KR20100092450A - 약학적 사용을 위한 프로테아제 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노카르옵시스속(Nocardiopsis sp.)(SEQ ID NO: 1)으로부터 유래되는 프로테아제의 신규한 변이체 및 밀접하게 관련된 프로테아제뿐만 아니라 그것의 약학적 사용에 관한 것이다. 변이체는 췌장 기능 부전(PEI)의 치료에서 개선된 성능을 나타낸다. 변이체는 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합될 수 있다. 의학적 징후의 다른 예는: 소화 장애, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료이다.

Description

약학적 사용을 위한 프로테아제 변이체{PROTEASE VARIANTS FOR PHARMACEUTICAL USE}

서열 목록에 대한 참고

본 출원은 컴퓨터로 판독가능한 형태로 서열 목록을 함유한다. 컴퓨터로 판독가능한 형태는 참고로써 본원에 포함된다.

본 출원은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제에 관한 것이며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여 다음의 치환 A1T; I3V; G12; R14I; T22A; N23D; G34A; R38; T41A; T44K; N47; G48D; E53K; Q54L,D; T68A,R,S; S69T; L73P; V88A; S99P; P124L; E125; M131V; T151I; R165; 및 T166A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. SEQ ID NO: 1의 프로테아제는 노카르옵시스속(Nocardiopsis sp.)의 야생형 프로테아제이다.

본 발명은 또한 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된 이들 프로테아제의 약학적 사용에 관한 것이다. 의학적 징후의 예는 소화 장애, 췌장 기능 부전(pancreatic exocrine insufficiency, PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료이다.

췌장 효소 보조제의 형태인 몇몇의 상업적 약제는 췌장 기능 부전의 치료를 위한 것으로 알려져 있다. 이것들의 생성물의 활성 성분은 보통 췌장에서 생성되고 소장의 윗 부분(십이지장)으로 분비되는 소화 효소, 주로 아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제이다. 이러한 약제에 사용되는 효소는 소 또는 돼지 췌장으로부터 유래된다.

WO 2005/115445는 SEQ ID NO: 1의 프로테아제의 사용을 기술하며, 약학적 사용, 예를 들어, PEI의 치료를 위한 프로테아제와 관련된다.

WO 2006/136159는 SEQ ID NO: 2의 리파아제의 사용을 기술하며, 약학적 사용, 예를 들어, PEI의 치료를 위한 리파아제에 관한 것이다.

WO 2006/136161은 SEQ ID NO: 3, 4, 및 5의 아밀라아제의 사용을 기술하며, 약학적 사용, 예를 들어, PEI의 치료를 위한 아밀라아제에 관한 것이다.

노카르디옵시스속(Nocardiopsis sp.)(SEQ ID NO: 1)으로부터 유래되는 프로테아제뿐만 아니라 그것의 제제 및 그것의 다양한 산업적 용도가 WO 88/03947 및 WO 01/58276에 기술된다. 관련된 프로테아제가 WO 2004/111220, WO 2004/111222, WO 2004/111223, WO 2004/111221 , WO 2005/035747, WO 2004/111219, WO 2005/123911 , 및 JP 2003284571-A (GENESEQP:ADF43564)에서 기술된다.

본 발명은 개선된 실행, 예를 들어, 생체내에서 개선된 겉보기 단백질 소화흡수율, 개선된 pH-비율 (pH5.6/pH8), 및/또는 감소된 독성의 신규한 프로테아제를 제공한다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제에 관한 것이며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여 다음의 치환 A1T; I3V; G12; R14I; T22A; N23D; G34A; R38; T41A; T44K; N47; G48D; E53K; Q54L,D; T68A,R,S; S69T; L73P; V88A; S99P; P124L; E125; M131V; T151I; R165; 및 T166A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

본 발명은 더 나아가 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된 약제로서 사용을 위한 이러한 프로테아제에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 또한 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된 이러한 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된, 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 사용에 대한 이러한 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질과 함께 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된 이러한 프로테아제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

최종적으로, 본 발명은 선택적으로 리파아제 및/또는 아밀라아제와 조합된 이러한 프로테아제의 치료적으로 유효한 양을 투여함으로써 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

효소

용어 "프로테아제"는 프로테아제 활성을 가지는 폴리펩티드로서 본원에서 정의된다. 프로테아제는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이다. 이는 EC 3.4 효소 군(그것의 각각 13개의 하위 분류를 포함하며, 이 효소들은 "EC 3.4.-.- 군에 속함"으로서 하기에 언급된다)에 속하는 어떤 효소를 포함한다. EC 수는 각각 Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; 및 Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650에서 공개된 증보판 1-5를 포함하는 NC-IUBMB, Academic Press, 캘리포니아 샌디애고의 효소 명명법 1992를 말한다. 명명법은 정기적으로 보충되고 업데이트된다; 예를 들어, 월드와이드웹, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme를 참조.

특정 구체예에서, 본 발명의 프로테아제는 노카르옵시스(Nocardiopsis)의 균주로부터 유래된 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택된다.

두 아미노산 서열 사이의 관계는 변수 "동일성"에 의해 기술된다.

본 발명의 목적에 대해, 두 아미노산 서열은 Needle program from the EMBOSS package (http://emboss.org) version 2.8.0을 사용하여 배열된다. Needle 프로그램은 Needleman, S. B. and Wunsch , C. D. (1 970) J . Mol. Biol. 48, 443-453에서 기술되는 global alignment 알고리즘을 보충한다. 사용되는 치환 매트릭스는 BLOSUM62이며, 갭 오프닝 페널티는 10이고, 갭 확장 페널티는 0.5이다.

본 발명의 아미노산 서열("본 발명 서열"; 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188)과 다른 아미노산 서열("외래 서열"; 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188) 사이의 동일성의 정도는, 두 서열의 이 배열에서 정확한 매치의 수를 어느 것이든 가장 짧은 "본 발명 서열"의 길이 또는 "외래 서열"의 길이로써 나눔으로서 계산된다. 결과는 백분율 동일성으로 표현된다.

"본 발명 서열"과 "외래 서열"이 동일한 위치에서 중첩의 동일한 아미노산 잔기를 가질 때, 정확한 매치가 일어난다(하기 배열예에서 이는 "|"로써 나타낸다). 서열의 길이는 서열에서 아미노산 잔기의 수이다(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 길이는 188이다).

순수하게 가정적인, 하기 배열예에서, 중첩은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 예에서, 갭은 "-"로써 표시된다.

가상적 배열 예:

따라서, 서열 1과 서열 2의 동일성의 백분율은 6/12=0.5이며, 50%에 대응한다.

특정 구체예에서, 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188을 가지는 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성의 백분율은 i) BLOSUM62 치환 매트릭스, 10의 갭 오프닝 페널티, 및 0.5의 갭 확장 페널티와 함께 Needle 프로그램을 사용하여 두 아미노산 서열을 배열하는 단계; ii) 배열에서 정확한 매치의 수를 카운팅하는 단계; iii) 두 아미노산 서열 중 가장 짧은 것의 길이에 의해 정확한 매치의 수를 나누는 단계, 및 iv) iii)의 나눈 결과를 백분율로 변환하는 단계에 의해 결정된다. SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269와 같은 본 발명의 다른 서열에 대한 또는 다른 서열을 가지는 동일성의 백분율은 유사한 방법으로 계산된다.

추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 프로테아제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-188에 적어도 90%, 적어도 91%, 또는 적어도 92%; 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성의 정도를 가진다.

본 발명에서, 아미노산 잔기 위치의 구체적 넘버링이 사용된다. 넘버링 시스템은 SEQ ID NO: 1에 개시되고, 다른 프로테아제의 아미노산 서열과 함께 치환 매트릭스 BLOSUM62, 갭 오프닝 페널티 10, 및 갭 확장 페널티 0.5를 가지는 Needle을 사용하여(상기 기술한 바와 같음) 배열된 프로테아제의 아미노산 서열로부터 기원한다.

SEQ ID NO: 1과 비교하여 아미노산 치환에 대해, 하기 명명법이 사용된다: 본래의 아미노산(SEQ ID NO: 1에서), 위치(배열에서), 치환된 아미노산(다른 프로테아제에서). 따라서, SEQ ID NO: 1의 글루탐산 (E)의, 예를 들어, 위치 125에서 SEQ ID NO: 6의 아스파르트산(D)으로의 치환은, SEQ ID NO: 1에 대해서 "E125D"로서 지정된다. 다양한 돌연변이는 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "T44K+S99P"는 위치 44 및 99에서 트레오닌(T)를 리신(K)으로, 그리고 세린(S)을 프롤린(P)으로 각각 치환하는 돌연변이를 나타낸다(예를 들어, SEQ ID NO: 8에서와 같이). 더 나아가 G12D,N,H와 같은 발현은 위치 12의 글리신(G)이 아스파르트산(D), 아스파라긴(N), 또는 히스티딘(H) 중 하나로 교환되는 것을 의미한다.

SEQ ID NO: 1의 위치 12에서 글리신의 어떤 다른 아미노산으로 치환은 "G12"로 지정된다.

SEQ ID NO: 1의 위치 38에서 아르기닌의 어떤 다른 아미노산으로 치환은 "R38"로 지정된다.

SEQ ID NO: 1의 위치 47에서 아스파라긴의 어떤 다른 아미노산으로 치환은 "N47"로 지정된다.

SEQ ID NO: 1의 위치 125에서 글루탐산의 어떤 다른 아미노산으로 치환은 "E125"로 지정된다.

SEQ ID NO: 1의 위치 165에서 아르기닌의 어떤 다른 아미노산으로 치환은 "R165"로 지정된다.

추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 프로테아제는 산-안정성이며, 이는 A₂₈₀ = 1.0에 대응하는 희석에서, 그리고 37℃에서 2시간 동안 배양 후 다음의 완충제: 10OmM 숙신산, 10OmM HEPES, 10OmM CHES, 10OmM CABS, 1 mM CaCl₂, 15OmM KCl, 0.01 % Triton® X-100, pH 3.5에서, WO 01/58276 (기질: Suc-AAPF-pNA, pH 9.0, 25℃)의 실시예 2C에서 기술되는 분석을 사용하여 측정되는 바와 같이, 순수한 프로테아제 효소의 프로테아제 활성은 기준 활성의 적어도 40%(또는 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 적어도 97%)이라는 것을 의미한다. 용어 기준 활성은 순수한 형태로, A₂₈₀= 1.0에 대응하는 희석에서, 다음의 완충제: 10OmM 숙신산, 10OmM HEPES, 10OmM CHES, 10OmM CABS, 1 mM CaCl₂, 15OmM KCl, 0.01 % Triton® X-100, pH 9.0에서 5℃에서 2시간 동안 배양 후 동일한 프로테아제의 프로테아제 활성을 말하며, 활성은 상기 기술한 바와 같이 결정된다. 용어 A₂₈₀ = 1.0은 완충제 블랭크(blank)에 대해 1cm 경로 길이 큐벳의 280nm에서 1.0의 흡광도를 상승시키는 상기 순수한 프로테아제의 농도(희석)를 의미한다. 용어 순수한 프로테아제는 1.70 이상 또는 동일한 A₂₈₀/A₂₆₀ 비율을 가지는 샘플을 말하며(예를 들어, WO 01/58276의 실시예 2E), 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔의 스캔에 의해 상기 프로테아제에 대응하는 밴드에서 적어도 95%의 그것의 스캔 강도를 가지는 것으로 측정된다(WO 01/58276의 실시예 2A 참조).

본 발명의 바람직한 프로테아제:

SEQ ID NO: 1의 아미노산과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여 다음의 치환: A1T; I3V; G12; R14I; T22A; N23D; G34A; R38; T41A; T44K; N47; G48D; E53K; Q54L,D; T68A,R,S; S69T; L73P; V88A; S99P; P124L; E125; M131V; T151I; R165; 및 T166A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 다음의 치환 G12D,N,H; R38T; N47H,T,S; E125D 및 R165S,H,G,T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 적어도 하나의 치환: G12D,N,H, 특히 G12D를 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 적어도 하나의 치환: N47H,T,S; 특히 N47H를 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 적어도 하나의 치환: R165S,H,G,T; 특히 N165H를 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO:1의 아미노산 1-188과 비교하여, 다음의 치환 G12D; 및 (N47H+G48D) 또는 이 치환의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 치환의 조합: (T41A + T68R + V88A); (G12N+T22A+N23D+N47T+R165H); 및 (R14I+R38T+T151I)로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 다음의 치환 R38T, (T44K+S99P), S69T, (S69T+E125D), E125D, 및 R165S 또는 이 치환의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 프로테아제는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 다음의 치환 R38T; T44K 및 S99P; S69T; S69T 및 E125D; E125D; 및 R165S 또는 이 치환의 조합 중 하나를 포함한다.

프로테아제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여, 다음의 치환 A1T; I3V; G12; R14I; T22A; N23D; G34A; R38; T41A; T44K; N47; G48D; E53K; Q54L,D; T68A,R,S; S69T; L73P; V88A; S99P; P124L; E125; M131V; T151I ; R165; 및 T166A 중 적어도 하나를 포함하며; 이는 더 나아가 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:

(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 가지는 프로테아제;

(b) (i) SEQ ID NO: 1의 코딩 서열 (본원에 참고로써 포함되는 WO 2005/035747의 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 900-1463), 또는 (ii) (i)의 전장 상보적 스트랜드와 매우 낮은(바람직하게는 낮은, 중간, 중간-높은, 높은, 가장 바람직하게는 매우 높은) 엄격 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 프로테아제; 및

(c) 추가로 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드, 바람직하게는 보존적 특성의 하나 이상의(예를 들어, 몇몇의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체.

