenitores por redistribución sintética como se
describe en Ness, J.E. et al, en Nature Biotechnology, Vol.
20 (12), pág. 1251-1255, 2002. Los oligonucleótidos
sintéticos se degeneraron en su secuencia de ADN para proporcionar
la posibilidad de que todos los aminoácidos encontrados en el
conjunto de proteasas progenitoras estén diseñados y los genes
ensamblados según la referencia. La redistribución puede llevarse a
cabo para la secuencia de longitud total o sólo para parte de la
secuencia y luego combinada más tarde con el resto del gen para dar
una secuencia de longitud total. Dos, tres, cuatro, cinco o los seis
de las proteasas designadas proteasa 10, 18, 11, 35, 08 y 22 (SEC
ID n.^{os} 2, 4, 6, 8, 10 y 21, en particular, las partes maduras
de las mismas) son ejemplos particulares de tales proteasas
progenitoras que se pueden someter a redistribución como se ha
descrito anteriormente, para proporcionar proteasas adicionales de
la invención.
En otras formas de realización particulares, la
proteasa progenitora comprende, o consiste en, respectivamente, la
secuencia de aminoácidos específica, o una variante alélica de la
misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de la
proteasa.
En otras formas de realización particulares, la
variante de proteasa de la invención no es idéntica a: (i) los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2, los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 4, los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 6, los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 8, y los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 10 (ii) los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 2 (iii) los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 2 con la sustitución T87A; (iv)
los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 4 (v) los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 6 (vi) los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 8 (vii) los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 10 (viii) la
proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133;
(ix) la proteasa que tiene los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2
como se describe en JP 2003284571-A; (x) la
proteasa que tiene la secuencia introducida en GENESEQP con n.º
ADF43564; (xi) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK
n.º 2004 00969 como SEC ID nº 2, en particular la parte madura de la
misma; (xii) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK n.º
2004 00969 como SEC ID n.º 4, en particular, la parte madura de la
misma; (xiii) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK n.º
2004 00969 como SEC ID n.º 6, en particular, la parte madura de la
misma; (xiv) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK n.º
2004 00969 como SEC ID n.º 8, en particular, la parte madura de la
misma; (xv) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK n.º
2004 00969 como SEC ID n.º 10, en particular, la parte madura de la
misma; (xvi) la proteasa descrita en la solicitud de patente DK n.º
2004 00969 como SEC ID n.º 12, en particular, la parte madura de la
misma; y/o (xvii) cualquier proteasa de la técnica anterior de un
porcentaje de identidad con SEC ID n.º 2 de al menos 60%.
Las preguntas acerca de la taxonomía pueden ser
resueltas consultando una base de datos de taxonomía, tal como el
explorador de taxonomías NCBI que está disponible en el siguiente
sitio de Internet: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
Taxonomy/taxonomyhome.html/, y/o consultando manuales de taxonomía. Para los objetivos presentes, la taxonomía es preferiblemente según el capítulo: The road map to the Manual de G.M. Garrity & J. G. Holt en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, segunda edición, volumen 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz.
Taxonomy/taxonomyhome.html/, y/o consultando manuales de taxonomía. Para los objetivos presentes, la taxonomía es preferiblemente según el capítulo: The road map to the Manual de G.M. Garrity & J. G. Holt en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, segunda edición, volumen 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz.
La presente invención se refiere a proteasas, es
decir, proteasas progenitoras, y/o variantes de proteasa, con un
cierto grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º
2, tales proteasas variantes y/o progenitoras son designadas en
adelante "proteasas homólogas".
Para objetivos de la presente invención, el
grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual
que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se
determina por el programa "align" que es una alineación de
Needleman-Wunsch (es decir, una alineación global).
El programa se usa para la alineación de polipéptido, al igual que
secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación predeterminada
BLOSUM50 se usa para alineamientos de polipéptidos, y la matriz
predeterminada se usa para alineamientos de nucleótidos. La
penalización para el primer residuo de un espacio es -12 para
polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para otros
residuos de un espacio son -2 para polipéptidos, y -4 para
nucleótidos.
"Align" es parte de la versión v20u6 del
paquete de FASTA (véase W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988),
"Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS
85:2444-2448 y W. R. Pearson (1990) "Rapid and
Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in
Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de
proteínas de FASTA usan el algoritmo de
Smith-Waterman sin ninguna limitación en tamaño de
espacio (véase "Smith-Waterman algorithm", T.
F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol.
147:195-197).
Los alineamientos múltiples de secuencias
proteícas pueden realizarse usando "ClustalW" (Tompson, J.D.,
Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
sequence weighting, positions-specific gap penalties
and weight matrix choice. Nucleic Acids Research,
22:4673-4680). Los alineamientos múltiples de
secuencias proteicas pueden realizarse usando la alineación de
proteínas como un molde, sustituyendo los aminoácidos con el codón
correspondiente de la secuencia de ADN.
En formas de realización particulares, la
proteasa homóloga tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un
grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 de al
menos 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o de al menos 99%
aproximadamente.
En formas de realización alternativas, la
proteasa homóloga tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un
grado de identidad con SEC ID n.º 2 de al menos 50%, 51%, 52%, 53%,
54%, 55%, 56%, 57%, 58% o al menos 59%.
En otra forma de realización particular, la
proteasa progenitora, y/o la variante de proteasa, comprende una
secuencia de aminoácidos madura que difiere de no más de setenta y
cinco, setenta y cuatro, setenta y tres, setenta y dos, setenta y
uno, setenta, sesenta y nueve, sesenta y ocho, sesenta y siete,
sesenta y seis, sesenta y cinco, sesenta y cuatro, sesenta y tres,
sesenta y dos, sesenta y uno, sesenta, cincuenta y nueve, cincuenta
y ocho, cincuenta y siete, cincuenta y seis, cincuenta y cinco,
cincuenta y cuatro, cincuenta y tres, cincuenta y dos, cincuenta y
uno, cincuenta, cuarenta y nueve, cuarenta y ocho, cuarenta y siete,
cuarenta y seis, cuarenta y cinco, cuarenta y cuatro, cuarenta y
tres, cuarenta y dos, cuarenta y uno, cuarenta, treinta y nueve,
treinta y ocho, treinta y siete, treinta y seis, treinta y cinco,
treinta y cuatro, treinta y tres, treinta y dos, treinta y uno,
treinta, veintinueve, veintiocho, veintisiete, veintiséis,
veinticinco, veinticuatro, veintitrés, veintidós, veintiuno,
diecinueve, dieciocho, diecisiete, dieciséis, quince, catorce,
trece, doce, once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro,
tres, de no más de dos aminoácidos, o sólo por un aminoácido de la
secuencia de aminoácidos específica, por ejemplo, los aminoácidos 1
a 188 de SEC ID n.º 2.
En otra forma de realización particular, la
proteasa progenitora, y/o la variante de proteasa, comprende una
secuencia de aminoácidos madura que difiere de al menos setenta y
cinco, setenta y cuatro, setenta y tres, setenta y dos, setenta y
uno, setenta, sesenta y nueve, sesenta y ocho, sesenta y siete,
sesenta y seis, sesenta y cinco, sesenta y cuatro, sesenta y tres,
sesenta y dos, sesenta y uno, sesenta, cincuenta y nueve, cincuenta
y ocho, cincuenta y siete, cincuenta y seis, cincuenta y cinco,
cincuenta y cuatro, cincuenta y tres, cincuenta y dos, cincuenta y
uno, cincuenta, cuarenta y nueve, cuarenta y ocho, cuarenta y siete,
cuarenta y seis, cuarenta y cinco, cuarenta y cuatro, cuarenta y
tres, cuarenta y dos, cuarenta y uno, cuarenta, treinta y nueve,
treinta y ocho, treinta y siete, treinta y seis, treinta y cinco,
treinta y cuatro, treinta y tres, treinta y dos, treinta y uno,
treinta, veintinueve, veintiocho, veintisiete, veintiséis,
veinticinco, veinticuatro, veintitrés, veintidós, veintiuno,
diecinueve, dieciocho, diecisiete, dieciséis, quince, catorce,
trece, doce, once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro,
tres, por al menos dos aminoácidos, o por un aminoácido de la
secuencia de aminoácidos específica, por ejemplo, los aminoácidos 1
a 188 de SEC ID n.º 2.
En la alternativa, las proteasas homólogas
progenitoras, al igual que las proteasas variantes, pueden
definirse como codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos que
se hibrida bajo condiciones de astringencia muy baja,
preferiblemente, condiciones de astringencia baja, más
preferiblement,e condiciones de astringencia media, más
preferiblemente, condiciones de astringencia
media-alta, incluso más preferiblemente, condiciones
de astringencia alta, y de forma más preferible, condiciones de
astringencia muy alta con los nucleótidos 900 1466, o
900-1463, de SEC ID n.º 1 o una subsecuencia o una
cadena complementaria de la misma (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T.
Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición,
Cold Spring Harbor, New York). Una subsecuencia puede ser de al
menos 100 nucleótidos, o al menos 200, 300, 400, o al menos 500
nucleótidos. Por otra parte, la subsecuencia puede codificar un
fragmento de polipéptido que tiene la actividad enzimática
pertinente.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, se definen condiciones de astringencia muy baja a muy
alta como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, SDS al
0,3%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
cortado y bien formamida al 25% para astringencias muy bajas y
bajas, formamida al 35% para astringencias medias y
media-altas, o formamida al 50% para astringencias
altas o muy altas, siguiendo procedimientos de transferencia de
Southern estándares.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces
durante 15 minutos cada vez usando 2 x SSC, SDS al 0,2%
preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más
preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más
preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más
preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia medio alta), incluso
más preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta) y de la
forma más preferible, al menos a 70ºC (astringencia muy alta).
Para sondas cortas que son de aproximadamente 15
nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las
condiciones de astringencia se definen como prehibridación,
hibridación y lavado post-hibridación a 5ºC a 10ºC
por debajo de la T_{m} calculada usando el cálculo según Bolton y
McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
48:1390) en 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM
EDTA, 0,5% NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM
pirofosfato de sodio, 1 mM fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM ATP y
0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos de
transferencia de Southern estándar.
Para sondas cortas que son de aproximadamente 15
nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el
material de portador se lava una vez en 6X SCC más SDS al 0,1%
durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando
6X SSC a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada.
En el presente contexto, la base para numerar
las posiciones es aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2, proteasa 10,
partiendo con A1 y finalizando con T188, véase la figura 1. Una
proteasa progenitora, al igual que una proteasa variante, puede
comprender extensiones en comparación con SEC ID n.º 2, es decir, en
el N-terminal, y/o las extremidades de
C-terminales de las mismas. Los aminoácidos de tales
extensiones, si los hay, se deben numerar como es usual en la
técnica, es decir, para una extensión C-terminal:
189, 190, 191 etcétera, y para una extensión
N-terminal -1; -2; -3, etcétera.
En el presente contexto, los siguientes son
ejemplos de varias maneras en las que una variante de proteasa
puede ser diseñada o derivada de una secuencia de aminoácidos
progenitora: un aminoácido se pueden sustituir por otro aminoácido;
un aminoácido pueden ser delecionado; un aminoácido puede ser
insertado; al igual que cualquier combinación de cualquier número
de tales alteraciones.
Para los objetivos presentes, el término
sustitución tiene por objeto incluir cualquier número de cualquier
tipo de tales alteraciones. Ésta es una definición razonable,
porque, por ejemplo, una deleción se puede considerar una
sustitución de un aminoácido, AA, en una posición determinada, nn,
con nada, (). Tal sustitución puede ser designada: AAnn().
Asimismo, una inserción de sólo un aminoácido, BB, debajo de un
aminoácido, AA, en una posición, nn, puede ser designada: ()nnaBB.
