ES2346654T3

ES2346654T3 - Proteasas.

Info

Publication number: ES2346654T3
Application number: ES04738930T
Authority: ES
Inventors: Soren Flensted Lassen; Carsten Sjoholm; Peter Rahbek Ostergaard
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2003-06-19
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2010-10-19
Anticipated expiration: 2024-06-21
Also published as: AU2004247802B2; EP1639106B1; WO2004111221A1; CN102505007B; JP4880453B2; ATE469214T1; BRPI0410820B1; DE602004027376D1; CN1809634A; AU2004247802A1; PL1639106T3; CN102505007A; CA2526806A1; CA2526806C; EP1639106A1; BRPI0410820A; JP2006527584A; DK1639106T3

Abstract

Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene una actividad específica en hemoglobina a pH 7, 5 y 25ºC de al menos 41 AU/g, midiéndose la actividad de proteasa en unidades AU usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2 de al menos un 65%; y/o (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 de un 74% como mínimo.

Description

Proteasas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que es homólogo a las proteasas de Nocardiopsis, al igual que a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que lo codifican. La invención se refiere además a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes, incluidas las plantas transgénicas y animales no humanos, que comprenden estas secuencias de ácidos nucleicos, al igual que a métodos para producir y usar la proteasa, en particular en piensos para animales.

La proteasa de la invención tiene una alta actividad específica. Se describen características estructurales propias de relevancia para la actividad específica alta de las proteasas de la familia de la peptidasa S2A o S1E.

Antecedentes de la invención

Las proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 se describen en WO 88/03947. El ADN y las secuencias de aminoácidos de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se muestran en la solicitud DK nº 1996 00013. WO 01/58276 describe el uso en piensos para animales de proteasas estables en ácido relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. No obstante, estas proteasas tienen una actividad específica baja.

JP 2-255081-A describe una proteasa derivada de la cepa de Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508), no obstante, sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, puesto que el depósito fue retirado.

DD 200432|8 expone una preparación proteolítica derivada de la cepa Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, no obstante, sin información de secuencia. La cepa parece ya no estar disponible.

JP 2003284571-A, publicada después de la primera fecha de presentación de la presente invención, expone la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiente de una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676). La secuencia se ha introducido en GENESEQP con nº ADF43564.

La proteasa de la técnica anterior más homologa que no es una proteasa de Nocardiopsis es Sapll_Streptomyces_
sp_sptrembl_q55353, la parte madura de la cual tiene una identidad de aminoácido de 61,5% y 63,5%, respectivamente, a las partes maduras de la SEC ID nº: 2 y 6, respectivamente. Las identidades de ADN correspondientes son 70,3% y 72,7%, a SEC ID nº: 1 y 5, respectivamente. La parte madura de una proteasa de Streptomyces relacionada, es decir, Sapll_Streptomyces_sp_sptrembl_q55352, tiene un porcentaje de identidad ligeramente más alto a la parte madura de SEC ID nº: 1, es decir, 70,8%.

Es un objeto de la presente invención proporcionar proteasas de una actividad específica alta homologa a proteasas de Nocardiopsis, en particular con potencial para el uso en piensos para animales y/o en detergentes.

Resumen de la invención

Las proteasas de alta actividad específica fueron aisladas y caracterizadas, es decir, una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 (véase SEC ID nº: 1 y 2), y una proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (véase SEC ID nº: 5 y 6).

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene actividad específica en hemoglobina a pH 7,5 y 25ºC de 41 AU/g como mínimo. La actividad de proteasa en unidades AL) se mide usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2, de al menos un 65%; y/o (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1, de al menos un 74%. La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican esas proteasas; constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos; al igual que métodos para producir y usar las proteasas, en particular, en piensos para animales.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que

(a): tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº: 6 del 76% como mínimo;

(b): es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia alta con los nucleótidos 568 1143 de la SEC ID nº: 5; y/o

(c): es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5 del 79% como mínimo.

Los polipéptidos aislados según se describen más abajo para información estarían comprendidos en la invención

A.: Polipéptido aislado de la familia de peptidasa S2A y/o familia de peptidasa S1 E con actividad de proteasa y con una secuencia amino que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada:

: 25S, 38T, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 92S, 95A, 99Q, 1001, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166F, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L y/o 185T; preferiblemente 25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q, 131L, 165S, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L y/o 185T; más preferiblemente junto con al menos uno de 24A, 51V, 53E, 86A, 87T, 96I, y/o 186L; y/o junto con (H35 + D61 + S143); caracterizado por el hecho de que cada posición corresponde a una posición de la SEC ID nº: 2.

B.: Polipéptido según A que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S y/o 171Y.

C.: Polipéptido según A que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 95A, 99Q, 1001, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184Ly/o 185T.

D.: Polipéptido según cualquiera de A, B o C, que tiene una Tm de al menos 78ºC según se mide por calorimetría por análisis diferencial en 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, pH 7,0; una actividad relativa a p H9 y 80ºC de 0,40 como mínimo y/o una actividad específica en hemoglobina a pH 7,5 y 25ºC de 39 AU/g como mínimo.

E.: Polipéptido según cualquiera de A, B, C o D, que tiene un porcentaje de identidad a los aminoácidos 1 a 188, de la SEC ID nº: 2, del 65% como mínimo y/o a los aminoácidos 1-192, de la SEC ID nº: 6 al menos del 76.

F.: Polipéptido según cualquiera de A, B, C, D o E, típicamente será i) una proteasa bacteriana; ii) una proteasa del filo Actinobacteria; iii) de la clase Actinobacteria; iv) del orden Actinomycetales v) de la familia Nocardiopsaceae; vi) del género Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) especies de Nocardiopsis tales como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis trópica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, o Nocardiopsis dassonvillei; y, opcionalmente, también de Nocardiopsis alkaliphila, p. ej. una proteasa derivada de Nocardiopsis alba, por ejemplo Nocardiopsis alba DSM 15647, o una proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei, por ejemplo Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-188, de la SEC ID nº: 2 y/o aminoácidos 1-192, de la SEC ID nº: 6.

G.: Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según cualquiera de A, B, C, D, E o F.

H.: Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de G operativamente vinculado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

I.: Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de H.

J.: Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de H o el vector de I.

K.: Método para la producción de un polipéptido según cualquiera de A, B, C, D, E o F que comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de K para producir un sobrenadante que comprenda el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

L.: Planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido según cualquiera de A, B, C, D, E o F.

M.: Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, que sean capaces de expresar el polipéptido según cualquiera de A, B, C, D, E o F.

N.: Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de A, B, C, D, E o F, (i) en piensos para animales; (ii) en la preparación de una composición para el uso en piensos para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas para animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales y/o (vi) para el tratamiento de proteínas.

O.: Aditivo de pienso para animales que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de A, B, C, D, E o F; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o (c) al menos un oligoelemento.

P.: Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de A, B, C, D, E o F, o al menos un aditivo de pienso para animales de O.

Q.: Composición que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de A, B, C, D, E o F, junto con al menos otra enzima seleccionada de entre alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

R.: Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de A, B, C, D, E o F, en detergentes.

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En un tercer aspecto, la invención se refiere a:

a.: Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2, del 86% como mínimo y/o a los aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº: 6 del 72% como mínimo; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia alta con los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5; (c) una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2, o aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº: 6, que comprende una sustitución, deleción, extensión y/o inserción de uno o más aminoácidos; (d) una variante alélica de (a); (b) o (c); y (e) un fragmento de (a); (b), (c) o (d) que tiene actividad de proteasa;

b.: Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que (a) codifica el polipéptido de a; (b) codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y que se hibrida bajo condiciones de astringencia media- alta con (i) cualquiera de los nucleótidos 502-1065 de SEC ID nº: 1 y/o los nucleótidos 568-1143 de SEC ID nº: 5, (ii) una subsecuencia de (i) de 100 nucleótidos como mínimo; y/o (ii) una cadena complementaria de cualquiera de (i)-(ii); y/o (c) codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y que tiene un grado de identidad (i) de los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 del 86% como mínimo, y/o de los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5 del 82% como mínimo;

c.: Secuencia de ácidos nucleicos aislada producida por (a) hibridación de un ADN bajo condiciones de astringencia media-alta con (i) cualquiera de los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 y/o nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5; (ii) una subsecuencia de (i) de 100 nucleótidos como mínimo; y/o (iii) una cadena complementaria de cualquiera de (i)-(ii); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucleicos;

d.: Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de b o c, operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado;

e.: Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de d;

f.: Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de d o el vector de e;

g.: Método para la producción de un polipéptido de a que comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de f para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido;

h.: Planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido de a;

i.: Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, que son capaces de expresar el polipéptido de a;

j.: Método para la producción de un polipéptido de a que comprende (a) cultivo de cualquiera de las siguientes cepas: (i) Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235, o Nocardiopsis alba DSM 15647 y (b) recuperación del polipéptido;

k.: Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en a (i) en pienso para animales; (ii) en la preparación de una composición para el uso en pienso para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales; (IV) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas para animales; (V) aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales; y/o (vi) para el tratamiento de proteínas;

l.: Aditivo de pienso para animales que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en a; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o (c) al menos un oligoelemento;

m.: Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruto de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en a, o al menos un aditivo de pienso para animales de I;

n.: Composición que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en a, junto con al menos otra enzima seleccionada entre alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); al igual que

o.: Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en a en detergentes.

Otras formas de realización comprendidas son variantes del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, de la SEC ID nº: 2, que comprenden una sustitución, deleción, extensión y/o inserción de uno o más aminoácidos; (e) una variante alélica de (a); (b) o (c); y (f) un fragmento de (a), (b); (c), (d) o (e) que tiene actividad de proteasa y muestra los requisitos de identidad de las reivindicaciones.

En la presente también se describe un polipéptido aislado con actividad de proteasa y con una temperatura de fusión (T_{m}) de 78ºC como mínimo, como lo determina la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, por sus siglas en inglés) en 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de tampón de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una tasa de barrido constante de 1,5ºC/min, caracterizado por el hecho de que el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2 del 50% como mínimo; (b) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de los aminoácidos -167 a 188 de la SEC ID nº: 2; (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia baja con (i) ADN que codifica una proteasa obtenible a partir de ADN genómico de Nocardiopsis alba DSM 15647 mediante el uso de las SEC ID nº 3 y 4; (ii) nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1; (iii) nucleótidos 1-1065 de la SEC ID nº: 1; (IV) una subsecuencia de (i) o (ii) o (iii) de 100 nucleótidos como mínimo; y/o (v) una cadena complementaria de (i); (ii), (iii) o (iv); (d) una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de aminoácidos 1 a 188, o -167 a 188 de SEC ID nº: 2, que comprende una sustitución, deleción, extensión, y/o inserción de uno o más aminoácidos; (e) una variante alélica de (a); (b) o (c); y (f) un fragmento de (a), (b); (c), (d) o (e) que tiene actividad de proteasa.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que (a) codifica el polipéptido tal y como se define anteriormente; (b) codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y que se hibrida bajo condiciones de astringencia media alta con (i) ADN que codifica una proteasa obtenible de ADN genómico de Nocardiopsis alba DSM 15647 mediante el uso de cebadores de las SEC ID nº 3 y 4, (ii) nucleótidos 502-1065 o 1-1065 de la SEC ID nº: 1; (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de 100 nucleótidos como mínimo; y/o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii) o (iii); (c) codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 del 86% como mínimo; y/o (d) codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y que tiene un grado de identidad de los nucleótidos 1-1065 de la SEC ID nº: 1 del 82% como mínimo.

Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa y una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, como se determina por Calorimetría Diferencial de Barrido(DSC, por sus siglas en inglés) en 10 mM de fosfato de sodio, 50 mM de tampón de cloruro de sodio, pH 7.0, usando una tasa de barrido constante de 1,5ºC/min, donde la secuencia de ácidos nucleicos (a) codifica el polipéptido con una T_{m} de 78ºC como mínimo tal como se ha definido anteriormente; (b) se hibrida bajo condiciones de astringencia baja con (i) ADN que codifica una proteasa obtenible de ADN genómico de Nocardiopsis alba DSM 15647 mediante el uso de cebadores de las SEC ID nº: 3 y 4; (ii) nucleótidos 502-1065 o 1-1065 de la SEC ID nº: 1; (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de 100 nucleótidos como mínimo; y/o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii) o (iii); (c) tiene un grado de identidad de los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 del 50% como mínimo; y/o (d) tiene un grado de identidad de los nucleótidos 1-1065 de la SEC ID nº: 1 del 50% como mínimo.

Secuencia de ácidos nucleicos aislada producida por (a) hibridación de un ADN bajo condiciones de astringencia media-alta con (i) ADN que codifica una proteasa obtenible de ADN genómico de Nocardiopsis alba DSM 15647 por medio del uso de cebadores de las SEC ID nº 3 y 4; (ii) nucleótidos 502- 1065 o 1-1065 de la SEC ID nº: 1; (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de 100 nucleótidos como mínimo; o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii) o (iii); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucleicos.

Constructo de ácidos nucleicos que comprende cualquiera de las tres secuencias de ácidos nucleicos definidas en cualquiera de los tres párrafos inmediatamente anteriores al presente, operativamente vinculado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos.

Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos o el vector.

Método para la producción de un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, el cual comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 8 para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido tal como se ha definido anteriormente.

Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, capaces de expresar el polipéptido definido más arriba.

Uso de al menos uno de los polipéptidos tal como se han definido anteriormente (i) en piensos para animales; (ii) en la preparación de una composición para el uso en piensos para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas para animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales y/o (vi) para el tratamiento de proteínas vegetales.

Aditivo de pienso para animales que comprende al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente; y (a) al menos una vitamina soluble en grasa y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o (c) al menos un oligoelemento.

Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruto de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, o al menos un aditivo de pienso para animales tal como se ha definido anteriormente.

Composición que comprende al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, junto con al menos otra enzima seleccionada entre alfa- amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

Uso de al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente en detergentes.

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Descripción detallada de la invención

Los polipéptidos que tienen actividad de proteasa, o las proteasas, a veces también son denominadas peptidasas, proteasas, hidrolasas peptídicas, o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidroliza péptidos comenzando en cualquiera de los extremos de los mismos, o del tipo endo que actúa internamente en cadenas polipeptídicas (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran actividad en sustratos peptídicos bloqueados en las terminales N y C que son pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

El término "proteasa" es definido en la presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima del grupo enzimático EC 3.4 (incluida cada una de las trece subclases del mismo). El número EC se refiere a la nomenclatura enzimática de 1992 de NC-IUBBM, Academic Press, San Diego, California, incluidos los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6 y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es suplementada y actualizada regularmente; véase p. ej. World Wide Web (WWW) en http://www.chem. qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html).

Las proteasas son clasificadas basándose en su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas (S), cisteína proteasas (c), proteasas aspárticas (a), metaloproteasas (m) y proteasas desconocidas o aún sin clasificar (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de la introducción general.

En formas de realización particulares, las proteasas de la invención y para el uso según la invención son seleccionadas del grupo que consisten en:

(a): proteasas del grupo enzimático EC 3.4.-.-;

(b): serina proteasas del grupo S del manual mencionado;

(c): serina proteasas de la familia peptidasa S2A; y/o

(d): serina proteasas de la familia S1E de peptidasa como se describe en Biochem.J. 290:205-218 (1993) y en la base de datos de proteasas de MEROPS, publicación 6.20, 24 de marzo de 2003, (www.merops.ac.uk). La base de datos es descrita en Rawlings, N.D., O'Brien, E. a. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30, 343-346.

Para determinar si una proteasa determinada es una serina proteasa, y una proteasa de la familia S2A, se hace referencia al manual mencionado y los principios indicados en el mismo. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas creadas genéticamente o sintéticas.

La actividad de la proteasa puede ser medida usando cualquier ensayo en el cual se emplee un sustrato que incluya enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo deben ser adaptados asimismo a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores del pH del ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 o 95ºC.

Ejemplos no limitativos de sustratos de proteasa son caseína, tales como caseína reticulada con azurina (AZCL-Caseína) y hemoglobina. Para los efectos de determinar la actividad específica de la proteasa de la invención, el sustrato es hemoglobina y un ensayo adecuado descrito en el ejemplo 3. Otros dos ensayos de proteasa son descritos en el ejemplo 2. Cualquiera de los dos pueden usarse para determinar la actividad de proteasa en general. Para objetivos aparte de las determinaciones de actividad específica, el denominado ensayo de pNA es un ensayo preferido.

La proteasa de la invención muestra una actividad específica en hemoglobina a pH 7,5 y 25ºC de 39AU/g como mínimo. La actividad específica puede ser determinada como se describe en el ejemplo 3. La proteasa de la invención puede mostrar una actividad específica de al menos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 o al menos 54AU/g.

Es bien sabido que la determinación de la actividad específica incluye la determinación de contenido de proteína, al igual que la actividad de la proteasa, de la proteasa purificada.

El contenido de proteína puede determinarse por análisis de aminoácidos, por ejemplo por hidrólisis ácida de la proteasa y separación y cuantificación posterior de los aminoácidos liberados, preferiblemente en un analizador de aminoácidos Biochrom 20 Plus.

Las siguientes son características particulares de la determinación de la actividad de la proteasa: (i) el sustrato de hemoglobina es desnaturalizado; (ii) el sustrato de hemoglobina se usa en una cantidad de 0,65% p/p; (ii) el tampón de ensayo es tampón de KH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,50; (ii) el tiempo de reacción para la proteasa es 10 minutos; (iii) después de la reacción enzimática, la hemoglobina no asimilada se precipita con ácido tricloroacético (ATC) y se elimina, preferiblemente por filtración; (iv) se determinan los productos de degradación de hemoglobina solubles en ATC en el filtrado, preferiblemente con el reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu; (v) la unidad de actividad (UA) es medida y definida por referencia a un estándar de enzima de ALCALASE™; (vi) la unidad de actividad (UA) es medida usando el ensayo EB-SM-0349, preferiblemente EB-SM-0349 02/01 como se describe en el ejemplo 7.

Otro ensayo es el "Ensayo de la actividad de la proteasa (AU/ml)" como se describe en el Ejemplo 3. El estándar de ALCALASE™ y el ensayo EB-SM-0349 está disponible en Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca (citando "patente de su ref. 10476" y "EB-SM-0349", o "EB-SM-0349 02/01", respectivamente).

Se puede realizar una selección de proteasas de alta actividad específica relacionada con las proteasas de las SEC ID nº: 2 y 6 de la siguiente manera: en una primera fase, una biblioteca de ADN se selecciona con cebadores, p. ej. SEC ID nº: 3, 4, 7, o 8, o preferiblemente con las regiones que codifican péptidos maduros de cualquiera de las SEC ID nº: 1 y 5; y los clones hibridizantes se expresan en una cepa adecuada, p. ej. una cepa de Bacillus o E. coli. En una siguiente fase, las proteasas expresadas relacionadas con la SEC ID nº: 2 y/o 6 son purificadas, preferiblemente en un proceso de micro-purificación (véase p. ej. WO 03/037914) y en una fase siguiente, se determina la cantidad de proteasa activa para cada candidato usando el principio bien conocido de titulación del sitio activo (TSA) con un inhibidor fuerte de la enzima. Esto tiene el propósito de poder comparar cantidades molares iguales de cada proteasa en la fase final posterior, que es una determinación de la actividad de la proteasa de la cantidad ahora conocida de proteasa por cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, el ensayo de pNA del ejemplo 2 contenido en la presente. Una parte importante de este procedimiento puede ser automatizada y, si se desea, realizada con la asistencia de robots. La verificación de la actividad específica alta se hace p. ej. por purificación de la proteasa y establecimiento de la actividad específica como se describe en la parte experimental contenida en la presente.

No hay limitaciones en el origen de la proteasa de la invención y/o para el uso según la invención. Así, el término proteasa incluye no sólo proteasas de tipo natural o salvaje obtenidas de microorganismos de cualquier género, sino también cualquier mutante, variante, fragmento, etc. de los mismos que muestran actividad de proteasa, al igual que proteasas sintéticas, tales como proteasas redistribuidas y proteasas de consenso. Tales proteasas genéticamente creadas pueden ser preparadas como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR que contenga la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR), o por mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso se describe en, por ejemplo, EP 897985. La transposición genética es descrita en general en, p. ej., WO 95/22625 y WO 96/00343. La recombinación de genes de proteasa puede realizarse independientemente de la secuencia específica de los progenitores por redistribución sintética como se describe en Ness, J.E. et al, en Nature Biotechnology, vol. 20 (12), págs. 1251-1255, 2002. Los oligonucleótidos sintéticos degenerados en su secuencia de ADN para proporcionar la posibilidad de todos los aminoácidos encontrados en el conjunto de proteasas progenitoras se diseñan y los genes son ensamblados según la referencia. La redistribución puede llevarse a cabo para la secuencia de longitud total o para una parte solamente de la secuencia y luego más tarde combinarse con el resto del gen para dar una secuencia de longitud total. Las proteasas con una secuencia de aminoácidos que comprende las partes maduras de cualquiera de las SEC ID nº: 2 y 6 son ejemplos particulares de tales proteasas progenitoras que se pueden someter a redistribución como se ha descrito anteriormente, si se desea junto con, p. ej., la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, para proporcionar proteasas adicionales de la invención. La expresión "obtenido a partir de" según se utiliza en este caso en relación con una fuente determinada significa que el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos es producida por la fuente o por una célula en la cual está presente la secuencia de ácidos nucleicos de la fuente. En una forma de realización preferida, el polipéptido es segregado extracelularmente.

La proteasa puede ser una variante hipoalergénica, diseñada para invocar una respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta a animales, incluido el hombre. El término respuesta inmunológica debe entenderse como cualquier reacción por el sistema inmunológico de un animal expuesto a la proteasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Las variantes poco alergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la proteasa se puede conjugar con partes protectoras de fracciones poliméricas o epítopos de la proteasa implicados en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar acoplamiento químico in vitro de polímero a la proteasa, p. ej. según se describe en WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, y/o WO 99/00489. La conjugación puede además o de forma alternativa a ella implicar acoplamiento in vivo de polímeros a la proteasa. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteasa, insertando secuencias de consenso que codifican sitios adicionales de glicosilación en la proteasa y expresando la proteasa en un huésped capaz de glicosilar la proteasa; véase p. ej. WO 00/26354. Otra forma de proporcionar variantes poco alergénicas es la creación genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteasa para hacer que la proteasa se auto-oligomerice, haciendo que los monómeros de proteasa protejan los epítopos de otros monómeros de proteasa reduciendo así la antigenicidad de los oligómeros. Esos productos y su preparación se describen, p. ej., en WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden identificarse por diferentes métodos tales como el método de exposición en fagos descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que un epítopo ha sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades inmunológicas alteradas de la proteasa por técnicas de manipulación génica conocidas tales como mutagénesis dirigida al sitio (véase, p. ej., WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse en proximidad suficiente al epítopo para el polímero para proteger el epítopo.

Un polipéptido según cualquier aspecto de la presente invención puede comprender una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad a la parte del péptido maduro de cualquiera de SEC ID nº: 2, o 6, por ejemplo de aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2, y/o de aminoácidos 1 a 192 de la SEC ID nº: 6 (las partes de péptido maduro), de, por ejemplo, al menos 65% aproximadamente, y que tienen actividad de proteasa (en adelante "polipéptidos homólogos"). En formas de realización particulares, el grado de identidad para cualquiera de las partes de péptido maduro de cualquiera de SEC ID nº: 2, es al menos aproximadamente 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99.

Para los objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se determina por el programa "align" que es un alineamiento de Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento global). El programa se usa para el alineamiento del polipéptido, al igual que de secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación predeterminada BLOSUM50 se usa para alineamientos de polipéptidos, y la matriz de identidad predeterminada se usa para alineamientos de nucleótidos. La penalización para el primer residuo de un gap es -12 para polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para otros residuos de un gap son -2 para polipéptidos, y -4 para nucleótido.

"Align" es parte de la Versión v20u6 del paquete FASTA (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis" PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, "Methods in Enzymology 183:63-98. Los alineamientos de proteína de FASTA usan el algoritmo de Smith-Waterman sin limitación en el tamaño del gap (véase "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

En una forma de realización particular, las partes del péptido maduro, o partes del péptido maduro predichas o previstas, de las dos secuencias de aminoácidos se usan para el alineamiento. En la alternativa, esa parte de la secuencia, cuya identidad a la parte de péptido maduro de la SEC ID nº: 2 está siendo examinada, es elegida, la cual según un alineamiento múltiple hecho según se describe más abajo es la más similar a la parte del péptido maduro de la SEC ID nº: 2, es decir, los residuos de aminoácidos correspondientes según son identificados por el alineamiento múltiple.

En el presente contexto, la base para numerar los residuos de aminoácidos (o asignar números de posición, compárese el segundo aspecto de la invención) es la SEC ID nº: 2 comenzando con A1 y finalizando con T188. En la alternativa, la base es aminoácidos 1-188 de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEC ID nº: 1 como se describe en WO 01/58276, preferiblemente SEC ID nº: 1 como se describe en WO 01/58276 en la cual A87 se sustituye con T87).

Las proteasas pueden comprender extensiones en comparación con las partes del péptido maduro, es decir, en los extremos N-terminal y/o C-terminal de los mismos. Los aminoácidos de tales extensiones, si los hay, deben ser numerados como es usual en la técnica, es decir, para una extensión C-terminal: 189, 190, 191, etcétera, y para una extensión N-terminal -1; -2; -3, etcétera.

Para cada residuo de aminoácido en cada proteasa alineada a la secuencia de referencia, p. ej. SEC ID nº: 2, como se explica más arriba (para los fines de determinar el grado de identidad), es posible asignar directamente y sin ambigüedad un residuo de aminoácido en la secuencia de referencia, p. ej. SEC ID nº: 2, a la cual corresponde. Se asignan a los residuos correspondientes la misma posición, o número, por referencia a, p. ej., SEC ID nº: 2.