매우 낮은 내지 매우 높은 엄격 조건은 선택적으로 12시간 내지 24시간 동안 선택적으로 표준 사우던 블롯팅 과정 후, 42℃에서, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로g/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 매우 낮은 및 낮은 엄격을 위한 25% 포름아미드, 중간 및 중간-높은 엄격을 위한 35% 포름아미드, 또는 높은 및 매우 높은 엄격을 위한 50% 포름아미드의 예비혼성화 및 혼성화로서 정의된다. 담체 재료는 최종적으로 바람직하게는 45℃ (매우 낮은 엄격), 더 바람직하게는 50℃ (낮은 엄격), 더 바람직하게는 55℃ (중간 엄격), 더 바람직하게는 60℃ (중간-높은 엄격), 훨씬 더 바람직하게는 65℃ (높은 엄격), 및 가장 바람직하게는 70℃ (매우 높은 엄격)에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 3회 세척된다.

보존적 특성의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 중요하게 영향을 미치지 않으며, 소 결실, 전형적으로 1 내지 약 30개의 아미노산; 소 아미노- 또는 카르복실-말단 확장, 예로써, 아미노-말단 메티오닌 잔기; 약 20-25개 이하 잔기의 소 링커 펩티드; 또는 순전하 또는 다른 작용을 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 소 확장, 예로써, 폴리-히스티딘 트랙(tract), 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다.

변이체에서 변형의 전체 수는 바람직하게는 18, 17, 또는 16이다. 더 바람직한 변형의 전체 수는 15, 훨씬 더 바람직하게는 14, 훨씬 더 바람직하게는 13, 훨씬 더 바람직하게는 12, 훨씬 더 바람직하게는 11, 훨씬 더 바람직하게는 10, 훨씬 더 바람직하게는 9, 훨씬 더 바람직하게는 8, 훨씬 더 바람직하게는 7, 훨씬 더 바람직하게는 6, 훨씬 더 바람직하게는 5, 훨씬 더 바람직하게는 4, 훨씬 더 바람직하게는 3, 훨씬 더 바람직하게는 2, 및 가장 바람직하게는 1개의 아미노산이다.

변이체는 하나 이상의 상동의 원래 프로테아제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 셔플링함으로써 생성되고, 변이체는 위치 38, 44, 69, 99, 125, 및 165로 구성되는 군으로부터 선택되는 원래 프로테아제의 하나 이상의 위치에 대응하는 하나 이상의 위치에서 변형을 포함하며, 변형(들)은 위치를 점유하는 아미노산의 치환에 독립적으로 대응하며, 변이체는 프로테아제 활성을 가진다.

용어 "원래" 프로테아제는 변형, 예를 들어, 치환(들), 삽입(들), 결실(들), 및/또는 절단(들)이 본 발명의 효소 변이체를 생성하도록 하는 프로테아제를 의미한다. 이 용어는 또한 변이체가 비교되고 정렬되는 폴리펩티드를 말한다. 원래는 자연적으로 발생하는 (야생형) 폴리펩티드일 수 있고, 또는 심지어 어떤 적당한 수단에 의해 만들어지는 그것의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 원래 단백질은 아미노산 서열에서 변형 또는 변경되는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드의 변이체일 수 있다. 원래는 또한 동일한 염색체 위치를 점유하는 유전자의 어떤 두 가지 이상의 다른 형태에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 대립 변이체일 수 있다.

용어 "셔플링"은 출발 뉴클레오티드 서열과 비교하여 다수의 교환된 뉴클레오티드를 가지는 재조합된 뉴클레오티드 서열(즉, 셔플링 사이클을 받는 뉴클레오티드 서열)을 초래하는 두 가지 이상의 상동 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 서열(들)의 재조합을 의미한다.

각각의 상기 예 및 추가 예에 따르는 프로테아제 및 프로테아제 변이체는 바람직하게는 본원 및 청구항에서 시작되는 바와 같은 본 발명의 조합, 사용, 조성물 및 방법으로 사용된다.

생체내 단백질 소화 흡수율, pH -비율( pH5 .6/ pH8 ), 및/또는 감소된 독성.

본 발명의 프로테아제 및 프로테아제 변이체는 개선된 성능, 예를 들어, 생체내에서 개선된 겉보기 단백질 소화흡수율, 개선된/변경된 pH-비율(pH5.6/pH8), 및/또는 감소된 독성을 나타낸다.

생체내에서 겉보기 단백질 소화흡수율은 유도 PEI와 함께 암컷 괴팅겐 미니피그(Goettingen minipigs (Ellegaard))에서 결정될 수 있다. 돼지는 바람직하게는 실시예 4에서 기술되는 바와 같이 구성되는, 21.3% 단백질, 51.9% 전분, 2.6% 지방을 함유하여 1일에 2회의 식사가 공급된다. 돼지는 물에 자유롭게 접근하도록 허용되며 바람직하게는 12:12시간 명-암 주기로 케이지에 수용한다. 돼지는 처음에는 일회 250g 시험식이 1리터의 물, 0.625 g Cr₂O₃ (마커)와 혼합되어 공급되며, SEQ ID NO: 1 (0 mg, 20mg, 50mg 및 120 mg 효소 단백질/식사)의 기준 프로테아제의 다른 양을 공급 전에 즉시 혼합한다. 시험 동안, 본 발명의 프로테아제를 20 mg, 50 mg 및 120 mg/식사로 투여한다. 회장에서 음식 마커(녹색 유미즙)의 첫 번째 출현 후 회장 유미즙을 총 8시간 동안 얼음에서 수집하고 분석 전에 -20℃에서 저장한다. 분리된 결정 사이에 적어도 하루 세척한다. 냉동시킨 회장 유미즙 샘플을 냉동-건조시키고, 분쇄하고 건조물(DM) 및 미정제 단백질에 대해 분석한다. DM은 냉동-건조 다음에 103℃에서 8시간 배양 후 중량을 측정한다. 미정제 단백질은 인자 6.25를 곱한 질소(N)로서 계산한다. 질소 함량을 바람직하게는 Dumas 연소 방법, 더 바람직하게는 "Vario MAX CNS" Elemental Analyzer를 사용하여 연소에 의해 결정한다. Cr₂O₃은 크로메이트로 산화되며 크롬 함량을 365 nm에서 소멸을 통해 계산한다. 겉보기 맹장 전방 단백질 소화흡수율을 실시예 4에서 나타내는 식에 따라서 계산하며, Cr₂O₃ 및 단백질을 g/100g 건조물로서 표현한다.

본 발명의 프로테아제에 대해, 소화흡수율(예로써, 겉보기 맹장 전방 단백질 소화흡수율)은 투약량 20, 50 및 120 mg 효소 단백질/식사 중 적어도 하나로 기준 프로테아제의 소화흡수율과 비교하여 바람직하게 개선된다. 개선은 바람직하게는 적어도 1 %, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 또는 적어도 10%이다. 더 바람직하게는, 개선은 적어도 11 %, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 또는 적어도 20%이다. 훨씬 더 바람직하게는, 개선은 적어도 21 %, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 또는 적어도 26%이다.

추가로 각각 50% 및 60% 단백질 소화흡수율 (% CNA)을 이루도록 요구되는 프로테아제의 양(mg)은 개개의 회귀 곡선(겉보기 맹장 전방 단백질 소화흡수율 대 효소 투약량)으로부터 추론될 수 있다. 개선 인자 50 및 60 (IF50 및 IF60)은 50% 및 60% 단백질 소화흡수율 (% CNA)을 이루도록 요구되는 기준 프로테아제의 양(mg)을 각각 50% 및 60% 단백질 소화흡수율 (% CNA)을 이루도록 요구되는 변이체 프로테아제의 양(mg)에 의해 나눔으로써 계산된다. 따라서, 기준 프로테아제 IF50 및 IF60은 둘 다 1.00이다.

본 발명의 프로테아제에 대해, IF50 및/또는 IF60 값은 바람직하게는 적어도 1.05, 적어도 1.10, 적어도 1.15, 적어도 1.20, 적어도 1.25, 적어도 1.30, 적어도 1.35, 적어도 1.40, 적어도 1.45, 또는 적어도 1.50이다.

더욱 상세하게는, 실시예 4를 참조.

pH-비율은 기질로서 카세인, 더 구체적으로는 적당한 붉은-형광 염료로 표지된 카세인 유도체에 의해 결정되며, 이는 바람직하게는 pH-무감각이다(예를 들어, pH 5.6-8.0의 영역에서). 형광의 증가는 프로테아제 활성에 비례한다. 바람직한 pH 8.0 분석 완충제는 100 mM Tris/염기이며, 바람직한 pH 5.6 분석 완충제는 25 ml 0.2 M 숙신산을 37.5 ml 0.2 M NaOH와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 인큐베이션은 적당한 시간 기간(예를 들어, 60분)동안, 적당한 온도(예를 들어, 실온, 예를 들어 22℃)에서 일어난다. 바람직한 형광 염료는 BODIPY TR-X이며, 이 경우 결과 형광 펩티드는 표준 플루오레세인 필터를 사용하여 결정될 수 있다(여기 = 590 nm, 방출 = 635 nm). pH 8.0에서 활성에 대한 pH 5.6에서 활성의 비율을 본 발명의 프로테아제 및 SEQ ID NO: 1의 기준 프로테아제에 대해 결정하며, 기준 프로테아제의 비율에 대한 본 발명의 프로테아제의 비율을 계산한다. 본 발명의 바람직한 프로테아제는 1 이상, 바람직하게는 적어도 1.05, 적어도 1.10, 적어도 1.15, 적어도 1.20, 또는 적어도 1.25 이상의 기준 프로테아제의 것에 대해 이러한 비율을 가진다. 더 상세하게는, 실시예 3을 참조.

독성을 HT-29 세포(예를 들어, DSMZ no. ACC 299)와 같은 인간 결장 선암 셀라인에서 시험관내 독성으로서 결정할 수 있다. 세포를 10% FBS (예를 들어, Sigma제, cat. no. F- 6178)로 보충한 McCoy's 5A 배지(예를 들어, Cambrex제)에서, 바람직하게는 96 웰 배양 플레이트에서 4·10⁴ 세포/웰/200 μl의 밀도에서 배양한다. 웰에 세포 적응의 24시간 후, 프로테아제를 9개의 다른 농도(w/vol 효소 단백질)에서 3중으로 2-배 희석에서 0.5 g/l 프로부민(Millipore), 1% 인슐린/트랜스페린/셀레늄 보충물(예를 들어, Invitrogen제) 및 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신(예를 들어, Invitrogen제)으로 보충된 무혈청 배지(예를 들어, DMEM : F12, Invitrogen)에 첨가하고, 다른 24시간 동안 인큐베이팅한다. 생존능력을 Alamar Blue (예를 들어, Invitrogen제) 측정을 사용하여 세포의 물질대사 능력에 의해 측정한다.

최대 대사 활성(100%)을 대조군의 대사 활성으로서 결정한다(프로테아제를 첨가하지 않음). 시험될 주어진 프로테아제에 대해, 그것의 독성 비율을 최대 대사 활성의 50%가 이 프로테아제에 대해 얻어지는 농도를 최대 대사 활성의 50%가 기준 프로테아제(SEQ ID NO: 1)에 대해 얻어지는 농도로 나누어 계산한다. 본 발명의 프로테아제에 대해, 독성 비율은 바람직하게는 적어도 1.1, 바람직하게는 적어도 1.2, 바람직하게는 적어도 1.3, 바람직하게는 적어도 1.4, 바람직하게는 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 1.6, 바람직하게는 적어도 1.7, 바람직하게는 적어도 1.8, 바람직하게는 적어도 1.9, 가장 바람직하게는 적어도 2.0이다. 독성 비율은 실시예 6에서 설명된다. 양호한 상관관계가 생체내 및 시험관내 독성 결과에 대해 발견되었다.

또 다른 추가의 특정 구체예에서, 선택적으로 추가의 프로테아제(들), 예를 들어, 포유동물 프로테아제가, 예를 들어, 돼지 또는 미생물 프로테아제로부터, 예를 들어, 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 또는 라이조푸스(Rhizopus)와 같은 박테리아 또는 진균 균주로부터 유도되는 췌장 추출물의 형태로 사용될 수 있다. 프로테아제는 특히 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus)와 같은 아스페르길루스(Aspergillus)의 균주로부터, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 상업적으로 이용가능한 제품 Prozyme 6™ (중성, 알칼리성 프로테아제 EC 3.4.21.63)으로부터 유도될 수 있다.

유전자 및 도입 돌연변이의 클로닝

유전자 및 도입 돌연변이(무작위 및/또는 부위 지정)의 클로닝을 위한 표준 과정은 효소들 및 본 발명의 프로테아제 변이체와 같은 효소 변이체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 관심의 유전자(예를 들어, 본원의 SEQ ID NO: 1을 코딩하는 유전자인 WO 2005/035747의 SEQ ID NO: 1)는 제한 자리를 포함하도록 지정되는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 적당한 기술의 추가 설명에 대해, 참고문헌은 Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990, 및 WO 96/34946으로 구성된다.

클로닝 목적을 위한 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 관심의 유전자 및 상기 플라스미드의 분해 후, 관심의 유전자 및 플라스미드는 리가아제를 수반하는 결찰 과정에 결합될 수 있다. 리가아제 반응 후, 결찰 혼합물이 Ausubel, F. M. et al.에서 기술된 바와 같은 E.coli 세포를 변형하는데 사용될 수 있다. 변형된 E.coli 세포는 액체 배지 또는 고체 한천 플레이트에서 전파될 수 있고, 플라스미드는 변형된 세포로부터 구조될 수 있고 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. MB1510, 168-유도체 (예를 들어, 등록 번호 1A1 168 trpC2와 함께 BGSC로부터 이용가능)와 같은 적당한 수용성(competent) 바실러스 세포는 WO 03/095658에서 기술되는 바와 같이 변형될 수 있다.