Y si dos aminoácidos, BB y CC, son insertados abajo del aminoácido
AA en la posición nn, esta sustitución (combinación de dos
sustituciones) puede ser designada: ()nnaBB+()nnbCC. Los espacios
creados de este modo entre los aminoácidos nn y nn+1 en la secuencia
madre tienen letra minúscula o de subíndice asignadas a, b, c etc.
al número de posición anterior, en este caso, nn. Se sigue un
procedimiento de numeración similar cuando se alinea una nueva
secuencia a la alineación múltiple de la figura 1, en caso de que
se cree un espacio por la alineación entre los aminoácidos nn y
nn+1: se asigna un número a cada posición del espacio: nna, nnb
etc. Una coma (,) entre sustituyentes, como, por ejemplo, en la
sustitución T129E, D,Y,Q significa "bien, o", es decir que
T129 se sustituye con E, o D, o Y, o Q. Un signo de más (+) entre
las sustituciones, por ejemplo 129D+135P significa "y", es
decir, que estas dos únicas sustituciones se combinan en una y la
misma variante de proteasa.
En el presente contexto, el término "una
sustitución" significa al menos una sustitución. Al menos una
significa uno o más, por ejemplo uno, o dos, o tres, o cuatro, o
cinco, o seis, o siete, u ocho, o nueve, o diez, o doce, o catorce,
o quince, o dieciséis, o dieciocho, o veinte, o veintidós o
veinticuatro, o veinticinco, o veintiocho, o treinta, etcétera,
para incluir, en principio, cualquier número de sustituciones. Las
variantes de la invención, no obstante, todavía deben ser, por
ejemplo, al menos 60% idénticas a SEC ID n.º 2. Este porcentaje se
determina por el programa mencionado arriba. Las sustituciones se
pueden aplicar a cualquier posición comprendida por cualquier
región mencionada en la reivindicación 1, y también están incluidas
las variantes que comprenden combinaciones de cualquier número y
tipo de tales sustituciones. El término sustitución, según se
utiliza en este caso, también incluye deleciones, al igual que
extensiones, o inserciones, que pueden contribuir a la longitud de
la secuencia correspondiente los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º
2.
Además, el término "una sustitución"
incluye una sustitución en cualquiera de los otros diecinueve
aminoácidos naturales, o en otros aminoácidos, tales como
aminoácidos no naturales. Por ejemplo, una sustitución del
aminoácido T en la posición 22 incluye cada una de las siguientes
sustituciones: 22A, 22C, 22D, 22E, 22F, 22G, 22H, 22I, 22K, 22L,
22M, 22N, 22P, 22Q, 22R, 22S, 22V, 22W y 22Y. Esto es, a propósito,
equivalente a la designación 22X, donde X designa cualquier
aminoácido. Estas sustituciones también pueden ser designadas T22A,
T22C, T22X, etc. Lo mismo se aplica por analogía a todas y cada una
de las posiciones mencionadas en la presente, para incluir
específicamente, en este caso, cualquiera de tales
sustituciones.
Para cada residuo de aminoácido en cada proteasa
progenitora o variante de la invención, y/o para el uso según la
invención, es posible asignar directamente y sin ambigüedad un
residuo de aminoácido en la secuencia de los aminoácidos 1 a 188 de
SEC ID n.º 2 a la cual corresponde. Se asigna el mismo número a los
residuos correspondientes, por referencia a la secuencia de la
proteasa 10.
Como aparece según la numeración de la figura 1,
conjuntamente con la numeración del listado de secuencias, para
cada residuo de aminoácido de cada una de la proteasas proteasa 10,
proteasa 18, proteasa 11, proteasa 35, proteasa 08 y proteasa 22,
el residuo de aminoácido correspondiente en SEC ID n.º 2 tiene el
mismo número. Este número puede derivarse fácilmente de la figura
1. Al menos en el caso de estas seis proteasas, el número es el
mismo que el número asignado a este residuo de aminoácido en el
listado de secuencias para la parte madura de la proteasa
respectiva.
Para una posición dada en otra proteasa - sea
ésta una proteasa progenitora o una variante - siempre puede
encontrarse una posición correspondiente de SEC ID n.º 2, de la
siguiente manera:
La secuencia de aminoácidos de otra proteasa
progenitora, o, a su vez, de una secuencia de aminoácidos de
proteasa variante, es designada SEQ-X. Una posición
correspondiente a la posición N de SEC ID n.º 2 se encuentra de la
siguiente manera: la secuencia de aminoácidos de proteasa variante o
progenitora SEQ-X se alinea con SEC ID n.º 2 como
se especificó más arriba en la sección titulada Homología de los
aminoácidos. De la alineación, la posición en la secuencia
SEQ-X correspondiente a la posición N de SEC ID n.º
2 puede ser derivada de manera clara y sin ambigüedad, usando los
principios descritos a continuación.
La SEQ-X es la parte madura de
la proteasa en cuestión. En la alternativa, también puede incluir
una parte de péptido señal, y/o una parte de propéptido, o puede
ser un fragmento de la proteasa madura que tiene actividad de la
proteasa, por ejemplo, un fragmento de la misma longitud que SEC ID
n.º 2, y/o puede ser el fragmento que se extiende desde A1 a T188
cuando está alineado con SEC ID n.º 2 como se describe en este
caso.
En el presente contexto, el término región
significa al menos una posición de una secuencia de aminoácidos de
proteasa progenitora. El término posición designa un residuo de
aminoácido de tal secuencia de aminoácidos. En una forma de
realización, región significa una o más posiciones sucesivas de la
secuencia de aminoácidos de proteasa progenitora, por ejemplo, uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, etc., hasta cualquier
número de posiciones consecutivas de la secuencia. Por consiguiente,
una región puede consistir en una posición solamente, o puede
consistir en cualquier número de posiciones consecutivas, tales
como, por ejemplo, la posición n.º 62 y 63 o la posición n.º. 111,
112, 113 y 114. Para los objetivos presentes, estas dos regiones son
designadas 62-63, y 111-114,
respectivamente. Los límites de estas regiones o gamas están
incluidos en la región.
Una región comprende específicamente todas y
cada una de las posiciones que abarca. Por ejemplo, la región
111-114 específicamente comprende todas y cada una
de las posiciones 111, 112, 113 y 114. Lo mismo se aplica por
analogía a las otras regiones mencionadas en este caso.
Para los objetivos presentes, el término
termoestable según se aplica en el contexto de un polipéptido
determinado, se refiere a la temperatura de fusión, Tm, de tal
polipéptido, según se determina usando calorimetría por análisis
diferencial (DSC por sus siglas en inglés) en 10 mM fosfato sódico,
50 mM cloruro sódico, pH 7, 0, usando una tasa de barrido constante
de 1,5ºC/min.
Las siguientes Tm fueron determinadas bajo las
condiciones anteriores: 76,5ºC (proteasa 10), 83,0ºC (proteasa 18),
78,3ºC (proteasa 08), 76,6ºC (proteasa 35), 73,7ºC (proteasa 11) y
83,5ºC (proteasa 22).
Para un polipéptido termoestable, la Tm es al
menos 83,1ºC. En formas de realización particulares, la Tm es al
menos 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99
o al menos 100ºC.
En la alternativa, el término termoestable se
refiere a una temperatura de fusión de al menos 73,8, o al menos
76,7ºC, o al menos 78,4ºC, preferiblemente al menos 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82 o al menos 83ºC, aún como se determina usando
calorimetría por análisis diferencial con un pH de 7,0.
Para la determinación de la Tm, puede usarse una
muestra del polipéptido con una pureza de al menos 90% (o 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97 o 98%) como se determina por
SDS-PAGE. Aun más, la muestra enzimática puede
tener una concentración de entre 0,5 y 2,5 mg/ml de proteína (o
entre 0,6 y 2,4, o entre 0,7 y 2,2, o entre 0,8 y 2,0 mg/ml de
proteína), como se determina a partir de la absorbencia a 280 nm y
sobre la base de un coeficiente de extinción calculado a partir de
la secuencia de aminoácidos de la enzima en cuestión.
La calorimetría por análisis diferencial se
desarrolla al pH deseado (p. ej. pH 5,5; 7,0; 3,0 o 2,5) y con un
índice de calentamiento constante, por ejemplo de 1; 1,5; 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9 o 10ºC/min.
En una forma de realización particular, la
variante de proteasa de la invención es termoestable,
preferiblemente más termoestable que la proteasa progenitora. En
este contexto, las proteasas progenitoras preferidas son la
proteasa 18, o la proteasa 10.
En otra forma de realización particular, un
sobrenadante del cultivo de la variante de proteasa de la
invención, apropiadamente diluido, muestra una actividad residual
tras la incubación durante cuatro horas a 65ºC en un tampón de 0,2M
Na_{2}HPO_{4}, titulado con 0,1 M ácido cítrico a i) pH 6,0, o
ii) pH 4,0, de al menos 20%, en relación con un control (congelado)
no incubado. La actividad se mide usando el ensayo de Protazyme AK
a pH 8, 5 y 37ºC, como se describe en el ejemplo 2. En otras formas
de realización particulares, la actividad residual es al menos 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, o al menos 77%.
En una forma de realización particular, la
variante de proteasa de la invención muestra un perfil de actividad
de la temperatura enmendada en comparación con, por ejemplo, la
proteasa 10 (o la proteasa 18, la proteasa 11, la proteasa 35 o la
proteasa 08). Por ejemplo, la variante de proteasa de la invención
puede mostrar una actividad relativa con pH 9 y 80ºC de al menos
0,40, preferiblemente al menos 0,45; 0,50, 0,55; 0,60; 0,65; 0,70;
0,75; 0,80; 0,85; 0,90, o al menos 0,95. El término "relativa"
se refiere a la actividad máxima medida para la proteasa en
cuestión. Para la proteasa 22, la actividad es relativa a la
actividad a 80ºC que se fija en 1,000 (100%), y para la proteasa
10, la actividad a 70ºC se fija en 1,000 (100%); véase el ejemplo
3. Como otro ejemplo, la variante de la proteasa de la invención
muestra una actividad relativa con pH 9 y 90ºC de al menos 0,10,
preferiblemente al menos 0,15, 0,20; 0,25; 0,30 o de al menos 0,35.
En una forma de realización particular, la actividad de la proteasa
se mide usando el ensayo de Protazyme AK del ejemplo 1.
En una forma de realización específica, las
variantes de proteasa de la presente invención son (también)
variantes poco alergénicas, diseñadas para invocar una respuesta
inmunológica reducida al ser expuestas a animales, incluido el
hombre. El término respuesta inmunológica debe ser entendido como
cualquier reacción por el sistema inmunológico de un animal
expuesto a la variante de proteasa. Un tipo de respuesta
inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles
aumentados de IgE en el animal expuesto. Las variantes poco
alergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la
técnica. Por ejemplo, la variante de proteasa se puede conjugar con
partes de protección de fracciones de polímero o epítopos de la
variante de proteasa implicados en una respuesta inmunológica. La
conjugación con polímeros pueden implicar acoplamiento químico
in vitro de polímero a la variante de proteasa, por ejemplo,
como se describe en WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 y/o WO
99/00489. La conjugación además o alternativamente puede implicar
acoplamiento in vivo de polímeros a la variante de proteasa.
Tal conjugación puede lograrse por creación genética de la secuencia
de nucleótidos que codifica la variante de la proteasa, insertando
secuencias de consenso que codifican sitios de glicosilación
adicional en la variante de proteasa y expresando la variante de
proteasa en un huésped capaz de glicosilar la variante de proteasa;
véase, por ejemplo, WO 00/26354. Otro modo de conseguir variantes
poco alergénicas es creando genéticamente la secuencia de
nucleótidos que codifica la variante de proteasa para causar que
las variantes de proteasa se auto-oligomericen,
ocasionando que los monómeros de la variante de proteasa puedan
proteger los epítopos de otros monómeros de la variante de proteasa
y así reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y
su preparación se describen, por ejemplo, en WO 96/16177. Los
epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden
identificarse por varios métodos, tales como el método de
exposición en fago descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el
enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que un epítopo ha
sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para
producir propiedades alteradas inmunológicas de la variante de
proteasa por técnicas de manipulación génica conocidas tales como
mutagénesis dirigida (véase, por ejemplo WO 00/26230, WO 00/26354
y/o WO 00/22103) y/o puede realizarse la conjugación de un polímero
en proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al
epítopo.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica una variante de proteasa de la
invención.
