CN101889084A

CN101889084A - 供药学应用的蛋白酶变体

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Publication number: CN101889084A
Application number: CN2008801193697A
Authority: CN
Inventors: 阿兰·斯文德森; 拉斯·贝耶尔; 西格恩·E·拉森; 托马斯·伦哈德; 坦加·M·R·凯尔; 彼得·C·格雷戈里
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals GmbH; Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2010-11-17
Also published as: IL205952A0; EP2220220A1; AU2008333313A1; JP2011505160A; CA2707658A1; US20100322915A1; TW200936158A; MX2010005690A; RU2010127329A; WO2009071550A1; ZA201003576B; KR20100092450A; AR071261A1; US8455235B2; BRPI0819662A2

Abstract

本发明涉及源自拟诺卡氏菌属菌种的蛋白酶(SEQ ID NO：1)及紧密相关蛋白酶的新变体，以及其药学用途。所述变体在治疗胰腺外分泌机能不全(PEI)方面显示改良的性能。所述变体可以与脂肪酶和/或淀粉酶组合。医学适应症的其它例子是：治疗消化性病症、胰腺炎、囊性纤维化、Ⅰ型糖尿病和/或Ⅱ型糖尿病。

Description

供药学应用的蛋白酶变体

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。通过提述而将计算机可读形式并入本文。

发明领域

本发明涉及一种蛋白酶，其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188相比包含选自下列取代的至少一个取代：A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。SEQ ID NO：1的蛋白酶是来自拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)的野生型蛋白酶。

本发明还涉及这些蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)的药学用途。医学适应症的其它例子是：治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全(pancreatic exocrine insufficiency，PEI)、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。

发明背景

已知数种处于胰酶补充物形式的商品化药物，用于治疗胰腺外分泌机能不全。这些产品的活性成分是消化酶(主要为淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶)，它们在正常情况下在胰腺中生成，并分泌至小肠上部(十二指肠)。此类药物中所使用的酶衍生自牛或猪胰。

WO 2005/115445描述了供药学应用的SEQ ID NO：1的蛋白酶及相关蛋白酶用于例如治疗PEI的用途。

WO 2006/136159描绘了供药学应用的SEQ ID NO：2的脂肪酶及相关脂肪酶用于例如治疗PEI的用途。

WO 2006/136161描绘了供药学应用的SEQ ID NO：3、4和5的淀粉酶及相关淀粉酶用于例如治疗PEI的用途。

源自拟诺卡氏菌属菌种的蛋白酶(SEQ ID NO：1)，及其制备物和其各种工业应用记载于WO 88/03947和WO 01/58276。相关蛋白酶记载于WO2004/111220、WO 2004/111222、WO 2004/111223、WO 2004/111221、WO2005/035747、WO 2004/111219、WO 2005/123911和JP 2003284571-A(GENESEQP：ADF43564)。

本发明提供了具有改良性能的新型蛋白酶，例如具有改善的体内表观蛋白质消化率、改善的pH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性。

发明概述

本发明涉及一种蛋白酶，其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下列取代的取代：A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。

此外，本发明涉及用作药物的此类蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)。

更进一步，本发明涉及此类蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。

本发明还涉及此类蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)，用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。

此外，本发明涉及药物组合物，其包含此类蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)连同至少一种药学可接受辅助性材料。

最后，本发明涉及用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通过施用治疗有效量的此类蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶组合)来进行。

发明详述

酶

术语“蛋白酶”在本文中定义为具有蛋白酶活性的多肽。蛋白酶指水解肽键的酶。它包括任何属于EC 3.4酶组(包括其13种亚类之每一种，这些酶在下文中称为“属于EC 3.4.-.-组”)的酶。EC编号指来自NC-IUBMB，AcademicPress，San Diego，California(包括分别于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；及Eur.J.Biochem.1999，264，610-650中出版的增补1-5)的酶命名法1992。命名进行定期补充和更新；参见例如万维网于http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme。

在具体的实施方案中，本发明的蛋白酶选自由源自拟诺卡氏菌属菌种菌株的蛋白酶组成的组。

以参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间的相关性(relatedness)。

出于本发明的目的，使用来自EMBOSS包(http://emboss.org)第2.8.0版的Needle程序来比对两个氨基酸序列。Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所描述的全局比对算法。所使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开放罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO：6的氨基酸1-188)与不同氨基酸序列(“外来序列”；例如SEQ ID NO：1的氨基酸1-188)之间的同一性程度计算为两个序列的此比对中的精确匹配数目除以“发明序列”的长度或“外来序列”的长度中的最短者。结果以百分比同一性表示。

在“发明序列”和“外来序列”在重叠的同一位置中具有相同氨基酸残基(在下文的比对例子中，这以“|”表示)时发生精确匹配。序列长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：6的长度是188)。

在下文纯假设的比对例子中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该例子中，缺口以“-”标示。

假设的比对例子：

序列1：ACMSHTWGER-NL

| ||| ||

序列2：HGWGEDANLAMNPS

因而，序列1比序列2的同一性的百分比是6/12＝0.5，对应于50％。

在一个具体的实施方案中，如下测定多肽的氨基酸序列与或对例如SEQID NO：1的氨基酸1-188的同一性百分比，即i)使用Needle程序及BLOSUM62取代矩阵、缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.5来比对两个氨基酸序列；ii)计算比对中精确匹配的数目；iii)用精确匹配的数目除以两个氨基酸序列的最短长度，并iv)将iii)的除法结果转化成百分比。以类似的方式计算比，或者与本发明的其它序列如SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的同一性百分比。

在另外的具体实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％、至少91％或至少92％；至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度。

在本发明中，采用氨基酸残基位置的特定编号方式。编号系统源自于使用Needle程序及BLOSUM62取代矩阵、缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.5(如上文所描述的)与另一个蛋白酶的氨基酸序列比对的在SEQ ID NO：1中所公开的蛋白酶氨基酸序列。

对于与SEQ ID NO：1相比的氨基酸取代，使用下列命名法：初始氨基酸(在SEQ ID NO：1中)、位置(在比对中)、取代氨基酸(在另一个蛋白酶中)。因而，用在例如SEQ ID NO：6中的天冬氨酸(D)对SEQ ID NO：1中的谷氨酸(E)的第125位(通过参照SEQ ID NO：1)取代称为“E125D”。多处突变由加号(“+”)分开，例如“T44K+S99P”表示分别用赖氨酸(K)替换苏氨酸(T)，和用脯氨酸(P)替换丝氨酸(S)的第44位和第99位突变(如例如在SEQ ID NO：8中)。此外，表述如G 12D，N，H意味着第12位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)交换。

在SEQ ID NO：1的第12位中甘氨酸取代为任何其它氨基酸称作“G12”。

在SEQ ID NO：1的第38位中精氨酸取代为任何其它氨基酸称作“R38”。

在SEQ ID NO：1的第47位中天冬酰胺取代为任何其它氨基酸称作“N47”。

在SEQ ID NO：1的第125位中谷氨酸取代为任何其它氨基酸称作“E125”。

在SEQ ID NO：1的第165位中精氨酸取代为任何其它氨基酸称作“R165”。

在另外的具体实施方案中，本发明的蛋白酶是酸稳定性的，这意味着在对应于A₂₈₀＝1.0的稀释液中，且于37℃在如下缓冲液中温育2小时后纯的蛋白酶的蛋白酶活性是参照活性的至少40％(或至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少97％)，如使用WO 01/58276的实施例2C中所描述的测定法(底物：Suc-AAPF-pNA，pH 9.0，25℃)所测量的，所述缓冲液为100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％