Para cada residuo de aminoácido en otra proteasa, la posición correspondiente de la secuencia de referencia, p. ej. SEC ID nº: 2, puede encontrarse de la siguiente manera:

: La secuencia de aminoácidos de la otra proteasa es designada SEC X. Una posición correspondiente a la posición N de la SEC ID nº: 2 se encuentra de la siguiente manera: la SEC X se alinea con la SEC ID nº: 2 como se especificó anteriormente. Del alineamiento, la posición en la secuencia de SEC X correspondiente a la posición N de la SEC ID nº: 2 puede ser derivada claramente y sin ambigüedad, usando los principios descritos abajo.

La SEC X puede ser una parte madura de la proteasa en cuestión, o también puede incluir una parte de péptido señal, o puede ser un fragmento de la proteasa madura que tiene actividad de proteasa, p. ej., un fragmento de la misma longitud que la SEC ID nº: 2, y/o puede ser el fragmento que se extiende de A1 a T188 cuando está alineado con la SEC ID nº: 2 como se describe en la presente.

A continuación se insertan tres alineamientos como Tablas I, II y III. Los alineamientos fueron preparados como se ha descrito anteriormente, alineando la parte madura de otra proteasa (secuencia X1, secuencia X2, y secuencia X3, respectivamente) a SEC ID nº: 2. Se muestran aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de cada proteasa.

Mirando primero el alineamiento de la Tabla I, es claro que, p. ej., P42 de SEC ID nº: 2 corresponde a Q42 de la secuencia X1, puesto que estos residuos están encima uno de otro en el alineamiento. A ambos se les asigna el número 42, es decir, el número del residuo correspondiente en la SEC ID nº: 2. También queda claro en este alineamiento que, p. ej., la secuencia X1 no comprende ninguno de 25S, 38T, 42P, 44S, o 49Q.

TABLA I

1

Las Tablas II y III son ejemplos de alineamientos que producen gaps en cualquiera de las dos secuencias.

En el alineamiento de la Tabla II, se produce un gap en la secuencia X2. El residuo P de aminoácido resaltado de la secuencia X2 es designado, para los fines presentes, P28, aunque en la SEC X como tal es P25.

TABLA II

2

En el alineamiento de la Tabla III, se produce un gap en la SEC X3. Cuando se produce un gap entre los aminoácidos que tienen el número de posición nn y (nn+1) de la SEC ID nº: 2, se asigna a cada posición del gap una letra minúscula o subíndice: a, b, c, etc. al número de posición anterior, es decir, nn. Por consiguiente, cada posición del gap es numerado nna, nnb, etc. El residuo de aminoácido R subrayado de la SEC X3 designado, para los fines presentes, R33a, aunque en la SEC X3 como tal es R34.

TABLA III

3

El polipéptido de la invención puede tener una temperatura de fusión T_{m} de 75ºC como mínimo, o hasta 95ºC como mínimo, según se determina por calorimetría diferencial de barrido (DSC). La DSC se realiza en 10 mM de fosfato de sodio, 50 mM de tampón de cloruro de sodio, pH 7,0. La tasa de barrido es constante, p. ej. 1,5ºC/min. El intervalo de barrido puede ser de 20 a 100ºC.

No hay limitaciones superiores en la T_{m}, no obstante, se contempla actualmente que la T_{m} pueda estar por debajo de 150ºC, o debajo de 100ºC.

En una alternativa, se selecciona otro tampón para el barrido, p. ej., un tampón de pH 5,0; 5,5; 6,0; o pH 6,5.

En otras alternativas, puede utilizarse una tasa de barrido más alta o inferior, p. ej. una inferior a 1,4ºC/min, 1,3ºC/min, 1,2ºC/min, 1,1ºC/min, 1,0ºC/min, o 0,9ºC/min.

Se hace referencia al Ejemplo 2 para obtener detalles adicionales acerca del procedimiento de barrido.

La proteasa puede mostrar un perfil de actividad de temperatura corregida en comparación con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262. Por ejemplo, la proteasa puede mostrar una actividad relativa a pH 9 y 80ºC de 0, 40 como mínimo, preferiblemente al menos 0,45; 0,50; 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80; 0,85; 0,90, o al menos 0,95. El término "relativo" se refiere a la actividad máxima medida para la proteasa en cuestión. Para la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, la actividad a 70ºC se fija a 1.000 (100%); véase el ejemplo 2. Como otro ejemplo, la proteasa muestra una actividad relativa a pH 9 y 90ºC de al menos 0,10, preferiblemente al menos 0,15; 0,20; 0,25; 0,30, o de al menos 0,35. En particular, la actividad de la proteasa es medida usando el ensayo de Protazyme AK del Ejemplo 2.

La presente invención también se refiere al uso en pienso para animales de los polipéptidos de la invención.

El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede ser determinado por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el Software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiple: Penalización de gap de 10 y penalización de longitud de gap de 10. Los parámetros de alineamiento de pares son Ktuple=1, penalización de gap =3, ventanas=5 y diagonales=5. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinado usando el mismo algoritmo y paquete de software descritos anteriormente con los siguientes ajustes: Penalización de gap de 10 y penalización de longitud de gap de 10. Los parámetros de alineamiento de pares son Ktuple=3, penalización de gap =3 y ventanas=20.

En una forma de realización particular, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de (a) las partes de péptido maduro de cualquiera de SEC ID nº: 2 o 6, o (b) de las proformas (excluidas las partes de péptido señal, incluidas las partes de péptido maduro), por (i) no más de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, o no más de 20 aminoácidos; (ii) no más de veinte, diecinueve, dieciocho, diecisiete, dieciséis, quince, catorce, trece, doce, o no más de once aminoácidos; (iii) no más de diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o no más de un aminoácido; (iv) diez, o por nueve, o por ocho,
o por siete, o por seis, o por cinco aminoácidos; o (v) cuatro, o por tres, o por dos aminoácidos, o por un aminoácido.

En una forma de realización particular, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la parte de péptido maduro de cualquiera de la SEC ID nº: 2 y 6, o variantes alélicas de los mismos; o fragmentos de los mismos con actividad de proteasa.

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos de la presente invención consisten en la parte de péptido maduro de cualquiera de SEC ID nº: 2, o 6, o variantes alélicas de los mismos; o fragmentos de los mismos con actividad de proteasa.

Un fragmento es un polipéptido con uno o más aminoácidos delecionados del término amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una forma de realización un fragmento contiene al menos 75 residuos de aminoácidos, o al menos 100 residuos de aminoácidos, o al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos, o al menos 160 residuos de aminoácidos, o al menos 165 residuos de aminoácidos, o al menos 170 residuos de aminoácidos, o al menos 175 residuos de aminoácidos.

Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa la misma localización cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede ocasionar polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa y que son codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de astringencia altas o muy altas con una sonda de ácidos nucleicos que se hibrida bajo las mismas condiciones con los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5; (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, New York).

Las secuencias de ácidos nucleicos de (a) mencionado, o una subsecuencia de la misma, al igual que las partes correspondientes de las secuencias de aminoácidos de la SEC ID nº: 2, o 6, o un fragmento de las mismas, pueden utilizarse para diseñar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN que codifica polipéptidos con actividad de proteasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el ADNc o genómico del género o la especie de interés, siguiendo procedimientos de Southern blot estándar, para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También pueden utilizarse sondas más largas. Pueden utilizarse tanto la sonda de ADN como la de ARN. Las sondas son marcadas típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S, biotina o avidina). Tales sondas están comprendidas en la presente invención.

Así, un ADN genómico o genoteca de ADNc obtenida a partir de esos otros organismos se pueden seleccionar para ADN que se hibrida con las sondas descritas anteriormente y que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa. El ADN genómico u otro ADN de tales otros organismos se puede separar por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN homólogo a cualquiera de las SEC ID Nos: 1 o 5, o una subsecuencia del mismo, el material portador se usa en un Southern blot. Para los objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos se hibrida a una sonda de ácidos nucleicos marcada correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en cualquiera de las SEC ID nº: 1, o 5; las cadenas complementarias de las mismas, o subsecuencias de las mismas, bajo condiciones de astringencia muy bajas a muy altas. Las moléculas a la que la sonda de ácidos nucleicos se hibrida bajo estas condiciones son detectadas usando película radiográfica.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, se definen condiciones de astringencia muy bajas a muy altas como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, 35% de formamida para astringencias medias y medio-altas, o 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos de Southern blot estándar.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,2 X SSC, 0,2% de SDS, 20% de formamida preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta), y de la forma más preferible al menos a 70ºC (astringencia muy alta).

Para las sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación y lavado post-hibridación a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0, 09 M de tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por mi siguiendo procedimientos de Southern blot estándar.

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SSC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando 6X SSC a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada.

La presente invención también se refiere a variantes del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de la parte madura de cualquiera de las SEC ID nº: 2 y 6, comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la parte madura de cualquiera de las SEC ID nº: 2 o 6, por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. En una forma de realización particular, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido de hasta 20-25 residuos aproximadamente; o una pequeña extensión que facilita la purificación por cambio de la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Por consiguiente, por ejemplo, la invención se refiere a un polipéptido que tiene, o comprende, una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID nº: 2, o 6, preferiblemente las partes maduras de las mismas, donde las sustituciones de aminoácidos conservadoras comprenden reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), entre los aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), entre los aminoácidos polares (glutamina y asparagina), entre los aminoácidos hidrofóbicos (alanina, leucina, isoleucina, y valina), entre los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y entre los aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina), o cualquier combinación de los mismos, o fragmentos activos de los mismos.

En la técnica se conocen y describen sustituciones de aminoácido que generalmente no alteran la actividad específica, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly al igual que estos a la inversa.

Los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención pueden ser estables en ácido. Para los fines presentes, el término estables en ácido significa que la actividad residual después de 2 horas de incubación a pH 2,0, pH 2,5 o pH 3,0 y 37ºC, es 50% como mínimo, en comparación con la actividad residual de una muestra correspondiente incubada durante 2 horas a pH 9,0 y 5ºC. La actividad residual es al menos 60%, 70%, 80% o al menos 90%. Un ensayo adecuado para determinar la estabilidad en ácido es el ensayo de estabilidad de pH del ejemplo 2.

Los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención pueden tener una actividad relativa a pH 7,0 de al menos 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30 o al menos 0,35. La prueba de perfil de pH del ejemplo 2 se usa para estas determinaciones.

Los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención pueden tener i) una actividad relativa a 60ºC y pH 9 de al menos 0,05, 0,10, 0,15 o al menos 0,20; y/o ii) una actividad relativa a 70ºC de al menos 0,40, 0,50, o al menos 0,56. La prueba de perfil de temperatura del ejemplo 2 se usa para estas determinaciones.

Los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención pueden tener una T_{m}, según se determina por calorimetría por análisis diferencial, de al menos 78ºC o de al menos 79, 80, 81, 82, o de al menos 83ºC. La T_{m} se determina a pH 7,0 como se describe en el ejemplo 2.

El polipéptido de la invención y para el uso según la invención puede ser un polipéptido bacteriano o fúngico. El polipéptido fúngico se puede derivar de un hongo filamentoso o de una levadura.

En particular, el polipéptido de la invención es i) una proteasa bacteriana; ii) una proteasa del filo Actinobacteria; iii) de la clase Actinobacteria; iv) de la orden Actinomycetales v) de la familia Nocardiopsaceae, vi) del género Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) especies de Nocardiopsis tales como, Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis alkalifila, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halófila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis sinnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis trópica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis o Nocardiopsis alba, por ejemplo, Nocardiopsis alba DSM 15647, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o - 167 a 188, de la SEC ID nº: 2, o de Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 4235, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-192, o - 160 a 192 de la SEC ID nº: 6. En una forma de realización particular, la proteasa se deriva de Nocardiopsis alba.

La taxonomía mencionada es según el capítulo: The road map to the Manual por G.M. Garrity & J. G. Holt en el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, segunda edición, volumen 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz.

Se entenderá que para las especies mencionadas, la invención comprende los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, independientemente del nombre de especie por el cual se los conoce. Los expertos en la técnica fácilmente reconocen la identidad de los equivalentes apropiados.

Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tales como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). P. ej., Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 está disponible públicamente en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania). Esta cepa también fue depositada en otras instituciones depositarias de la siguiente manera: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489.

Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener a partir de otras fuentes incluidos microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos puede entonces ser derivada seleccionando de forma similar un ADN genómico o genoteca de ADNc de otro microorganismo. Una vez que se ha detectado una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con la/s sonda/s, la secuencia se puede aislar o clonar utilizando técnicas conocidas por personas con conocimientos en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

Tal y como se define en la presente, un polipéptido "aislado" o "purificado " es un polipéptido que esencialmente está libre de polipéptidos, p. ej., al menos puro en aproximadamente un 20%, preferiblemente al menos puro en aproximadamente un 40%, más preferiblemente puro en aproximadamente un 60%, incluso más preferiblemente puro en aproximadamente un 80%, de forma más preferible puro en aproximadamente un 90%, e incluso de forma más preferible puro en aproximadamente un 95%, como lo determina SDS-PAGE.

Los polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en los cuales otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido de fusión se produce por fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, p. ej. PCR, o ligando las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén en el mismo marco de lectura y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor/es y terminador.