El término "secuencia de ácidos nucleicos
aislada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que es
esencialmente libre de otra secuencia de ácidos nucleicos, por
ejemplo, al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al
menos aproximadamente 40% pura, más preferiblemente al menos
aproximadamente 60%, pura, incluso más preferiblemente al menos
aproximadamente 80% pura, y de forma más preferible, al menos
aproximadamente 90% pura como se determina por electroforesis de
agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada se
puede obtener por procedimientos de clonación estándares usados en
ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos
de su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducida.
Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y
aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende
la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido,
inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación
del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán
copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos nucleicos. La
secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen de ADN genómico,
ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los
mismos.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
invención se pueden preparar por introducción de al menos una
mutación en la secuencia codificante de proteasa progenitora o una
subsecuencia de la misma, donde la secuencia de ácidos nucleicos
mutante codifica una proteasa variante. La introducción de una
mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un
nucleótido por otro nucleótido se puede realizar por mutagénesis
dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica,
por ejemplo, por mutagénesis dirigida, por mutagénesis aleatoria, o
por mutagénesis aleatoria localizada, adicionada o dopada.
La mutagénesis aleatoria es adecuadamente
realizada bien como mutagénesis aleatoria específica de la región o
localizada en al menos tres partes del gen que se traducen en la
secuencia de aminoácidos mostradas en cuestión, o en el gen entero.
Cuando la mutagénesis se realiza por el uso de un oligonucleótido,
el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres
nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido
en las posiciones que se van a cambiar. El dopaje o el adicionado se
puede realizar de modo que se eviten los codones para aminoácidos
indeseados. El oligonucleótido adicionado o dopado se puede
incorporar en el ADN que codifica la enzima de proteasa por
cualquier técnica, usando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier ADN
polimerasa y ligasa según se considere apropiado.
Preferiblemente, el dopaje se realiza usando
"dopaje aleatorio constante", en el cual se define previamente
el porcentaje de mutación y el tipo salvaje en cada posición.
Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la
introducción de nucleótidos determinados, y así una preferencia para
la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos.
El dopaje puede realizarse, por ejemplo, para permitir la
introducción de 90% de tipo salvaje y 10% de mutaciones en cada
posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema
de dopaje se basa en limitaciones estructurales de proteínas y
genéticas.
La mutagénesis aleatoria puede ser localizada
ventajosamente en una parte de la proteasa progenitora en cuestión.
Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, cuando las regiones
determinadas de la enzima han sido identificadas para ser de
importancia particular para una propiedad determinada de la
enzima.
Los métodos alternativos para conseguir
variantes de la invención incluyen transposición de genes, por
ejemplo, como se describe en WO 95/22625 o en WO 96/00343, y el
proceso de derivación de consenso como se describe en EP 897985
(véase la sección "Proteasa progenitora" para más
detalles).
En formas de realización particulares, la
secuencia de ácidos nucleicos de la invención no es idéntica a: (i)
los nucleótidos 900 1466, o 900-1463, de SEC ID n.º
1, los nucleótidos 499-1062 de SEC ID n.º 3, los
nucleótidos 496-1059 de SEC ID n.º 5, los
nucleótidos 496-1059 de SEC ID n.º 7, y los
nucleótidos 502-1065 de SEC ID n.º 9; (ii) los
nucleótidos 900-1466 de SEC ID n.º 1; (iii) los
nucleótidos 900-1463 de SEC ID n.º 1; (iv) los
nucleótidos 900-1463 de SEC ID n.º 1 como se
describen en DK 1996 00013; (v) los nucleótidos
499-1062 de SEC ID n.º 3 (vi) los nucleótidos
496-1059 de SEC ID n.º 5; (vii) los nucleótidos
496-1059 de la SEC ID n.º 7; (viii) los nucleótidos
502-1065 de SEC ID n.º 9; (xi) la secuencia de
ácidos nucleicos que codifica la parte de péptido maduro de la
proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133;
(x) la secuencia de ácidos nucleicos que tiene SEC ID n.º 1 como se
describe en JP 2003284571-A; (xi) la secuencia de
ácidos nucleicos GENESEQN n.º ADF43563; (xii) la secuencia de
ácidos nucleicos descrita en la solicitud de patente DK n.º 2004
00969 como SEC ID n.º 1, en particular, la parte de codificación de
péptido maduro de la misma; (xiii) la secuencia de ácido nucleico
descrita en la solicitud de patente DK n.º 2004 00969 como SEC ID
nº: 3, en particular, la parte de codificación de péptido maduro de
la misma; (xiv) la secuencia de ácido nucleico descrita en la
solicitud de patente DK n.º 2004 00969 como SEC ID nº: 5, en
particular, la parte de codificación de péptido maduro de la misma;
(xv) la secuencia de ácido nucleico descrita en la solicitud de
patente DK n.º 2004 00969 como SEC ID n.º 7, en particular, la
parte de codificación de péptido maduro de la misma; (xvi) la
secuencia de ácidos nucleicos descrita en la solicitud de patente DK
n.º 2004 00969 como SEC ID n.º 9, en particular, la parte de
codificación de péptido maduro de la misma; (xvii) la secuencia de
ácido nucleico descrita en la solicitud de patente DK n.º 2004
00969 como SEC ID nº: 11, en particular, la parte de codificación
de péptido maduro de la misma; y/o (xviii) secuencias de ácidos
nucleicos que codifican cualquier proteasa de la técnica anterior
de al menos 60% de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID
n.º 2.
Un constructo de ácidos nucleicos comprende una
secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención
operativamente vinculado a una o más secuencias de control que
dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula
huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de
control. Se entenderá que la expresión incluye cualquier paso
relacionado con la producción del polipéptido incluidos, entre
otros, transcripción, modificación postranscripcional, traducción,
modificación postraduccional y secreción.
Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
una variante de proteasa de la invención puede ser expresada usando
un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control
que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma,
señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor
o varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la
secuencia de ADN que codifica una variante de proteasa de la
invención puede ser cualquier vector que pueda convenientemente ser
sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del
vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la cual será
introducido. El vector puede ser uno que, al ser introducido en una
célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se
replique con el/los cromosoma/s en que ha sido integrado.
La variante de proteasa también puede ser
coexpresada junto con al menos otra enzima de interés de pienso
para animales, tal como una alfa-amilasa, una
fitasa, una galactanasa, una xilanasa, una endoglucanasa, una
endo-1,3(4)-beta- glucanasa,
una alfa-galactosidasa y/o una proteasa. Las enzimas
se pueden coexpresar a partir de distintos vectores, de un vector o
usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan vectores
diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables
diferentes, y orígenes de replicación diferentes. Cuando se usa
sólo un vector, los genes se pueden expresar a partir de uno o más
promotores. Si se clona bajo la regulación de un promotor (di o
multicistrónico), el orden en el cual se clonan los genes puede
afectar los niveles de expresión de las proteínas. La variante de
proteasa también puede ser expresada como una proteína de fusión,
es decir, que el gen que codifica la variante de proteasa ha sido
fusionada en marco al gen que codifica otra proteína. Esta proteína
puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos de la invención, lo cual se usa ventajosamente en
la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención
se introduce en una célula huésped de modo que el vector se
mantiene como un integrante cromosómico o como un vector
extracromosómico que se autoduplica. El término "célula
huésped" comprende cualquier progenie de una célula madre que no
es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren
durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran
parte depende del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula huésped puede ser un microorganismo
unicelular, por ejemplo, una procariota, o un microorganismo no
unicelular, por ejemplo, una célula eucariota, tal como una célula
de animal, mamífero, insecto, planta o fúngica. Las células de
animal preferidas son células de animal no humano.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una célula fúngica, o una célula de levadura, tal como
una cálula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia,
Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. La célula huésped
fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa, tal como una
célula de una especie de Acremonium, Aspergillus, Fusarium,
Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia,
Tolypocladium o Trichoderma, entre otras. Son células unicelulares
útiles las células bacterianas tales como bacterias gram positivas
incluidas, entre otras, una célula de Bacillus, por ejemplo,
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans,
Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus
megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y
Bacillus thuringiensis, o una célula de Streptomyces, tal
como Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o
una célula de Nocardiopsis, o células de bacterias de ácido lático;
o bacterias gram negativas tales como E. coli y
Pseudomonas sp. Las bacterias del ácido lático incluyen,
entre otras, especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus y Enterococcus.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir una variante de proteasa de la presente
invención que comprenden (a) cultivo de una célula huésped bajo
condiciones propicias para la producción de la variante de
proteasa; y (b) recuperación de la variante de proteasa.
En los métodos de producción de la presente
invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado
para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en
matraz de agitación, fermentación a gran escala o pequeña escala
(incluyendo fermentaciones por lote alimentado, discontinua,
continua o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o
industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que
permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo se
desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de
nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos
conocidos en la técnica. Se encuentran disponibles medios adecuados
de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones
publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture
Collection). Si la proteasa se segrega en el medio nutritivo, puede
recuperarse directamente del medio. Si no es segregada, puede
recuperarse de lisatos celulares.
La proteasa resultante se puede recuperar por
métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede ser recuperarse
del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos,
entre otros, centrifugado, filtración, extracción, secado por
pulverización, evaporación o precipitación.
Las proteasas de la presente invención pueden
purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la
técnica incluidos, entre otros, cromatografía (p. ej., de
intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y
de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej.,
isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej.,
precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o
extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson
and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).
La presente invención también se refiere a una
planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido
transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido que tiene actividad de la proteasa de la presente
invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades
recuperables. El polipéptido puede recuperarse de la planta o parte
de planta. De manera alternativa, la planta o parte de planta con
el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar
calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorando el valor
nutritivo, la apetencia y las propiedades reológicas, o para
destruir un factor antinutritivo.
En una forma de realización particular, el
polipéptido es dirigido a las vacuolas de almacenamiento de
endospermo en semillas. Este se puede obtener sintetizándolo como un
precursor con un péptido señal adecuado; véase Horvath et al
en PNAS, 15 de feb. de 2000, vol. 97, n.º 4, pág.
1914-1919.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea o
monocotiledónea o variantes de las mismas creadas genéticamente.
Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de
prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como Festuca,
Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo,
trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, triticale (híbrido
estabilizado de trigo (Triticum) y centeno (Secale) y mazorca
(maíz). Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas,
tales como girasol (helianto), algodón (Gossipium), altramuces,
patata, remolacha azucarera, guisante, moldura y semilla de soja y
plantas de crucífero (familia Brassicaceae), tal como coliflor,
semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado, la
Arabidopsis thaliana. Las plantas de bajo fitato según se
describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 5.689.054 y
la patente estadounidense n.º 6.111.168, son ejemplos de plantas
creadas genéticemnte.
Ejemplos de plantas de dicotiledóneas son
tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha
azucarera, guisante, moldura y semilla de soja, y plantas crucíferas
(familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza y el
organismo modelo estrechamente relacionado, la Arabidopsis
thaliana. Las plantas de bajo fitato según se describe, por
ejemplo, en la patente estadounidense n.º 5.689.054 y la patente
estadounidense n.º 6.111.168, son ejemplos de plantas creadas
genéticemnte. Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas,
raíz, frutas, semilla y tubérculos, al igual que los tejidos
individuales que compren estas partes, por ejemplo epidermis,
mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los
compartimentos de célula vegetal específicos, tales como
cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y
citoplasma también se consideran parte de la planta. Además,
cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido,
se considera una parte de la planta. Asimismo, las partes de la
planta tales como tejidos específicos y células aisladas para
facilitar la utilización de la invención también se consideran
partes de la planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona
y revestimientos de semilla.
También se incluye dentro del campo de la
presente invención la progenie de tales plantas, partes de la
planta y células vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal que
expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir
conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o
célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de
expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en
el genoma huésped de la planta y propagando la planta o célula
vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal
transgénica.
Convenientemente, el constructo de expresión es
un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente
invención operativamente enlazado con secuencias reguladoras
apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos
nucleicos en la planta o parte de la planta de elección. Además, el
constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable
útil para identificar células huéspedes en la cuales se ha integrado
el constructo de expresión y las secuencias de ADN necesarias para
la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto último
depende del método de introducción de ADN que se debe
utilizar).