X-100，pH 3.5。术语参照活性指相同蛋白酶以纯的形式在对应于A₂₈₀＝1.0的稀释液中于5℃在如下缓冲液中温育2小时后的蛋白酶活性，其中所述活性如上文所描述的那样测定，所述缓冲液为：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mMKCl、0.01％

X-100，pH 9.0。术语A₂₈₀＝1.0意味着相对于缓冲液空白在1cm路径长度比色皿中在280nm处产生1.0吸光度的所述纯蛋白酶的此类浓度(稀释度)。术语纯的蛋白酶指A₂₈₀/A₂₆₀比率高于或等于1.70(参见WO01/58276的实施例2E)，并且通过扫描经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测量为条带中至少95％的其扫描强度对应于所述蛋白酶(参见WO 01/58276的实施例2A)的样品。

本发明优选的蛋白酶：

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下列取代的取代的蛋白酶：A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下列取代的取代的蛋白酶：G12D，N，H；R38T；N47H，T，S；E125D和R165S，H，G，T。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个取代：G12D，N，H；特别是G12D的蛋白酶。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个取代：N47H，T，S；特别是N47H的蛋白酶。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个取代：R165S，H，G，T；特别是N165H的蛋白酶。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下列取代或取代组合的取代的蛋白酶：G12D；和(N47H+G48D)。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下组取代组合的取代的蛋白酶：(T41A+T68R+V88A)；(G12N+T22A+N23D+N47T+R165H)；和(R14I+R38T+T151I)。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个选自下列取代或取代组合的取代的蛋白酶：R38T、(T44K+S99P)、S69T、(S69T+E125D)、E125D和R165S。

与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且与SEQ IDNO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个下列取代或取代组合的蛋白酶：R38T；T44K和S99P；S69T；S69T和E125D；E125D；和R165S。

如下蛋白酶，其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188相比包含至少一个下列取代：A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A；并且此外其选自下组：

(a)包含，优选具有与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％同一性的氨基酸序列的蛋白酶；

(b)由如下多核苷酸编码的蛋白酶，所述多核苷酸在非常低的(优选低的、中等的、中-高的、高的，或者最优选非常高的)严格条件下与如下杂交：(i)SEQID NO：1的编码序列(WO 2005/035747的SEQ ID NO：1的核苷酸900-1463，在此通过提述而并入本文)，或者(ii)(i)的全长互补链；和

(c)SEQ ID NO：1的成熟多肽中还包含一个或多个(例如数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入(优选保守性质的取代、缺失和/或插入)的变体。

非常低至非常高的严格条件定义为于42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的鲑精DNA和对于非常低和低严格性为25％甲酰胺、对于中等和中-高严格性为35％甲酰胺或者对于高和极高严格性为50％甲酰胺中遵循标准的Southern印迹方法进行最佳12至24小时的预杂交和杂交。使用2X SSC、0.2％ SDS，优选于45℃(非常低的严格性)，更优选于50℃(低严格性)，更优选于55℃(中等严格性)，更优选于60℃(中-高严格性)，甚至更优选于65℃(高严格性)，且最优选于70℃(非常高的严格性)将载体材料最终清洗三次，每次15分钟。

保守性质的氨基酸变化没有显著影响蛋白质的折叠和/或活性，而且包括小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小的接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的小的延伸，如多组氨酸束(tract)、抗原性表位或结合域。

优选地，变体中改变的总数是18、17或16。更优选地，改变的总数是15，甚至更优选14，甚至更优选13，甚至更优选12，甚至更优选11，甚至更优选10，甚至更优选9，甚至更优选8，甚至更优选7，甚至更优选6，甚至更优选5，甚至更优选4，甚至更优选3，甚至更优选2，且最优选1个氨基酸。

通过改组编码一种或多种同源亲本蛋白酶的一种或多种多核苷酸所生成的变体，其中所述变体包含与亲本蛋白酶中选自下组的一个或多个位置对应的一个或多个位置处的改变：第38位、第44位、第69位、第99位、第125位和第165位，其中所述改变独立地对应于对占据该位置的氨基酸的取代，且其中所述变体具有蛋白酶活性。

术语“亲本”蛋白酶指对其进行修饰，例如取代、插入、缺失和/或截短以生成本发明的酶变体的蛋白酶。此术语还指与变体比较和比对的多肽。亲本可以是天然存在(野生型)多肽，或者它可以甚至是通过任何合适的手段制备的其变体。例如，亲本蛋白质可以是在氨基酸序列方面已经进行过修饰或改变的天然存在多肽的变体。亲本还可以是由占据同一染色体基因座的基因的两种以上备选形式之任一种编码的多肽的等位变体。

术语“改组”指两种以上同源核苷酸序列间的核苷酸序列重组，导致重组核苷酸序列(即已经进行过改组循环的核苷酸序列)与起始核苷酸序列相比具有许多改变了的核苷酸。

优选地，在如本文中和权利要求书中所列的本发明的组合、用途、组合物和方法中使用根据各个上文的例子和其它例子的蛋白酶和蛋白酶变体。

体内蛋白质消化率、pH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性。

本发明的蛋白酶和蛋白酶变体展现出改良的性能，例如改善的体内表观蛋白质消化率、改善/改变的pH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性。

可以在患有诱导性PEI的雌性

迷你猪(Ellegaard)中测定体内表观蛋白质消化率。每天喂养猪两餐，其含有21.3％蛋白质、51.9％淀粉、2.6％脂肪，其优选如实施例4中所描述的那样组成。猪容许自由获取水，并且优选地，按照12：12h光-暗周期圈养在笼中。首先给猪喂养与1升水、0.625g Cr₂O₃(标志物)混合的单一250g测试餐，在喂养前立即向其中混合不同量的SEQ IDNO：1的参照蛋白酶(0mg、20mg、50mg和120mg酶蛋白/餐)。对于该试验，本发明的蛋白酶的剂量为20mg、50mg和120mg/餐。在回肠中第一次出现膳食标志物(绿色食糜)后，在冰上收集回肠食糜达总共8小时，并于-20℃贮存，之后进行分析。在分开的测定之间容许至少一天的冲洗(washout)。将冷冻的回肠食糜样品冷冻干燥，磨碎，并分析干物质(DM)和粗制蛋白质。冷冻干燥，接着于103℃温育8小时后按重量评估DM。以氮(N)乘以因数6.25计算粗制蛋白质。通过燃烧，优选用Dumas燃烧方法，更优选使用“Vario MAX CNS”元素分析仪来测定氮含量。将Cr₂O₃氧化成铬酸盐，并经由365nm处的消光来计算铬含量。根据实施例4中所显示的公式来计算表观盲肠前蛋白质消化率，其中Cr₂O₃和蛋白质表示为g/100g干物质。

对于本发明的蛋白酶，优选地，消化率(如表观盲肠前蛋白质消化率)与参照蛋白酶的消化率相比在剂量20、50和120mg酶蛋白/餐的至少一种中得到改善。优选地，改善是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。更优选地，改善是至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％。甚至更优选地，改善是至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％或至少26％。

此外，可以从个体回归曲线(表观盲肠前蛋白质消化率对酶剂量)外推分别实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)所需要的蛋白酶量(mg)。分别通过用实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)所需要的参照蛋白酶量(mg)除以实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)所需要的变体蛋白酶量(mg)来计算改善因数50和60(IF50和IF60)。如此，对于参照蛋白酶，IF50和IF60都是1.00。