라이브러리 구성을 위한 E. coli 플라스미드-함유 통합 카세트는 Bacillus 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 WO 03/095658에서 상세하게 기술된다. 또 다르게는, 시험관내 증폭된 PCR-SOE-생성물 (Melnikov and Youngman, Nucleic Acid Research 27, 1056)이 사용될 수 있다.

플라스미드 벡터는 다음의 구성요소를 함유할 수 있다:

i) 단일 펩티드 코딩 영역(예를 들어, 바실러스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라아제, 바실러스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 알파-아밀라아제, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 서브틸리신, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라아제, 바실러스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) prsA에 대한 유전자로부터 얻어짐), 다음에 SEQ ID NO: 1 (WO 2005/035747의 SEQ ID NO: 1의 잔기 405-899)의 노카르옵시스속(Nocardiopsis sp.) 프로테아제의 프로-도메인 및 성숙 프로테아제 변이체 유전자. 이 서열은 하기에 앞설 수 있고 작동적으로 연결될 수 있다:

ii) mRNA 안정화 부분을 포함하는 DNA 서열(예를 들어, WO 1999/043835에서 나타내는 바와 같이 Cryllla 유전자로부터 유도됨);

iii) 마커 유전자(예를 들어, 클로람페니콜 저항 유전자); 및

iv) 측면 부분 및 바실러스 게놈 사이의 상동 재조합에 의한 유전적 통합을 가능하게 하기 위한, 각각 폴리뉴클레오티드의 위쪽 및 아래쪽의 5' 및 3' 측면 부분으로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 유전적 DNA.

본 발명의 프로테아제는 리파아제와 조합하여 사용될 수 있다.

본 문맥에서, 리파아제는 카르복실산 에스테르 가수분해효소 EC 3.1.1.-을 의미하며, 이는 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파아제, EC 3.1.1.4 포스포리파아제 A1, EC 3.1.1.5 리소포스포리파아제, EC 3.1.1.26 갈락토리파아제, EC 3.1.1.32 포스포리파아제 A1, EC 3.1.1.73 페룰로일 에스테라아제와 같은 활성을 포함한다. 특정 구체예에서, 리파아제는 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파아제이다.

특정 구체예에서, 리파아제는 포유동물 리파아제이며, 예를 들어, 돼지 또는 미생물 리파아제로부터 췌장 추출물의 형태로, 예를 들어, 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 또는 라이조푸스(Rhizopus)와 같은 박테리아 또는 진균 균주로부터 유도된다. 리파아제는 특히 라이조푸스 자바니쿠스(Rhizopus javanicus), 라이조푸스 오리재(Rhizopus oryzae), 또는 라이조푸스 델레마르(Rhizopus delemar)와 같은 라이조푸스의 균주, 예를 들어, Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 상업적으로 이용가능한 제품 리파아제 D Amano 2000™(또한 Lipase D2™을 지정)으로부터 유도될 수 있다.

추가의 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용을 위한 리파아제는 재조합적으로 생성된 미생물 리파아제, 예를 들어, Humicola 또는 Rhizomucor와 같은 진균, 칸디다(Candida)와 같은 효모, 또는 슈모도모나스(Pseudomonas)와 같은 박테리아로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 리파아제는 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 또는 라이노무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei)의 균주로부터 유도된다.

후미콜라 라누기노사(써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus)와 동의어) 리파아제는 EP 305216에서 기술되며, 특히 리파아제 변이체는, 예를 들어, WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679, WO 02/066622, 및 WO 2006/136159에서 기술된다. 더욱 나아가서, 진균 리파아제의 예는 EP 785994에서 기술되는 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)로부터의 큐틴분해효소, 및 EP 869167에서 기술되는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로부터의 포스포리파아제이다. 효모 리파아제의 예는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)로부터의 리파아제 A 및 B이며, 리파아제 A는 EP 652945에서 기술되고, 리파아제 B는 예를 들어, Uppenberg et al in Structure, 2 (1994), 293에 의해 기술된다. 박테리아 리파아제의 예는 EP 214761에서 기술되는 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia)로부터 유도된다.

바람직한 구체예에서, 리파아제는 또한 WO 2006/136159에서 기술되는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 리파아제와 적어도 70% 동일하다. 추가의 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 바람직하게는 다음의 아미노산 서열을 가지는 것을 포함하는 리파아제가 바람직하다: (i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 +1 내지 +269, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 -5 내지 +269, (iii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 -4 내지 +269; (iv) SEQ ID NO: 2의 아미노산 -3 내지 +269; (v) SEQ ID NO: 2의 아미노산 -2 내지 +269; (vi) SEQ ID NO: 2의 아미노산 -1 내지 +269, (vii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 +2 내지 +269, 및 (viii) (i)-(vii)의 리파아제 중 두 가지 이상의 어떤 혼합물. 특정 구체예에서, 리파아제는 (i), (ii)의 리파아제, 및 (i) 및 (ii)의 어떤 혼합물로부터 선택된다. (i) 및 (ii)의 바람직한 혼합물은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%의 리파아제 (i)을 포함하며, 백분율은 WO 2006/136159의 실시예 5에 기술되는 바와 같은 Edman 방법을 사용하여 N-말단 서열분석에 의해 결정된다. 다른 바람직한 혼합물은: (a) 35-75%, 바람직하게는 40-70%, 더 바람직하게는 45-65%의 리파아제 (ii)를 포함하는 조성물; (b) 20-60%, 바람직하게는 25-55%, 더 바람직하게는 30-50%, 가장 바람직하게는 35-47%의 리파아제 (i)을 포함하는 조성물; (c) 30% 이하, 바람직하게는 25% 이하, 더 바람직하게는 20% 이하, 가장 바람직하게는 16% 이하의 리파아제 (vii)를 포함하는 조성물; 및 (d) (a), (b), 및/또는 (c)의 어떤 조합, 예로써 리파아제 (ii)의 45-65%, 리파아제 (i)의 35-47%, 및 리파아제 (vii)의 16% 이하를 포함하는 조성물.

또한 추가의 바람직한 구체예에서, 포유동물 췌장 리파아제와 유사한 리파아제는 1,3-위치 특이적 리파아제이다.

상기 기술된 리파아제와 함께 또는 없이 본 발명의 프로테아제는 또한 아밀라아제와 조합하여 사용될 수 있다.

본 문맥에서, 아밀라아제는 전분 및 다른 선형 및 분지형 올리고- 및 폴리사카라이드의 엔도-가수분해를 촉매화하는 효소이다. 전분의 아밀로오스 부분은 1,4-알파-글루코시드 결합에서 풍부한 반면, 아밀로펙틴 부분은 1,4-알파- 뿐만 아니라 1,6-알파-글루코시드 결합을 함유하여 더 분지된다. 특정 구체예에서, 아밀라아제는 EC 3.2.1.1 기에 속하는 효소이다.

특정 구체예에서, 아밀라아제는 포유동물 아밀라아제이며, 예를 들어, 돼지 또는 미생물 아밀라아제로부터 췌장 추출물의 형태로, 예를 들어, 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 또는 라이조푸스(Rhizopus)와 같은 박테리아 또는 진균 균주로부터 유도된다.

아밀라아제는 특히 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus)와 같은 아스페르길루스의 균주, 예를 들어, Amano Pharmaceuticals, Japan으로부터 상업적으로 이용가능한 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae)로부터 유도된 제품 아밀라아제 A1™ 또는 Extract-Chemie, Germany으로부터 상업적으로 이용가능한 아스페르길루스 멜레우스(Aspergillus melleus)로부터 유도된 Amylase EC™ 중 하나로부터 유도될 수 있다.

진균 아밀라아제의 다른 예는 또한 WO 89/01969의 실시예 3에서 기술되는 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger) 아밀라아제(SWISSPROTP56271), 및 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 아밀라아제이다. 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 아밀라아제의 변이체의 예는 WO 01/34784에서 기술된다.

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유도된 알파-아밀라아제는 박테리아 알파-아밀라아제의 예이다. 이 아밀라아제는, 예를 들어, WO 99/19467에서, 예를 들어, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 뿐만 아니라 그것의 변이체로부터 유도된 다른 상동 박테리아 알파-아밀라아제와 함께 기술된다. 추가 아밀라아제 변이체의 예는 미국 특허 번호 4,933,279; EP 722490, EP 904360, 및 WO 2006/136161에 기술된 것이다.

바람직한 아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-481(예로써 그것의 아미노산 1-481, 1-484, 또는 1-486), SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481, 및/또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 포함하는 아밀라아제이다. 바람직한 구체예에서, 아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513, (ii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483 중 하나와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지거나 또는 포함하는 아밀라아제이다. SEQ ID NOs: 3-5의 아밀라아제는, 예를 들어, WO 2006/136161에서 기술되는 바와 같이 제조될 수 있다. (i), (ii), 또는 (iii)의 추가의 바람직한 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다.

일반적으로, 본 발명에 따르는 사용을 위한 프로테아제, 리파아제, 및 아밀라아제 효소(본원에서 이후에 "효소(들)")는 특정 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 돼지 효소에서; 식물로부터, 또는 미생물로부터 뿐만 아니라 요망되는 효소 활성을 나타내는 그것의 어떤 돌연변이, 변이체, 부분 등으로부터 얻어지는 천연 또는 야생형 효소, 및 셔플링된 효소 및 일치 효소와 같은 합성 효소일 수 있다.

특정 구체예에서, 효소(들)는 인간을 포함하는 동물에 노출되었을 때 감소된 면역 반응을 일으키도록 설계된 저-알레르기 변이체이다. 용어 면역반응은 효소(들)에 노출된 동물의 면역 체계에 의한 어떤 반응으로서 이해되어야 한다. 면역 반응의 한 종류는 노출된 동물에서 증가된 수준의 IgE를 유발하는 알레르기 반응이다. 저-알레르기 변이체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 효소(들)는 면역 반응에 수반된 효소(들)의 폴리머 모이어티 쉴딩 부분 또는 에피토프와 콘쥬게이트될 수 있다. 폴리머와 콘쥬게이션은, 예를 들어, WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, 및/또는 WO 99/00489에서 기술되는 바와 같은 효소(들)에 폴리머의 시험관내 화학적 커플링을 수반할 수 있다. 콘쥬게이션은 그것에 추가로 또는 다르게는 효소(들)에 폴리머의 생체내 커플링을 수반할 수 있다. 이러한 콘쥬게이션은, 효소(들)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 유전적 엔지니어링하고, 효소(들)에서 추가의 글리코실화 자리를 코딩하는 일치 서열을 삽입하고, 효소(들)를 글리코실화할 수 있는 숙주에서 효소(들)를 발현시킴으로써 달성될 수 있다, 예를 들어, WO 00/26354 참조. 저-알레르기 변이체를 제공하는 다른 방법은 자기-올리고머화를 위한 효소를 야기할 수 있도록 효소(들)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 유전적 엔지니어링이며, 효소 모노머는 다른 효소 모노머의 에피토프를 쉴딩할 수 있고 이에 의해 올리고머의 항원성을 낮추는 것을 초래한다. 이러한 생성물 및 그것의 제조는 예를 들어, WO 96/16177에서 기술된다. 면역학적 반응에서 수반되는 에피토프는 파지가 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 기술되는 방법을 나타내는 것과 같은 다양한 방법, 또는 EP 561907에서 기술되는 무작위 접근에 의해 확인될 수 있다. 일단 에피토프가 확인되면, 그것의 아미노산 서열은 부위 지정 돌연변이와 같은 공지된 유전자 조작 기술에 의해 효소(들)의 변경된 면역학적 특성을 만들도록 변경될 수 있고(예를 들어, WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO 00/22103 참조) 및/또는 폴리머의 콘쥬게이션은 에피토프를 쉴딩하기 위한 폴리머에 대해 에피토프에 충분히 근접될 수 있다.

특정 구체예에서, 프로테아제, 리파아제, 및/또는 아밀라아제 효소는 (i) pH 4-8에서, 바람직하게는 또한 pH 3-4에서, 더 바람직하게는 pH 3.5에서 안정하며; (ii) pH 4-9에서, 바람직하게는 4-8에서, 더 바람직하게는 pH 6.5에서 활성이며; (iii) 펩신 및 다른 소화 프로테아제(예로써, 췌장 프로테아제, 즉 주로 트립신 및 키모트립신)에 의한 분해에 안정하고; 및/또는 (iv) 담즙산염의 존재하에서 안정 및/또는 활성이다.

용어 "조합하여"는 프로테아제, 리파아제, 및/또는 아밀라아제의 본 발명에 따르는 조합된 사용을 말한다. 조합된 사용은 동시, 중복하여, 또는 순차적일 수 있으며, 이들 3가지의 용어는 일반적으로 전문의에 의한 처방에 비추어 이해된다.

용어 "동시의"는, 예를 들어, 그것들이 하나 이상의 분리된 약학 제품으로서 동일 시간에 투여될 때, 또는 그것들이 하나 및 동일한 약학 조성물로 투여된다면, 효소가 동일 시간에 활성인 것 하에서의 환경을 말한다.

용어 "순차적인"은 효소 중 하나 및/또는 두 가지가 이후에 제 1, 및 제 2 및/또는 제 3 효소를 작용시키는 경우를 말한다. 순차적인 작용은 원하는 간격으로 별개의 약학 조제물로서, 또는 당해 효소가 다르게 조제되는(구분되는) 하나의 약학 조성물로서, 예를 들어, 개선된 생성물 안정성을 제공하는 다른 방출 시간을 얻기 위한, 또는 효소 투약량을 최적화하는 관점으로 당해 효소를 투여함으로써 얻어질 수 있다.