La elección de secuencias reguladoras, tales
como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente
secuencias de tránsito o señal se determina, por ejemplo, basándose
en cuándo, dónde y cómo desea expresarse el polipéptido. Por
ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la
presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser
desarrollable, específica de fase o tejido, y el producto genético
puede ser dirigido a un tejido o parte de planta específica tal como
semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son descritas, por
ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86:
506.
Para la expresión constitutiva, pueden
utilizarse los siguientes promotores: el promotor
35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21:
285-294), la ubiquitina de maíz 1 (Christensen AH,
Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure,
thermal perturbation of expression and transcript splicing, and
promoter activity following transfer to protoplasts by
electroporation), o el promotor de la actina 1 de arroz (Plant Mo.
Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. and Wu R
1991, Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice
plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Promotores
específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de
tejidos sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos
de patata y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet.
24: 275-303), de tejidos sumidero metabólicos tales
como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:
863-878), un promotor específico de semilla tal como
el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del
arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:
885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina
B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad
et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152:
708-711), un promotor de una proteína estructural de
aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell
Physiology 39: 935-941), el promotor napA de una
proteína de almacenamiento de Brassica napus, u otro
promotor cualquiera específico de semillas conocido en la técnica,
p. ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede
ser un promotor específico de la hoja, tal como el promotor de rbcs
de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology
102: 991-1000, the chlorella virus adenine
methyltransferase gene promoter (Mitra and Higgins, 1994, Plant
Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor aldP
del gen del arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General
Genetics 248: 668-674), un promotor inducible por
herida tal como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993,
Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el
promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como
temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducibles por
sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por
ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de planta como etileno, ácido
abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados.
Un elemento intensificador del promotor también
puede usarse para conseguir una expresión más alta de la enzima en
la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor
puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia
de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención.
Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, revelan el uso
del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la
expresión.
Aun más, el uso de codón se puede optimizar para
las especies de planta en cuestión para mejorar la expresión (véase
Horvat et al mencionado anteriormente).
El gen de marcador seleccionable y cualquier
otra parte del constructo de expresión se puede elegir a partir de
los disponibles en la técnica.
El constructo de ácidos nucleicos se incorpora
en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas
en la técnica, incluidas transformación mediada por Agrobacterium,
transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de
partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser
et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990,
Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:
274).
Actualmente, la transferencia de genes mediada
por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para
generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase
Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19:
15-38), y también puede utilizarse para la
transfomación de monocotiledóneas, aunque generalmente se prefieren
otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el
método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas,
complementando el enfoque del Agrobacterium, es el bombardeo de
partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno revestido
con ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en
desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2:
275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion
Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al.,
1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método
alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en
la transformación de protoplasto como describen Omirulleh et
al., 1993, Plant Molecular Biology 21:
415-428.
Después de la transformación, se seleccionan los
transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión y
se regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la
técnica.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención que
comprende (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal
que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
variante de proteasa de la presente invención bajo condiciones
propicias para la producción de la variante de proteasa; y (b)
recuperar la variante de proteasa.
La presente invención también se refiere a un
animal transgénico no humano y productos o elementos de los mismos,
ejemplos de los cuales son fluidos biológicos tales como leche y
sangre, órganos, carne y células animales. Las técnicas para
expresar proteínas, por ejemplo en células mamíferas, se conocen en
la técnica; véase por ejemplo el manual Protein Expression: A
Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University
Press (1999) y los otros tres manuales en esta serie acerca de la
transcripción de genes, la maduración del ARN y el tratamiento
postraduccional. En términos generales, para preparar un animal
transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado se
transforman con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
variante de proteasa de la presente invención para expresar y
producir la variante de proteasa. La variante de proteasa puede ser
recuperada del animal, por ejemplo, de la leche de animales hembra,
o puede expresarse para beneficio del animal mismo, por ejemplo,
para ayudar a la digestión del animal. A continuación se mencionan
ejemplos de animales en la sección titulada Pienso para animales y
aditivos para pienso.
Para producir un animal transgénico con el
propósito de recuperar la variante de proteasa de la leche del
animal, se puede insertar un gen que codifica la variante de
proteasa en los ovarios fertilizados de un animal en cuestión, por
ejemplo, usando un vector de expresión de transgenes que comprende
un promotor de proteínas de la leche adecuado y el gen que codifica
la variante de proteasa. El vector de expresión de transgenes se
microinyecta en ovarios fertilizados y, preferiblemente, se integra
permanentemente en el cromosoma. Una vez que el ovario comienza a
crecer y dividirse, el embrión potencial se implanta en una madre
sustituta y se identifica a los animales que llevan el transgen. El
animal resultante puede después ser multiplicado por reproducción
convencional. La variante de proteasa puede purificarse de la leche
del animal; véase, por ejemplo, Meade, H.M. et al (1999):
Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic
animals, Gene expression systems: Using nature for the art of
expression. J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler (eds.), Academic
Press.
En la alternativa, para producir un animal no
humano transgénico que lleva en el genoma de sus células somáticas
y/o germinales una secuencia de ácidos nucleicos incluido un
constructo de transgen heterólogo que incluye un transgen que
codifica la variante de proteasa, el transgen puede ser
operativamente vinculado a una primera secuencia reguladora para la
expresión específica de la glándula salival de la variante de
proteasa, como se describe en WO 2000064247.
Para los objetivos presentes, el término animal
incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. En una
forma de realización particular, las variantes de proteasa y las
composiciones de la invención se pueden usar como un aditivo de
pienso para animales no humanos. Ejemplos de animales son no
rumiantes y rumiantes, tales como oveja, cabras, caballos y ganado,
por ejemplo, ganado bovino para carne, vacas y terneros jóvenes. En
una forma de realización particular, el animal es un animal no
rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales
monogástricos, por ejemplo, cerdos o puercos (incluidos, entre
otros, lechones, cerdos en crecimiento y puercas); aves tales como
pavos, patos y pollo (incluidos, entre otros, pollos para asar,
ponedoras); terneros jóvenes; y peces (incluidos, entre otros,
salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustáceos (incluidos,
entre otros, gambas y cigalas).
El término pienso o composición de pienso
significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición
destinada o adecuada para la ingestión por parte de un animal. El
pienso se puede administrar al animal antes, después, o
simultáneamente con la dieta. Se prefiere la última opción.
La composición de la invención, cuando está
destinada a la adición al pienso para animales, se puede designar
un aditivo para pienso. Tal aditivo siempre comprende la variante de
proteasa en cuestión, preferiblemente, en forma de líquido
estabilizado o composiciones secas. El aditivo puede comprender
otros componentes o ingredientes de pienso para animales. Las
denominadas premezclas para pienso para animales son ejemplos
particulares de tales aditivos para pienso. Las premezclas pueden
contener la/s enzima/s en cuestión, y en adición al menos una
vitamina y/o al menos un mineral.
Por consiguiente, en una forma de realización
particular, además de los polipéptidos componentes, la composición
de la invención puede comprender o contener al menos una vitamina
liposoluble y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un
oligoelemento. También puede incluirse al menos un macromineral.
Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina
A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo, vitamina
K3.
Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina
B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6,
niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo,
Ca-D-pantotenato.
Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc,
hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto.
Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y
sodio.
Además, ingredientes aditivos para pienso
opcionales son los agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides
tales como betacaroteno, astaxantina, y luteína; compuestos de
aroma; estabilizadores; ácidos grasos poliinsaturados; especies
generadoras de oxígeno reactivo; péptidos antimicrobianos y/o al
menos una enzima adicional.
Componentes enzimáticos adicionales de la
invención incluyen, por lo menos, un polipéptido que tiene amilasa,
preferiblemente actividad de alfa-amilasa, y/o al
menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa; y/o al menos
un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa; y/o al menos un
polipéptido que tiene actividad de
endo-1,3(4)-beta-glucanasa;
y/o al menos un polipéptido que tiene actividad de fitasa; y/o al
menos un polipéptido que tiene actividad de galactanasa; y/o al
menos un polipéptido que tiene actividad de
alfa-galactosidasa; y/o como mínimo otro
polipéptido que tiene actividad de la proteasa (EC 3,4.-.-); y/o al
menos un polipéptido que tiene actividad de fosfolipasa A1 (EC
3,1,1,32), fosfolipasa A2 (EC 3,1,1,4), lisofosfolipasa (EC
3.1.1.5), fosfolipasa C (EC 3.1.4.3) y/o fosfolipasa D (EC
3.1.4.4).
La actividad de alfa-amilasa
puede ser medida como se conoce en la técnica, por ejemplo, usando
un sustrato basado en almidón.
La actividad de xilanasa puede medirse usando
cualquier ensayo, en el cual se emplee un sustrato, que incluye
endoenlaces
1,4-beta-D-xilosídicos
en xilanos. Están disponibles diferentes tipos de sustratos para la
determinación de la actividad de xilanasa, por ejemplo, comprimidos
de arabinoxilano de Xylazyme reticulados (de MegaZyme), o
dispersiones de polvo insolubles y soluciones de arabinoxilano
coloreado con azo.
La actividad de endoglucanasa puede determinarse
usando cualquier ensayo de endoglucanasa conocido en la técnica.
Por ejemplo, pueden aplicarse diferentes sustratos con betaglucano o
de celulosa. Un ensayo de endoglucanasa puede usar
beta-glucano de AZCL-cebada o,
preferiblemente (1)
AZCL-HE-celulosa, o (2)
Azo-CM-celulosa como un sustrato.
En ambos casos, la degradación del sustrato es seguida
espectrofotométricamente a OD_{595} (véase el método Megazyme
para AZCL-polisacáridos para el ensayo de
endohidrolasas en http://www.megazyme.com/booklets/
AZCLPOL.pdf.
AZCLPOL.pdf.
La actividad de
endo-1,3(4)-beta-glucanasa
puede determinarse usando cualquier ensayo de
endo-1,3(4)-beta-glucanasa
conocido la técnica. Un sustrato preferido para las mediciones de
actividad de
endo-1,3(4)-beta-glucanasa
es un sustrato de cebada de betaglucano reticulado
azo-coloreado, donde las mediciones se basan en
principios de determinación espectrofotométricos.
La actividad de la fitasa puede medirse usando
cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, el ensayo FYT descrito en
el ejemplo 4 de WO 98/28408.
La galactanasa se puede evaluar, por ejemplo,
con galactano de AZCL de Megazyme, y alfagalactosidasa se puede
evaluar, por ejemplo, con
pNP-alfa-galactósido.
Para evaluar estas actividades enzimáticas,
deben adaptarse el pH y la temperatura del ensayo a la enzima en
cuestión (preferiblemente, un pH cercano al pH óptimo y una
temperatura cercana a la temperatura óptima). Un pH de ensayo
preferido está en la gama de 2-10, preferiblemente
3-9, más preferiblemente pH 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8,
por ejemplo, pH 3 o pH 7. Una temperatura de ensayo preferida está
en la gama de 20-90ºC, preferiblemente
30-90ºC, más preferiblemente
40-80ºC, incluso más preferiblemente
40-70ºC, preferiblemente 40 o 45 o 50ºC. La
actividad enzimática se define por referencia a ciegos apropiados,
por ejemplo, un tampón ciego.
Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP) son
CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina1, tanatina, defensina,
lactoferrina, lactoferricina y ovispirina tal como novispirina
(Robert Lehren, 2000), plectasinas y estatinas, incluidos los
compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148,
al igual que variantes o fragmentos de los anteriores que retienen
actividad antimicrobiana.
Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (AFP)
son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus
niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismos que
retienen actividad antifúngica, según se describen en WO 94/01459 y
WO 02/090384.
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son
ácidos grasos poliinsaturado C18; C20 y C22, tales como ácido
araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido
gamma-linolénico.
Ejemplos de especies generadoras de oxígeno
reactivo son los productos químicos tales como perborato,
persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una
oxigenasa o una sintetasa.