对于本发明的蛋白酶，优选地，IF50和/或IF60值是至少1.05、至少1.10、至少1.15、至少1.20、至少1.25、至少1.30、至少1.35、至少1.40、至少1.45或至少1.50。

关于更多细节，参见实施例4。

用酪蛋白作为底物，更具体地，用标记有合适的红色荧光染料的酪蛋白衍生物测定pH-比率，所述合适的红色荧光染料优选是pH不灵敏的(例如在pH5.6-8.0的范围中)。荧光增强与蛋白酶活性成比例。优选的pH8.0测定缓冲液是100mM Tris/碱，并且可以通过混合25ml 0.2M琥珀酸与37.5ml 0.2MNaOH来制备优选的pH5.6测定缓冲液。于合适的温度(例如室温，例如22℃)进行温育达合适的时间期限(例如60分钟)，优选的荧光染料是BODIPYTR-X，在该情况中可以使用标准的荧光素滤器(激发＝590nm，发射＝635nm)来测定所得的荧光肽。对本发明的蛋白酶和SEQ ID NO：1的参照蛋白酶测定pH5.6活性与pH8.0活性的比率，并计算相对于参照蛋白酶的比率的本发明蛋白酶的比率。本发明优选的蛋白酶具有1以上，优选至少1.05，至少1.10，至少1.15，至少1.20，或至少1.25的相对于参照蛋白酶比率的所述比率。关于更多详情，参见实施例3。

毒性可以作为对人结肠腺癌细胞系如HT-29细胞(例如DSMZ号ACC 299)的体外毒性来测定。将细胞在补充有10％FBS(例如来自Sigma，产品目录编号F-6178)的McCoy氏5A培养基(例如来自Cambrex)中优选以4·104个细胞/孔/200μl的密度在96孔培养板中培养。使细胞适应各孔24小时后，在补充有0.5g/l Probumin(Millipore)、1％胰岛素/运铁蛋白/硒补充物(例如来自Invitrogen)和1％青霉素和链霉素(例如来自Invitrogen)的无血清培养基(例如DMEM：F12，Invitrogen)中以2倍稀释一式三份以9种不同浓度(w/vol酶蛋白)添加蛋白酶，并再温育24小时。通过细胞的代谢能力来测量成活力，其通过使用Alamar Blue(例如来自Invitrogen)测量来进行。

最大代谢活性(100％)以对照(没有添加蛋白酶)的代谢活性来测定。对于要测试的给定蛋白酶，其毒性比率计算为对这种蛋白酶获得50％的最大代谢活性时的浓度除以对参照蛋白酶(SEQ ID NO：1)获得50％的最大代谢活性时的浓度。对于本发明的蛋白酶，毒性比率优选是至少1.1，优选至少1.2，优选至少1.3，优选至少1.4，优选至少1.5，优选至少1.6，优选至少1.7，优选至少1.8，优选至少1.9，最优选至少2.0。在实施例6中解释毒性比率。已经对体内和体外毒性结果发现良好的关联。

在更进一步的具体的实施方案中，任选地，可以使用另外的蛋白酶，例如哺乳动物蛋白酶，例如处于来自猪的胰提取物形式，或者微生物蛋白酶，例如源自细菌或真菌菌株，如芽孢杆菌书(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)或根霉属(Rhizopus)。具体地，蛋白酶可以源自曲霉属，如米曲霉(Aspergillus oryzae)或蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的菌株，特别是商业上可从Amano Pharmaceuticals，Japan得到的产品Prozyme6TM(中性、碱性蛋白酶EC 3.4.21.63)。

基因的克隆和引入突变

可以使用用于克隆基因和引入突变(随机的和/或定点的)的标准方法，以获得酶和酶变体如本发明的蛋白酶变体。可以使用设计成包含限制位点的引物来扩增感兴趣的基因(例如WO 2005/035747的SEQ ID NO：1，其是编码本文中的SEQ ID NO：1的基因)。关于合适技术的进一步描述，参考Sambrook等(1989)，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel，F.M.等(编)“Current protocols in Molecular Biology”.JohnWiley and Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)“Molecular BiologicalMethods for Bacillus”.John Wiley and Sons，1990，及WO 96/34946。

出于克隆目的使用相关限制性内切核酸酶消化感兴趣的基因和上文的质粒后，可以在牵涉连接酶的连接方法中连接感兴趣的基因和质粒。连接酶反应后，可以使用连接混合物来转化大肠杆菌(E.coli)细胞，如Ausubel，F.M.等中所述。可以在液体培养基中或在固体琼脂板上繁殖经转化的大肠杆菌细胞，可以自经转化的细胞挽救质粒，并用于转化枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。可以转化合适的感受态芽孢杆菌细胞如MB1510，其为168-衍生物(例如可从BGSC以登录号1A1168trpC2得到)，如WO 03/095658中所述。

可以使用用于文库构建的大肠杆菌质粒携带的整合盒进行芽孢杆菌属转化。方法详细记载于WO 03/095658。或者，可以使用体外扩增的PCR-SOE产物(Melnikov和Youngman，Nucleic Acid Research 27，1056)。

质粒载体可以含有下列元件：

i)信号肽编码区(例如获自芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)的基因和枯草芽孢杆菌prsA)，接着有SEQ ID NO：1的拟诺卡氏菌属菌种蛋白酶的前域(pro-domain)(WO 2005/035747的SEQ ID NO：1的残基405-899)和成熟的蛋白酶变体基因。此序列之前可以为且可操作连接至：

ii)包含mRNA稳定区段(例如衍生自CryIIIa基因，如WO 1999/043835中所示)的DNA序列；

iii)标志物基因(例如氯霉素抗性基因)；和

iv)分别作为多核苷酸上游和下游5’和3’侧翼区段的来自枯草芽孢杆菌的基因组DNA，以通过侧翼区段与芽孢杆菌属基因组间的同源重组实现基因组整合。

本发明的蛋白酶可以与脂肪酶组合使用。

在本语境中，脂肪酶指羧酸酯水解酶EC 3.1.1.-，其包括如下活性，如EC3.1.1.3三酰基甘油脂肪酶、EC 3.1.1.4磷脂酶A1、EC 3.1.1.5溶血磷脂酶、EC3.1.1.26半乳糖脂肪酶、EC 3.1.1.32磷脂酶A1、EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶。在一个具体的实施方案中，脂肪酶是EC 3.1.1.3三酰基甘油脂肪酶。

在具体的实施方案中，脂肪酶是哺乳动物脂肪酶，例如为来自猪的胰提取物形式，或者微生物脂肪酶，例如源自细菌或真菌菌株，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属。具体地，脂肪酶可源自根霉属，如爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)或德氏根霉(Rhizopus delemar)的菌株，例如商业上可从Amano Pharmaceuticals，Japan得到的产品脂肪酶DAmano 2000^TM(也称作脂肪酶D2^TM)。

在另外的具体实施方案中，在本发明中使用的脂肪酶是重组生成的微生物脂肪酶，例如源自真菌如腐质霉属(Humicola)或根毛霉属(Rhizomucor)，酵母如假丝酵母属(Candida)，或者细菌如假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，脂肪酶衍生自疏棉状腐质霉(Humicola lanuginose)或曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。

疏棉状腐质霉(同物异名细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus))脂肪酶记载于EP 305216，而特定的脂肪酶变体记载于例如WO 92/05249、WO92/19726、WO 94/25577、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO99/42566、WO 00/32758、WO 00/60063、WO 01/83770、WO 02/055679、WO 02/066622和WO 2006/136159。真菌脂肪酶的更进一步的例子是记载于EP 785994的来自特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶，和记载于EP869167的来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的磷脂酶。酵母脂肪酶的例子是来自南极假丝酵母(Candida Antarctica)的脂肪酶A和B，其中脂肪酶A记载于EP652945，而脂肪酶B由例如Uppenberg等在Structure，2(1994)，293中描述。细菌脂肪酶的例子是源自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶，其描述于EP 214761。