용어 "중복하여"는 효소 활성 기간이 완전히 동시도 완전히 순차적인 것도 아닌, 즉, 효소가 둘 다, 또는 모두가 활성인 특정 기간이 있는 경우를 말한다.

단수의 용어는, 예를 들어, 본 발명의 프로테아제, 리파아제, 및/또는 아밀라아제의 문맥에서 사용될 때, 적어도 하나를 의미한다. 특정 구체예에서, 단수는 "하나 이상", 또는 "적어도 하나"를 의미하며, 이는 다시 1, 2, 3, 4, 5 등을 의미한다.

두 아미노산 서열 사이의 관련은 상기에 상세하게 기술된(프로테아제 섹션에서) 변수 "동일성"에 의해 기술된다. 정의 및 과정은 또한 본 발명에 따르는 사용을 위한 리파아제 및 아밀라아제에 유사하게 적용가능하다.

본 발명의 효소(들)의 활성은 어떤 적당한 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 분석-pH 및 분석-온도는 당해 효소에 적용될 수 있다. 분석-pH-값의 예는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이다. 분석-온도의 예는 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 또는 95℃이다.

적당한 효소(주로 프로테아제) 분석의 예는 적당한 리파아제 및 아밀라아제 분석에 관한 본원의 실시예 1에 포함되며, 참고문헌은 또한 각각 WO 2006/136159 및 WO 2006/136161으로 구성된다.

약제

본 문맥에서, 용어 "약제"는 질병의 증상을 치료, 예방 및/또는 완화하는, 바람직하게는 질병의 증상을 치료 및/또는 완화하는 화합물, 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 약제는 전문의에 의해 처방될 수 있으며, 또는 처방전 없이 살 수 있는 제품일 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 효소(들)의 분리, 정제, 및 농도는 통상적인 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 그것들은, 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 통상적인 과정에 의해 발효 브로스(broth)로부터 회수될 수 있고, 제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피(예를 들어, 이온교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기배제), 전기영동과정(예를 들어, 분취 등전점 전기영동), 다른 용해도(예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출(예를 들어, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하는 다양한 공지된 과정에 의해 추가로 정제된다.

예를 들어, SEQ ID NO: 2의 리파아제는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,869,438의 기초로, 즉, 미국 특허의 SEQ ID NO: 1의 대응하는 변형인 DNA 서열의 적당한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 공지된 부위-지정 돌연변이에 의해 만들어질 수 있다.

특정 구체예에서, 각각의 효소(들)의 농축된 고체 또는 액체 제제는 개별적으로 제조된다. 이 농축물들은 또한, 하기에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이 적어도 부분적으로, 개별적으로 조제될 수 있다.

추가의 특정 구체예에서, 효소(들)는 고체 농축물의 형태로 본 발명의 약학 조성물에 포함된다. 효소(들)는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 고체 상태로 될 수 있다. 예를 들어, 고체 상태는 효소 분자가 매우 정돈된 형태인 경우 결정질, 또는 효소 분자가 덜 정돈된 형태, 또는 무질서한 형태인 경우 침전물일 수 있다.

결정화는, 예를 들어, EP 691982에서 기술되는 바와 같이 효소(들)의 pI에 가까운 pH 및 낮은 전도성, 예를 들어, 10 mS/cm 또는 미만에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따르는 사용을 위한 리파아제는 EP 600868 B1의 실시예 1에 기술되는 바와 같이 제조될 수 있는 결정질 리파아제이다. 리파아제 결정은 WO 2006/044529에서 기술되는 바와 같이 교차-결합될 수 있다.

다양한 침전 방법은, 황산암모늄, 및/또는 황산나트륨과 같은 염; 에탄올 및/또는 이소프로판올과 같은 유기 용매; 또는 PEG(폴리 에틸렌 글리콜)와 같은 폴리머에 의한 침전을 포함하여 당업계에 공지되어 있다. 또 다르게는, 효소(들)는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 동결건조, 증발(예를 들어, 감압에서), 및/또는 분무 건조에 의해 용매(전형적으로 물)를 제거함으로써 용액으로부터 침전될 수 있다.

추가의 특정 구체예에서, 효소(들)의 고체 농축물은 고체 농축물의 전체 단백질 함량에 대해 적어도 50% (w/w)의 활성 효소 단백질의 함량을 가진다. 또 다른 특정 구체예에서, 고체 농축물의 총 단백질 함량에 비하여 활성 효소 단백질의 함량은 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95% (w/w)이다. 단백질 함량은 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔의 덴시토미터 스캐닝에 의해, 예를 들어, BIO-RAD로부터 GS-800 캘리브레이팅된 덴시토미터를 사용하여; Roche로부터 상업적으로 이용가능한 Protein Assay ESL, order no. 1767003과 같은 상업적 키트를 사용하여; 또는 WO 01/58276의 실시예 8에 기술된 방법을 기초로 측정될 수 있다.

바람직하게는, 효소 단백질은 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔의 덴시토미터 스캐닝에 의해 측정되는 바와 같이, 본 발명에 따르는 사용을 위한 고체 효소 농축물의 단백질 스펙트럼의 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 또는 적어도 97%를 구성한다. 이러한 효소는 "분리된" 효소 또는 폴리펩티드를 지정할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 효소(들), 바람직하게는 농축된 효소 제제의 형태로, 더 바람직하게는 고체 농축물을 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조제, 또는 부수물을, (i) 적어도 하나의 담체 및/또는 부형제; 또는 (ii) 적어도 하나의 담체, 부형제, 희석제, 및/또는 보조제와 같은 재료와 함께 포함한다. 모두 약학적으로 허용가능한 선택적인 다른 성분의 비-제한적 예는, 붕괴제, 윤활제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향미제, 용매, 가용화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제, 추진제 및 비히클이다.

일반적으로, 특히 당해 의학적 징후에 따라서, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 모든 투여 방법에 대해 설계될 수 있고, 바람직하게는 장 투여(소화관을 통해)를 포함한다. 따라서, 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 마이크로스피어, 연고, 크림, 폼(foam), 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 로션 및 에어로졸과 같은 고체, 반-고체, 액체, 가스 형태로 있을 수 있다. 의사는 가장 적당한 투여 경로를 선택하는 것을 알 것이며, 물론 잠재적으로 위험한 또는 다른 불리한 투여 경로를 피할 것이다.

다음의 방법 및 보조 물질은 따라서 또한 단지 예시적이며 제한하는 방법은 아니다.

고체 경구 제제에 대해, 효소(들)는 단독으로 또는, 예를 들어, 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 보통의 담체; 결정질, 또는 마이크로결정질, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴과 같은 부형제 또는 결합제; 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 분해제; 카르나우바 왁스, 백랍, 셸락, 무수 콜로이드 실리카, 1500 내지 20000의 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs, 또한 용어 마크로골 하에서 공지됨), 특히 PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, 포비돈, 활석, 모놀레인(monolein), 또는 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제; 및 원한다면, 희석제, 보조제, 완충제, 습윤제, 메틸파라히드록시벤조에이트(E218)와 같은 보조제, 이산화티탄(E171)과 같은 착색제, 및 자당, 사카린, 오렌지 오일, 레몬 오일, 및 바닐린과 같은 향미제와 함께 펠렛, 마이크로펠렛, 정제, 마이크로정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만들기 위한 적당한 첨가제와 조합하여 사용될 수 있다. 경구 제제는 PEI의 의학적 징후를 치료하기 위한 바람직한 제제의 예이다.

효소(들)는 또한, 매우 일반적으로, 물과 같은 수용액, 또는 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고차 지방산의 에스테르, 프로필렌 글리콜, PEG 4000과 같은 폴리에틸렌 글리콜, 또는 선형 또는 분기된 C1-C4 알코올과 같은 저급 알코올, 예를 들어, 2-프로판올과 같은 비-수성 용액에서; 원한다면, 가용화제, 보조제, 희석제, 등장화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제, 및 보존제와 같은 통상적인 보조제 재료 또는 첨가제와 함께 그것들을 용해, 현탁화 또는 에멀젼화함으로써 액체 경구 제제로 조제될 수 있다.

전달 비히클로서 리포좀의 사용은 가능한 일반적 관심의 다른 방법이다. 리포좀은 표적 자리의 세포와 함께 융합되며 내강 세포 내의 내용물을 전달한다. 리포좀은 분리, 결합제 등과 같은 관계를 유지하기 위한 다양한 수단을 사용하여 융합을 위한 충분한 시간 동안 세포와 접촉하여 유지된다. 본 발명의 한 양태에서, 리포좀은 폐 투여를 위해 에어로졸화되도록 설계된다. 리포좀은 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등과 같은 막의 융합을 매개하는 정제된 단백질 또는 펩티드와 함께 제조될 수 있다. 지질은 양이온성 또는 포스파티딜콜린과 같은 양쪽이온성 지질을 포함하는 지질을 형성하는 공지된 리포좀의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 남은 지질은 보통 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같은 중성 또는 산성 지질일 수 있다. 리포좀을 제조하기 위해, Kato et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:3361에 의해 기술되는 과정이 사용될 수 있다.

시럽, 엘릭시르, 분말 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투약 형태가 제공될 수 있으며, 각 투약 단위, 예를 들어, 티스푼, 테이블스푼, 캡슐, 정제 또는 좌약은 미리 결정된 양의 효소(들)를 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥 투여를 위한 단위 투약 형태는 멸균수, 정상 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체에서 용액으로서 조성물 중에서 효소(들)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단위 투약 형태"는 인간 및 동물 피험자에 대한 단위 투약량으로서 적당한 물리적으로 별개인 단위를 말하며, 각 단위는 원하는 효과를 만들기에 충분한 양으로 미리 결정된 양의 효소(들)를 함유한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 장용, 바람직하게는 경구 투여를 위한 것이다.

추가의 특정 구체예에서, 경구 조성물은 (i) 효소(들)의 결정을 함유하는 액체 조성물; (ii) (매우) 정제된 효소(들)의 침전물의 액체 현탁액; (iii) 고체 또는 가용화된 형태로 효소(들)를 함유하는 겔; (iv) 고정된 효소(들)의 또는 입자 등에 흡수되는 효소들의 액체 현탁액; 또는 (v) 효소(들)-함유 분말, 펠렛, 과립, 또는 마이크로스피어의 형태인 고체 조성물, 원한다면, 정제, 캡슐 등의 형태(이는 선택적으로, 예를 들어 산에 안정한 코팅으로 코팅된다)이다.

본 조성물의 다른 특정 구체예에서, 효소(들)는 예를 들어, 개별 코팅에 의해 구분되며, 즉, 서로 분리된다.

본 조성물의 또 다른 추가 특정 구체예에서, 프로테아제는 리파아제 및/또는 아밀라아제와 같은 조성물의 다른 효소 성분으로부터 선택된다.

효소(들)의 투약량은 투여되는 특정 효소(들), 투여 빈도, 투여 방식, 증상의 중증도, 및 부작용에 대한 피험자의 민감성 등에 의존하여 광범위하게 다양할 것이다. 일부 특정 효소는 다른 것들보다 더 강력할 수 있다.

본 발명의 효소(들)의 고체 경구 제제의 예는 (i) SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11을 가지는 프로테아제; (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269와 적어도 70% 동일성을 가지는 리파아제; 및/또는 (iii) a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제, b) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제, 및 c) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 아밀라아제를 포함한다. 본 발명의 더 바람직한 고체 경구 제제에서, (ii) 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 포함하며, (iii) 아밀라아제는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-486을 포함한다.

(i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 매일의 임상적 투약량의 예는 다음과 같다(모두 체중(bw)의 kg 당 mg 효소 단백질): (i)의 프로테아제에 대해: 0.005-500, 0.01-250, 0.05-100, 또는 0.1-50 mg/kg bw; (ii)의 리파아제에 대해: 0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250, 또는 0.5-100 mg/kg bw; (iii)의 아밀라아제에 대해: 0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 또는 0.05-10 mg/kg bw, 바람직하게는 (i)의 프로테아제에 대해: 0.05-100, 0.1-50, 또는 0.5-25 mg/kg bw; (ii)의 리파아제에 대해: 0.1-250, 0.5-100, 또는 1-50 mg/kg bw; 및 (iii)의 아밀라아제에 대해: 0.01-50, 0.05-10, 또는 0.1-5 mg/kg bw.

아미드 (펩티드) 결합 뿐만 아니라 아미노 및 카르복시 말단은 경구 투여에 더 큰 안정성을 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 카르복시 말단이 아미드화될 수 있다.

소화 장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료에 적당한 본 발명의 약학 조성물의 특정 구체예는 본 발명의 효소(들)를 펠렛에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 펠렛은 일반적으로 생리학적으로 허용가능한 유기 폴리머의 10-90% (w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 비해), 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체의 10-90% (w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 비해), 및 효소(들)의 80-20%(w/w, 결과 펠렛의 건조 중량에 비해), 유기 폴리머의 총량, 각 경우에 100% 이하로 구성되는 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체 및 효소(들)를 포함할 수 있다.

생리적으로 허용가능한 유기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 1500, 폴리에틸렌 글리콜 2000, 폴리에틸렌 글리콜 3000, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴리에틸렌 글리콜 10000, 폴리에틸렌 글리콜 20000, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌의 공중합체 및 상기 유기 폴리머의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 4000은 생리적으로 허용가능한 유기 폴리머로서 바람직하다.

셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체는, 예를 들어, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 지방산 에스테르, 셀룰로오스 니트레이트, 셀룰로오스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 메틸에틸셀룰로오스 및 메틸히드록시프로필 셀룰로오스로부터 선택될 수 있다. 셀룰로오스, 특히 미정질 셀룰로오스는 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체로서 바람직하다.