Usualmente, las vitaminas liposolubles e
hidrosolubles, al igual que los oligoelementos, forman parte de una
denominada premezcla destinada a la adición al pienso, mientras que
los macrominerales normalmente se adicionan de manera separada al
pienso. Una premezcla enriquecida con una proteasa de la invención
es un ejemplo de un aditivo de pienso de la invención.
En una forma de realización particular, el
aditivo de pienso de la invención está destinado a ser incluido (o
se prescribe que tiene que ser incluido) en pienso o dietas para
animales a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a
5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g de pienso).
Esto es así en particular para premezclas.
Los requisitos nutritivos de estos componentes
(ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se presentan en la
tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos
componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las
concentraciones indicadas.
En la alternativa, el aditivo de pienso de la
invención comprende al menos uno de los componentes individuales
especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa
uno o más de uno, o dos, o tres, o cuatro, etcétera hasta trece, o
hasta quince componentes individuales. Más específicamente, este al
menos un componente individual se incluye en el aditivo de la
invención en cantidad tal como para proporcionar una concentración
en pienso en la gama indicada en la columna cuatro, o la columna
cinco, o la columna seis de la tabla A.
La presente invención también se refiere a
composiciones de pienso para animales. Las composiciones de pienso
o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de
proteína. Las dietas de ave y cerdo se pueden caracterizar según se
indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3.
Las dietas de peces se pueden caracterizar según se indica en la
columna 4 de esta tabla B. Además, tales dietas de peces normalmente
tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.
WO 01/58275 corresponde a US 09/779334 que se incorpora a la
presente a modo de referencia.
Una composición de pienso para animales según la
invención tiene un contenido de proteína bruta de
50-800 g/kg, y, además, comprende al menos una
variante de proteasa como se reivindica aquí.
Además, o en la alternativa (al contenido bruto
de proteína indicado más arriba), la composición de pienso para
animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable
de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de
0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible
de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de
0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más
cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina
de 0,5-50 g/kg.
En formas de realización particulares, el
contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio,
fósforo, metionina, metionina más cisteína y/o lisina está dentro de
cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la tabla B de WO 01/58275
(R. 2-5).
La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N)
multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína cruda (g/kg)= N
(g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método
Kjeldahl (Official Methods of Analysis 14th ed., Association of
Official Analytical Chemists, Washington DC).
La energía metabolizable puede calcularse
basándose en la publicación de NRC Nutrient requirements in swine,
novena edición corregida 1988, subcomisión para la nutrición de
puercos, comité sobre nutrición animal, junta de agricultura,
consejo de investigación nacional. National Academy Press,
Washington, D.C., pág. 2-6, y la tabla europea de
valores de energía para ingredientes de pienso de ave, centro
Spelderholt para investigación y extensión de aves, 7361 DA
Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv,
Wageningen. ISBN
90-71463-12-5.
El contenido dietético de calcio, fósforo y
aminoácidos disponibles en dietas para animales completas es
calculado basándose en tablas de pienso tales como Veevoedertabel
1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en
voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg
6, 8219 pk Lelystad. ISBN
90-72839-13-7.
En una forma de realización particular, la
composición de pienso para animales de la invención contiene al
menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tal
como harina de carne y hueso, y/o harina de pescado; o, en una
forma de realización particular, puede ser una proteína vegetal. El
término proteínas vegetales según se utilizan en este caso se
refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla
que incluye, al menos, una proteína derivada de u originada en un
vegetal, incluidas las proteínas modificadas y derivados de
proteína. En formas de realización particulares, el
\hbox{contenido de proteína de las proteínas vegetales es al
menos 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p).}
Las proteínas vegetales se pueden derivar de
fuentes de proteína vegetal, tal como leguminosas y cereales, por
ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae
(Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tal como
harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.
En una forma de realización particular, la
fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la
familia Fabaceae, por ejemplo, la semilla de soja, altramuz,
guisante o judía.
En otra forma de realización particular, la
fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la
familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera,
espinaca o quinoa.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal
son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y
repollo.
La semilla de soja es una fuente de proteína
vegetal preferida.
Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal
son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz
(mazorca), arroz, triticale y sorgo.
En otras formas de realización particulares, la
composición de pienso para animales de la invención contiene
0-80% maíz; y/o 0-80% sorgo; y/o
0-70% trigo; y/o 0-70% cebada; y/o
0-30% avena; y/o 0-40% harina de
soja; y/o 0-25%, preferiblemente
0-10%, harina de pescado; 0-25%
harina de carne y hueso; y/o 0-20% lactosuero.
Las dietas para animales pueden, por ejemplo,
ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso
granulado. Típicamente, los ingredientes de pienso molidos y
cantidades suficientes y de vitaminas y minerales esenciales se
mezclan y se agregan según las especificaciones para las especies en
cuestión. Las enzimas se pueden adicionar como formulaciones de
enzima sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de enzima
sólida típicamente es adicionada antes o durante el paso de mezcla;
y una preparación enzimática líquida típicamente es adicionada
después del paso de granulación. La enzima también puede ser
incorporada en un aditivo o premezcla de pienso.
La concentración de enzima final en la dieta
está en la gama de 0,01-200 mg de proteína
enzimática por kg de dieta, por ejemplo, en la gama de
0,5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta
animal.
La variante de proteasa debería, por supuesto,
ser aplicada en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad
adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor
nutritivo de pienso. Actualmente se contempla que la enzima se
administre en una o más de las siguientes cantidades (gamas de
dosificación): 0,01-200, 0,01-100,
0,5-100, 1-50,
5-100, 10-100,
0,05-50 o 0,10-10. Todas estas gamas
son en mg de proteína de enzima proteásica por kg (ppm) de
pienso.
Para determinar los mg de proteína enzimática
por kg de pienso, la proteasa se purifica de la composición de
pienso, y la actividad específica de la proteasa purificada es
determinada usando un ensayo pertinente (véase debajo de actividad
de la proteasa, sustratos y ensayos). La actividad de la proteasa de
la composición de pienso como tal también es determinada usando el
mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula
la dosificación en mg de proteína enzimática por kg de pienso.
Los mismos principios se aplican para determinan
los mg de proteína enzimática en aditivos de pienso. Por supuesto,
si se encuentra disponible una muestra de la proteasa usada para
preparar el aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica
se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la
proteasa de la composición de pienso ni el aditivo).
La variante de proteasa de la invención se puede
adicionar a, y así convertirse en, un componente de una composición
de detergente.
La composición de detergente de la invención
puede, por ejemplo, ser formulada como una composición de
detergente a mano o a máquina de lavandería incluida una composición
de aditivo de lavandería adecuada para pretratamiento de tejidos
manchados y una composición de suavizante adicionado de enjuague, o
ser formulado como una composición de detergente para el uso en
operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general,
o ser formulado para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a
máquina.
En un aspecto específico, la invención
proporciona un aditivo de detergente que comprende la variante de
proteasa de la invención. El aditivo de detergente, al igual que la
composición de detergente, puede comprender una o más enzimas
adicionales tal como otra proteasa, tal como proteasas alcalinas de
Bacillus, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa,
una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una
galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o
una peroxidasa.
En general, las propiedades de la/s enzima/s
elegidas debería ser compatible con el detergente seleccionado, (es
decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes no
enzimáticos y enzimáticos, etc.), y la/s enzima/s deberían estar
presentes en cantidades eficaces.
Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de
origen fúngico o bacteriano. Los mutantes químicamente modificados
o creados genéticamente de proteína están incluidos. Ejemplos de
lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces),
por ejemplo de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) como se
describe en EP 258068 y EP 305216 o de H. insolens como se
describe en WO 96/13580, una lipasa de pseudomonas, por ejemplo de
P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272),
P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034),
P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y
WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de
Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al.
(1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131,
253-360), B. stearothermophilus (JP
64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son
variantes de lipasa tales como las descritas en WO 92/05249, WO
94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO
95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO
97/07202. Las enzimas de lipasa preferidas disponibles
comercialmente incluyen LipolaseTM y Lipolase UltraTM (Novozymes
A/S).
Las amilasas adecuadas (beta y/o alfa) incluyen
aquellas de origen fúngico o bacteriano. Los mutantes químicamente
modificados o creados genéticamente de proteína están incluidos. Las
amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas
obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B.
licheniformis, descrita en más detalle en GB 1.296.839.
Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO
94/02597, WO 94/18314, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 97/43424, WO
00/60060 y WO 01/66712, especialmente, las variantes con
sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23,
105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208,
209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Ailasas disponibles
comercialmente son Natalase^{TM}, Supramyl^{TM},
Stainzyme^{TM}, Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y
BAN^{TM} (Novozymes A/S), Rapidase^{TM} y Purastar^{TM} (de
Genencor International Inc.).
Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de
origen fúngico o bacteriano. Los mutantes químicamente modificados
o creados genéticamente de proteína están incluidos. Las celulasas
adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas,
Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las
celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens,
Myceliophthora thermonhila y Fusarium oxysporum descritos
en US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 y WO
89/09259. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas
neutras o alcalinas que tienen beneficios de cuidados del color.
Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0
495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros
ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WO
94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254,
WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 99/01544. Ls celulasas disponibles
comercialmente incluyen CelluzymeTM y CarezimeTM (Novozymes A/S),
ClazinaseTM y Puradax HATM (Genencor International Inc.), y
KAC-500(B)TM (Kao Corporation).
Peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas
origen fúngico, bacteriano o de planta. Los mutantes químicamente
modificados o creados genéticamente de proteína están incluidos.
Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus,
por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de las mismas como
las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.
Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen GuardzymeTM
(Novozymes).
La/s enzima/s detergente/s se puede/n incluir en
una composición de detergente añadiendo aditivos separados que
contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que
comprenda todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la
invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, se
puede formular, por ejemplo, como un granulado, un líquido, un
compuesto acuoso, etc. Las formulaciones de aditivo de detergente
preferidas son granulados, en particular, granulados no
polvorientos, líquidos, en particular, líquidos estabilizados o
mezclas.
Los granulados no polvorientos pueden
producirse, por ejemplo, como se describe en US 4.106.991 y
4.661.452 y opcionalmente pueden ser revestidos por métodos
conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento
cerosos son productos de poli(etileno óxido)
(polietilenglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000,
nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de
etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol
contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15 a 80
unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y
mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales
de recubrimiento que forman películas adecuados para la aplicación
por técnicas de lecho fluidificado se dan en GB 1483591. Las
preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser
estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un
azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según
métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar
según el método descrito en EP 238216.
La composición de detergente de la invención
puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra,
una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un
detergente líquido puede ser acuoso, y típicamente contiene hasta
70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no
acuoso.
La composición de detergente comprende uno o más
tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluidos zwitteriónico
y/o catiónico y/o aniónico y/o semipolar. Los tensioactivos
típicamente están presentes a un nivel de 0,1% a 60% en peso.
Cuando está incluido, el detergente normalmente
contiene de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un
tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal,
alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de
alcohol graso), alcohol etoxisulfato, alcanosulfonato secundario,
éster metílico de ácido graso alfa-sulfo, ácido
alquenilsuccínico o de alquilo o jabón.
Cuando está incluido, el detergente normalmente
contiene de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de un
tensioactivo no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol,
etoxilato alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina,
monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido
graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados
N-acilo N-alquilo de glucosamina
("glucamidas").
El detergente puede contener
0-65% de un constructor de detergente o agente
complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato,
carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido
etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético,
ácido alquenilsuccínico o de alquilo, silicatos solubles o silicatos
estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más
polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa,
poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), alcohol
polivinílico, poli(vinilpiridina-N-óxido),
poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como
poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros
de lauril metacrilato/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema
blanqueante que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal
como perborato o percarbonato que se puede combinar con un
activador blanqueante de formación de perácido tal como
tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato.
Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender
peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida o sulfona.
La/s enzima/s de la composición de detergente de
la invención puede/n ser estabilizada/s usando agentes
estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como
propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido
láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo,
un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico
tal como ácido 4-formilfenil borónico y la
composición se puede formular como se describe en, por ejemplo, WO
92/19709 y WO 92/19708.