在一个优选的实施方案中，脂肪酶与也记载于WO 2006/136159中的SEQID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶至少70％相同。在其它优选的实施方案中，与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的同一性程度是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。包含(优选具有)下列氨基酸序列的脂肪酶是优选的：(i)SEQ ID NO：2的氨基酸+1至+269，(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸-5至+269，(iii)SEQ ID NO：2的氨基酸-4至+269；(iv)SEQ ID NO：2的氨基酸-3至+269；(v)SEQ ID NO：2的氨基酸-2至+269；(vi)SEQ ID NO：2的氨基酸-1至+269，(vii)SEQ ID NO：2的氨基酸+2至+269，以及(viii)(i)-(vii)的两种以上脂肪酶的任何混合物。在一个具体的实施方案中，脂肪酶选自(i)，(ii)的脂肪酶和(i)和(ii)的任何混合物。(i)和(ii)的优选混合物包含至少5％，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少95％的脂肪酶(i)，百分比是通过使用Edman方法进行的N端测序而确定的，如WO2006/136159的实施例5中所描述的。其它优选的混合物是：(a)包含35-75％，优选40-70％，更优选45-65％的脂肪酶(ii)的组合物；(b)包含20-60％，优选25-55％，更优选30-50％，最优选35-47％的脂肪酶(i)的组合物；(c)包含多至30％，优选多至25％，更优选多至20％，最优选多至16％的脂肪酶(vii)的组合物；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任何组合，如包含45-65％的脂肪酶(ii)、35-47％的脂肪酶(i)和多至16％的脂肪酶(vii)的组合物。

在一个更进一步优选的实施方案中，脂肪酶(如哺乳动物胰脂肪酶)是1，3-位特异性脂肪酶。

本发明的蛋白酶(会有或不含有如上文所述的脂肪酶)也可以与淀粉酶组合使用。

在本语境中，淀粉酶是催化对淀粉和其它线性和分支寡糖和多糖的内水解的酶。淀粉的直链淀粉部分富含1，4-α-糖苷键，而支链淀粉部分分支更多，不仅含有1，4-α-而且含有1，6-α-糖苷键。在一个具体的实施方案中，淀粉酶是一种属于EC 3.2.1.1组的酶。

在具体的实施方案中，淀粉酶是哺乳动物淀粉酶，例如为来自猪的胰提取物形式，或者微生物淀粉酶，例如源自细菌或真菌菌株，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属。

具体地，淀粉酶可以源自曲霉属，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉或蜂蜜曲霉的菌株，例如商业上可从Amano Pharmaceuticals，日本得到的源自米曲霉的产品淀粉酶A1^TM或商业上可从Extract-Chemie，德国得到的源自蜂蜜曲霉的淀粉酶EC^TM之任一种。

真菌淀粉酶的其它例子是黑曲霉淀粉酶(SWISSPROT P56271)(其也记载于WO 89/01969的实施例3中)，和米曲霉淀粉酶。米曲霉淀粉酶的变体的例子记载于WO 01/34784。

源自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶的例子。在例如WO99/19467中描述了此淀粉酶，连同源自例如解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌的其它同源性细菌α-淀粉酶，以及其变体。另外的淀粉酶变体的例子是记载于美国专利No.4,933,279；EP 722490，EP 904360，及WO 2006/136161的那些。

优选的淀粉酶是(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或1-486)、SEQ ID NO：3的氨基酸1-481和/或SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶。在一个优选的实施方案中，淀粉酶是具有或包含如下氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与下列任一项至少70％相同：(i)SEQ IDNO：5的氨基酸1-513，(ii)SEQ ID NO：3的氨基酸1-481，和/或(iii)SEQ ID NO：4的氨基酸1-483。SEQ ID NO：3-5的淀粉酶可以例如如WO 2006/136161中所描述的那样制备。在(i)、(ii)或(iii)任一项的其它优选的实施方案中，同一性程度是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

一般而言，根据本发明使用的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶(下文为“酶”)可以是自动物，特别是哺乳动物(例如人或猪酶)；自植物，或自微生物获得的天然的或野生型的酶，而且还可以是其展现出想要的酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成酶，如改组酶(shuffled enzyme)，和共有酶(consensus enzyme)。

在一个具体的实施方案中，酶是低变应原性变体，其被设计成在暴露于动物(包括人)时引起降低的免疫应答。术语免疫应答应当理解为由暴露于酶的动物的免疫系统产生的任何反应。一类免疫应答是变应性应答，导致暴露动物中的IgE水平升高。可以使用本领域中已知的技术来制备低变应原性变体。例如，可以将酶与聚合物模块(moieties)缀合，所述聚合物模块屏蔽(shield)免疫应答中牵涉的酶的部分或表位。与聚合物的缀合可以牵涉聚合物与酶的体外化学偶联，例如如WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO99/00489中所述。另外/或者，缀合可以牵涉聚合物与酶的体内偶联。可以如下实现此类缀合，即遗传改造编码酶的核苷酸序列，在酶中插入编码额外的糖基化位点的共有序列，并在能够使酶糖基化的宿主中表达酶，参见例如WO00/26354。提供低变应原性变体的另一种方式是遗传改造编码酶的核苷酸序列，从而引起酶自我寡聚体化，实现酶单体可屏蔽其它酶单体的表位，由此降低寡聚物的抗原性。此类产物及其制备记载于例如WO 96/16177。可以通过多种方法如记载于WO 00/26230和WO 01/83559中的噬菌体展示方法，或记载于EP 561907中的随机方法来鉴定免疫应答中牵涉的表位。一旦鉴定出表位，便可以通过已知的基因操作技术如定点诱变(参见例如WO 00/26230，WO00/26354和/或WO 00/22103)来改变其氨基酸序列以产生改变的酶免疫学特性，和/或可以与表位足够接近地完成聚合物的缀合以使聚合物屏蔽表位。

在具体的实施方案中，蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶(i)在pH4-8，优选还有在pH3-4，更优选在pH3.5是稳定的；(ii)在pH4-9，优选4-8，更优选在pH6.5是有活性的；(iii)针对通过胃蛋白酶和其它消化性蛋白酶(如胰腺蛋白酶，即主要为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)进行的降解是稳定的；和/或(iv)在存在胆汁盐的情况中是稳定的和/或有活性的。

术语“与...组合”指根据本发明组合使用蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶。组合使用可以是同时的、重叠的或顺序的，这三个术语一般按照内科医生开出的处方进行解读。

术语“同时的”指所述酶同时有活性所处的情况，例如在它们同时作为一种或多种分开的药用产品施用时，或者若它们在同一种药物组合物中施用。

术语“顺序的”指一种和/或两种酶首先起作用，随后为第二种和/或第三种酶的此类情况。顺序作用可以通过如下获得：作为分开的药物配制物以想要的时间间隔，或者作为其中所讨论的酶进行有差别地配制(分隔)(例如着眼于获得不同的释放时间，提供改善的产品稳定性，或者优化酶剂量)的一种药物组合物施用所讨论的酶。