결과 펠렛은 적당한 장용 코팅, 다른 비기능적 코팅으로 코팅될 수 있고 또는 이러한 코팅 없이 직접 사용될 수 있다. 추가로, 결과 펠렛은 상기에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같은 장애 또는 질병의 치료를 위한 적당한 크기의 경질 젤라틴 캡슐 또는 무젤라틴 캡슐과 같은 캡슐에 채워질 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 다른 효소 종류, 특히 리파아제, 프로테아제 및/또는 아밀라아제로부터 제조된 펠렛은 상기 캡슐에 채워질 수 있다. 다른 효소 종류로 캡슐을 채우는 동안, 단일 효소 종류(즉, 리파아제, 프로테아제 또는 아밀라아제)의 투약은 리파아제, 프로테아제 및/또는 아밀라아제 중 어떤 것의 특정 양이 캡슐에 첨가됨으로써 특정 증상 군 또는 특정 환자 하위군의 구체적 필요에 적용될 수 있으며, 즉, 캡슐은 리파아제:프로테아제:아밀라아제의 그것의 특정 비율에서 다양하게 만들어질 수 있다.

본 발명의 프로테아제의 바람직한 약학 조성물은 WO 2005/092370에서 기술되며, 특히 바람직한 부형제를 포함하는 조제물이 그것에서 언급된다. 특정의 바람직한 구체예에서, 약학 조성물은 모노-, 디- 및 트리-아실글리세라이드와 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지방족 C6-C22 카르복실산의 모노- 및 디-에스테르의 마크로골글리세라이드 혼합물, 및 또한 가능하다면 글리세롤 및 자유 폴리에틸렌 글리콜의 소부분을 포함한다.

마크로골글리세라이드 혼합물에 함유된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 바람직하게는 분자 당 평균 6 내지 많아야 40개의 에틸렌 옥사이드 단위 또는 200 내지 2000의 분자량을 가지는 PEG이다.

본 발명의 한 가지 추가 양태는 계면활성제, 보조 계면활성제 및 친유성 상으로 구성되는 시스템을 포함하기 위한 본 발명의 효소(들)의 약학 조성물을 제공하며, 시스템은 10보다 크거나 같은 HLB 값(친수-친유 평형) 및 30℃보다 크거나 같은 융점을 가진다. 바람직한 구체예에서, 시스템은 10 내지 16, 바람직하게는 12 내지 15의 HLB 값을 가지며, 30 내지 600℃, 바람직하게는 40 내지 500℃의 융점을 가진다. 특히, HLB 값 및 융점을 특징으로 하는 시스템은 모노-, 디- 및 트리아실글리세라이드 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 모노- 및 디에스테르와 8 내지 20개, 바람직하게는 8 내지 18개의 탄소 원자를 가지는 지방족 카르복실산의 혼합물이며, 이에 의해 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 분자당 약 6 내지 약 32개의 에틸렌 옥사이드 단위를 가지고, 시스템은 선택적으로 자유 글리세린 및/또는 자유 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다. 이러한 시스템의 HLB 값은 바람직하게는 PEG의 사슬 길이에 의해 조절된다. 이러한 시스템의 융점은 지방산의 사슬 길이, PEG의 사슬 길이 및 지방산 사슬의 포화 정도, 그리고 이런 이유로 마크로골글리세라이드 혼합물의 제조를 위한 출발 오일에 의해 조절된다.

"지방족 C8-C18 카르복실산"은 이들 산이 포화된다면, 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16) 및 스테아르산(C18)이 중요하고 가변적인 부분에 함유되는 혼합물, 및 대응하는 불포화 C8-C18 카르복실 산을 지정한다. 이들 지방산의 부분은 출발 오일에 따라서 다양할 수 있다.

모노-, 디- 및 트리아실글리세라이드 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 모노- 및 디에스테르와 8 내지 18개의 탄소 원자를 가지는 지방족 카르복실산의 이러한 혼합물은 예를 들어, 200 내지 1500의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 출발 오일 사이의 반응에 의해 얻어질 수 있고, 출발 오일은 개별적으로 또는 혼합물로서 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산 및 스테아르산, 올레산 및 리놀렌산을 포함하는 군으로부터 선택되는 지방산을 가지는 트리글리세라이드 혼합물로 구성된다. 선택적으로, 이러한 반응의 생성물은 또한 글리세린 및 자유 폴리에틸렌 글리콜의 소부분을 함유할 수 있다.

이러한 혼합물은 예를 들어 상표명 Gelucire® 하에서 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 한 가지 유리한 구체예는 상표명 Gelucire®하에서 알려진 제품의 혼합물을 제공하는 것이며, 특히 "Gelucire® 50/13" 및/또는 "Gelucire® 44/14"는 본 발명에 따르는 약학 제제에서 사용을 위한 적당한 혼합물을 나타낸다.

Gelucire® 50/13은 40% 내지 50% 및 48% 내지 58%에서 각각 결합된 지방산의 주요 부분을 구성하는 모노-, 디- 및 트리아실글리세라이드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르와 팔미트산(C16) 및 스테아르산(C18)의 혼합물이다. 카프릴산(C8) 및 카프르산(C10)의 비율은 각 경우에 3% 미만이며, 라우르산(C12) 및 미리스트산(C14)의 비율은 각 경우에 5% 미만이다.

Gelucire® 44/14는 모노-, 디- 및 트리아실글리세라이드와 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르의 혼합물이며, 각 경우에 팔미트산(C16)의 비율은 4 내지 25%, 스테아르산(C18) 5 내지 35%, 카프릴산 (C8) 15% 미만, 카프르산(C10) 12% 미만, 라우르산(C12) 30 내지 50% 및 미리스트산 (C14) 5 내지 25%이다. Gelucire® 44/14는 팜커넬 오일 및 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 알코올 분해/에스테르화 반응에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 모노-, 디- 및 트리아실-글리세라이드 및 폴리에틸렌 글리콜 모노-, 디에스테르의 지방족 C8-C18 카르복실산 및 또한 가능하다면 글리세린 및 자유 폴리에틸렌 글리콜의 소부분의 혼합물을 함유하는 시스템을 포함하는 본 발명의 효소(들)의 약학 조성물을 제공하며, 시스템은 40℃ 내지 55℃의 융점 및 12 내지 15 범위의 HLB 값을 가진다. 더 바람직하게는, 시스템은 44℃ 내지 50℃의 융점 및 13-14 범위의 HLB 값을 가진다. 또 다르게는, 시스템은 약 44℃의 융점 및 14의 HLB 값을 가지며, 또는 시스템은 약 50℃의 융점 및 13의 HLB 값을 가진다.

치료 방법

선택적으로 리파아제, 및/또는 아밀라아제(본 발명의 효소(들))와 조합한 본 발명에 따르는 사용을 위한 프로테아제는, 동물에서 다양한 질병 또는 장애의 치료적 및/또는 예방적 처리에 유용하다. 용어 "동물"은 모든 동물, 특히 인간을 포함한다. 동물의 예는, 비-반추동물, 및 양, 염소 및 소, 예를 들어, 육우 및 젖소와 같은 반추동물이다. 특정 구체예에서, 동물은 비-반추 동물이다. 비-반추 동물은 단위(mono-gastric) 동물, 예를 들어, 말, 돼지(제한되는 것은 아니지만, 새끼돼지, 성장중인 돼지, 어미돼지); 칠면조, 오리 및 닭과 같은 가금류(제한되는 것은 아니지만, 영계 병아리, 산란계를 포함); 어린 송아지; 고양이 및 개와 같은 애완동물; 및 어류(제한되는 것은 아니지만, 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함); 및 갑각류(작은새우 및 새우류를 포함)를 포함한다. 특정 구체예에서, 동물은 포유동물, 더 구체적으로는 인간이다.

예를 들어, 효소(들)는 보통 위 및 췌장으로부터 선택되는 소화 효소의 위장관으로의 부족한 생성 및/또는 분비에 의해 종종 야기되는 소화불량과 같은 소화장애의 치료에 유용하다.

추가로, 효소(들)는 PEI의 치료에 특히 유용하다. PEI는 특히, Borgstroem 테스트(JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5):1 16-125)를 사용하여 확인될 수 있고, 이는 췌장 암, 췌장 및/또는 위 수술과 같은 질병 및 질환, 예를 들어, 췌장의 전체 또는 부분적 절제, 위절제, 위장 후방 우회술(예를 들어, Billroth II 위장 문합술); 만성 췌장염; 열대성 췌장염; 유전성 췌장염; 슈바치만 다이아몬드 증후군(Shwachman-Diamond syndrome); 췌장 또는 총수담관의 관 폐쇄(예를 들어, 종양); 및/또는 낭포성 섬유증(진한 점액이 췌장의 관을 차단하는 유전성 질병)에 의해 야기될 수 있다. 효소(들)는 또한 급성췌장염의 치료에 유용할 수 있다.

소화 장애에 효소(들)의 효과는 EP 0600868에서 일반적으로 기술되는 바와 같이 측정될 수 있고, 실시예 2에서 위 질환 하에서 리파아제 안정성을 측정하기 위한 시험관내 소화흡수율을 기술하며, 실시예 3은 담즙산염의 존재하에서 리파아제 활성에 대한 시험관내 소화흡수율 시험이다. 대응하는 시험은 프로테아제 및 아밀라아제에 대한 설정일 수 있다. 또한 WO 02/060474는 적당한 시험, 예를 들어 (1) 돼지 시험 사료에서 지질 소화를 측정하기 위한 시험관내 시험, 및 (2) 지방, 단백질 및 전분의 소화흡수율이 측정되는 췌장 결핍 돼지에 의한 생체내 시험을 개시한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 프로테아제의 효과는 실시예 4의 생체내 스크리닝을 사용하여 측정된다.

다른 예에서와 같이, 효소(들)는 제 1 형 당뇨병, 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료에서, 특히 보통 이들 질병을 수반하는 소화 장애의 당뇨병 치료법에서 보조 치료를 위해 말기 합병증을 감소시키기 위한 목적으로 유용하다. 효소(들)의 당뇨병에서의 효과는 WO 00/54799에서 기술되는 하나 이상의 방법에 의해, 예를 들어, 글루코실화된 헤모글로빈의 수준, 혈당 수준, 저혈당 발작, 비타민 A, D 및 E와 같은 지용성 비타민의 상태, 인슐린의 요구되는 1일 투약량, 체중 지표 및 고혈당증 기간을 조절함으로써 결정될 수 있다.

본원에서 기술되고 청구되는 발명은, 제한되는 것은 아니지만, 본원에 개시되는 특정 구체예에 의한 범주에서 제한되지 않는데, 이들 구체예가 본 발명의 몇몇 양태의 예시로서 의도되기 때문이다. 어떤 동등한 구체예가 본 발명의 범주 내인 것으로 의도된다. 게다가, 본원에서 나타나고 기술되는 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 앞에서 언급한 기술로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부되는 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 충돌의 경우에, 정의를 포함하는 본 내용이 조절할 것이다.

다양한 참고문헌이 본원에서 인용되며, 이것의 개시는 그것 전체가 참고로써 포함된다.

사용되는 화학 물질은 적어도 시약 등급의 상업적 제품이었다.

실시예 1: 효소 분석

돼지 판크레아틴의 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제 활성에 대한 분석은 FIP (Federation Internationale Pharmaceutique)뿐만 아니라 European Pharmacopoeia 및 United States Pharmacopeia에 의해 공개되었다. 1 FIP-단위 = 1 Ph.Eur.-단위(European Pharmacopoeia). 분석은, 예를 들어: Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia에서 기술된다. 또한 Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds.): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385 참조. 적절한 효소 표준은 International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent로부터 구할 수 있다.

프로테아제 FIP 분석 뿐만 아니라 프로테아제, 리파아제 및 아밀라아제에 대한 다른 적당한 분석을 하기 기술한다.

프로테아제 FIP 분석

프로테아제 활성을 FIP 분석(Federation Internationale Pharmaceutique), 1 FIP-단위 = 1 Ph.Eur.-단위 (European Pharmacopoeia)를 사용하여 결정할 수 있다. 이 분석을 Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia. 또한 Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds.) 참조: Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385에서 다른 FIP 분석과 함께 기술한다.

이 분석은 판크레아틴에서 프로테아제 활성을 결정하기 위해 사용하였다. 미생물 프로테아제의 FIP 활성을 결정하기 위해, 엔테로키나아제를 첨가함으로써 활성화 단계를 생략하였다.

원칙: 기질 카세인을 pH 7.5 및 35℃에서 프로테아제에 의해 가수분해한다. 반응을 트리클로로아세트산의 첨가로 중단하고, 비-분해된 카세인을 여과한다. 용액 내 남아있는 펩티드의 양을 275nm에서 분광 광도법에 의해 결정한다.

활성의 정의: 프로테아제 활성을 공지된 FIP 활성의 췌장 기준 분말(프로테아제 기준 표준)에 대한 참고로써, 트리클로로아세트산의 5.0% (wt/vol, 즉, 5.0 g/100ml) 용액에 의해 침전되지 않은 펩티드의 양으로서 결정한다.

재료 및 방법:

카제인 용액:

1.25g 카제인(건조 물질), 예를 들어 Calbiochem no. 218680을 실제 투명한 용액이 얻어질 때까지 물에 현탁한다. pH를 8.0으로 조정하고, 용액을 물로 희석하여 최종 부피를 100mL로 만든다. 지금부터 물은 탈이온수를 의미한다.

붕산염 버퍼 pH 7.5:

2.5g 염화나트륨, 2.85g 사붕산이나트륨 및 10.5g 붕산을 900mL 물에 용해하고, pH를 pH 7.5+/-0.1로 조정한 다음, 물로 1000mL까지 희석한다.