En otras formas de realización particulares, la invención excluye una o más de las proteasas derivadas de (i) Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 que se describe en WO 88/03947; (ii) cepa de Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508) que se describe en JP 2-255081-A; (iii) cepa ZIMET 43647 de la especie Nocardiopsis dassonvillei que se describe en DD 200432|8; (iv) Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM-P-18676) que se describe en JP 2003284571; y/o (v) el ADN correspondiente.

Secuencias de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención. Secuencias particulares de ácidos nucleicos de la invención son los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1, de la cual los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 corresponden a la región que codifica el polipéptido maduro, al igual que los nucleótidos 568-1143, de la SEC ID nº: 5. La presente invención también comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-188, de la SEC ID nº: 2, o los aminoácidos 1-192, de la SEC ID nº: 6, que difieren de las partes correspondientes de la SEC ID nº: 1 en virtud de la degeneración del código genético.

La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad de (i) nucleótidos 568-1143 de SEC ID nº: 5, o a (ii) los nucleótidos 88-1143 de la SEC ID nº: 5, de al menos un 79%. En formas de realización particulares, el grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos de (i) o (ii) es al menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99%.

La presente invención también comprende secuencias de ácidos nucleicos mutantes que comprenden al menos una mutación en cualquiera de las SEC ID nº: 1 o 5, preferiblemente en las regiones que codifican el péptido maduro, en las cuales la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste en los aminoácidos 1-188, de la SEC ID nº: 2, o los aminoácidos 1-192, de la SEC ID nº: 6; o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i).

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención de tal ADN genómico puede ser efectuada, p. ej., usando la conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonado con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia de ácidos nucleicos se puede clonar de una cepa de Nocardiopsis u otra u organismo relacionado y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región que codifica el polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos.

El término "secuencia aislada de ácidos nucleicos" según se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., al menos pura en aproximadamente un 20%, preferiblemente al menos pura en aproximadamente un 40%, más preferiblemente al menos pura en aproximadamente un 60%, incluso más preferiblemente al menos pura en aproximadamente un 80%, y de la forma más preferible al menos pura en aproximadamente un 90% según se determina por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada puede obtenerse por procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos de su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

La modificación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión "sustancialmente similares" al polipéptido se refiere a las formas presentes de manera natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna forma creada genéticamente del polipéptido aislado de su fuente nativa, p. ej., variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, alergenicidad o similares. La secuencia variante puede ser construida basándose en la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte que codifica el polipéptido de la SEC ID nº: 1 y/o 5, p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificadas por la secuencia de ácidos nucleicos, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la proteasa, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia diferente de aminoácidos. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Los polipéptidos poco alergénicos pueden ser preparados, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Será evidente para los expertos en la materia que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y aún así obtener como resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificados por la secuencia aislada de ácidos nucleicos de la invención, y, por lo tanto, preferiblemente no sujetos a sustitución, pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (véase, por ej., Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, las mutaciones se introducen en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para la actividad de proteasa para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de sustrato-proteasa también pueden ser determinados por análisis de la estructura tridimensional como se determina por técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (véase, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La presente invención también se refiere a secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención, que se hibridan bajo condiciones de astringencia alta, y de la forma más preferible condiciones de astringencia muy alta con una sonda de ácidos nucleicos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID nº: 1 y/o 5, (Sambrook et al., 1989, supra), tal y como se define en la presente.

La presente invención también se refiere a secuencias aisladas de ácidos nucleicos producidas (a) hibridando un ADN bajo condiciones de astringencia alta o muy alta con los nucleótidos 502-1065, de la SEC ID nº: 1, o los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5, y (b) aislando la secuencia de ácidos nucleicos.

Métodos para producir secuencias mutantes de ácidos nucleicos

La presente invención además comprende métodos para producir una secuencia mutante de ácidos nucleicos, que comprende la introducción de al menos una mutación en la secuencia que codifica el polipéptido maduro de las SEC ID nº: 1 y/o 5, o una subsecuencia de las mismas, donde la secuencia mutante de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos -167 a 188, preferiblemente 1-188, de SEC ID nº: 2, o los aminoácidos -160 a 192, preferiblemente 1-192, de SEC ID nº: 6; o un fragmento de los mismos con actividad de proteasa.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar por mutagénesis dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Es de particular utilidad el procedimiento que utiliza un vector de ADN superenrollado bicatenario con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación cíclica de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. En la incorporación de los cebadores, se genera un plásmido mutado que contiene muescas alternadas. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con Dpnl que es específico para ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar para ADN sintetizado que contiene la mutación. También pueden utilizarse otros procedimientos conocidos en la técnica.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Debe entenderse que la expresión incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido que incluya, de modo no limitativo, transcripción, modificación postranscripción, traducción, modificación postraduccional y secreción.

El "constructo de ácidos nucleicos" se define en la presente como una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenario, que se aísla de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico combinado y superpuesto en un modo que, de lo contrario, no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. El término "secuencia codificante" es definido en la presente como una secuencia de ácidos nucleicos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los bordes de la secuencia codificante generalmente son determinados por un sitio de unión al ribosoma (procariotas) o por el codón de iniciación ATG (eucariotas) localizado justo arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia de terminación de transcripción localizada justo abajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, de modo no limitativo, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes.

Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención se puede manipular en una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. En la técnica se conocen las técnicas para modificar las secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinante.

El término "secuencias de control" se define en la presente para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, de modo no limitativo, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminación de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlaces con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido. La expresión "operativamente vinculado" se define en la presente como una configuración en la cual una secuencia de control es apropiadamente colocada a una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirija la expresión de un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y se pueden obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, genes xyIA y xyIB de Bacillus subtilis y gen procariótico de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94 y en Sambrook et al., 1989, supra.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus nidulans y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores híbridos, mutantes y truncados de los mismos.

En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles a partir de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de terminación de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación está operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

Los terminadores preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, sintasa de antranilato de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

Terminadores preferidos para células huéspedes bacterianas, tales como una célula huésped de Bacillus, son los terminadores de gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus o gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens.

La secuencia de control puede también ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente vinculada al término 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia guía que es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada en la presente invención.

Líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Líderes adecuados para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces Cerevisiae, 3-fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y que, transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada en la presente invención.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región que codifica el péptido señal que codifique una secuencia de aminoácidos vinculada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos puede contener intrínsecamente una región que codifica el péptido señal naturalmente vinculada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es extranjera a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal externa puede ser requerida donde la secuencia codificante naturalmente no contiene una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal externa puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. No obstante, en la presente invención se puede utilizar cualquier región codificante del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección.

Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes filamentosas fúngicas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.

Los péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura se obtienen a partir de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido generalmente está inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener a partir de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

La región codificante del propéptido son los nucleótidos 1-501 de SEC ID nº: 1, o los nucleótidos 88-567 de la SEC ID nº: 5.

Donde tanto el péptido señal como las regiones del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido relativa al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que provocan que la expresión del gen se produzca o no en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas de los operadores lac, tac y Trp. En levadura, puede utilizarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, el promotor para TAKA alfa-amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae puede ser utilizado como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido sería operativamente vinculada con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diferentes secuencias de ácido nucleico y de control anteriormente descritas se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido en esos sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención se puede expresar por la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente vinculada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede estar convenientemente sujeto a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual se introducirá el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique con el/los cromosoma/s en que ha sido integrado. Además, puede utilizarse un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se introducirá en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes daI de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, de modo no limitativo, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Para el uso en una célula de Aspergillus son preferidos los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un/os elemento/s que permite/n la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una/s ubicación/es precisa/s en el/los cromosoma/s. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y de forma más preferible 800 a 1.500 pares de bases, que sean altamente homólogos a la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homologa a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que le permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMB1 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son los orígenes de replicación de 2 miera, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que haga que su funcionamiento sea sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).

Más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Un aumento en el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácidos nucleicos donde las células que contengan copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y así copias adicionales de la secuencia de ácidos nucleicos, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989, supra).

La proteasa también puede ser coexpresada junto con al menos otra enzima de interés para piensos para animales, como una amilasa, por ejemplo alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

Las enzimas se pueden coexpresar a partir de distintos vectores, a partir de un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Al utilizar vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes y orígenes de replicación diferentes. A utilizar sólo un vector, los genes pueden expresarse a partir de uno o más promotores. Si se clonan bajo la regulación de un promotor (di o multicistrónico), el orden en el cual los genes son clonados puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. La proteasa puede también ser expresada como una proteína de fusión, es decir, que el gen que codifica la proteasa se ha fusionado dentro del marco de lectura del gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huéspedes

La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprendan una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, que sean ventajosamente usados en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se autorreplica como se describe anteriormente. El término "célula huésped" se refiere a cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped depende en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota.

Las células unicelulares útiles son células bacterianas como las bacterias gram positivas que incluyen, de modo no limitativo, una célula de Bacillus, o una célula de Streptomyces, o células de bacterias del ácido láctico; o bacterias gram negativas como E. coli y Pseudomonas sp. Las bacterias de ácido láctico incluyen, de modo no limitativo, especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus y Enterococcus.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto (véase, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology169: 5771-5278).

La célula huésped puede ser un eucariota, tal como una célula de animal no humano, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica.

En una forma de realización particular, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" según se utiliza en este caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chitridiomycota, y Zigomycota (según la definición de Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que los Oomycota (según se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

En otra forma de realización particular, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" según se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidiosporogénea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series nº 9,1980).

La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según las definen Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

Ejemplos de células huéspedes filamentosas fúngicas son células de especies de, pero de modo no limitativo, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.

Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritas en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar la especie de Fusarium están descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. 147-156 y WO 96/00787. Levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una cepa, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. Preferiblemente, la cepa es del género Nocardiopsis, más preferiblemente Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis dassonvillei o Nocardiopsis alba, más preferiblemente Nocardiopsis alba DSM 15647, o Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutantes que comprende al menos una mutación en los nucleótidos 502-1065 o 1-1065 de la SEC ID nº: 1, o en los nucleótidos 1-1143, 88-1143, preferiblemente 568-1143 de la SEC ID nº: 5, en la cual la secuencia mutante del ácido nucleico codifica un polipéptido que (i) consiste en los aminoácidos 1 a 188, o -167 a 188, de la SEC ID nº: 2, o los aminoácidos -160 a 192, preferiblemente 1-192, de la SEC ID nº: 6, o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i) o (iv) es un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i).

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluidas fermentaciones continuas, discontinuas, alimentadas discontinuas o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, puede recuperarse de lisados celulares.

Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto, o desaparición de un sustrato. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de proteasa para determinar la actividad del polipéptido según se describe en este caso.

El polipéptido resultante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos, pero de modo no limitativo, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluidos, pero de modo no limitativo, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, cromatoenfoque, hidrofóbico y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas

La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido puede recuperarse de la planta o parte de planta. De forma alternativa, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante puede ser utilizada como tal para mejorar la calidad del alimento o pienso, p. ej., mejorar el valor nutritivo, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

En una forma de realización particular, el polipéptido está dirigido a las vacuolas de almacenamiento de endospermo en semillas. Este se puede obtener sintetizándolo como un precursor con un péptido señal adecuado; véase Horvath et al en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, nº 4, p. 1914-1919.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea o variantes de las mismas creadas genéticamente. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son las hierbas, tales como poa pratense (poa azul, Poa), hierba forrajera como Festuca, Lolium, césped templado, como Agrostis y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, tritical (híbrido de trigo estabilizado (Triticum) y centeno (Secale) y maíz. Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, alubias y semilla de soja y plantas cruciferas (familia Brassicaceae), como girasol (Helianthus), algodón (Gossypium), coliflor, semilla de colza y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana. Las plantas bajas en fitato como se describe p. ej. en la patente estadounidense nº. 5689054 y la patente estadounidense nº 6111168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente.

Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutas, semillas y tubérculos, al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, p. ej. epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. También, los compartimentos específicos de célula vegetal, como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma son considerados una parte de planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se consideran una parte de planta. Asimismo, las partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también son consideradas partes de planta, p. ej. embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semilla.

También se incluye dentro del campo de la presente invención la progenie de esas plantas, partes de planta y células vegetales.

La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propagando la planta modificada o célula vegetal resultante en una planta o célula vegetal transgénica.

Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente vinculado con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huéspedes en las cuales el constructo de expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto depende del método de introducción de ADN que se use).

La elección de secuencias reguladoras, como secuencias de promotores y terminadores y opcionalmente las secuencias señal o de tránsito son determinadas, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica de fase o tejido y el producto genético puede ser dirigido a un tejido específico o parte de planta como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva, los siguientes promotores pueden ser utilizados: El promotor ^{35}S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), la ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation), o el promotor de actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McEIroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' región activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Los promotores específicos a un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de patata y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen desconocido de proteína de semilla de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de almacenamiento de proteínas de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, p. ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja como el promotor de eritrocitos de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor de patata pin2 (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducible por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, p. ej. etanol, estrógenos, hormonas vegetales como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados.

También se puede utilizar un elemento intensificador del promotor para conseguir mayor expresión de la proteasa en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión.