术语“重叠”指这样的情况，酶活性期间既不是完全同时也不是完全顺序，即有某段期间所述酶两者或全部是有活性的。

术语“一个或一种”例如在本发明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的语境中使用时意味着至少一个或一种。在具体的实施方案中，“一个或一种”意味着“一个或一种或多个或多种”或“至少一个或一种”，其又指一个或一种、两个或两种、三个或三种、四个或四种、五个或五种等。

以参数“同一性”(其在上文详细描述(在蛋白酶部分))描述两种氨基酸序列之间的相关性。定义和方法同样也可应用于根据本发明使用的脂肪酶和淀粉酶。

可以使用任何合适的测定法来测量本发明的酶活性。一般而言，测定pH和测定温度应当适应所讨论的酶。测定pH值的例子是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的例子是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。

本文实施例1中包括合适的酶(主要为蛋白酶)测定法的例子，关于合适的脂肪酶和淀粉酶测定法，还可分别参考WO 2006/136159和WO 2006/136161。

药物

在本语境中，术语“药物”指治疗、预防和/或减轻疾病症状，优选治疗和/或减轻疾病症状的化合物或化合物的混合物。药物可以是内科医生开出处方的，或者它可以是非处方产品。

药物组合物

可以通过常规手段来实施本发明酶的分离、纯化和浓缩。例如，它们可以通过常规方法(包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)自发酵培养液回收，并通过本领域中已知的多种方法(包括但不限于层析(例如离子交换、亲合、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取)来进一步纯化(参见例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，NewYork，1989)。

例如，SEQ ID NO：2的脂肪酶可以基于例如美国专利号5,869,438制备，即通过在合适的宿主细胞中重组表达作为该美国专利的SEQ ID NO：1的相应修饰的DNA序列来进行。可以通过定点诱变来进行此类修饰，如本领域中公知的。

在一个具体的实施方案中，分开制备各种酶的浓缩的固体或液体制备物。也可以(至少部分)分开配制这些浓缩物，如下文更为详细地解释的。

在又一个具体的实施方案中，在本发明的药物组合物中以固体浓缩物形式并入酶。可以通过正如本领域中已知的多种方法使酶达到固体状态。例如，固体状态可以是晶体的(其中酶分子以高度有序形式排列)，或沉淀物(其中酶分子以有序性较小，或混乱形式排列)。

例如，可以在接近酶pI的pH和在低电导率(例如10mS/cm或更小)时进行结晶，如EP 691982中所描述的。在一个具体的实施方案中，根据本发明使用的脂肪酶是晶体脂肪酶，其可以如EP 600868 B1的实施例1中所描述的那样制备。此外，可以如WO 2006/044529中所描述的那样交联脂肪酶晶体。

多种沉淀方法是本领域中已知的，包括用盐(如硫酸铵和/或硫酸钠)；用有机溶剂，如乙醇和/或异丙醇；或者用聚合物，如PEG(聚乙二醇)进行沉淀。在备选方案中，可以通过本领域中已知的多种方法(例如冻干、蒸发(例如在减压下)和/或喷雾干燥)通过除去溶剂(通常为水)自溶液沉淀酶。

在又一个具体的实施方案中，酶的固体浓缩物相对于固体浓缩物的总蛋白质含量具有至少50％(w/w)的活性酶蛋白含量。在更进一步的具体的实施方案中，相对于固体浓缩物总蛋白质含量的活性酶蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95％(w/w)。可以测量蛋白质含量，正如本领域中已知的，例如通过使用例如来自BIO-RAD的GS-800校准密度计对经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶进行密度计扫描；通过使用商业上可从Roche得到的商业试剂盒，如蛋白质测定ESL，订单号1767003；或者基于WO 01/58276的实施例8中所述的方法来进行。

优选地，酶蛋白构成根据本发明使用的固体酶浓缩物的蛋白质谱的至少50％，更优选至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97％，如通过对经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的密度计扫描所测量的。此类酶可以称作“分离的”酶或多肽。

本发明的药物组合物包含酶，优选处于浓缩的酶制备物形式，更优选固体浓缩物，连同至少一种药学可接受的辅助性或补充性材料，如(i)至少一种载体和/或赋形剂；或(ii)至少一种载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。任选的其它成分(均为药学可接受)的非限制性例子是崩解剂、滑润剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、溶剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、推进剂和媒介物。

一般而言，特别取决于所讨论的医学适应症，可以针对本领域中已知的所有施用方式，优选包括肠施用(经由消化道)来设计本发明的组合物。如此，组合物可以处于固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶囊、粉剂、粒剂、微球、软膏剂、乳剂(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、洗剂(lotion)和气溶胶。医学从业人员会知道选择最合适的施用路径，而且当然会避免潜在有危险的或其它方面不利的施用路径。因此以下方法和辅助性材料仅仅是例示性的，而决不是限制性的。

对于固体口服制品，酶可以单独地或者与合适于制备丸剂(pellet)、微丸剂(micropellet)、片剂、微片剂、粉剂、粒剂或胶囊的添加剂，例如与常规的载体如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与赋形剂或粘合剂，如晶体或微晶、纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与滑润剂，如加拿巴蜡(carnauba wax)、白蜡、虫胶(shellac)、无水胶质硅石、1500至20000的聚乙二醇(PEG，也以术语Macrogol为人所知)，特别是PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000，聚乙烯吡咯酮(povidone)、滑石、甘油单油酸酯(monolein)或硬脂酸镁；而且若想要的话，与稀释剂、佐剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯(E218)、着色剂如二氧化钛(E171)和调味剂如蔗糖、糖精、橙油、柠檬油和香草醛组合使用。口服制剂是用于治疗PEI的医学适应症的优选制剂的例子。

相当通常地，也可以将酶配制成液体口服制剂，其通过将它们在水性溶剂如水，或非水性溶剂如植物油或其它类似的油、合成的脂族酸甘油酯、高级脂肪酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG 4000或低级醇如线性或分枝的C1-C4醇，例如2-丙醇中溶解、悬浮或乳化来进行；而且若想要的话，与常规的补充性材料或添加剂如增溶剂、佐剂、稀释剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起配制。

脂质体作为递送媒介物的用途是可能普遍感兴趣的另一种方法。脂质体与靶位点的细胞融合，并在细胞内递送腔内容物。使用多种用于维持接触的手段如分离、结合剂等来维持脂质体与细胞接触足够的时间以进行融合。在本发明的一方面，将脂质体设计成为气溶胶化的以进行肺施用。可以用介导膜融合的纯化蛋白质或肽，如仙台病毒或流感病毒等来制备脂质体。脂质可以是已知的脂质体形成脂质(包括阳离子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱)的任何有用组合。剩余的脂质通常会是中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。对于制备脂质体，可以使用由Kato等(1991)J.Biol.Chem.266：3361所描述的方法。

可以提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式如糖浆剂、酏剂、粉剂和悬浮液，其中每个剂量单位例如茶匙量(teaspoonful)、汤匙量(tablespoonful)、胶囊、片剂或栓剂含有预先确定量的酶。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可以在作为无菌水、正常盐水或另一种药学可接受载体中的溶液的组合物中包含酶。

如本文中所使用的，术语“单位剂量形式”指对于人和动物受试者适合作为单一剂量的物理离散单元，每个单元含有足以产生想要效果的量的预先确定量的酶。

在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物用于肠(优选口服)施用。

在另外的具体实施方案中，口服组合物是(i)含有酶晶体的液体组合物；(ii)(高度)纯化的酶的沉积物的液体悬浮液；(iii)含有固体或溶解形式的酶的凝胶；(iv)固定化酶或吸附至颗粒等的酶的液体悬浮液；或(v)处于含酶粉末、丸状、颗粒或微球形式，若想要的话，处于片剂、胶囊等(任选地，其用例如酸稳定性涂层)形式的固体组合物。