여과지:

직경 125mm의 접힌 필터, 예를 들어 Schleicher & Schuell no. 15731A

여과지의 시험:

5.0% 트리클로로아세트산 5mL를 필터를 통과시킨다. 여과되지 않은 트리클로로아세트산 용액을 블랭크로 사용했을 때 여과물의 275nm 흡광도는 0.04 미만이어야 한다.

프로테아제 기준 표준물질:

프로테아제(췌장)는 국제 제약효소협회 표준물질 센터(벨기에 비-9000 겐트 하렐베케스트라트 72)로부터 상업적으로 입수가능하다. 표준물질에는 FIP/Ph.Eur.-단위/g로서 활성(A)이 표지된다. 약 130 프로테아제 FIP/Ph.Eur.-단위에 상응하는 양을 정확히 칭량한다. 해사 스파툴라 팁을 넣고, 얼음 냉각한 0.02M 염화칼슘(pH 6.0-6.2)로 적신 다음, 끝이 편평한 유리막대로 전체적으로 간다. 동일한 얼음 냉각된 염화칼슘 용액 약 90mL로 희석하고, 이 현탁액을 얼음조에서 15-30분간 교반한다. pH를 6.1로 조정하고, 부피를 동일한 염화칼슘 용액으로 100mL로 조정한다. 이 현탁액 5.0mL를 붕산염 버퍼 pH 7.5로 100mL까지 희석한다. 이 용액 1.0, 2.0, 및 3.0mL를 활성 시험에서 기준으로 사용한다(이후 표준물질(Standard)의 첫 글자를 따서 표준물질을 S1, S2, 및 S3로 칭한다).

시험 현탁액:

약 260 FIP/Ph.Eur.-단위와 등가 양의 샘플을 사용하여 프로테아제 기준 표준물질에 대한 상기 설명에 따라 샘플의 현탁액을 제조한다. pH를 6.1로 조정하고, 물을 100mL까지 가한다. 이 용액 5.0mL를 염화칼슘 용액 5mL와 혼합한다. 이 용액 5mL를 붕산염 버퍼로 100mL까지 더 희석한다. 이 용액 2.0mL를 분석에 사용한다(이후 활성 불명(unknon activity)의 샘플, 번호(number)의 첫 글자를 따서 샘플을 Un이라고 칭한다).

분석 과정(활성 시험):

기준 현탁액 3개(S1, S2, S3)와 샘플 현탁액(Un)에 대해 각기 3벌씩 분석을 수행한다. 샘플당 블랭크 1개면 충분하다(각각 S1b, S2b, S3b, 및 Unb라고 칭한다). 분광광도계의 보정 액체로 샘플/표준물질이 없는 블라인드(B)를 준비한다. 붕산염 버퍼를 각각 블라인드(B) 3.0mL; 샘플(Un) 1.0mL; 표준물질(S1, S2 및 S3) 2.0, 1.0 및 0mL씩 시험관에 넣는다. 프로테아제 기준 표준물질을 S1, S2 및 S3에 각각 1.0, 2.0 및 3.0mL씩 가한다. 시험 현탁액 2.0mL를 샘플(Un) 시험관에 가한다. 모든 블라인드(S1b, S2b, S3b, Un 및 B)에 트리클로로아세트산 5mL를 가하고 즉시 혼합한다. 모든 시험관을 유리 마개로 막고, 일정 온도(35+/-0.5℃)의 수조 안에 기질 용액과 함께 놓아둔다. 온도가 평형에 도달하면, 제0시간 시점에서 카제인 용액 2.0mL를 시험관 S1, S2, S3 및 Un에 가하고 즉시 혼합한다. 정확히 30분 후, 트리클로로아세트산 5.0mL를 각 시험관 S1, S2, S3 및 Un에 가하고 즉시 혼합한다. 시험관을 수조에서 꺼낸 다음, 실온에서 20분간 방치하여 단백질의 침전을 완료한다. 각 시험관의 내용물을 동일한 필터를 통해 2번 여과하고, 보상 액체로서 시험관 B로부터의 여과물을 사용하여 275nm에서 여과물의 흡광도를 측정한다. 표준물질(S1, S2, S3)의 기지의 표지된 활성(A)에 상대적으로 샘플(Un)의 활성을 FIP 단위로 계산한다. 흡광도 값 - 각 블라인드의 값(예를 들어, S1의 흡광도 - S1b의 흡광도)는 0.15-0.60 구간에 놓여야 한다.

프로테아제 Protazyme AK 분석

기질: 2.0mL 0.01% Triton X-100에 현탁된 Protazyme AK 정제(Megazyme T-PRAK1000) 1정. 교반에 의해 균질 현탁액이 제조되었다.

온도: 37℃

분석 버퍼: 10OmM HEPES/NaOH, 0.01% Triton X-100, pH 7.0

50OuL(마이크로 리터) Protazyme AK 기질 현탁액과 50OuL 분석 버퍼를 에펜드로프 시험관에서 혼합하고, 얼음 위에 놓아두었다. 2OuL 프로테아제 샘플(0.01% Triton X-100으로 희석)을 가했다. 에펜드로프 시험관을 37℃로 설정된 에펜드로프 써모믹서로 옮겨서 분석을 시작했다. 시험관을 에펜드로프 써모믹서에서 최고 진탕 속도(1400rpm)로 15분간 인큐베이션했다. 시험관을 다시 얼음조로 옮겨서 인큐베이션을 중단했다. 수분 후 냉각된 원심분리기에서 시험관을 원심분리했다(15,000rpm, 3분). 200uL 상청액을 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 프로테아제 활성의 척도로서 OD650을 판독했다. 분석에는 버퍼 블라인드도 포함시켰다(효소 대신).

프로테아제 Suc - AAPF - pNA 분석

기질: Suc-AAPF-pNA(Sigma® S-7388)

분석 버퍼: 10OmM 숙신산, 10OmM HEPES, 10OmM CHES, 10OmM CABS, 1 mM CaCl₂, 15OmM KCl, 0.01% Triton® X-100, HCl 또는 NaOH로 pH 9.0으로 조정

분석 온도: 25℃

희석된 프로테아제 샘플 300μL를 분석 버퍼 1.5mL와 혼합하고, 1.5mL의 pNA 기질(50mg을 1.0mL DMSO에 용해한 다음, 0.01% Triton® X-100로 45배 더 희석)을 가하여 활성 반응을 시작시키고, 혼합 후, 프로테아제 활성의 척도로서 분광광도계로 A405의 증가를 모니터했다. 모든 활성 측정값이 분석의 용량-반응 곡선의 선형 범위에 들어가도록 보장하고자 활성 측정 전에 프로테아제 샘플을 희석했다.

리파아제

기질: 파라-니트로-페닐(pNP) 발레레이트

분석 pH: 7.7

분석 온도: 40℃

반응 시간: 25분

황색을 나타내는 효소 분해된 산물은 405nm에서 특징적인 흡광도를 가진다. 그것의 양은 분광광도계로 결정된다. 리파아제 활성은 기지 활성을 가진 효소 표준물질에 상대적으로 결정될 수 있다. 활성은 Lipolase 단위(LU)로 표시될 수 있다. 1 LU(Lipolase 단위)는 상기 표준 조건에서 분당 적정가능한 부티르산 1mmol을 방출하는 효소의 양이다. 1 KLU = 1000 LU.

아밀라아제

기질: Phadebas 정제(Pharmacia Diagnostics; 가교형 불용성 청색 녹말 중합체, 소 혈청 알부민 및 버퍼 물질과 혼합되어 정제로 제조된다)

분석 온도: 37℃

분석 pH: 4.3

반응 시간: 20분

물에 현탁 후, 녹말은 알파-아밀라아제에 의해 가수분해되어 가용성 청색 단편들을 제공한다. 620nm에서 측정된 얻어진 청색 용액의 흡광도는 알파-아밀라아제 활성의 함수이다. 1 진균 알파-아밀라아제 단위(1 FAU)는 표준 분석 조건에서 1시간당 5.26g 녹말(Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275)을 분해하는 효소의 양이다.

실시예 2: 프로테아제의 제조

SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 및 11의 프로테아제 변이체를 표준 과정에 의해 제조했다. 간단히 말해서, 유전자에 무작위 및/또는 부위-지정 돌연변이를 도입하고, 돌연변이된 유전자로 Bacillus subtilis 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 발효시키고(예를 들어, WO 2004/111220의 실시예 1에 설명된 대로), 발효 육즙으로부터 프로테아제를 정제한다. 기준 프로테아제(SEQ ID NO:1)는 유사한 방식으로 Bacillus subtilis에서 재조합 방식으로 생산하였다.

다량의 프로테아제를 정제하기 위하여, 배양 육즙을 원심분리(13,000rpm, 20분)하여 투명한 상청액을 얻은 다음, 상청액을 0.45μm 필터를 통해 여과하여 나머지 Bacillus 숙주 세포를 제거했다. 여과물을 pH를 3M Tris로 pH 9.0으로 조정하고, 50mM Tris/HCl, pH 9.0으로 평형화된 MEP Hypercel 칼럼(PALL Life Sciences)에 프로테아제 용액을 적용했다. 몇 칼럼 부피의 평형화 버퍼로 칼럼을 세척한 후, 5OmM CH₃COOH/NaOH, pH 4.0을 사용하여 프로테아제를 용출시켰다. 용출 동안 수집된 분획들을 프로테아제 활성에 대해 시험했다(실시예 1의 종말점 Protazyme AK 분석 사용). 활성 분획들을 모아서 pH를 pH 4.5로 조정한 다음, 2OmM CH₃COOH/NaOH, 5OmM H₃BO₃, 1mM CaCl₂, pH 4.5(SP 평형화 버퍼)와 동일한 전도도가 되도록 분획 풀을 탈이온수로 희석했다. 조정된 분획 풀을 SP 평형화 버퍼로 평형화된 SP 세파로스 HP 칼럼에 적용했다. 몇 칼럼 부피의 SP 평형화 버퍼로 칼럼을 세척한 후, 동일한 버퍼에 NaCl을 선형 구배(0→0.5M)로 첨가하여 5 칼럼 부피에 걸쳐서 칼럼을 용출시켰다. 용출 동안 수집된 분획들을 프로테아제 활성에 대해 시험했다(Protazyme AK 분석 사용). 칼럼으로부터의 활성 분획들을 정제된 프로테아제 산물로서 모았다.

소량의 프로테아제를 제조하기 위하여(마이크로 정제), 배양 육즙을 0.45μm 필터를 통해 멸균 여과했다. 필터 플레이트(Whatman, Unifilter 800μL, 25-30μm MBPP)의 각 웰에 약 100μL의 MEP-HyperCel 크로마토그래피 매질 슬러리를 가했다. 크로마토그래피 매질이 교반되도록 격렬하게 진탕하면서(Heidolph, Titramax 101, 1000rpm) 실온에서 5분간 인큐베이션함으로써 크로마토그래피 매질을 200μL 25 mM Tris, 25mM 붕산나트륨, 2mM CaCl₂, pH 8.5로 2번 세척한 다음, 진공에서 액체를 제거했다(Whatman, UniVac 3). 다음에, 100μL 결합 버퍼(0.5M Tris, 25mM 붕산나트륨, 10mM CaCl₂, pH 8.5)와 400μL 배양 상청액을 필터 플레이트의 웰로 옮겼다. 4개 웰을 각 프로테아제에 대해 정상적으로 마이크로 정제하였다. 프로테아제와 크로마토그래피 매질을 결합시키기 위하여, 필터 플레이트를 격렬하게 진탕하면서 30분간 인큐베이션했다. 진공에서 미결합 물질의 제거 후, 100μL 결합 버퍼와 400μL 배양 상청액을 가하고, 진탕하면서 30분간 인큐베이션한 다음, 진공에서 미결합 물질을 제거하는 결합 단계를 반복했다. 다음에, MEP-HyperCel 매질을 0.1M Tris, 25mM 붕산나트륨, 2mM CaCl₂, pH 8.5로 1번, 25mM Tris, 25mM 붕산나트륨, 2mM CaCl₂, pH 8.5로 1번, 그리고 10mM Tris, 25mM 붕산나트륨, 2mM CaCl₂, pH 8.5로 1번 세척했다. 각 세척 단계에서, 200μL의 버퍼를 가하고, 실온에서 10분간 플레이트를 격렬하게 진탕하면서 인큐베이션한 다음, 진공에서 버퍼를 제거했다. 크로마토그래피 매질로부터 프로테아제를 유리시키기 위하여, 100μL 용출 버퍼(50mM 아세트산나트륨, 2mM CaCl₂, pH 4.3)를 가하고, 필터 플레이트를 실온에서 10분간 격렬하게 진탕하면서 인큐베이션했다. 프로테아제를 함유하는 용출 버퍼를 진공에서 96-웰 플레이트로 옮겼다. 100μL 용출 버퍼를 가하고, 실온에서 10분간 진탕하고, 같은 96-웰 플레이트에 수집함으로써 용출 단계를 반복했다. 모아진 마이크로 정제된 프로테아제를 -18℃에 보관했다.

아래 설명된 대로 활성 부위 적정에 의해서 효소 단백질 농도를 결정하거나, 또는 S. C. Gill & P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)에 개략된 원리를 이용하여 A280 값과 아미노산 서열(아미노산 조성)을 기준으로 계산했다. 또한, 예를 들어 WO 2004/111221의 실시예 3에 설명된 아미노산 분석에 의해서 효소 단백질 농도를 결정할 수 있다.