Adicionalmente, el uso de codón puede optimizare para que las especies vegetales en cuestión mejoren la expresión (véase Horvath et al mencionado anteriormente).

El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se pueden elegir de aquellas disponibles en la técnica.

El constructo de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluida la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también puede ser usado para transfomar monocotiledóneas, aunque generalmente se prefieren otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas, complementando el enfoque de Agrobacterium, es el bombardeo de partículas (partículas de oro microscópico o tungsteno revestidas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como la describen Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que hayan incorporado el constructo de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica.

Un polipéptido de la presente invención se puede producir por un método que comprende (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Animales

La presente invención también se refiere a un animal transgénico no humano y productos o elementos de los mismos. Ejemplos de éstos son los fluidos corporales como leche y sangre, órganos, carne y células animales. Las técnicas para expresar proteínas, p. ej. en células mamíferas, son conocidas en la técnica; véase p. ej. el manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999) y los otros tres manuales en esta serie acerca de la transcripción de genes, maduración del ARN y tratamiento postraduccional. En términos generales, para preparar un animal transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado se transforman con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido. El polipéptido puede ser recuperado del animal, p. ej. de la leche de animales hembras, o el polipéptido se puede expresar en beneficio del animal mismo, p. ej. para ayudar a la digestión del animal. A continuación se mencionan ejemplos de animales en la sección titulada Piensos para
animales.

Para producir un animal transgénico con el propósito de recuperar la proteasa de la leche del animal, se puede insertar un gen que codifica la proteasa en los ovarios fertilizados de un animal en cuestión, p. ej. usando un vector de expresión de transgen que comprenda un promotor adecuado de proteínas de leche y el gen que codifica la proteasa. El vector de expresión de transgen se microinyecta en ovarios fertilizados, y preferiblemente es integrado permanentemente en el cromosoma. Una vez que el ovario comienza a crecer y dividirse, el embrión potencial se implanta en una madre sustituta y los animales que llevan el transgen son identificados. El animal resultante después puede ser multiplicado por cultivo convencional. El polipéptido puede ser purificado de la leche de animal; véase p. ej. Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez y J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press.

En la alternativa, para producir un animal transgénico no humano que lleve en el genoma de sus células somáticas y/o germinales una secuencia de ácidos nucleicos que incluya un constructo de transgen heterólogo incluido un transgen que codifica la proteasa, el transgen puede estar operativamente vinculado a una primera secuencia reguladora para la expresión específica de la glándula salival de la proteasa, como está descrito en WO 2000064247.

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Composiciones

En otro aspecto posterior, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención.

Las composiciones de polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que será incluido en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

A continuación se presentan ejemplos de usos preferidos de los polipéptidos o composiciones de polipéptido de la invención.

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Piensos para animales

La presente invención también está dirigida a usar los polipéptidos de la invención en piensos para animales, al igual que a composiciones de piensos y aditivos de piensos que comprenden los polipéptidos de la invención.

El término animal incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras, caballos y ganado, p. ej. ganado bovino, vacas y terneros jóvenes. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p. ej. cerdos o puercos (incluidos, de modo no limitativo, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves como pavos, patos y pollo (incluidos, de modo no limitativo, pollos de engorde, ponedoras); terneros jóvenes y peces (incluidos, de modo no limitativo, salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas y crustáceos (incluidos, de modo no limitativo, gambas y cigalas).

El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para la ingesta por parte de un animal, o destinada para ello.

En el uso según la invención la proteasa se puede dar como alimento al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

En particular, la proteasa, en la forma en la que se agrega al pienso, o incluida en un aditivo de pienso, está bien definida. Bien definida significa que la preparación de la proteasa es pura en al menos un 50% según ha sido determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares la preparación de proteasa es pura al menos en un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos un 95% según se determina por este método.

Una preparación de proteasa bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al pienso una proteasa que esté esencialmente libre de interferir o contaminar otras proteasas. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes y la capacidad de optimizar la dosificación sobre la base del efecto deseado.

Para el uso en pienso para animales, no obstante, la proteasa no necesita ser tan pura; puede p. ej. incluir otras enzimas, en cuyo caso podría ser denominada una preparación de proteasa.

La preparación de proteasa puede ser (a) agregada directamente al alimento (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) puede usarse en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos o premezclas alimenticias que posteriormente son agregadas al alimento (o usadas en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de proteasa original, así se utilice según (a) o (b) mencionados.

Las preparaciones de la proteasa con purezas de este orden de magnitud son en particular obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que no son tan fácilmente obtenidas y también están sujetas a una variación entre lotes mucho más alta cuando la proteasa se produce por métodos de fermentación tradicionales.

Tal preparación de proteasa por supuesto puede ser mezclada con otras enzimas.

En particular, la proteasa para el uso según la invención es capaz de solubilizar proteínas. Un ensayo adecuado para determinar las proteínas solubilizadas se describe en el ejemplo 5.

La proteína puede ser una proteína animal, tal como harina de carne y hueso y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales según se utilizan en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada o originada de un vegetal, incluidas las proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60% (p/p).

Las proteínas vegetales pueden derivarse de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tal como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

En particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej. semilla de soja, altramuz, guisante o alubia.

La fuente de proteína vegetal también puede ser material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej. remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo.

La semilla de soja es una fuente de proteína de vegetal preferida.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, tritical y sorgo.

El tratamiento de las proteínas con al menos una proteasa de la invención da como resultado una solubilización aumentada de proteínas.

A continuación se encuentran ejemplos de % de proteína solubilizada obtenible usando las proteasas de la invención en un modelo monogástrico in vitro: Al menos 101%, o al menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, o al menos 107%, en relación a un blanco. El porcentaje de proteína solubilizada se determina usando el modelo monogástrico in vitro del ejemplo 5. El término solubilización de proteínas significa básicamente llevar proteína/s en solución. Esa solubilización se puede deber a la liberación mediada por proteasa de proteína de otros componentes de las composiciones naturales normalmente complejas como el pienso.

Además, la proteasa para el uso según la invención es capaz de aumentar la cantidad de proteínas digeribles. A continuación se encuentran ejemplos de % de proteína digerida o digerible obtenible usando las proteasas de la invención en un modelo monogástrico in vitro: Al menos 101%, o al menos 102%, en relación a un blanco. El porcentaje de proteína digerida o digerible se determina usando el modelo in vitro del ejemplo 5.

Además, la proteasa para el uso según la invención es capaz de aumentar el grado de hidrólisis (GH) de las proteínas. En una forma de realización particular, el grado de hidrólisis es al menos 101%, 102%, 103%, 104% o al menos 105%, en relación a un blanco. El grado de hidrólisis se determina usando el modelo in vitro del ejemplo 5.

En un proceso de (pre) tratamiento particular, la/s proteasa/s en cuestión afecta/n (o actúa/n, o ejerce/n su influencia de solubilización en) las proteínas o fuentes de proteína. Para lograr esto, la proteína o fuente de proteína típicamente es suspendida en un solvente, p. ej. un solvente acuoso tal como agua, y los valores del pH y de la temperatura son ajustados considerando las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede tener lugar a un valor de pH en el que la actividad de la proteasa real sea al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede tener lugar a una temperatura en la cual la actividad de la proteasa real sea al menos un 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos 90%. Las indicaciones de porcentaje de actividad mencionadas son relativas a las actividades máximas. La reacción enzimática es continua hasta que se alcanza el resultado deseado, después de lo cual puede o no ser detenida inactivando la enzima, p. ej. por una fase de tratamiento térmico.

En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento, la acción de la proteasa es sostenida, lo cual significa p. ej. que la proteasa se añade a las proteínas o fuentes de proteína, pero su influencia de solubilización es, por decirlo de algún modo, no accionada hasta más tarde cuando se desee, una vez que las condiciones adecuadas de solubilización son establecidas, o una vez que cualquier inhibidor enzimático es inactivado, o cualquier otro medio podría haber sido aplicado para posponer la acción de la enzima.

En una forma de realización el tratamiento es un pretratamiento de pienso para animales o proteínas para el uso en pienso para animales.

La expresión mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales significa mejorar la disponibilidad y/o la digestibilidad de las proteínas, conduciendo así a la extracción aumentada de proteínas de los componentes de la dieta, rendimientos más altos de proteínas, degradación aumentada de las proteínas y/o la utilización mejorada de las proteínas. El valor nutritivo del pienso es, por lo tanto, aumentado, y el rendimiento del animal tal como el índice de crecimiento y/o aumento de peso y/o proporción de conversión del pienso (es decir, el peso del pienso ingerido en relación al aumento de peso) del animal es/son mejorado/s.

En particular, la relación de conversión del pienso se aumenta en al menos un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o al menos en un 10%. El aumento de peso se aumenta en al menos un 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o al menos en un 11%. Estas cifras son relativas a los experimentos de control sin adición de proteasa.

La proporción de conversión del pienso (FCR, por sus siglas en inglés) y el aumento de peso pueden ser calculados según se describe en EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés à la volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130,
53-54.

La proteasa se puede agregar al pienso en cualquier forma, ya sea como una proteasa relativamente pura, o en aditivo con otros componentes destinados a la adición a pienso para animales, es decir, en forma de aditivos de pienso para animales, como las denominadas premezclas para pienso para animales.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en pienso para animales, tales como pienso para animales, y aditivos de pienso para animales, p. ej. premezclas.

Además de la proteasa de la invención, los aditivos de pienso para animales de la invención contienen al menos una vitamina soluble en grasa y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento. El aditivo de pienso para animales también puede contener al menos un macromineral.

Otros ingredientes de aditivo de pienso opcionales son los agentes colorantes, p. ej. carotenoides como betacaroteno, astaxantina y luteína; compuestos aromáticos; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especies generadoras de oxígeno reactivo; y/o al menos otra enzima seleccionada entre la amilasa como, por ejemplo, amilasa como alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

En una forma de realización particular, estas otras enzimas son bien definidas (como se define anteriormente para preparaciones de proteasa).

Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMPs) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina y Ovispirina como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas y Estatinas, incluidos los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

Ejemplos de polipéptidos antimicóticos (AFPs) son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, al igual que las variantes y los fragmentos de los mismos los cuales retienen actividad antifúngica, según se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18; C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico.

Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

Usualmente las vitaminas solubles en grasa e hidrosolubles, al igual que los oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada a la adición al pienso, mientras que los macrominerales habitualmente se agregan separadamente al alimento. Una premezcla enriquecida con una proteasa de la invención, es un ejemplo de un aditivo de pienso para animales de la invención.

En particular, el aditivo de pienso para animales de la invención está destinado a ser incluido (o se prescribe que debe ser incluido) en dietas para animales o pienso a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así en particular para las premezclas.

Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K, p. ej. vitamina K3.

Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p. ej. Ca-D-pantotenato.

Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.

Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con ave y lechones/cerdos) están catalogados en la tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

En la alternativa, el aditivo de pienso para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este componente individual, al menos uno, se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal para proporcionar una concentra-
ción en el pienso en la gama indicada en la columna cuatro, o la columna cinco, o la columna seis de la tabla de A.

La presente invención también se refiere a composiciones de pienso para animales. Las composiciones de dietas o pienso para animales tienen un contenido de proteína relativamente alto. Las dietas para aves y cerdos pueden ser caracterizadas como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden ser caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además, esas dietas para peces normalmente tienen un contenido de grasa bruto de 200-310 g/kg. WO 01/58275 corresponde a US 09/77334 que es incorporada en la presente a modo de referencia.

Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta de 50-800 g/kg, y además, comprende al menos una proteasa como se reivindica en la presente.

Además, o en la alternativa (al contenido de proteína bruta indicado anteriormente), la composición de pienso para animales tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

En particular, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

La proteína bruta es calculada como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) X 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., Official Methods of Analysis 14ª ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

La energía metabolizable puede calcularse basándose en la publicación de NRC Nutrient requirements in swine, novena edición corregida 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2-6, y European Table of Energy Valúes for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo y aminoácidos disponibles en dietas completas para animales es calculada basándose en las tablas de pienso como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En particular, la composición de pienso para animales contiene al menos una proteína o fuente de proteína tal como se ha definido anteriormente. También puede contener proteína animal, tal como harina de carne y hueso, y/o harina de pescado, típicamente en una cantidad de 0-25%.

Adicionalmente, la composición de pienso para animales contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; 0-25% de harina de carne y hueso; y/o 0-20% de lactosuero.

Las dietas para animales pueden p. ej. ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Típicamente, los piensos molidos se mezclan y se agregan cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. Las enzimas pueden ser agregadas como formulaciones enzimáticas líquidas o sólidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida típicamente es agregada antes o durante la fase de mezcla; y una preparación enzimática líquida típicamente es agregada después del fase de granulación. La enzima también puede ser incorporada en un aditivo de pienso para animales o premezcla.

La concentración enzimática final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 0,5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.

La proteasa por supuesto debería ser aplicada en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutritivo del alimento. Se contempla actualmente que la enzima se administre en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0,01-200, 0,.01-100, 0,5-100, 1-50, 5-100, 10-100, 0,05-50; o 0,10-10 - todas estas gamas están en mg de proteína enzimática de proteasa por kg de pienso (ppm).