在组合物的另一个具体的实施方案中，依靠例如分开涂层将酶分隔，即彼此分开。

在组合物的一个更进一步的具体的实施方案中，将蛋白酶与组合物的其它酶成分如脂肪酶和/或淀粉酶分开。

酶剂量会随要施用的特定酶、施用频率、施用方式、症状严重性和受试者对副作用的易感性等而广泛变化。一些特定的酶能比其它酶更有力。

本发明酶的固体口服制剂的例子包括：(i)具有SEQ ID NO：6、7、8、9、10或11的蛋白酶；(ii)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-269具有至少70％同一性的脂肪酶；和/或(iii)与选自下组的淀粉酶具有至少70％同一性的淀粉酶：a)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶，b)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶。在本发明的更优选的固体口服制剂中，(ii)脂肪酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-269，而(iii)淀粉酶包含SEQ ID NO：5的氨基酸1-486。

(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量的例子如下(均按每kg体重(bw)mg酶蛋白计)：对于(i)的蛋白酶：0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.1-50mg/kgbw；对于(ii)的脂肪酶：0.01-1000、0.05-500、0.1-250或0.5-100mg/kg bw；对于(iii)的淀粉酶：0.001-250、0.005-100、0.01-50或0.05-10mg/kg bw，优选对于(i)的蛋白酶：0.05-100、0.1-50或0.5-25mg/kg bw；对于(ii)的脂肪酶：0.1-250、0.5-100或1-50mg/kg bw；而对于(iii)的淀粉酶：0.01-50、0.05-10或0.1-5mg/kg bw。

为了关于口服的更大稳定性，可以修饰酰胺(肽)键，以及氨基和羧基端。例如，可以使羧基端酰胺化。

可以通过将本发明的酶掺入丸剂中来准备适合于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的本发明药物组合物的具体实施方案。丸剂一般可包含10-90％(w/w，相对于所得丸剂的干重)的生理学可接受的有机聚合物、10-90％(w/w，相对于所得丸剂的干重)的纤维素或纤维素衍生物，和80-20％(w/w，相对于所得丸剂的干重)的酶，有机聚合物、纤维素或纤维素衍生物和酶的总量在每种情况中达到100％。

生理学可接受的有机聚合物可以选自下组：聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羟丙基甲基纤维素、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯的共聚物和所述有机聚合物的混合物。优选聚乙二醇4000作为生理学可接受有机聚合物。

纤维素或纤维素衍生物可以例如选自纤维素、乙酸纤维素、纤维素脂肪酸酯、硝酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、甲基乙基纤维素和甲基羟丙基纤维素。优选纤维素，特别是微晶纤维素作为纤维素或纤维素衍生物。

可以用合适的肠溶衣、其它非功能性涂层包被或者在没有此类涂层的情况中直接地使用所得的丸剂。此外，可以在具有合适大小的胶囊(如硬明胶胶囊或无明胶胶囊)中填充所得的丸剂，用于治疗如上文更为详细地描述的病症或疾病。在本发明的一个实施方案中，可以将自不同酶类型，特别自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶生成的丸剂填充入所述胶囊中。在用不同酶类型填充胶囊时，可以使单一酶类型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的剂量给料(dosing)适应于某一适应症组或某一患者亚组的特定需要，其通过将规定量的任何脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶添加至胶囊来实现，即可以生成在其脂肪酶：蛋白酶：淀粉酶比率方面有所变化的胶囊。

WO 2005/092370中描述了本发明蛋白酶的优选的药物组合物，特别是包含其中所提及的优选赋形剂的配制物。在一个特别优选的实施方案中，药物组合物包含单、二和三酰基甘油酯和脂肪族C6-C22羧酸的聚乙二醇(PEG)单酯和二酯的Macrogol甘油酯混合物，和还有可能的小比例的甘油和游离的聚乙二醇。

优选地，Macrogol甘油酯混合物中含有的聚乙二醇(PEG)是具有每个分子平均6至最多40个环氧乙烷单元或200和2000之间的分子量的PEG。

本发明的一个另外的方面提供了本发明酶的药物组合物，包含由表面活性剂、助表面活性剂和亲脂相组成的系统，该系统具有大于或等于10的HLB值(亲水性-亲脂性平衡)和大于或等于30℃的熔点。在一个优选的实施方案中，系统具有10至16，优选12至15的HLB值，而且具有30-600℃，优选40-500℃的熔点。具体地，以HLB值和熔点表征的系统是单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)与具有8至20，优选8至18个碳原子的脂肪族羧酸的单酯和二酯(由此聚乙二醇优选具有每个分子约6至约32个环氧乙烷单元)的混合物，而且任选地，系统含有游离的甘油和/或游离的聚乙二醇。优选地，此系统的HLB值受到PEG链长度调节。此系统的熔点受到脂肪酸的链长、PEG的链长和脂肪酸链饱和度，并且因此受到用于制备Macrogol甘油酯混合物的起始油调节。

“脂肪族C8-C18羧酸”指以显著且可变的比例含有辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)的混合物(若这些酸是饱和的话)，及相应的不饱和C8-C18羧酸。这些脂肪酸的比例可以随起始油而变化。

可以例如通过具有200-1500的分子量的聚乙二醇与起始油之间的反应来获得单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)与具有8至18个碳原子的脂肪族羧酸的单酯和二酯的此类混合物，所述起始油由具有选自下组的脂肪酸的甘油三酯混合物组成：辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈醛、硬脂酸、油酸和亚麻酸(单独地或作为混合物)。任选地，此类反应的产物还可以含有小比例的甘油和游离的聚乙二醇。

此类混合物是以例如商品名

商品化的。本发明的一个有利的实施方案提供了，在商品名下知晓的产品中，特别是“

50/13”和/或“

44/14”代表适合于在根据本发明的药物制剂中使用的混合物。

50/13是具有单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇与分别为40％至50％和48％至58％(构成结合脂肪酸的主要比例)的棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)的单酯和二酯的混合物。在每种情况中辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例小于3％，而在每种情况中月桂酸(C12)和豆蔻酸(C14)的比例小于5％。

44/14是具有单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单酯和二酯的混合物，比例分别为棕榈酸(C16)4至25％，硬脂酸(C18)5至35％，辛酸(C8)小于15％，癸酸(C10)小于12％，月桂酸(C12)30至50％和豆蔻酸(C14)5至25％。可以例如通过使用棕榈仁油和聚乙二醇1500进行的醇解/酯化反应来制备

44/14。

本发明的一个优选的实施方案提供了本发明酶的药物组合物，其包含的系统含有单、二和三酰基甘油酯和脂肪族C8-C18羧酸的聚乙二醇单酯和二酯的混合物和还有可能的小比例的甘油和游离的聚乙二醇，该系统具有40℃-55℃的熔点和12-15范围内的HLB值。更优选地，系统具有44℃-50℃的熔点和13-14范围内的HLB值。或者，系统具有44℃左右的熔点和14的HLB值，或者系统具有50℃左右的熔点和13的HLB值。

治疗方法

根据本发明使用的蛋白酶(任选地，与脂肪酶和/或淀粉酶(本发明的酶)组合)可用于治疗性和/或预防性处理动物中的多种疾病或病症。术语“动物”包括所有动物，而且特别是人类。动物的例子是非反刍类，和反刍类如绵羊、山羊和牛(例如肉牛和奶牛)。在一个具体的实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如马、猪(包括但不限于小猪、饲育猪和母猪)；禽类如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡、蛋鸡)；幼年牛犊；宠物如猫和犬；和鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼(trout)、罗非鱼(tilapia)、鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp)；和甲壳类(crustacean)(包括但不限于虾和对虾)。在一个具体的实施方案中，动物是哺乳动物，更具体的是人类。