El detergente también puede contener otros
ingredientes de detergentes convencionales tales como, por ejemplo,
acondicionadores de tejido incluidas arcillas, reforzadores de
espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de
supensión de suciedad, agentes de reposición antisuciedad, tintes,
bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de
decoloración o perfumes.
Se contempla actualmente que en las
composiciones detergentes cualquier enzima, en particular la enzima
de la invención, se pueda adicionar en una cantidad correspondiente
a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de
solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de
proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular
0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de
solución de lavado.
La enzima de la invención puede adicionalmente
ser incorporada en las formulaciones de detergente descritas en WO
97/07202.
La invención también se refiere a un método para
generar una variante de proteasa de una propiedad mejorada. El
método comprende los siguientes pasos:
(a) seleccionar una proteasa progenitora de al
menos 60% de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º
2;
(b) establecer una estructura tridimensional de
la proteasa progenitora por modelado por homología usando la
estructura de la figura 2 como un modelo; y/o alineando la proteasa
progenitora según la alineación de la figura
1;
1;
(c) proponiendo al menos una sustitución de
aminoácido, por ejemplo:
- (i)
- sometiendo la estructura tridimensional de (b) a simulaciones de DM a temperaturas aumentadas e identificando regiones en la secuencia de aminoácidos de la proteasa progenitora de alta movilidad (fluctuaciones isotrópicas);
- (ii)
- introduciendo puentes disulfuros a modo de sustituciones de cisteína (C-C);
- (iii)
- introduciendo sustituciones de prolina (P);
- (iv)
- sustituyendo residuos de aminoácidos neutros expuestos con residuos de aminoácidos cargados negativamente (E,D);
- (v)
- sustituyendo residuos de aminoácidos neutros expuestos con residuos de aminoácidos cargados positivamente (R,K);
- (vi)
- sustituyendo residuos de aminoácidos pequeños dentro de la proteína con residuos de aminoácidos más voluminosos (W);
- (vii)
- comparando por alineación por homología y/o modelado por homología según el paso (c)(i) al menos dos proteasas progenitoras relacionadas y transfiriendo las diferencias de residuo de aminoácido entre estas estructuras de proteasa, preferiblemente, de una estructura que tenga la propiedad mejorada a una estructura que no tenga esta propiedad mejorada;
(d) preparando una secuencia de ADN que codifica
la proteasa progenitora excepto la inclusión de un codón de ADN de
al menos una sustitución de aminoácido propuesta en los pasos
(c)(ii)-(c)(vii), o sometiendo a la secuencia de ADN progenitora a
mutagénesis aleatoria, dirigiendo al menos a una de las regiones
identificadas en el paso
(c)(i);
(c)(i);
(e) expresando la secuencia de ADN obtenida en
el paso (d) en una célula huésped, y
(h) seleccionando una célula huésped que exprese
una variante de proteasa con una propiedad mejorada.
La invención además se refiere a un método para
la producción de una variante de proteasa obtenible u obtenida por
el método de generación de variantes de proteasa anteriormente
descrito, que comprende (a) cultivar la célula huésped para
producir un sobrenadante que comprenda la variante; y (b) recuperar
la variante.
La invención también se refiere a secuencias de
ácidos nucleicos aisladas que comprenden una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la variante de proteasa obtenible según este
método, al igual que métodos para producirla (a) cultivando la
célula huésped para producir un sobrenadante que comprenda la
variante; y (b) recuperando la variante; una planta transgénica, o
parte de planta, capaz de expresarla, animales transgénicos no
humanos, o productos, o elementos de los mismos, capaces de
expresarla; piensos para animales, al igual que aditivos para
pienso, que la comprendan; métodos para mejorar el valor nutritivo
de un pienso para animales por uso de la misma; métodos para el
tratamiento de proteínas, tales como proteínas vegetales, por uso de
la misma; así como el uso de la misma (i) en pienso para animales;
(ii) en la preparación de pienso para animales; (iii) para mejorar
el valor nutritivo de pienso para animales; y/o (iv) para el
tratamiento de proteínas; y/o en detergentes.
En una forma de realización alternativa, se usa
el término "alteración" en vez de "sustitución" como el
término general para enmiendas en la molécula de proteasa. Esta
forma de realización alternativa incluye cada una de las
reivindicaciones formuladas como se ejemplifica a continuación para
la reivindicación 1, y también específicamente incluye todo lo que
se expresa en la presente, por ejemplo, las definiciones (aparte de
la definición de sustitución), es decir, los diferentes aspectos,
formas de realización particulares, etc.
Una variante de una proteasa progenitora, que
comprende una alteración en al menos una posición de al menos una
región seleccionada del grupo de regiones que consisten en:
6-18; 22-28;
32-39; 42-58; 62-63;
66-76; 78-100;
103-106; 111-114;
118-131; 134-136;
139-141; 144-151;
155-156; 160-176;
179-181; y 184-188; donde
(a) la o las alteraciones son
independientemente
- (i)
- una inserción de un aminoácido inmediatamente debajo de la posición,
- (ii)
- una deleción del aminoácido que ocupa la posición, y/o
- (iii)
- una sustitución del aminoácido que ocupa la posición;
(b) la variante tiene actividad de la proteasa;
y
(c) cada posición corresponde a una posición de
SEC ID n.º 2, preferiblemente, los aminoácidos 1 a 188 de las
mismas; y
(d) la variante tiene un porcentaje de identidad
con SEC ID n.º 2, preferiblemente con los aminoácidos 1 a 188 de la
misma, de al menos 60%.
El término, "variante de polipéptido",
"variante de proteína", "variante de enzima" "variante
de proteasa" o simplemente "variante" se refiere a un
polipéptido de la invención que comprende una o más alteraciones,
tales como sustitución(es), inserción(es),
deleción(es) y/o truncamientos de uno o más residuos de
aminoácido específico en una o más posiciones específicas en el
polipéptido.
El término, "polipéptido progenitor",
"proteína progenitora", "enzima progenitora", "enzima
estándar", "proteasa progenitora" o simplemente
"progenitor/a" se refiere al polipéptido sobre el que se basó
la variante. Este término también se refiere al polipéptido con el
cual se compara y se alinea una variante.
El término, "biblioteca aleatorizada",
"biblioteca variante", o simplemente "biblioteca" se
refiere a una biblioteca de polipéptidos variantes. La diversidad
en la biblioteca variante puede generarse por medio de mutagénesis
de los genes que codifican las variantes en el nivel de tripletes de
ADN, de manera que los codones individuales se diversifiquen, por
ejemplo, usando cebadores de secuencia parcialmente aleatorizados
en una reacción de PCR. Se han descrito diferentes técnicas mediante
las cuales se puede crear una biblioteca combinatoria diversa
diversificando diferentes posiciones de nucleótido en un gen y
recombinándolos, por ejemplo donde estas posiciones están demasiado
separadas para ser cubiertas por un único cebador oligonucleótido
(dopado o adicionado). Estas técnicas incluyen el uso de
recombinación in vivo de los segmentos de gen individuales
diversificados como se describe en WO 97/07205 en la página 3,
líneas 8 a 29 (Novozymes A/S). También incluyen el uso de técnicas
de redistribución de ADN para crear una librería de genes de
longitud total, donde se combinan diferentes segmentos de gen, y
donde cada segmento se puede diversificar, por ejemplo, por
mutagénesis adicionada, (Stemmer, Nature 370, pág.
389-391, 1994 y US 5.811.238; US 5.605.793; y US
5.830.721). Se puede usar un gen que codifica una "estructura"
de proteína (polipéptido progenitor de tipo salvaje) como un
polinucleótido modelo, y combinarlo con uno o más oligonucleótidos
monocatenarios o bicatenarios como se describe en WO 98/41623 y en
WO 98/41622 (Novozymes A/S). Los oligonucleótidos monocatenarios
podrían ser parcialmente aleatorizados durante la síntesis. Los
oligonucleótidos bicatenarios podrían ser productos de PCR que
incorporan diversidad en una zona específica. En ambos casos, se
puede diluir la diversidad con los segmentos correspondientes que
codifican la secuencia de la proteína de esqueleto para limitar el
número medio de cambios que se introducen.
Los métodos también han sido establecidos para
diseñar de las proporciones de mezclas de nucleótido (A; C; T; G)
para ser insertadas en posiciones de codón específicas durante la
síntesis de polinucleótidos o de olgonucleótidos, para introducir
un sesgo para aproximar una distribución de frecuencias deseada
hacia un conjunto de uno o más aminoácidos deseados que serán
codificados por los codones particulares. Puede ser de interés
producir una biblioteca variante que comprenda permutaciones de
varias modificaciones de aminoácido conocidas en diferentes lugares
en la secuencia primaria del polipéptido. Éstas podrían introducirse
post traduccionalmente o por sitios de modificación químicos, o
podrían introducirse a través de mutaciones en los genes de
codificación. Las modificaciones solas pueden deben haber demostrado
ser provechosas previamente por una razón u otra (p. ej.
disminución de la antigenicidad, o mejora de la actividad
específica, el rendimiento, la estabilidad u otras
características). En tales ejemplos, puede ser conveniente primero
crear una biblioteca de combinaciones diversas de secuencias
conocidas. Por ejemplo, si doce mutaciones individuales son
conocidas, una podría combinar (como mínimo) doce segmentos del gen
codificante de la proteína progenitora, donde cada segmento está
presente en dos formas: una con, y una sin, la mutación deseada. Al
variar las cantidades relativas de esos segmentos, podría diseñarse
una biblioteca (de tamaño 212) para la cual el número medio de
mutaciones por gen puede ser predicho. Esta puede ser una manera
útil de combinar mutaciones, que en sí mismas dan algún efecto,
pero no suficiente, sin recurrir a bibliotecas muy grandes, como es
frecuentemente el caso cuando se usa "mutagénesis adicionada".
Otro modo de combinar estas "mutaciones conocidas" podría ser
usando redistribución de familias de ADN oligomérico que codifican
las mutaciones conocidas con fragmentos de la secuencia de tipo
salvaje de longitud total.
Al describir las diferentes variantes
contempladas o producidas según la invención, se utilizan varias
nomeclaturas y convenios que están descritos en detalle más abajo.
Un marco de referencia se define primero alineando el polipéptido
variante con una enzima progenitora. Una enzima progenitora
preferida es la proteasa 10 (aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2).
De ese modo, varias alteraciones serán definidas en relación a la
secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º
2.
Una sustitución en una variante es indicada
como:
- Aminoácido original - posición - aminoácido sustituido;
Se utilizan los códigos de tres o una letra,
incluidos los códigos Xaa y X para indicar cualquier residuo de
aminoácido. Por consiguiente, la notación "T82S" o
"Thr82Ser" significa que la variante comprende una sustitución
de treonina con serina en la posición de aminoácido variante
correspondiente al aminoácido en la posición 82 en la enzima
progenitora, cuando los dos se alinean como se ha indicado
anteriormente.
Donde el residuo de aminoácido original puede
ser cualquier residuo de aminoácido, una notación rápida puede
usarse a veces indicando sólo la posición y el aminoácido
sustituido, por ejemplo:
- Posición - aminoácido sustinuido; o "82S".
Tal notación es particularmente pertinente en
relación con las modificaciones en una serie de polipéptidos
homólogos.
De forma similar, cuando la identidad del
residuo o los residuos de aminoácido de substitución es
irrelevante:
- Aminoácido original - posición; o "T82"
Cuando el/los aminoácido/s originales y el/los
aminoácido/s sustituidos puede/n ser cualquier aminoácido, sólo se
indica la posición, por ejemplo: "82".
Cuando el/los aminoácido/s originales y/o
aminoácido/s sustituidos pueden comprender más de uno, pero no
todos, los aminoácido/s, los aminoácidos son catalogados separados
por comillas:
- Aminoácidos originales - n.º de posición - aminoácidos sustituidos; o "T10E,D,Y".
A continuación se presentan varios ejemplos de
esta nomenclatura:
La sustitución de treonina para histidina en la
posición 91 es designada: "His91Thr" o "H91T"; o la
sustitución de cualquier ácido de residuo de aminoácido para
histidina en la posición 91 es designada: "His91Xaa" o
"H91X" o "His91" o "H91".