Para determinar los mg de proteína enzimática por kg de pienso, la proteasa se purifica de la composición alimenticia y la actividad específica de la proteasa purificada se determina usando un ensayo pertinente (véase actividad de proteasa, sustratos, y ensayos). La actividad de la proteasa de la composición de pienso como tal también es determinada usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína enzimática por kg de pienso.

Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína enzimática en aditivos de piensos. Por supuesto, si una muestra está disponible a partir de la proteasa usada para preparar el aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (no hay necesidad de purificar la proteasa de la composición de pienso o el aditivo).

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Composiciones de detergentes

La proteasa de la invención se puede agregar a una composición de detergente y así convertirse en un componente de la misma.

La composición de detergente de la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición de detergente de lavado a mano o a máquina incluida una composición de aditivo para lavado adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante agregada al enjuague, o ser formulada como una composición de detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la proteasa de la invención. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una o más enzimas tales como otra proteasa, como proteasas alcalinas de Bacillus, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, p. ej., una lacasa, y/o una peroxidasa.

En general, las propiedades de la/s enzima/s elegida/s deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la/s enzima/s debería/n estar presente/s en cantidades eficaces. Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por ingeniería de las proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces), p. ej. de H. lanuginosa (T. lanuginosus) según se describe en EP 258068 y EP 305216 o de H. insolens según se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej. de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Las enzimas de lipasa preferidas comercialmente disponibles incluyen Lipolase™ y Lipolase Ultra™ (Novozymes A/S).

Las amilasas (alfa y/o beta) adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o por ingeniería de las proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, p. ej. una cepa especial de B. licheniformis, descrita en más detalle en GB 1,296,839. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 97/43424, WO 00/60060 y WO 01/66712, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. amilasas comercialmente disponibles son Natalase™, Supramyl™, Stainzyme™, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.).

Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o por ingeniería de las proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa como las descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, 5,457,046, 5,686,593, 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 99/01544. Celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC- 500(B)™ (Kao Corporation).

Peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o por ingeniería de las proteínas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C. cinereus, y variantes de las mismas como las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzyme™ (Novozymes).

La/s enzima/s detergente/s se puede/n incluir en una composición de detergente añadiendo aditivos separados con una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado p. ej. como un granulado, un líquido, un compuesto acuoso, etc. Formulaciones de aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular, granulados no pulverizados, líquidos, en particular, líquidos estabilizados o lodos.

Los granulados no pulverizados pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente pueden ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de óxido de polietileno (polietilenoglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuados para aplicación por técnicas de lecho fluidificado se dan en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238216.

La composición de detergente de la invención puede ser en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente hasta un 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluidos semipolares y/o amónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos típicamente están presentes a un nivel de un 0,1% a un 60% en peso.

Cuando se incluye, el detergente normalmente contiene de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 40% de un tensioactivo aniónico como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.

Cuando se incluye, el detergente normalmente contiene de aproximadamente 0, 2% a aproximadamente 40% de un tensioactivo no iónico como alcohol etoxilato, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso polihidroxi alquilo, o derivados N-acilo o N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").

El detergente puede contener un 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquenilsuccínico o alquilo, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), alcohol polivinílico, poli(vinilpiridin-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de ácido de lauril metacrilato/acrílico.

El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador del blanqueamiento formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos de p. ej. tipo amida, imida o sulfona.

La/s enzima/s de la composición detergente de la invención puede/n ser estabilizada/s usando agentes estabilizantes convencionales, p. ej., un poliol como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico como ácido 4-formilfenil borónico y la composición puede ser formulada como se describe en p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales como p. ej. acondicionadores de tejido incluidas arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes de reposición antisuciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de la decoloración o perfumes.

Actualmente se contempla que en las composiciones de detergentes cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, se puede agregar en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado, preferiblemente 0, 05-5 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado, en particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado.

La enzima de la invención puede adicionalmente incorporarse en las formulaciones de detergentes descritas en WO 97/07202.

Depósito de material biológico

El siguiente material biológico, aislado de una muestra de tierra recogida en Dinamarca en 2001, se ha depositado según las condiciones del Tratado de Budapest con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, y ha recibido el siguiente número de acceso:

300

La cepa se ha depositado bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la pendencia de las solicitudes de patente a la persona que el Comisario de Patentes y Marcas Registradas determine que tiene derecho a ello bajo 37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según lo requieren las leyes de patentes extranjeras en países donde se han presentado copias de estas solicitudes o su progenie. No obstante, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención en derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión de la proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 Reactivos y medios

4

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Procedimiento experimental

: SEC ID nº: 1 es la secuencia de ADN que codifica una proforma de la proteasa de Nocardiopsis alba DSM 15647. Los nucleótidos 502 -1065 corresponden a la parte codificante del péptido maduro.

: SEC ID nº: 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID nº: 1. Los aminoácidos -167 a -1 es el propéptido y los aminoácidos 1 a 188, el péptido maduro.

Clonación de la SEC ID nº: 1

El tipo salvaje fue dejado crecer durante 3 días antes de la cosecha en el siguiente medio a 30ºC:

6

pH ajustado a 9 por adición de carbonato de sodio

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El ADN genómico de Nocardiopsis alba DSM 15647 fue aislado según el siguiente procedimiento:

: Cosechar 1,5 ml de cultivo y resuspender en 100 \mul de TEL. Incubar a 37ºC durante 30 min.

: Añadir 500 \mul de tampón de tiocinato y dejar a temperatura ambiente durante 10 min.

: Añadir 250 \mul de NH_{4}AC y dejar en hielo durante 10 min.

: Añadir 500 \mul de CIA y mezclar.

: Transferir a una microcentrifugadora y centrifugar durante 10 min. a toda velocidad.

: Transferir el sobrenadante a un tubo de Eppendorf nuevo y añadir 0,54 volúmenes de isopropanol frío. Mezclar íntegramente.

: Centrifugar y lavar el granulado de ADN con EtOH al 70%.

: Resuspender el ADN genómico en 100 \mul de TER.

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El ADN genómico fue usado como molde para amplificación de PCR usando los siguientes cebadores SEC ID nº 3 y 4. El fragmento de PCR fue aislado en un gel de agarosa al 0,7%.

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Cebadores

7

El fragmento de PCR digerido y purificado fue ligado al plásmido pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/
Sav digerido con Cla I y BamH I (patente estadounidense nº 5955310).

La mezcla de ligadura fue usada para transformación en E. coli TOP10F' (Invitrogen BV, Países Bajos) y diferentes colonias fueron seleccionadas para miniprep (QIAprep spin, QIAGEN GmbH, Alemania). Los plásmidos purificados fueron controlados para inserto antes de la transformación en una cepa de Bacillus subtilis derivada de B. subtilis DN 1885 con los genes apr, npr y peI interrumpidos (Diderichsen et al (1990), J. Bacteriol., 172, 4315-4321). La interrupción fue realizada esencialmente como se describe en "Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria", American Society for Microbiology, p.618, eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch y Richard Losick (1993). Las células transformadas fueron colocadas en placas de agar LB-PG y leche desnatada al 1%, suplementadas con 6 \mug/ml de cloranfenicol. Las células colocadas en placas fueron incubadas durante toda la noche a 37ºC y se identificaron colonias con contenido de protasa en una zona despejada circundante. Las colonias positivas de proteasa fueron seleccionadas y la secuencia codificante de la enzima expresada del constructo de expresión fue confirmada por análisis de la secuencia de ADN.

Fermentación

La célula huésped de Bacillus subtilis transformada como se ha descrito anteriormente fue fermentada en una mesa vibradora giratoria (250 r.p.m.) en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con deflectores con 100 ml de medio PS-1 suplementado con 6 \mug/ml de cloranfenicol, a 37ºC durante 16 horas y a 26ºC por 4 días adicionales.

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Ejemplo 2 Purificación y caracterización de la proteasa de Nocardiopsis alba DSM 15647 Ensayos de proteasa 1) Ensayo de pNA

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20 \mul de proteasa (diluida de Triton X-100 al 0,01%) se mezcla con 100 \mul de tampón de ensayo. El ensayo se inicia añadiendo 100 \mul de sustrato de pNA (50 mg disuelto en 1,0 ml de DMSO y además diluido 45x con Triton X-100 al 0,01%). El aumento en OD_{405} es controlado como una medida de la actividad de la proteasa.

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2) Ensayo de Protazyme AK

80

Una pastilla de Protazyme AK se suspende en 2,0 ml de Tritón X-100 al 0,01% por agitación suave. 500 \mul de esta suspensión y 500 \mul de tampón de ensayo se mezclan en un tubo de Eppendorf y se colocan en hielo. Se añaden 20 \mul de muestra de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0,01%). El ensayo se inicia transfiriendo el tubo de Eppendorf a un termomezclador de Eppendorf, que se fija a la temperatura del ensayo. El tubo se incuba durante 15 minutos en el termomezclador de Eppendorf a su índice de agitación máximo (1400 r.p.m.). La incubación se detiene transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo. Luego el tubo se centrifuga en un centrifugador congelado durante unos minutos y 200 \mul del sobrenadante se transfieren a una placa de microtitulación. OD_{650} se lee como una medida de actividad de proteasa. Se incluye un tampón ciego en el ensayo (en vez de enzima).

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La fermentación de proteasa descrita en el ejemplo 1 fue centrifugada (20000 X g, 20 min) y los sobrenadantes fueron cuidadosamente decantados de los precipitados. Los sobrenadantes combinados fueron filtrados a través de una placa Seitz EKS para eliminar el resto de las células de Nocardiopsis. El filtrado de EKS fue transferido a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7 en un columna Sephadex G25 que dio como resultado una solución turbia. El turbidez fue eliminada por otra filtración a través de una placa Seitz EKS. El filtrado claro fue aplicado a una columna de sílice de bacitracina equilibrado en el mismo tampón. Después de lavar la columna ampliamente con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida por fases con 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl_{2}, 1M de NaCl, isopropanol al 25%, pH 7. El eluato de bacitracina fue transferido a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCk, pH 7 en una columna Sephadex G25 y concentrada por ultrafiltración a un volumen mínimo en una célula de concentración de Amicon equipada con una membrana cortada de 5000 Da. La enzima concentrada fue aplicada a una columna de exclusión por tamaño Superdex 75 equilibrada en 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCh, 200 mM de NaCl, pH 7 y la columna fue eluida con el mismo tampón. Se analizó la actividad de proteasa de fracciones de la columna (usando el ensayo Protazyme AK a 37ºC y pH 9) y las fracciones activas fueron analizadas posteriormente por SDS- PAGE. Las fracciones, dónde sólo una banda fue vista en el gel SDS-PAGE manchado de Coomassie, fueron agrupadas como la preparación purificada y fue usada para otra caracterización.

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Actividad de pH. estabilidad de pH y actividad de la temperatura

El ensayo de pNA fue usado para obtener el perfil de la actividad del pH al igual que el perfil de estabilidad de pH. Para el perfil de estabilidad del pH la proteasa fue diluida 10x en los tampones de ensayo e incubada durante 2 horas a 37ºC. Tras la incubación, las muestras de proteasa fueron transferidas al mismo pH - pH 9, antes del ensayo para actividad residual, por dilución en el tampón de ensayo de pH 9.

El ensayo Protazime AK fue usado para obtener el perfil de actividad de temperatura a pH 9. Los resultados se muestran en las tablas 1-3 siguientes.

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TABLA 1 Perfil de la actividad del pH

9

TABLA 2 Perfil de la estabilidad del pH

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TABLA 3 Perfil de actividad de la temperatura

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La proteasa resultó ser inhibida por fenil metil sulfonil fluoruro. Su peso molecular relativo según se determinó por SDS-PAGE fue M_{r} = 19 kDa.

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Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC)

La DSC fue usada para determinar la estabilidad de la temperatura a pH 7,0 de la proteasa derivada de Nocardiopsis alba y de Nocardiopsis sp. NRRL 18262. Las proteasas purificadas fueron dializadas durante la noche a 4ºC contra 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, pH 7,0 y siguen un instrumento de calorimetría por análisis diferencial de vasopresina (Micro Cal) con una tasa de barrido constante de 1.5ºC/min de 20 a 100ºC. La manipulación de datos fue realizada usando el Software Microcal Origin.

La desnaturalización o las temperaturas de fusión, T_{m}, resultantes fueron: para la proteasa de la invención derivada de Nocardiopsis alba: 78,3ºC; para la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262: 76,5ºC.

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Ejemplo 3 Actividad específica de la proteasa de Nocardiopsis alba DSM 15647

La preparación de proteasa purificada descrita en el ejemplo 2 fue usada para la determinación de la actividad específica. La pureza de la preparación fue superior al 95% al ser analizada por SDS-PAGE (determinada según se describe en el ejemplo 2A en WO 01/58275). La muestra de proteasa fue dividida en dos. En una parte se analizó el contenido de proteína (mg/ml) por análisis de aminoácidos, en la otra parte se analizó la actividad de la proteasa.