활성 부위 적정에 의한 효소 농도의 결정은 다음에 따라서 치밀하게 결합하는 키모트립신 억제제 2A(CI-2A; Ludvigsen, S., Shen, H. Y., Kjaer, M., Madsen, J. C, Poulsen, F. M.: Refinement of the three-dimensional solution structure of barley serine proteinase inhibitor 2 and comparison with the structures in crystals. J. Mol. Biol., vol 222, pp. 621-635, 1991 참조)을 사용하여 행했다. 마이크로타이터 플레이트에서, 마이크로 정제된 프로테아제의 20μL 알리쿼트(0.1M Tris, 0.0225% Brij 35(폴리옥시에틸렌(23) 라우릴에테르), pH 8.6로 적당히 희석)와 20μL CI-2A(0.1M Tris, 0.0225% Brij 35, pH 8.6를 사용하여 2, 1.5, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 및 0μM로 정규 희석)를 혼합했다. 진탕하면서 1시간 인큐베이션한 후, 160μL 기질 용액(DMSO에 용해한 200mg/mL 스톡으로 제조된 0.1M Tris, 0.0225% Brij 35, pH 8.6에 정규 용해한 0.4mg/mL Suc-Ala-Ala-Ala-pNA)을 가하고, 3분간 10초 마다 405nm에서 흡광도를 측정하여 잔류 활성을 측정했다(Spectramax, Molecular Devices). 잔류 활성 대 (유의한) 잔류 활성을 나타낸 웰의 억제제 농도의 선형 회귀식으로부터 활성 프로테아제 농도를 계산했다.

표 1은 본 발명의 선별된 변이체의 리스트이다. 이들 프로테아제를 다음 실시예들에 설명된 대로 시험했다.

변이체 리스트

변이체	SEQ ID NO:	돌연변이
기준 프로테아제	1	-
VAR294	6	E125D
VAR295	7	R38T
VAR375	8	T44K+S99P
VAR213	9	S69T
VAR307	10	R165S
VAR203	11	S69T+E125D

실시예 3: 개선된 pH -비를 가진 프로테아제

프로테아제 변이체 VAR294(SEQ ID NO:6)을 pH 5.6과 pH 8.0에서 프로테아제 활성에 대해 시험하고, 아래 설명된 대로 기준 프로테아제(SEQ ID NO:1)의 상응하는 활성과 비교했다.

프로테아제 분석

Molecular Probes(Invitrogen, 카탈로그 번호 E6639)의 EnzChek® 프로테아제 분석 키트를 사용했다. 이것은 기질로서 pH-무감응 적색-형광 BODIPY® TR-X 염료로 무겁게 표지된 카제인 유도체들을 사용하며, 결과적으로 콘쥬게이트의 형광이 거의 모두 퀀칭된다. 프로테아제-촉매된 가수분해는 형광이 높은 BODIPY TR-X 염료-표지된 펩티드를 방출한다. 수반된 형광의 증가는 프로테아제 활성에 비례한다.

시약:

적색 형광(200μg)에 대해 EnzChek 프로테아제 분석 키트 시험관 1개를 200μL 0.1M NaHCO₃(pH 8)에 용해하여 1mg/mL의 스톡 용액을 얻는다.

HCl로 100mM Tris/염기를 pH 8.0으로 조정하여 분석 버퍼 pH 8을 제조한다. 표지된 기질 6.25μg/mL를 가한다.

0.2M 숙신산 25mL와 0.2M NaOH 37.5mL를 혼합하여 분석 버퍼 pH 5.6을 제조한다(참고자료: Gomori, Meth. Enzymol. 1, 141 (1955)). 첨가된 프로테아제를 보상하기 위하여, 분석 버퍼 각 100mL당 1M HCl를 1.143mL씩 가한다. 이로써 버퍼의 pH가 약 5.0으로 저하된다. 표지된 기질 5μg/mL를 가한다.

샘플 분석:

0.5μM 프로테아제 용액(기준 프로테아제, 프로테아제 변이체, 모두 2벌씩) 10μL를 384-웰 플레이트에서 각 버퍼 40μL와 혼합한다. 750rpm/분으로 격렬하게 진탕하면서 실온에서 60분 인큐베이션한다. t=0 및 t=60분 시점에서 형광 마이크로플레이트 리더에서 형광을 판독한다. BODIPY TR-X 표지된 펩티드는 589/617nm의 여기/방출 최대점을 가진다. 표준 플루오레세인 필터(여기 = 590nm, 방출 = 635nm)를 사용하여 BODIPY TR-X 염료-표지된 펩티드를 검출했다.

계산:

t=60분 시점에서 pH 5.6에서 판독값은 t=0에 비해 4배 더 높았다. pH 5.6의 판독값과 pH 8의 판독값 사이의 비를 계산한다. 얻어진 값은 기준 효소의 각 값에 비해 1.4배 더 높았다. 변이체에 대한 비를 각 96-웰 플레이트의 8개 기준 웰의 평균 비와 비교한다. 계산에서는 두 pH 값 모두에서 t=60에서 t=0을 뺀다.

결과

아래 표 2에 기재된 변이체는 1.00의 pH 5.6/pH 8.0 비를 갖는 기준 프로테아제와 비교하여 pH 5.6/pH 8.0에서 상이한 활성비를 가진다.

변이체	SEQ ID NO:	pH 5.6/pH 8.0 활성비
VAR294	6	1.27

실시예 4: 프로테아제 효율에 대한 생체내 스크리닝 시험

정제된 프로테아제 변이체 VAR294, VAR295, VAR375, VAR213, 및 VAR307(SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 및 10)를 췌장 내분비 기능부전(PEI)을 유발시킨 3-4마리의 암컷 괴팅겐 미니돼지(Ellegaard) 그룹에서 프로테아제 스크리닝 시험 연구했다. 췌장관을 결찰하여 미니돼지에서 췌장 내분비 기능부전(PEI)을 유발시켰고, 모두 이소플루오란 마취하에 이들에게 회맹장 재진입 캐뉼라를 장착했고, 체중은 약 25kg이었으며, 다른 점은 Tabeling 등(Tabeling et al. (1999): "Studies on nutrient digestibilities(pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution", J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82:251-263)과 Gregory 등(Gregory et al. (1999): "Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation" in "Biology of the Pancreas in Growing Animals"(SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393)에 설명된 바를 따랐다. 연구를 시작하기 전에 적어도 4주 동안 수술에서 회복되도록 두었다. 연구 시작 전에, 대변 키모트립신 검사를 통해 각 돼지의 PEI 상태를 확인했다(독일 디-64625 벤스하임 비젠스트라세 4에 위치한 Immundiagnostik AG로부터 상업적으로 이용가능, 카탈로그 번호 K6990).

분석

연구 동안 돼지를 12:12 시간 명암 사이클을 적용하는 변형된 대사 케이지에 넣어 길렀고, 물에는 자유롭게 접근하도록 했으며, 하루 2번 식사를 제공했다.

시험식

시험식은 단백질 21.3%, 녹말 51.9%, 지방 2.6%을 함유했으며, 조성(g/100g 건조 물질)은 어분 3.5, 가금육분 10.2, 밀가루 29.5, 도정한 쌀 14, 감자녹말 11, 옥수수녹말 14, 카제인 5.9, 셀룰로오스 분말 4.3, 비타민, 미네랄 및 미량 원소 7.6이었다(돼지/새끼돼지에 대한 영양 요건에 따라, 예를 들어 WO 01/58276의 표 A 참조).

성능

프로테아제 효율을 평가하기 위하여, 돼지에게 물 1L, 0.625g Cr₂O₃(산화크롬 마커)와 혼합된 250g 시험식을, 제공하기 직전에 기준 프로테아제 SEQ ID NO:1을 상이한 양(0mg, 20mg, 50mg 및 120mg 효소 단백질, 0, 500, 1250 및 3000 FIP U 프로테아제/식사와 등량)으로 혼합하여 1번 제공했다.

시험을 위하여, 본 발명의 프로테아제 변이체를 mg 효소 단백질(20mg, 50mg 및 120mg/식사)에 따라서 복용시켜, 기준 프로테아제와 생체내 효율을 비교했다.

회장에 식사 마커(녹색 미즙)가 최초 나타난 후 8시간 뒤 전체 회장 미즙을 얼음 위에 수집하고, 분석시까지 -20℃에 보관했다. 각 측정 사이에 최소 1일의 장세척 기간을 두었다.

분석

냉동된 회장 미즙 샘플을 동결 건조하고 분쇄하여, 건조 물질(DM)과 조 단백질에 대해 분석했다.

DM은 동결 건조 후 103℃에서 8시간 인큐베이션한 다음, 중량 기준으로 추정했다.

조 단백질은 Animal Nutrition, 4판, 13장(Eds. P. McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9)에 기재된 대로 조 단백질(g/kg) = N(g/kg) x 6.25에 따라서 인자 6.25를 곱한 질소(N)로서 계산했다. 질소 함유량은 "Vario MAX CNS" 원소분석기(Elementar Analysensysteme GmbH)를 사용하여 Dumas 연소법(PG Wiles, IK Gray, RC Kissling, J AOAC Int. 1998 May-Jun; 81(3):620-32)에 의해 결정했다.

Cr₂O₃는 크롬산염으로 산화되며, Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p 181-189(Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)에 Petry와 Rapp에 의해 설명된 대로 305nm(분광광도계)에서의 여기에 의해 크롬 함유량을 계산했다.

겉보기 전-맹장 단백질 소화능을 아래 식에 따라서 마커법에 의해 계산했다:

상기에서, Cr₂O₃ 및 단백질은 g/100g 건조 물질로 표시되었다.

또한, 50% 및 60% 단백질 소화능(% CNA)을 달성하는데 필요한 프로테아제의 양(mg)을 각 회귀 곡선으로부터 각각 외삽하여 구하였다(엑셀). 기준 프로테아제의 50% 및 60% 단백질 소화능(% CNA)과 더 효과적으로 비교하기 위하여, 소위 개선 인자라고 하는 "IF"를 계산했다. 50% 및 60% 단백질 소화능(% CNA)를 달성하는데 필요한 기준 프로테아제의 양(mg)을 50% 및 60% 단백질 소화능(% CNA)을 달성하는데 필요한 변이체 프로테아제의 양(mg)으로 각각 나누어 각 프로테아제 변이체에 대한 IF50 및 IF60 값을 결정했다.

결과 및 결론

회장 단백질 소화 결과를 다음 표 3에 나타낸다. 프로테아제 용량은 식사당 효소 단백질 밀리그램(mg/식사)으로 표시한다.

또한, 표 4에 언급된 변이체도 모두 시험했다. 이들은 모두 0.8 이상의 IF를 가졌다.

실시예 5: 제약학적 프로테아제 조성물

펠릿

프로테아제 변이체 VAR295(SEQ ID NO:7)의 액상 농축물을 실시예 2에 설명된 대로 제조한다. 이 액상 농축물을 세균 여과하고 분무 건조한 다음, 건조된 분말의 프로테아제 단백질 함유량을 측정한다. 프로테아제 단백질 함유량은 50% 이상인 것이 바람직하다(규제 요건에 따라서). 상업적으로 입수가능한 믹서에서 200g 미세결정 셀룰로오스 및 300g 폴리에틸렌 글리콜 4000(Macrogol™ 4000)과 함께 건조 프로테아제 분말 500g을 예비 혼합한다. 통상 사용되는 습윤제를 충분한 양으로 가하고, 얻어진 젖은 덩어리를 실온에서 충분히 혼합한다. 다음에, 균질한 덩어리를 어떤 구멍 직경, 예를 들어 0.8mm의 구멍 직경을 가진 피어싱 다이가 장착된 상업적으로 입수가능한 압출기에서 압출하여 원통형 펠릿을 형성한다. 통상 사용되는 습윤제를 필요한 양으로 첨가하여 상업적으로 입수가능한 구형화 장치에서 생성된 압출물을 구형 펠릿으로 둥글게 만든다. 펠릿을 상업적으로 입수가능한 진공 건조기에서 약 40℃의 제품 온도로 건조시킨다. 다음에, 적당한 크기의 스크린, 예를 들어 0.7 및 1.4mm 스크린을 구비한 기계적 분류기를 사용하여 건조된 펠릿을 분리하여 바람직한 체 통과 분획을 얻는다. 수집된 체 통과 분획, 예를 들어 ≥ 0.7mm이고 ≤1.4mm인 분획을 수집하고, 적당한 크기의 캡슐에 바람직한 표준화된 활성 물질 내용물을 포함하는 부분에 충전한다.

실시예 1에 설명된 대로 활성화 단계가 생략된 변형된 췌장 분말로부터의 프로테아제에 대한 FIP 법을 적용하여, 얻어진 펠릿을 단백질 가수분해 활성에 대해 시험한다.

다음에, 얻어진 펠릿을 Pharm. Eur. 2.9.1.("Disintegration of tablets and capsules" 부문)(시험 용액: 물 - 50OmL, 37℃)에 따라서 붕해에 대해 시험한다.

실시예 6: 시험관내 독성

프로테아제 독성의 시험관내 스크리닝에는 인간 결장 선암종 셀라인을 사용한 세포 분석을 사용했다. 이 분석은 세포의 대사 능력과 그에 따른 생육성을 측정한다.