Para una modificación donde el/los aminoácido/s
originales y/o aminoácido/s sustituidos puede comprender más de
uno, pero no todos los aminoácido/s, la sustitución de ácido
glutámico, ácido aspártico o tirosina para treonina en la posición
10:
- "Thr10Glu,Asp,Tyr" o "T10E,D,Y"; que indica las variantes específicas: "T10E", "T10D" y "T10Y".
Una deleción de glicina en la posición 26 estará
indicada por: "Gly26*" o "G26*".
De manera correspondiente, la deleción de uno o
más residuos de aminoácido, tal como la deleción de glicina y
glutamina en las posiciones 26 y 27 será designada
"Gly26*+Gln27*" o "G26*+Q27*".
La inserción de un residuo de aminoácido
adicional tal como, por ejemplo, una lisina después de G26 es
indicada por: "Gly26GlyLys" o "G26GK"; o, cuando más de un
residuo de aminoácido es insertado, tal como, por ejemplo, Lys y
Ala después de G26, esto se indicará como: "Gly26GlyLysAla" o
"G26GKA".
En tales casos, el/los residuo/s de aminoácido
insertado/s se numeran por medio de la adición de letras minúsculas
al número de posición del residuo de aminoácido que precede el/los
residuo/s de aminoácido insertado/s. En el ejemplo anterior, las
secuencias serían entonces:
\vskip1.000000\baselineskip
En casos en los cuales se inserta un residuo de
aminoácido idéntico al residuo de aminoácido existente, es claro
que surge la degeneración en la nomenclatura. Si, por ejemplo, va a
insertarse una glicina después de la glicina en el ejemplo
anterior, esto sería indicado por medio de "G26GG".
Suponiendo que una alanina estuviera presente en
la posición 25, el mismo cambio real bien podría indicarse también
como "A25AG":
Tales ejemplos serán claros para el experto en
la materia, y la indicación "G26GG" y las indicaciones
correspondientes para este tipo de inserciones están de este modo
destinadas a comprender tales indicaciones de degeneración
equivalentes.
Por analogía, si los segmentos de secuencia de
aminoácidos se repiten en el polipéptido progenitor y/o en la
variante, será claro para el experto en la materia que están
comprendidas las indicaciones de degeneración equivalentes, también
cuando otras alteraciones aparte de las inserciones sean catalogadas
tales como deleciones y/o sustituciones. Por ejemplo, la deleción
de dos aminoácidos consecutivos "AG" en la secuencia
"AGAG" de la posición 194-197, puede
escribirse como "A196*+G197*" o "A194*+G1956*":
Las variantes que comprenden modificaciones
múltiples se separan por signos de suma, por ejemplo:
"Arg170Tyr+ Gly195Glu" o "R170Y+G195E", que
representan modificaciones en las posiciones 170 y 195 que
sustituyen tirosina y ácido glutámico para arginina y glicina,
respectivamente. Por tanto,
"Tyr167Gly,Ala,Ser,Thr+Arg170Gly,Ala,Ser,Thr" designa las
siguientes variantes: "Tyr167Gly+Arg170Gly",
"Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Gly+Arg170Ser",
"Tyr167Gly+Arg170Thr", "Tyr167Ala+Arg170Gly", "Tyr167Ala+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Ser", "Tyr167 Ala+Arg170Thr", "Tyr167Ser+Arg170Gly", "Tyr167Ser+Arg 170Ala", "Tyr167Ser+Arg170Ser", "Tyr167Ser+Arg 170Thr", "Tyr167Thr+Arg170Gly", "Tyr167Thr+Arg170Ala", "Tyr167Thr+Arg170Ser" y "Tyr167Thr+Arg 170Thr".
"Tyr167Gly+Arg170Thr", "Tyr167Ala+Arg170Gly", "Tyr167Ala+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Ser", "Tyr167 Ala+Arg170Thr", "Tyr167Ser+Arg170Gly", "Tyr167Ser+Arg 170Ala", "Tyr167Ser+Arg170Ser", "Tyr167Ser+Arg 170Thr", "Tyr167Thr+Arg170Gly", "Tyr167Thr+Arg170Ala", "Tyr167Thr+Arg170Ser" y "Tyr167Thr+Arg 170Thr".
Esta nomenclatura es particularmente pertinente
en relación a modificaciones destinadas a substitución, inserción o
deleción de residuos de aminoácidos que tienen propiedades
específicas comunes. Tales modificaciones se denominan modificación
o modificaciones de aminoácido conservadora/s.
Estas son distintas formas de realización
adicionales de la invención:
La variante de cualquiera de las
reivindicaciones 1-16 y 18-20 que
comprende al menos una de las siguientes sustituciones: T10Y, A24S,
V51T, E53Q, T82S, A86Q, T87S, I96A, G118N, S122R, N130S, L186I.
La variante de cualquiera de las
reivindicaciones 1-16 y 18-19 que
comprende al menos una de las siguientes sustituciones: R38T;
Q42G,P; R49T,Q; Q54N,R; A89S,T; H91S,T; N92S; S99A,Q; A120T; E125Q;
T129Y,Q; M131L; T135N; Y147F; N151S; R165S; T166V,F; F171Y;
V179I,L; preferiblemente, al menos una de las siguientes
sustituciones: R38T; N92S; A120T; E125Q; M131 L; T135N; Y147F;
N151S; R165S y/o F171Y.
La variante de cualquiera de las
reivindicaciones 1-19 que comprende al menos una de
las siguientes sustituciones: A25S, T44S, A62S, P95A, V100I, I114V,
T176N, N180S, V184L, R185T.
La variante de cualquiera de las
reivindicaciones 1-20 que tiene propiedades
enmendadas, tal como una termostabilidad mejorada y/o una
temperatura óptima más alta o más baja, tal como una Tm de al menos
83,1ºC según se mide por calorimetría por análisis diferencial en 10
mM fosfato sódico, 50 mM cloruro sódico, pH 7,0.
La variante de cualquiera de las
reivindicaciones 1-20 que deriva de una cepa del
género Nocardiopsis, tal como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis
antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta,
Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis
halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis,
Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis
metallicus, Nocardiopsis sp., Nocardiopsis synnemataformans,
Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis
umidischolae o Nocardiopsis xinjiangensis,
preferiblemente Nocardiopsis alha DSM 15647, Nocardiopsis
dassonvillei NRRL 18133, Nocardiopsis dassonvillei subsp.
dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis prasina DSM 15648,
Nocardiopsis prasina DSM 15649, Nocardiopsis sp. NRRL
18262, de forma más preferible, Nocardiopsis sp. FERM
P-18676.
Una composición, tal como un aditivo para
pienso, que comprende al menos una variante de proteasa de
cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y
(a) al menos una vitamina liposoluble;
(b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o
(c) al menos un oligoelemento,
que además comprende, opcionalmente, al menos
una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasas,
galactanasas, alfa-galactosidasas, xilanasas,
endoglucanasas,
endo-1,3(4)-beta-glucanases,
fitasas, fosfolipasas y otras proteasas; si se desea, que también
comprenden al menos una amilasa y/o fosfolipasa.
La presente invención es descrita, además, por
los siguientes ejemplos los cuales no deberían interpretarse como
limitadores del ámbito de la invención.
Ejemplo
1
Sustrato de pNA:
Suc-AAPF-pNA (Bachem
L-1400).
Temperatura: Temperatura ambiente (25ºC)
Tampones de ensayo: 100 mM ácido succínico, 100
mM HEPES, 100 mM colinesterasas, 100 mM CABS, 1 mM CaCl_{2}, 150
mM KCl, 0,01% Tritón X-100 ajustado a valores de pH
2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0 y 12,0
con HCl o NaOH.
Se mezclan 20 \mul de proteasa (diluida en
Triton 100-X al 0,01%) con 100 \mul de tampón de
ensayo. El ensayo se comienza añadiendo 100 \mul de sustrato de
pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml DMSO y además diluido 45x con Triton
100-X al 0,01%). El aumento en OD_{405} se
controla como una medida de la actividad de la proteasa.
Sustrato: tableta de Protazyme AK (caseína
reticulada y coloreada; de Megazyme).
Temperatura: controlada (temperatura de
ensayo).
Tampones de ensayo: 100 mM ácido succínico, 100
mM HEPES, 100 mM colinesterasas, 100 mM CABS, 1 mM CaCl_{2}, 150
mM KCI, Triton 100-X al 0,01% ajustados a valores de
pH 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 y 11,0
con HCl o NaOH.
Una tableta de Protazyme AK se suspende en 2,0
ml de Triton 100-X al 0,01% por agitación suave. Se
mezclan 500 \mul de esta suspensión y 500 \mul de tampón de
ensayo en un tubo de Eppendorf y se coloca en hielo. Se añaden 20
\mul de muestra de proteasa (diluido en Triton
100-X al 0,01%). El ensayo se inicia transfiriendo
el tubo de Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, que se fija a la
temperatura de ensayo. El tubo se incuba durante 15 minutos en el
termomezclador Eppendorf a su velocidad de agitación máxima (1400
r.p.m.). La incubación se detiene transfiriendo el tubo de nuevo al
baño de hielo. Luego, el tubo se centrifuga en un centrifugador
congelado durante unos minutos y se transfieren 200 \mul de
sobrenadante a una placa de microtitulación. OD_{650} se lee como
una medida de actividad de la proteasa. Un tampón ciego se incluye
en el ensayo (en vez de enzima).
Ejemplo
2
Cuatro variantes de proteasa que comprenden la
secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2
(proteasa 10) con las únicas sustituciones N47D, T127R, N92K y Q54R,
respectivamente, fueron preparadas como se describe más abajo para
la variante N47D.
La mutagénesis dirigida se efectuó usando el
método "Mega-cebador" como describen Sarkar y
Sommen, 1990 (BioTechniques 8: 404-407).
La variante N47D se construyó usando los
siguientes cebadores, de los cuales el cebador
R10WT-CL29 (SEC ID n.º 11) es específico del gen, y
el cebador RSWT126 (SEC ID n.º 12) es mutagénico:
- R10WT-CL29: 5' CCGATTATGGAGCGGATTGAACATGCG 3' (SEC ID n.º 11)
- RSWT126: 5' GTGACCATCGGCGACGGCAGGGGCGTCTTCG 3' (SEC ID n.º 12),
para amplificar por PCR un fragmento de ADN de
aproximadamente 469 pb del constructo descrito más abajo.
El constructo de ADN de proteasa 10 usado para
la amplificación anterior fue un cassette de expresión (SEC ID n.º
13) para incorporación en el genoma de Bacillus subtilis. El
constructo contiene una fusión de ADN que codifica la secuencia
señal y el gen que codifica la proteína madura y pro de la proteasa
10 (SEC ID n.º 14), una construcción promotora y también el gen cat
que confiere resistencia al cloranfenicol. Para facilitar la
integración en el genoma por recombinación homóloga, las regiones
flanqueantes de alrededor de 3 kb de genes endógenos de Bacillus
subtilis fueron incorporados arriba y abajo de la secuencia de
codificación de la proteasa 10.
El fragmento de 469 pb resultante fue purificado
de un gel de agarosa (Sigma Aldrich cat. n.º A6877) y usado como un
Mega-cebador junto con el cebador
R10WT-CL39N (SEC ID n.º 15) en una segunda PCR
realizada en el mismo molde.
- R10WT-CL39N: 5' GGAGCTCTGAAAAAAAGGAGAGGATAAAGAATGAA 3' (SEC ID n.º 15).
La construcción completa de aproximadamente 10
kb se hace in vitro por PCR de largo rango, usando los
oligonucleótidos R10WT-CL28N (SEC ID n.º 16),
R10WT-CL28C (SEC ID n.º 17), y el Sistema Expand
Long Template PCR de Roche Applied Science (cat. n.º11759060),
según el manual del proveedor.