例如，酶可用于治疗消化性病症如消化不良(maldigestion)或消化不良(dyspepsia)，它们常常由在正常情况下从胃和胰分泌的消化酶的生成和/或向胃肠道中的分泌不足引起。

此外，酶在治疗PEI中是特别有用的。可以特别使用

测试(JOP.J Pancreas(在线)2002；3(5)：116-125)来验证PEI，并且它可以是由疾病和状况如胰腺癌、胰和/或胃手术，例如胰的全部或部分切除、胃切除术、后胃肠旁路手术(例如比尔罗特II胃肠吻合术)；慢性胰腺炎；热带胰腺炎；遗传性胰腺炎；舒-戴二氏综合征(Shwachman Diamond Syndrome)；胰腺或常见胆管的导管阻塞(例如由于新生物)；和/或囊性纤维化(一种遗传性疾病，其中粘稠的粘液阻断胰腺导管)引起的。酶在治疗急性胰腺炎中也可以是有用的。

可以如EP 0600868中一般所描述的那样测量酶对消化性病症的效果，其中实施例2描述了用于在胃条件下测量脂肪酶稳定性的体外消化率测试，而实施例3描述了用于在存在胆汁盐的情况中脂肪酶活性的体外消化率测试。可以对蛋白酶和淀粉酶建立相应的测试。还有，WO 02/060474披露了合适的测试，例如(1)用于测量猪测试饲料中的脂质消化的体外测试，和(2)用胰腺机能不全的猪进行的体内试验，其中测量脂肪、蛋白质和淀粉的消化率。

在一个具体的实施方案中，使用实施例4的体内筛选测试来测量本发明蛋白酶的效果。

作为另一个例子，酶在治疗I型和/或II型糖尿病中是有用的，特别对于在通常伴随此疾病的消化性病症的糖尿病疗法中的辅助治疗(着眼于减少晚期并发症)。

可以通过WO 00/54799中所描述的一种或多种方法来确定酶对糖尿病的影响，例如通过控制糖基化血红蛋白水平、血糖水平、低血糖发作(hypoglycaemic attack)、脂溶性维生素如维生素A、D和E的状态、所需要的胰岛素日剂量、体重系数和高血糖周期来进行。

本文中所描述和要求保护的发明在范围方面并不受限于所公开的本文中的具体实施方案，因为这些实施方案意图作为本发明数个方面的例示。意图任何等同实施方案在本发明的范围内。确实，在那些于本文中所显示和描述的之外对本发明的各种修饰从上文的描述出发对于本领域技术人员会变得显而易见。还意图此类修饰落入所附权利要求书的范围内。在矛盾的情况中，以本公开内容(包括定义)为准。

本文中引用各种参考文献，其公开内容通过提述而完整并入。

实施例

所使用的化学品是至少试剂级别的商品。

实施例1：酶测定法

FIP(国际药学联合会(Fédération Internationale Pharmaceutique))以及欧洲药典和美国药典已经发表了用于猪胰酶制剂(pancreatin)的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的测定法。1个FIP-单位＝1个Ph.Eur.-单位(欧洲药典)。测定法记载于例如：国际药学联合会，科学部分：国际药用酶标准化委员会(International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes)。a)“Pharmaceutical Enzymes(药用酶)，”R.Ruyssen和A.Lauwers编，E.StoryScientia，Ghent，Belgium(1978)，b)欧洲药典。还可参见Deemester等，于Lauwers A，ScharpéS(编)：Pharmaceutical Enzymes，New York，Marcel Dekker，1997，第343-385页。合适的酶标准品可以获自：国际药用酶委员会(International Commission on Pharmaceutical Enzymes)，标准中心(Centre forStandards)，Harelbekestraat 72，B-9000 Ghent。

下文描述了蛋白酶FIP测定法以及其它适合于蛋白酶、脂肪酶和淀粉的测定法。

蛋白酶FIP测定法

可以使用FIP测定法(国际药学联合会)，1个FIP-单位＝1个Ph.Eur.-单位(欧洲药典)来测定蛋白酶活性。此测定法与其它FIP测定法一起记载于：国际药学联合会，科学部分：国际药用酶标准化委员会。a)“PharmaceuticalEnzymes(药用酶)”R.Ruyssen和A.Lauwers编，E.Story Scientia，Ghent，Belgium(1978)，b)欧洲药典。还可参见Deemester等，于Lauwers A，ScharpéS(编)：Pharmaceutical Enzymes，New York，Marcel Dekker，1997，第343-385页。

使用此测定法来测定胰酶制剂中的蛋白酶活性。对于测定微生物蛋白酶的FIP活性，省略通过添加肠激酶进行的活化步骤。

原理：蛋白酶在pH7.5和35℃的温度时水解底物酪蛋白。通过添加三氯乙酸来使反应停止，并滤掉未降解的酪蛋白。通过在275nm处的分光光度法来测定溶液中残留的肽量。

活性的定义：通过参照已知FIP活性的胰参照粉末(蛋白酶参照标准)，测定不被5.0％(wt/vol，即5.0g/100ml)三氯乙酸溶液沉淀的肽量作为蛋白酶活性。材料和方法：

酪蛋白溶液：

将1.25g酪蛋白(干重)(例如Calbiochem号218680)在水中悬浮，直至获得实质上澄清的溶液。将pH调节至8.0，并用水将溶液稀释至终体积100ml。在这里和在下文中，水意味着去离子水。

硼酸盐缓冲液pH 7.5：

将2.5g氯化钠、2.85g四硼酸二钠和10.5g硼酸在900ml水中溶解，将pH调节至pH 7.5+/-0.1，并用水稀释至1000ml。

滤纸：

具有125mm直径的折叠滤纸，例如Schleicher & Schuell号15731/2。滤纸测试：将5ml 5.0％三氯乙酸过滤流过滤纸。使用未过滤的三氯乙酸溶液作为空白，滤液在275nm处的吸光度应当小于0.04。

蛋白酶参照标准：

商业上可从国际药用酶委员会，标准中心，Harelbekestraat 72，B-9000Ghent，Belgium得到的蛋白酶(胰)。该标准品具有以FIP/Ph.Eur.-单位/g计的标记活性(A)。精确称重对应于约130个蛋白酶-FIP/Ph.Eur.-单位的量。添加一刮勺尖端的海沙，用几滴冰冷的0.02M氯化钙(pH 6.0-6.2)润湿，并用平端玻璃棒捣碎全部。用约90ml相同的冰冷氯化钙溶液稀释，并在冰浴中搅动悬浮液达15至30分钟。将pH调节至6.1，并用相同氯化钙溶液将体积调节至100ml。用硼酸盐缓冲液pH 7.5将5.0ml此悬浮液稀释至100ml。对于活性测试，使用1.0、2.0和3.0ml此溶液作为参照(在下文中称作S1、S2和S3，S代表标准)。

测试悬浮液：

使用等于约260个FIP/Ph.Eur.-单位的样品量制备样品悬浮液，如上文关于蛋白酶参照标准所描述的。将pH调节至6.1，并将水添加至100ml。将5.0ml此溶液与5ml氯化钙溶液混合。用硼酸盐缓冲液将5ml此稀释液进一步稀释至100ml。对该测定法使用2.0ml此溶液(在下文中样品称作Un，其表示未知活性的样品，数目n)。