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Análisis de aminoácidos (AAAV(mg/ml)

Los enlaces peptídicos de la muestra de proteasa fueron sometidos a hidrólisis ácida, seguida de separación y cuantificación de los aminoácidos libres en un analizador de aminoácidos Biochrom 20 Plus, comercialmente disponible de Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, según las instrucciones del fabricante. Para la hidrólisis ácida, la muestra de proteína fue secada en un centrifugador de vacío, redisuelta en 18,5% (vol/vol) de HCl + fenol al 0,1% (vol/vol) e incubada durante 16hr a 110ºC. Tras la incubación, la muestra fue otra vez secada en el centrifugador de vacío, redisuelta en tampón de carga (0.2 M de Na-citrato, pH 2,2) y cargada sobre el analizador de aminoácidos Biochrom 20 Plus.

Para la cuantificación, la muestra hidrolizada fue cargada en una columna de la resina de intercambio de cationes UltroPac nº 8, forma de sodio, que está comercialmente disponible de Bie & Berntsen A/S, catálogo nº 80-2104-15. Los tampones de pH variable (pH 1 a pH 8) y la fuerza iónica fueron bombeados a través de la columna según las instrucciones del fabricante mencionadas anteriormente, para separar los diferentes aminoácidos. La temperatura de la columna fue controlada con precisión, también según las instrucciones del fabricante (de 53ºC a 92ºC y de nuevo a 53ºC) para asegurar la separación requerida. El eluyente de la columna fue mezclado con reactivo de ninhidrina (Bie & Berntsen, catálogo nº. 80-2038-07) y la mezcla fue pasada a través de la bobina de reacción de alta temperatura del analizador de aminoácidos. En la bobina de reacción, la ninhidrina reaccionó con los aminoácidos para formar compuestos coloreados, cuya cantidad fue directamente proporcional a la cantidad de aminoácidos
presentes.

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Ensayo de actividad de la proteasa (AU/ml)

La hemoglobina desnaturalizada (0,65% (p/p) en 6,7 mM KH_{2}PO_{4}/tampón NaOH, pH 7,50) fue degradado a 25ºC durante 10 minutos por la proteasa, y la hemoglobina no asimilada fue precipitada con ácido tricloroacético (ATC) y eliminada por filtración. Los productos de degradación de hemoglobina solubles en ATC en el filtrado fueron determinados con reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu, que da un color azul con diferentes aminoácidos. La unidad de actividad (AU) fue medida y definida por referencia a un estándar de ALCALASE™. Una descripción detallada del ensayo, al igual que una muestra del estándar de ALCALASE™, está disponible a pedido de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca (ensayo nº. EB-SM-0349.02/01).

La actividad específica fue calculada como: actividad específica (AU/g) = (actividad (AU/ml)/AAA (mg/ml)) x 1000 (mg/g).

La actividad específica de la proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 fue 53.5 AU/g, en comparación con la actividad específica de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 de 38,3 AU/g.

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Ejemplo 4 Proteasa L1a

Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235 fue cultivada en el medio de tripticasa de tipo salvaje, y el ADN genómico aislado, según se describe en el ejemplo 1.

La región codificante para la proteasa pro-madura L1a (nucleótidos 88-1143 de SEC ID nº: 1) fue amplificada con los siguientes cebadores 1424 y 1485 en el ADN genómico:

: Cebador 1485 (SEC ID nº: 7): 5'-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3'

: Cebador 1424 (SEC ID nº: 8): 5'-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3'

Los polinucleótidos L1a fueron fusionados, por PCR, en marco a un fragmento de ADN heterólogo que codifica un péptido señal Sav (SEC ID nº: 9).

Una cepa de Bacillus subtilis designada Sav-L1 a fue construida incorporando el gen (incluida la parte codifcante del péptido señal) por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped de Bacillus subtilis MB1053(WO03/95658). El gen fue expresado bajo el control de un sistema de promotor triple (como se describe en WO 99/43835), que consiste en los promotores del gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, y el promotor cryIIIA de Bacillus thuringiensis que incluye la secuencia estabilizante. El gen que codifica la acetiltransferasa de Cloranfenicol fue usado como marcador (descrito en, por ejemplo, Diderichsen, B.; Poulsen, G.B.; Joergensen, S.T.; A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid 30:312 (1993)).

Se controló la actividad de proteasa de los transformantes resistentes al cloranfenicol y un transformante fue seleccionado para la verificación de secuencia como se describe en el ejemplo 1, después de lo cual fue fermentado y también descrito en el ejemplo 1, pero a 26ºC durante 6 días.

El caldo de cultivo fue centrifugado (20000 x g, 20 min) y los sobrenadantes fueron cuidadosamente decantados de los precipitados. Los sobrenadantes combinados fueron filtrados a través de una placa Seitz EKS para eliminar el resto de las células huéspedes de Bacillus. El filtrado EKS fue transferido a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7 en una columna de sephadex G25. Se añadió sulfato amónico sólido a la solución enzimática de la columna de sephadex G25 para dar una concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,6M final en la solución enzimática. La solución enzimática fue mezclada suavemente con un agitador magnético durante la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} y la agitación se continuó durante 30 minutos después de la adición para equilibrar el sistema. Luego, la solución enzimática fue aplicada a un columna de Butyl Toyopearl equilibrada en 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl_{2}, 1,6M de (NH_{4})_{2}SO_{4}, pH 7. Después de lavar por completo la columna con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente (NH_{4})_{2}SO_{4} lineal (1,6 a 0M) en el mismo tampón. Las fracciones que contienen proteasa fueron agrupadas y transferidas a 20 mM de HEPES, pH 8 en una columna de sephadex G25 y aplicadas a una columna de Q sepharose FF equilibrada en el mismo tampón. Después de lavar la columna por completo con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente de NaCl lineal (O a 0,5M) en el mismo tampón. Se analizó la actividad de proteasa de las fracciones de la columna (usando el ensayo suc-AAPF-pNA a pH 9) y las fracciones activas además fueron analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones con sólo una banda (según se juzga por un gel de SDS-PAGE manchado de Coomassie) fueron agrupadas para proporcionar la preparación purificada que fue usada para otra caracterización.

La proteasa L1a es una proteasa alfa lítica como enzima (familia de peptidasa S1E, notación anterior S2A) que demuestra ser inhibida por fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) y por el inhibidor de subtilisina de Streptomyces (SSI). Su peso molecular relativo según se determinó por SDS-PAGE es el M_{r} = 22 kDa.

La actividad específica de la proteasa L1a fue determinada como se describe en el ejemplo 3 a 49,8 AU/g.

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Ejemplo 5 Resultados in vitro en monogástricos

El rendimiento de la proteasa purificada descrita en el ejemplo 2 fue evaluado en un modelo in vitro simulando la digestión en animales monogástricos. En particular, la proteasa fue evaluada en relación a su capacidad para mejorar la solubilización y la digestión de proteínas de maíz/-SBM (harina de maíz/-soja). El sistema in vitro consistió en 10 matraces los cuales se incubó sustrato de maíz/-SMB con HCl/pepsina - simulando la digestión gástrica - y posteriormente con pancreatina - simulando la digestión intestinal. Cinco de los matraces fueron dosificados con la proteasa al principio de la fase gástrica mientras que los cinco matraces restantes sirvieron como blancos. Al final de la fase de incubación intestinal las muestras del digesto in vitro fueron eliminadas y analizadas en relación a la proteína solubilizada y digerida.

Resumen del procedimiento de digestión in vitro

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Condiciones

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Soluciones

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La cantidad de proteína de enzima proteasa (EP) se calcula basándose en los valores A_{280} y las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácido) usando los principios descritos en S. C. Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989). El procedimiento experimental fue según el resumen de más arriba. El pH fue medido en el tiempo de 1, 2,5, y 5,5 horas. Las incubaciones fueron terminadas después de 6 horas y las muestras de 30 ml fueron retiradas y colocadas en hielo antes del centrifugado (10000 x g, 10 min, 4ºC). Los sobrenadantes fueron eliminados y almacenados a -20ºC.

Todas las muestras fueron analizadas en relación al contenido de proteína solubilizada y digerida usando filtración en gel y el grado de hidrólisis (DH) con el método de OPA.

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Determinación del DH por el método OPA

El grado de hidrólisis de proteína en diferentes se determinó usando un método calorimétrico a base de placa de microtitulación semi-automatizada (Nielsen, P.M.; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis., J. Food Sci. 2001, 66, 642-646). El reactivo OPA fue preparado de la siguiente manera: 7,620 g de tetraborato di-sodio decahidratado y 200 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS) fueron disueltos en 150 ml de agua desionizada. Los reactivos fueron completamente disueltos antes de continuar. 160 mg de o-ftaldialdehído 97% (OPA) fueron disueltos en 4 ml de etanol. La solución de OPA fue transferida de forma cuantitativa a la solución mencionada anteriormente enjuagando con agua desionizada. 176 mg de ditiotreitol 99% (DTT) se añadieron a la solución que fue llenada hasta 200 mi con agua desionizada. Un estándar de serina (0, 9516 meqv/l) fue preparado solubilizando 50 mg de serina (Merck; Alemania) en 500 ml de agua desionizada.

La solución de la muestra fue preparada diluyendo cada muestra a una absorbencia (280 nm) de aproximadamente 0,5. Generalmente, los sobrenadantes fueron diluidos (100*) usando una estación de dilución Tecan automatizada (Männedorf, Suiza). Todas las otras lecturas de espectrofotómetro fueron realizadas a 340 nm usando agua desionizada como el control. 25 \mul de muestra, estándar y ciego fue dispensado en una placa de microtitulación. La placa de microtitulación fue insertada en un lector IEMS MF (Labsystems; Finlandia) y 200 \mul de reactivo OPA fue automáticamente dispensado. Las placas fueron agitadas (2 min; 700 r.p.m.) antes de medir la absorbencia. Finalmente, se calculó el DH. Se efectuó la determinación quíntupla de todas muestras.

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Estimación de la proteína solubilizada y digerida

Se calculó el contenido de proteína solubilizada en los sobrenadantes de muestras digeridas in vitro cuantificando la proteína bruta (CP) usando HPLC de filtración en gel. Los sobrenadantes fueron descongelados, filtrados a través de filtros de policarbonato de 0, 45 \mum y diluidos (1:50; v/v) con H_{2}O. Las muestras diluidas fueron cromatografiadas por HPLC usando una columna de filtración en gel (Global) Superdex Peptide PE (7,5 X 300 mm). El eluyente usado para la elución isocrática fue 50 mM de tampón de fosfato sódico (pH 7,0) con 150 mM de NaCl. El volumen total de eluyente por prueba fue 26 ml y la velocidad de flujo fue 0, 4 ml/min. El perfil de elución fue registrado a 214 nm y el área total bajo los perfiles fue determinada por integración. Para estimar el contenido de proteína de las áreas integradas, una curva de calibración (R^{2}=0,9993) fue hecha a partir de una serie de dilución de una muestra de maíz/-SBM in vitro de referencia digerida con contenido de proteína conocido. La determinación de proteína en esta muestra de referencia se efectuó usando el método de Kjeldahl (determinación de % de nitrógeno; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14ª ed., Washington DC).

El contenido de proteína digerida fue estimado integrando el área de cromatograma correspondiente a los péptidos y los aminoácidos con una masa molecular de 1500 Dalton o menos (Savoie, L.; Gauthier, S.F. Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498; Babinszky,L.; Van, D.M.J.M.; Boer, H.; Den,H.L.A. An In-vitro Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sci. Food Agr. 1990, 50, 173-178; Boisen,S.; Eggum,B.O. Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animáis. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). Para determinar la línea divisoria de 1500 Dalton, la columna de filtración en gel fue calibrada usando citocromo C (Boehringer; Alemania), aprotinina, gastrina I y sustancia P (Sigma Aldrich, EEUU), como estándares de masa molecular.

Los resultados mostrados en las tablas 4 y 5 a continuación indican que la proteasa aumentó significativamente el nivel de proteína digerible, al igual que el grado de hidrólisis, ambos relativamente al blanco.

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TABLA 4 Grado de hidrólisis (DH)

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TABLA 5 Proteína bruta solubilizada o digerida

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Ejemplo 6 Pienso para animales y aditivos de pienso para animales

Un aditivo de pienso para animales comprende la proteasa preparada según se describe en el ejemplo 2. El aditivo de pienso para animales en forma de una premezcla de vitaminas y minerales está compuesto como se muestra en tabla 6 a continuación. Las vitaminas y los carotenoides están comercialmente disponibles de DSM Nutritional Products. Todas las cantidades están en g/kg.

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TABLA 6 Composición de premezcla

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20

La premezcla de la tabla 6 se incluye en una dieta para ponedoras con una composición según se muestra en la tabla 7 a continuación. La cantidad de cada ingrediente se indica en % (p/p). La concentración en la dieta de proteasa L2a es 100 mg de proteína de enzima proteasa por kg de la dieta.

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TABLA 7 Dieta para ponedoras

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Ejemplo 7 Ensayo de actividad de la proteasa EB-SM-0349.02/01 Principio

Usando el método de hemoglobina de Anson, la hemoglobina desnaturalizada es degradada durante la incubación de la enzima y el sustrato bajo condiciones estándares. La hemoglobina no asimilada es precipitada usando ácido tricloroacético (ATC).