- R10WT-CL28N: 5' GCGTTCCGATAATCGCGGTGACAATGCCG 3' (SEC ID n.º 16)
- R10WT-CL28C: 5' TTCATGAGTCTGCGCCCTGAGATCCTCTG 3' (SEC ID n.º 17)
El fragmento de 1,2 kb aproximadamente
resultante fue purificado y combinado en una reacción de PCR nueva
usando el Expand Long Template PCR System con los fragmentos
flanqueantes de la construcción hecha por dos reacciones de la PCR
usando R10WT-2C-rev (SEC ID n.º 18)
y R10WT-CL28C (SEC ID n.º 17); y RSWT001 (SEC ID
n.º 19) y R10WT- CL28N (SEC ID n.º 16) como conjuntos de cebador. El
fragmento de 10 kb resultante puede ser amplificado usando los
cebadores R10WT-CL28N (SEC ID n.º 16) y
R10WT-CL28C (SEC ID n.º 17), para aumentar el
número de transformantes.
- R10WT-2C-rev: 5' TAATCGCATGTTCAATCCGCTCCATAATCG 3' (SEC ID n.º 18)
- RSWT001: 5' CCCAACGGTTTCTTCATTCTTTATCCTCTCCTTTTTTTCAGAGC 3' (SEC ID n.º 19)
Las células competentes de una cepa de proteasa
y de amilasa baja de Bacillus subtilis (tal como cepa SHA273
descrita en WO92/11357 y WO95/10603) fueron transformadas con los
fragmentos de la PCR resultantes respectivos, y se seleccionaron
transformantes resistentes al cloranfenicol y se controlaron por
secuenciación del ADN para verificar la presencia de la mutación
correcta en el genoma.
Las células de constructos que albergan
Bacillus subtilis que codifican la proteasa 10 y cada una de
las cuatro variantes de las mismas fueron usadas para incubar
matraces de agitación con contenido de medios ricos
(PS-1: 100 g/L de sacarosa (Danisco cat.n.º
109-0429), 40 de g/L soja de corteza, 10 g/L
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O (Merck cat.n.º 6579), 0,1 ml/L
de plurónico PE 6100 (BASF 102-3098)), y el cultivo
se realizó durante cinco días a 30ºC bajo agitación vigorosa.
Después del cultivo, los sobrenadantes fueron
diluidos cuatro veces en un tampón Na_{2}HPO_{4} 0,2M,
titulados con 0,1M de ácido cítrico con pH 4,0 o pH 6,0, y fueron
divididos en dos. Una mitad fue incubada durante cuatro horas a
65ºC con el pH respectivo, después de lo cual fue congelada. La otra
mitad fue congelada inmediatamente y sirvió como el control.
Antes de medir la actividad de la proteasa
residual, las muestras fueron diluidas diez veces en 50 mM de
tampón CHES-HEPES, pH 8,5. La actividad fue
determinada usando una versión modificada del ensayo Protazyme AK
del ejemplo 1, solubilizando una tableta del sustrato en 4 ml de
tampón CHES-HEPES, pH 8,5, mezclando bajo agitación
continua un ml de esta solución de sustrato con 20 ul de muestra de
proteasa diluida, que fue luego incubada a 37ºC. El sustrato
debería tener la temperatura correcta antes de añadir la proteasa.
Después de 15 minutos, la reacción fue detenida añadiendo 100 ul de
NaOH 1 M y el sustrato insoluble fue precipitado por centrifugado a
15000 r.p.m. durante 3 minutos después de lo cual se midió la
absorbencia a 650 nm. Los valores deberían estar por debajo de OD
3,0; alternativamente, la muestra de proteasa debería ser diluida
más de diez veces antes de la medición de actividad.
La actividad residual relativa (%) se calcula
dividiendo la actividad tras la incubación a 65ºC con la actividad
del control correspondiente. Los resultados de la tabla 1 a
continuación muestra que las cuatro variantes son de una
termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa 10.
Ejemplo
3
Se diseñó una variante de proteasa designada
"Proteasa 22" y que comprendía un número de sustituciones en
trece de las diecisiete regiones especificadas en la reivindicación
1. Esta variante comprende las siguientes sustituciones en
comparación con la parte madura de la proteasa 10 (aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 2): T10Y, A25S, R38T, Q42P,
T44S, R49K, Q54R, V56I, A62S, T82S, S99A, G118Ns, S120T, S122R,
E125Q, T129Y, N130S, M131L, R165S, T166A, F171Y, T176N, V179L,
N180S, V184L y R185T.
La parte madura de la proteasa 22 son los
aminoácidos 1-196 de SEC ID n.º 21. La secuencia de
ADN correspondiente a SEC ID n.º 21 es SEC ID n.º 20.
La secuencia de ADN de SEC ID n.º 20 fue
construida e introducida en un huésped de Bacillus para la
expresión. La proteasa expresada fue purificada y caracterizada como
una proteasa alfa-lítica (familia de peptidasa S1E
y/o S2A).
Se midió la relación de
actividad-temperatura de la proteasa 22 a pH 9,
usando el ensayo Protazyme AK del ejemplo 1. La proteasa 10 se
incluye con fines comparativos. Los resultados se muestran en la
tabla 2 a continuación.
A partir de estos resultados, resulta que la
proteasa 22 tiene una temperatura óptima más alta a pH 9 que la
proteasa 10, es decir, alrededor de 80ºC en comparación con
alrededor de 70ºC.
Se utilizó la calorimetría por análisis
diferencial (DSC) para determinar la estabilidad de la temperatura
con pH 7,0 de la proteasa 22 y la proteasa 10. Las proteasas
purificadas fueron dializadas durante la noche a 4ºC contra 10 mM
de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, pH 7,0 y se analizaron
en un instrumento VP-DSC (Micro Cal) con una tasa
de barrido constante de 1,5ºC/min de 20 a 100ºC. La manipulación de
datos se realizó usando el software MicroCal Origin.
La desnaturalización resultante o temperaturas
de fusión, las Tm, fueron: para la proteasa 22: 83.5ºC; para la
proteasa 10: 76,5ºC.
La invención descrita y reivindicada en la
presente no debe estar limitada en su alcance por las formas de
realización específicas descritas en la presente, ya que estas
formas de realización están destinadas a ser ilustraciones de
diferentes aspectos de la invención. De hecho, varias modificaciones
de la invención además de las descritas y mostradas en la presente
serán evidentes para los expertos en la técnica de la descripción
precedente.
<110> Novozymes A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes de proteasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10508
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262
("Proteasa 10")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (318)..(1463)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig-péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (318)..(404)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (900)..(1463)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262
("Proteasa 10")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1065
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis dassonvillei
subespecie dassonvillei DSM 43235 ("Proteasa 18")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1062)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (499)..(1062)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis dassonvillei
subespecie dassonvillei DSM 43235 ("Proteasa 18")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15648 ("Proteasa 11")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1059)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (496)..(1059)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15648 ("Proteasa 11")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15649 ("Proteasa 35")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1059)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (496)..(1059)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15649 ("Proteasa 35")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1068
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis alba DSM 15647
("Proteasa 08")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1065)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (502)..(1065)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis alba DSM 15647
("Proteasa 08")
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgattatgg agcggattga acatgcg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaccatcg gcgacggcag gggcgtcttc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cassette de expresión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3323)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de genoma de Bacillus
subtilis incluyendo genes
yfmH-yfmD-yfmC-yfmB-yfmA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3561)..(4208)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen cat que proporciona resistencia
al cloranfenicol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4523)..(5633)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Triple promotor
PamyL-scBAN-CryIIIA incluyendo la
secuencia estabilizante mRND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5658)..(5738)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5658)..(6797)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6234)..(6797)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6839)..(7540)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de gen de pectato liasa de
Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7541)..(10172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN de genoma de Bacillus
subtilis incluidos genes de yfls-citM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 380
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagctctga aaaaaaggag aggataaaga atgaa
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgttccgat aatcgcggtg acaatgccg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcatgagtc tgcgccctga gatcctctg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatcgcatg ttcaatccgc tccataatcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaacggtt tcttcattct ttatcctctc ctttttttca gagc
\hfill44
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<210> 20
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<211> 1164
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteasa 22
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1164)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(81)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (577)..(1164)
\newpage
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<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo sintético
\newpage
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<400> 21
\hskip1.1cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 22
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<211> 188
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<212> PRT
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<213> Nocardiopsis sp.
TOA-1
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<400> 22
\hskip0,8cm
\hskip1.1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
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<212> PRT
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<213> Nocardiopsis dassonvillei subesp.
dassonvillei DSM 43235
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
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<212> PRT
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<213> Nocardiopsis prasina DSM
15649
\newpage
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
14010
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Nocardiopsis sp. DSM
16424
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
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<212> PRT
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<213> Nocardiopsis alkalifila DSM
44657
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<400> 27
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis lucentensis DSM
44048
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (20)
1. Proteasa con un porcentaje de identidad de
los aminoácidos 1 a 188 de una proteasa progenitora que consiste en
SEC ID n.º 2 de al menos 60%, que exhibe una termoestabilidad
mejorada en comparación con la proteasa progenitora por
determinación de actividad residual tras la incubación durante
cuatro horas a 65ºC con pH 6 o pH 4 en un tampón Na_{2}HPO_{4}
0,2M y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones:
N47D, Q54R, N92K, y/o T127R, donde cada posición corresponde a una
posición de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2;
con la condición de que la proteasa no sea:
los aminoácidos 1-188 de SEC ID
n.º 2, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2 con la
sustitución T87A, los aminoácidos 1-188 de SEC ID
n.º 4, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 6, los
aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 8, los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 10, los aminoácidos
1-188 de SEC ID n.º 22, y no las partes maduras de
las proteasas que tienen las secuencias de SEC ID n.º 23, SEC ID n.º
24, SEC ID n.º 25, SEC ID n.º 26, SEC ID n.º 27 y SEC ID n.º 28 y
donde el grado de identidad entre secuencias se determina por el
programa "align" usando la matriz de puntuación BLOSUM50, la
penalización para el primer residuo de un espacio es -12 y las
penalizaciones para otros residuos de un espacio son -2.
2. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 salvo al menos
una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o
T127R.
3. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 4 salvo al menos
una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, N54R, S92K y/o
T127R.
4. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 6 salvo al menos
una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o
T127R.
5. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 8 salvo al menos
una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o
T127R.
6. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 10 salvo al menos
una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, S92K y/o
T127R.
7. Proteasa según la reivindicación 2 que se
selecciona de los siguientes:
- N47D de SEC ID n.º 2,
- T127R de SEC ID n.º 2,
- N92K de SEC ID n.º 2 y
- Q54R de SEC ID n.º 2.
8. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la
proteasa de cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
9. Constructo de ácidos nucleicos que comprende
la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8
operativamente enlazada a una o más secuencias de control que
dirigen la producción de la variante de proteasa en un huésped de
expresión adecuado.
10. Vector de expresión recombinante que
comprende el constructo de ácidos nucleicos según la
reivindicación
9.
9.
11. Célula huésped recombinante que comprende el
constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9 y/o el
vector de expresión según la reivindicación 10.
12. Método para la producción de la proteasa
según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el
método comprendiendo:
(a) cultivar la célula huésped según la
reivindicación 11 para producir un sobrenadante que comprende la
proteasa; y
(b) recuperar la proteasa.
13. Planta transgénica, o parte de la planta,
capaz de expresar una proteasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7.
14. Animal transgénico no humano, o productos, o
elementos de los mismos, que sean capaces de expresar una proteasa
según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
15. Aditivo de pienso que comprende al menos una
proteasa según cualquiera de las reivindicaciones
1-7, y
(a) al menos una vitamina liposoluble;
(b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o
(c) al menos un oligoelemento.
16. Composición de pienso para animales con un
contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende la
proteasa según cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
17. Método para mejorar el valor nutritivo de un
pienso para animales, donde la proteasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, y/o la composición según
cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16 se añade al pienso.
18. Método para el tratamiento de proteínas, que
comprende el paso de añadir la proteasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 y/o la composición según
cualquiera de las reivindicaciones 15-16 a al menos
una proteína o fuente de proteína.
19. Uso de la proteasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 y/o la composición según
cualquiera de las reivindicaciones 15-16 (i) en
pienso para animales; (ii) en la preparación de pienso para
animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de pienso para
animales; y/o (iv) para el tratamiento de proteínas.
20. Uso de la proteasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 en detergentes.
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