HT -29 및 Caco -2 세포를 사용한 시험관내 독성 분석

HT-29 세포(ACC 299, 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈, DSMZ)를 10% FBS(Sigma, cat. no. F-6178)로 보충된 McCoy's 5A 배지(Cambrex)에서 배양했다. 실험을 위해 96-웰 배양 플레이트에서 4·10⁴ 세포/웰/200μL 밀도로 세포를 배양했다. 세포를 웰에 24시간 적응시킨 후, 0.5g/L 프로부민(Millipore), 1% 인슐린/트랜스페린/셀레늄 보충제(Invitrogen) 그리고 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)으로 보충된 혈청 무함유 배지(DMEM:F12, Invitrogen)에 시험 성분(프로테아제)을 가했는데, 2배씩 희석하여 9개의 상이한 농도(중량/부피 효소 단백질)를 3벌씩 만들었고, 24시간 더 인큐베이션했다. Alamar Blue(Invitrogen) 측정을 이용하여 세포의 대사 능력에 의해서 생육성을 측정했다. Caco-3 세포를 10% 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 및 1% 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM(Invitrogen, 11960-044)에서 배양했고, 가습 5% 이산화탄소 분위기에서 성장시켰다. 실험을 위해 96-웰 플레이트에서 3·10⁴ 세포/웰/200μL 밀도로 세포를 배양했다. 세포를 웰에 24시간 적응시킨 후, 혈청 무함유 배지에 시험 성분을 가하여 혈청에 존재하는 프로테아제 억제제와 프로테아제의 결합을 피했고, 24시간 더 인큐베이션한 후, 생육성을 측정했다. 세포가 Alamar Blue를 대사시키는 능력을 측정함으로써 세포 생육성을 측정했다. 프로테아제 변이체의 시험에 따른 모든 실험은 혈청 무함유 조건에서 행했다.

어떤 프로테아제도 가하지 않은 웰들에서 최대 대사 활성을 관찰한다(100%로 설정). 시험 프로테아제에 대해 최대 대사 활성의 50%가 얻어진 농도를 기준 프로테아제에 대해 최대 대사 활성의 50%가 얻어진 농도로 나눈 결과, 얻어진 "독성비"를 아래 표 4에 나타낸다. 농도가 높을수록 독성은 낮다. 기준 프로테아제에 대한 비가 높을수록 독성이 더 많이 감소된다. 따라서, 프로테아제 VAR203의 독성은 기준 프로테아제와 비교하여 감소된다. 변이체들을 Caco-2와 HT-29 세포에 대해 모두 시험했다.

실시예 7: 시험관내 소화 성능

프로테아제 VAR203(SEQ ID NO:11)과 표 4에 언급된 나머지 변이체들의 성능을 1시간 pH 3(위) 단계와 2시간 pH 6(장) 단계를 포함하는 시험관내 소화 모델에서 결정하고, 기준 프로테아제(SEQ ID NO:1)의 성능과 비교했다. 프로테아제는 실시예 2에 설명된 대로 정제했고, 효소 단백질의 함유량은 mg/mL 단위로 A280에 따라 결정했다.

실시예 4의 시험식과 동일한 음식을 0.1M HCl에 용해하여 0.2g 음식/mL의 작업 슬러리를 얻었다. HCl로 pH를 pH 2.5로 조정했다. 100μL 음식 슬러리를 MTP(마이크로타이터 플레이트)의 각 웰에 넣고, 20μL 펩신(Merck VL 317492437, 카탈로그 번호 1.0792.0001, 700mg/L, 최종 농도 93μg/mL) 및 30μL 희석 효소(10μM로 희석(0.2mg/mL))와 혼합했다. 모든 웰의 최종 pH는 2.8-3.0였다. 각 효소에 대해 4개의 농도를 2벌씩 만들었다(2OmM Acetate, 0.01% Triton X-100, pH5로 희석). 이것을 37℃에서 1시간 동안 750rpm(에펜드로프 써모믹서)으로 인큐베이션했으며, 시험관내 소화 모델의 위 단계로서 정의한다.

장 단계를 시작하기 위하여, 각 웰에 25μL 버퍼(0.8M MES, 0.8M 이미다졸, 0.8M 아세테이트, 40%/60% 혼합 pH 5/9)를 가하여 pH를 6.0-6.05로 상승시켰다. 이에 더하여, 25μL 담즙산염(8OmM 담즙산염, Solvay Pharmaceuticals의 담즙산염 혼합물, Batch 176.01-PA-7374, 탈이온수, Millipore milliQ에 용해)을 10mM의 최종 농도로 가하고 37℃에서 2시간 동안 750rpm으로 인큐베이션했다. 10분간 40℃에서 2700rpm으로 원심분리하여 음식 슬러리로부터 프로테아제를 분리함으로써 장 단계를 종료했다.

OPA 법(O-프탈디알데히드)을 이용하여 상청액 중의 자유 아미노기를 정량함으로써 프로테아제 활성을 결정했다. '펩신 단독' 웰에서 효소를 가진 웰에 존재하는 자유 아미노기의 수를 뺀 것이 프로테아제 성능을 반영한다. 상청액을 효소 희석 버퍼(2OmM 아세테이트 pH 5, 0.01% Triton X-100)로 10배 희석했고, 희석된 상청액 20μL를 200μL OPA 시약(3.81g 사붕산이나트륨 10수화물, 1mL 10% SDS, 88mg DTT를 혼합하고, 2mL 96% 에탄올에 용해된 80mg OPA를 가한 후, 탈이온수를 총 부피 100mL까지 가했다)과 혼합했다. 자유 아미노기 정량의 표준물질로서 세린 희석물(0.5mg/mL 스톡을 2배 희석) 줄을 포함시켰다. 340nm에서 흡광도를 측정했다.

효소를 사용하지 않은 경우에 대해 보정된 가수분해된 아미노기(OPA 결정법에 의해 얻어짐)의 절대 데이터를 3개-매개변수 논리식에 맞춰 피팅하여 기준 프로테아제에 상대적인 시험된 변이체의 겉보기 개선 인자(IF)를 계산한다:

상기에서, NH₂는 자유 아미노기의 양(mM)이고, NH₂(최대)는 음식으로부터 프로테아제가 유리될 수 있는 자유 아미노기의 최대량이고, 농도는 프로테아제 농도(음식(250g)당 mg 효소)이고, 기울기는 평행 곡선(아래 참조)의 기울기이고, I(50)은 IF가 계산되는 변수이다. 뒤집힌 V는 지수임을 의미한다. NH₂(최대)는 아주 높은 용량의 기준 프로테아제를 사용하여 20mM까지 실험적으로 결정했다.

얻어진 데이터를 이 식에 맞춰 피팅하기 위해 두 가지를 가정했다. 첫째, 가수분해된 아미노기 대 복용된 효소 mg에 대해 얻어진 곡선들은 모두 평행이다(기울기 일정). 두 번째, 기질 활용성은 활성의 제한 인자이고, 따라서 가수분해된 아미노기의 양의 평탄역(NH₂(최대))은 상당히 높은 효소 농도에서 얻어질 것이다. 개선 인자(IF)는 다음과 같이 정의한다:

IF = I(50)(기준)/I(50)(변이체)

상기에서, I(50)(기준)은 반 NH₂(최대)를 얻는데 필요한 기준 효소의 농도이고, I(50)(변이체)는 반 NH₂(최대)를 얻는데 필요한 변이체 농도이다.

기준 프로테아제 개선 인자를 1.0이라고 정의하면 프로테아제 변이체 VAR203은 2.6의 개선 인자를 가진다. 이것은 기준 프로테아제와 유사한 효과를 얻기 위해서 2.6배 더 낮은 양의 VAR203 프로테아제가 필요하다는 것을 의미한다. 표 4에 기재된 변이체는 모두 0.7 이상의 IF를 가졌다.

실시예 8: 위에 카테테르가 삽입된 래트 모델을 이용한 독물학 평가

시험 시스템

경험상 시험 품목은 래트에 위관을 통한 프로테아제의 투여 후, 증가된 구토 위험을 나타냈으며, 뒤이은 폐에의 의도치 않은 노출 위험도 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 특수 실험 방법을 사용하여 위장관에서 야생형(SEQ ID NO:1)으로부터의 프로테아제 변이체들의 생체내 독성을 구별해 보았다. 이들 실험에는 Charles River Laboratories Germany GmbH에서 제공된 위에 카테테르가 삽입된 래트를 사용했다. 시험 품목을 14일간 매일 위-카테테르를 통해 위에 직접 투여하여 기관에 잘못 투약될 위험을 제거했고, 위로부터 시험 품목이 구토될 위험을 감소시켰다. 적용 부피는 모든 프로테아제에 대해 10mL/kg이었고, 투여 약 4시간 전에 음식을 회수하고, 투약 후 4시간 뒤에 다시 제공했다. 동물들은 단독으로 사육되었고, 카테테르의 막힘을 방지하기 위해서 카테테르를 투여 후 매번 그리고 매주 한번 오후에 수돗물로 헹구었다.

측정

거동 변화, 치료에 대한 반응 또는 질병의 어떤 징후들에 대해 투약 전후 개별적으로 래트를 관찰했다. 투약 전과 투약 후 1시간 뒤에 연구 도중 3번 항문 체온계로 모든 동물의 체온을 측정했다. 체중 및 음식 소비는 1주일 간격으로 측정했고, 물 소비는 물병을 매일 육안 조사했다. 종료 시점에서 모든 동물을 세밀히 부검했고, 위, 기관 및 폐를 포함하는 잠재적 표적 장기에 대해 조직병리검사를 수행했다.

결과

본 연구에서 관찰된 사망률은 구토로 인한 시험 품목의 호흡관 유입 및 적용 부위(위)로부터 시험 품목의 누출을 포함한 기술적 문제와 우세하게 관련된다. 사망률은 대부분 700mg/kg 용량 수준의 야생형 프로테아제 치료군에서 우세하다.

조직병리검사에서 상피의 편평세포 증식증과 관련된 앞위 염증이 표적 독성으로 고려된다. 시험 품목에 의해 유발된 위점막에 대한 국소 효과에 기초하면, 전체적으로 변이체와 비교하여 야생형 프로테아제가 더욱 독성이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S Solvay Pharmaceuticals GmbH <120> Protease variants for pharmaceutical use <130> 11144.204-WO <160> 11 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 1 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant (T231R+N233R) of Humicola lanuginosa lipase <220> <221> PROPEP <222> (1)..(5) <220> <221> mat_peptide <222> (6)..(274) <400> 2 Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn -5 -1 1 5 10 Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp 15 20 25 Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 30 35 40 Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly 45 50 55 Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu 60 65 70 75 Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly 80 85 90 Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys 95 100 105 Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr 110 115 120 Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg 125 130 135 Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala 140 145 150 155 Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 160 165 170 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 175 180 185 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 190 195 200 Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu 205 210 215 Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile 220 225 230 235 Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn 240 245 250 Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr 255 260 265 Cys Leu <210> 3 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of Bacillus licheniformis amylase <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(481) <400> 3 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 305 310 315 320 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 4 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of Bacillus sp. amylase <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(483) <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys <210> 5 <211> 513 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant of Bacillus stearothermophilus amylase <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(486) <400> 5 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 6 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant E125D of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 6 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 7 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant R38T of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 7 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 8 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant (T44K+S99P) of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 8 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Lys Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Pro Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 9 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant S69T of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 9 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Thr Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 10 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant R165S of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 10 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 11 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant (S69T+E125D) of Nocardiopsis sp. protease <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(188) <400> 11 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Thr Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185

Claims (19)

1. SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 적어도 90% 동일성을 가지며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-188과 비교하여 다음의 치환 A1T; I3V; G12; R14I; T22A; N23D; G34A; R38; T41A; T44K; N47; G48D; E53K; Q54L,D; T68A,R,S; S69T; L73P; V88A; S99P; P124L; E125; M131V; T151I; R165; 및 T166A로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 프로테아제.
2. 제 1 항에 있어서, 다음의 치환 G12D,N,H; R38T; N47H,T,S; E125D 및 R165S,H,G,T 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
3. 제 2 항에 있어서, 다음의 치환 G12D; 및 (N47H+G48D) 또는 이 치환의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
4. 제 1 항에 있어서, 다음의 치환 R38T, (T44K+S99P), S69T, (S69T+E125D), E125D, 및 R165S 또는 이 치환의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
5. 제 1 항에 있어서, 약제로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 프로테아제.
6. 제 1 항에 있어서, 약제로서 사용을 위해 리파아제 또는 아밀라아제와 조합되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
7. 제 6 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제와 조합되며,
   (i) 상기 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 70% 동일성을 가지고; 및/또는
   (ii) 상기 아밀라아제는
   a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제,
   b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제, 및
   c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제
   로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
8. 제 1 항에 있어서, 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 프로테아제.
9. 제 8 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제와 조합된 것을 특징으로 하는 프로테아제.
10. 제 9 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제와 조합되고,
    (i) 상기 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 70% 동일성을 가지고; 및/또는
    (ii) 상기 아밀라아제는
    a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제,
    b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제, 및
    c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
11. 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 보조 물질과 함께, 제 1 항에서 정의되는 프로테아제를 포함하는 약학 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 12 항에 있어서,
    (i) 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 70% 동일성을 가지고; 및/또는
    (ii) 아밀라아제는
    a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제,
    b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제, 및
    c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 정의되는 프로테아제의 치료적으로 유효한 양을 투여함으로써, 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서,
    (i) 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 70% 동일성을 가지고; 및/또는
    (ii) 아밀라아제는
    a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제,
    b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제, 및
    c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 소화 장애, 췌장 기능 부전, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제 1 형 당뇨병 및/또는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제 1 항에서 정의되는 프로테아제의 사용.
18. 제 17 항에 있어서, 리파아제 또는 아밀라아제의 사용을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
19. 제 18 항에 있어서,
    (i) 리파아제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-269를 가지는 리파아제와 적어도 70% 동일성을 가지고; 및/또는
    (ii) 아밀라아제는
    a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-481을 가지는 아밀라아제,
    b) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-483을 가지는 아밀라아제, 및
    c) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-513을 가지는 아밀라아제
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아밀라아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 사용.