La cantidad de la fracción de hemoglobina soluble en ATC es determinada usando el reactivo de fenol según Folin & Ciocalteu que da un color azul con diferentes aminoácidos, en particular con tirosina y triptófano, y -en menor medida- cistina, cisteína y histidina.

Condiciones de reacción Solución enzimática

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Incubación de enzima/sustrato

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Reacción de color

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Definición de unidades

La actividad de hemoglobina en Alcalase Anson (AU) se determina en relación a un estándar de Novo Nordisk AIS.

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Especificidad y sensibilidad

Límite de determinación: 0,0020 AU/g [1,0 AU/litro (muestras líquidas)]

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Aparato

Medidor de pH (p. ej. Orion 520A)

Equilibrio estándar (p. ej. Mettler PM 6100)

Equilibrio analítico (p. ej. Mettlen AE 100)

Placas de agitador, una con elemento de calor

Termómetro

Baño María termostático

Cronómetro

Agitador Vortex

Equipamiento de dilución (p. ej. autopipetas y diluidor Hamilton Microlab 1000) Dispensador (p. ej. Brand Dispensette)

Diluidor Hamilton Microlab 1000 (para añadir reactivo de fenol Folin & Ciocalteu)

Automuestreador (p. ej. Hitachi AS 1000)

Espectrofotómetro (p. ej. Hitachi 2000)

Reactivos/Sustratos

La preparación de cada reactivo debería ser documentada en un libro de registros pertinente.

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HaOH, 1,0 M

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Ejemplo: Preparación de 1 litro 1,0 M de NaOH

26

Almacenabilidad: 2 meses a temperatura ambiente

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HCl, 1,0 M

27

Ejemplo: Preparación de 1 litro 1,0 M de HCl

28

Almacenabilidad: 2 meses a temperatura ambiente

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KH2PO4, 1,0 M

29

Ejemplo: Preparación de 1 litro 1,0 M de KH 2 PO4

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30

Almacenabilidad: 3 meses a 5ºC

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Sustrato de hemoglobina

31

La hemoglobina es de Novo Nordisk A/S, liofilizada. De forma alternativa, puede usarse la hemoglobina de Merck (p. ej. Merck 4300). Antes de usar un lote nuevo de sustrato de hemoglobina desnaturalizada, se controla lo siguiente: 1. valor ciego contra agua desmineralizada (\leq 0,160). 2. Gama de absorbencia de curva estándar (aprox. 0,05-0,70). El valor ciego se nota en la lista de comprobación de preparación del sustrato. Si la prueba falla, se prepara un sustrato nuevo. La prueba se repite en al menos 2 días para Neutrasa, Tripsina y Alcalasa. Los resultados y la firma de aprobación a la lista de comprobación del libro de registro.

Ejemplo: preparación de 3260 g de sustrato de hemoglobina

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Los siguientes son pesados en un vaso de precipitación de 5 litros:

32

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La úrea es disuelta por agitación durante 20 minutos como mínimo a 25ºC. Se evita la formación de espuma siempre que sea posible no agitando con demasiada fuerza. Agitando continuamente, se añade lo siguiente a la solución:

NaOH, 1 M: 240.3 g

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Se pesa lo siguiente en un vaso de precipitación de 1 litro:

Hemoglobina: 63,45 g

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Agitando continuamente, la hemoglobina se añade lentamente a la solución de úrea. La hemoglobina restante es lavada con:

Agua desmineralizada: máx. 50 ml

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La solución se agita durante 45 minutos a 25ºC. Sin dejar de agitar, se añade lo siguiente:

33

El pH se ajusta a 7,50 +/- 0,05 usando 1 M de HCl (32-38 mL). El sustrato se prepara para el uso aprox. 4 horas después de la preparación.

Almacenabilidad: 14 días a 5ºC

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Tampón de fosfato, 2/3 M de solución madre

34

Ejemplo: preparación de 1 litro 2/3 M de tampón de fosfato

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35

Almacenabilidad: 2 meses a temperatura ambiente

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Tampón de fosfato, 1/15 M

36

Ejemplo: Preparación de 1 litro 1/15 M de tampón de fosfato

37

Almacenabilidad: 1 mes a temperatura ambiente

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PMSF, 1%

38

Ejemplo: preparación de 1 ml 1% PMSF

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39

Almacenabilidad: 1 mes a aprox. a 5o

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NaOH. 0.50 M

40

Ejemplo: Preparación de 2 litros 0,50 M de NaOH

41

Almacenabilidad: 2 meses a temperatura ambiente

ATC (ácido tricloroacético), 0,3 M

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ATC (ácido tricloroacético, CCl_{3} COOH) usado directamente (peso molecular: 163,4), 0,3 M (p. ej., Struers Kebo Lab)

Almacenabilidad: 6 meses a temperatura ambiente.

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De forma alternativa, puede prepararse 0,3 M de ATC según se describe a continuación:

Ejemplo: Preparación de 5 litros 0.3 M de ATC

42

10,00 ml se titula con 0,100 N de NaOH. 5 gotas de fenolftaleína (1 g en 100 ml de etanol al 96%) se usan como un indicador. El consumo de NaOH debería estar entre 29,7 y 30,3 ml.

Almacenabilidad: 6 meses a temperatura ambiente

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Reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu

43

Ejemplo: Preparación de aprox. 1,5 litros de reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu

Se pesa un vaso de precipitación de 2 litros. Un matraz de 500 ml con reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu (Merck 9001) X g

se vierte en el vaso de precipitación y se registra la masa X.

Luego se calcula la cantidad de agua desmineralizada necesaria: Agua desmineralizada Y g

44

Almacenabilidad: 1 semana a temperatura ambiente - almacenada en una botella oscura

Véase el comentario a la reacción de color (alrededor de p. 64) en verificaciones antes de usar un lote nuevo de reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu.

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Muestras y Estándares Ciego

Los estándares, muestras y controles se analizan con un ciego para permitir el ajuste para cualquier aminoácido en la materia prima.

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Curva estándar

El estándar debe ser material de producción representativo.

Ejemplo: preparación de curva estándar de Alcalase

45

El estándar se agita hasta disolverlo (aprox. 15 minutos). Las siguientes diluciones son preparadas usando p. ej. un duluidor Hamilton Microlab 1000:

Manual

46

Almacenabilidad: 3 horas a temperatura ambiente

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Procedimiento Incubación de enzima/sustrato

El sustrato de hemoglobina se calienta a 25ºC. 1,0 ml de cada solución de enzima se pipetea en 2 tubos de ensayo (1 muestra y 1 ciego).

Muestra

2,0 ml de sustrato de hemoglobina se añaden a la muestra (T=0). Después de mezclar íntegramente, el tubo se coloca al baño María a 25ºC. Exactamente 10 minutos después, se añade el sustrato (T=10), 5, 0 ml de ATC al tubo. El contenido del tubo se mezcla íntegramente. Se devuelve el tubo al baño María.

Después de 10-30 minutos la muestra precipitada se mezcla y filtra a través de un Munktell 1 F o filtro equivalente. La fracción de hemoglobina soluble en ATC en el filtrado luego es analizada usando reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu.

Ciego

Se añaden 5.0 ml de ATC al tubo ciego que luego son mezclados íntegramente. 2.0 ml de sustrato de hemoglobina se añaden al tubo (no se necesita sincronización). Después de mezclar íntegramente, el tubo se deja reposar a temperatura ambiente.

Después de 10-30 minutos, la muestra precipitada es mezclada y filtrada a través de un Munktell 1 F o filtro equivalente. La fracción de hemoglobina soluble en ATC en el filtrado luego es analizada usando reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu.

Reacción de color

0.5 M de NaOH..... 2,8 g* se dispensan en dos tubos de ensayo (1 muestra y 1 ciego) para cada muestra, filtrado..1,5 ml es pipetado en reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu.....1, 0 ml se añade usando un diluidor Hamilton Microlab 1000.

6-10 minutos después de añadir reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu, se lee la diferencia en absorbencia entre la muestra y el ciego (p. ej en un espectrofotómetro de doble barra) a 750 nm.

Se añade NaOH para asegurar que la reacción de color se realice en el pH óptimo (11,4-11,6) para intensidad de color y estabilidad.

El pH durante la reacción de color debe, por lo tanto, ser controlada antes de usar un lote nuevo de reactivo de fenol de Folin & Ciocalteu. El pH de la mezcla reactiva de color se anota en la lista de comprobación de aprobación de lote en el cuaderno de registros del reactivo.

Si el pH es incorrecto, la concentración de NaOH necesitará ser ajustada.

Esto también se registra en la lista de comprobación del cuaderno de registro.

* La cantidad real de NaOH pedida se identifica por el control de pH de un lote nuevo de reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu y por un control de dispensador de NaOH, compárese el comentario anterior ("Se añade el NaOH- -").

Cálculo

La actividad de cada muestra se calcula en relación a un estándar de Novo Nordisk A/S.

Se traza la curva estándar. Debe ser ligeramente curvada, elevándose firmemente a una absorbencia de aprox. 0,7 para el estándar nº 5.

La actividad de cada muestra (AU/litro) es leída de la curva estándar.

Los cálculos finales para permitir que los pesos y diluciones usados son realizados usando la siguiente fórmula:

47

S = actividad de la muestra diluida en AU/litro

Vol = volumen de matraz de dilución en mi

D = proporción de dilución

W peso de muestra en g

1000 = factor de conversión (1000 ml/L)

Estos cálculos pueden ser realizados usando un programa informático.

Ejemplos de cálculo Ejemplo 1 Cálculo de la actividad de una muestra pesada

Se disuelve 1,0 g de muestra en 0.0067 M de tampón de fosfato en un matraz graduado de 250 ml y diluido 1:10.

La curva estándar da la actividad de la muestra diluida como 0,228 AU/L.

La actividad de la muestra original puede entonces ser calculada de la siguiente manera:

48

Ejemplo 2 Cálculo de la actividad de una muestra pipetada

Se diluye 1,0 ml de muestra con 0,0067 M de tampón de fosfato en un matraz graduado de 50 ml. La muestra no se diluye más.

La curva estándar da la actividad de la muestra diluida como 0,275 AU/L.

49

Cálculo de medias

Los resultados son dados como 3 dígitos significativos, excepto en el 3 caso de actividades <0,1 AU/g que son dados como 2 dígitos significativos.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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\bulletBoisen, S.; Eggum, B. O. Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals Nutrition Research Reviews, 1991, vol. 4, 141-162 [0307]

<110> Novozymes A/S

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<120> Proteasas

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<130> 10476,204-WO

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 9

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 1068

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<212> ADN

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<213> Nocardiopsis alba DSM 15647

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1065)

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<220>

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<221> mat_péptido

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<222> (502)..(1065)

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<400> 1

50

51

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<210> 2

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<211> 355

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<212> PRT

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<213> Nocardiopsis alba DSM 15647

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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52

53

54

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<210> 3

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_característica

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<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> 31

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sintético

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1146

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1143)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(87)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

<22l> mat_péptido

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<222> (568)..(1143)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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57

59

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<210> 6

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<211> 381

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sintético

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<220>

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<221> misc_característica

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<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400>7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttttagtt catcgatcgc atcggctgcg accgtaccgg ccgagccag

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>8

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<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

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<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagcggatt gaacatgcga ttactaaccg gtcaccaggg acagcc

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Bacillus clausii

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(81)

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<400> 9

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62

Claims

1. Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene una actividad específica en hemoglobina a pH 7, 5 y 25ºC de al menos 41 AU/g, midiéndose la actividad de proteasa en unidades AU usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en:

(a): un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2 de al menos un 65%; y/o

(b): un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 de un 74% como mínimo.

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2. Polipéptido según la reivindicación 1 que

(a): tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1-192 de la SEC ID nº: 6 de un 76% como mínimo;

(b): es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de astringencia alta con los nucleótidos 568-1143 de SEC ID nº: 5; y/o

(c): es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5 de un 79% como mínimo.

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3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

4. Secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 que

(a): se hibrida bajo condiciones de astringencia alta con los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5;

(b): tiene un grado de identidad a los nucleótidos 568-1143 de la SEC ID nº: 5 de al menos un 79%; y/o

(c): codifica un polipéptido que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 192 de la SEC ID nº: 6 de un 76% como mínimo.

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5. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 3-4 operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

6. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6.

8. Método para la producción de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 8 para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

9. Planta transgénica, o parte de planta, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6 y es capaz de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

10. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6 y que es capaz de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

11. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 1, el método comprendiendo

(a): cultivo de cualquiera de las siguientes cepas:

(i): Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235,

(ii): Nocardiopsis alba DSM 15647 y

(b): recuperación del polipéptido.

12. Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 (i) en pienso para animales; (ii) en la preparación de una composición para el uso en pienso para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas para animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales; y/o (vi) para el tratamiento de proteínas.

13. Aditivo de pienso para animales que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2; y

(a): al menos una vitamina liposoluble, y/o

(b): al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(c): al menos un oligoelemento.

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14. Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1ª y 2ª, o al menos un aditivo de alimento para animal según la 13ª reivindicación.

15. Composición que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, junto con al menos otra enzima seleccionada entre amilasa, fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o beta-glucanasa.

16. Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en detergentes.

17. Nocardiopsis alba DSM 15647.