测定方法(活性测试)：

对三种参照悬浮液(S1、S2、S3)和样品悬浮液(Un)(均一式三份)实施测定法。每种样品一个空白是足够的(分别称作S1b、S2b、S3b，和Unb)。在没有样品/标准品的情况中制备盲样(B)作为分光光度计的补偿液体(A blind(B)isprepared without without sample/standard as compensation liquid for thespectrophotometer)。如下将硼酸盐缓冲液添加至管：盲样(B)3.0ml；样品(Un)1.0ml；标准品(S1、S2和S3)分别为2.0、1.0和0ml。如下将蛋白酶参照标准品添加至S1、S2和S3：分别为1.0、2.0和3.0ml。如下将测试悬浮液添加至样品管(Un)：2.0ml。将5ml三氯乙酸添加至所有盲样(S1b、S2b、S3b、Un和B)，接着立即混合。用玻璃塞塞住所有管，并在水浴中于恒定的温度(35+/-0.5℃)与底物溶液一起放置。在达到温度平衡时，在时间0时，将2.0ml酪蛋白溶液添加至管S1、S2、S3和Un，接着立即混合。正好30分钟后，将5.0ml三氯乙酸添加至各管S1、S2、S3和Un，接着立即混合。从水浴取回管，并容许于室温竖立20分钟以完成蛋白质的沉淀。将每管的内容物过滤通过同一滤纸两次，并使用来自管B的滤液作为补偿液体在275nm处测量滤液的吸光度。相对于标准品(S1、S2、S3)的已知标记活性(A)计算以FIP单位计的样品(Un)活性。减去各个盲样的吸光度值(例如S1吸收减去S1b吸收)应当处于0.15-0.60的区间。

蛋白酶Protazyme AK测定法

底物：2.0ml 0.01％Triton X-100中悬浮的1片Protazyme AK片剂(Megazyme T-PRAK1000)。通过搅动制备均质悬浮液。

温度：37℃

测定缓冲液：100mM HEPES/NaOH，0.01％Triton X-100，pH 7.0

将500ul(微升)Protazyme AK底物悬浮液和500ul测定缓冲液在Eppendorf管中混合，并在冰上放置。添加20ul蛋白酶样品(在0.01％ Triton X-100中稀释的)。通过将Eppendorf管转移至Eppendorf恒温混合器(其被设置至37℃)来启动测定法。在Eppendorf恒温混合器上以其最高摇动速率(1400rpm)将管温育15分钟。通过将管转移回冰浴来使温育停止。几分钟后，在冷的离心机中对管离心(15000rpm，3分钟)。将200ul上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的量度。测定法中包括缓冲盲样(代替酶)。

蛋白酶Suc-A APF-pNA测定法

底物：Suc-AAPF-pNA(

S-7388)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％

X-100，用HCl或NaOH调节至pH 9.0。

测定温度：25℃。

将300μl稀释的蛋白酶样品与1.5ml测定缓冲液混合，通过添加1.5ml pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中，并用0.01％

X-100进一步稀释45x的)来开始活性反应，并在混合后，通过分光光度计监测A₄₀₅增加作为蛋白酶活性的量度。将蛋白酶样品稀释，之后进行活性测量以确保所有活性测量均落入测定法的剂量响应曲线的线性部分内。

脂肪酶

底物：对-硝基-苯基(pNP)戊酸盐

测定pH：7.7

测定温度：40℃

反应时间：25分钟

具有黄色的消化产物具有405nm处的特征性吸光度。其量通过分光光度法测量。可以相对于已知活性的酶标准品测定脂肪酶活性。活性可以以Lipolase单位(LU)表示。1个LU(Lipolase单位)是在上文的标准条件下每分钟释放1mmol可滴定丁酸的酶量。1KLU＝1000LU。

淀粉酶

底物：Phadebas片剂(Pharmacia Diagnostics；交联的、不溶性的、着蓝色的淀粉聚合物，其与牛血清清蛋白和缓冲物质混合，并制成片剂)。

测定温度：37℃

测定pH：4.3

反应时间：20分钟

在水中悬浮后，淀粉被α-淀粉酶水解，给出可溶性蓝色片段。在620nm处测量的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。1个真菌α-淀粉酶单位(1个FAU)是在标准的测定条件下每小时分解5.26g淀粉(Merck，可溶性淀粉Erg.B.6，批次9947275)的酶量。

实施例2：蛋白酶的制备

通过标准的方法来制备SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的蛋白酶变体，简言之：将随机和/或定点突变引入基因中，用突变基因转化枯草芽孢杆菌宿主细胞，发酵经转化的宿主细胞(例如如记载于WO 2004/111220的实施例1的)，并自发酵培养液纯化蛋白酶。在枯草芽孢杆菌中以类似的方式重组生成参照蛋白酶(SEQ ID NO：1)。

对于纯化较大量的蛋白酶，将培养液离心(13.000rpm.达20分钟)以给出澄清的上清液，并将上清液过滤通过0.45μm滤纸以除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。用3M Tris将滤液的pH调节至pH 9.0，并将蛋白酶溶液上样至在50mM Tris/HCl，pH 9.0中平衡的MEP Hypercel柱(PALL Life Sciences)。用数个柱体积的平衡缓冲液清洗柱后，用50mM CH₃COOH/NaOH，pH 4.0洗脱蛋白酶。对洗脱过程中收集的级分测试蛋白酶活性(使用实施例1的终点ProtazymeAK测定法)。汇合活性级分，将pH调节至pH 4.5，并用去离子水稀释汇合物以给出与20mM CH₃COOH/NaOH、50mM H₃BO₃、1mM CaCl₂，pH 4.5(SP平衡缓冲液)相同的电导率。将所调节的汇合物上样至在SP平衡缓冲液中平衡的SP Sepharose HP柱。用数个柱体积的SP平衡缓冲液清洗柱后，在5个柱体积里用相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0--＞0.5M)洗脱柱。对洗脱过程中收集的级分测试蛋白酶活性(使用Protazyme AK测定法)。汇合来自柱的活性级分作为纯化的蛋白酶产品。

对于制备较少量的蛋白酶(微纯化)，将培养液进行无菌过滤通过0.45μm滤纸。向滤板(Whatman，Unifilter 800μl，25-30μm MBPP)的每孔添加约100μlMEP-HyperCel层析介质浆体。通过如下用200μl 25mM Tris、25mM硼酸钠、2mM CaCl2，pH 8.5清洗层析介质两次：于室温在有力摇动(Heidolph，Titramax101，1000rpm)以搅拌层析介质的条件下温育5分钟，随后通过真空(Whatman，UniVac 3)除去液体。然后将100μl结合缓冲液(0.5M Tris、25mM硼酸钠、10mMCaCl₂，pH 8.5)和400μl培养上清液转移至滤板的各孔。通常对每种蛋白酶微纯化4个孔。为了将蛋白酶结合至层析介质，在有力摇动的情况中将滤板温育30分钟。通过真空除去未结合的材料后，重复结合步骤：添加100μl结合缓冲液和400μl培养上清液，在摇动的情况中温育30分钟，并通过真空除去未结合的材料。然后将MEP-HyperCel介质用0.1M Tris、25mM硼酸钠、2mMCaCl₂，pH 8.5清洗一次，用25mM Tris、25mM硼酸钠、2mM CaCl₂，pH 8.5清洗一次，并且用10mM Tris、25mM硼酸钠、2mM CaCl₂，pH 8.5清洗一次。在每次清洗步骤中，添加200μl缓冲液，并在有力的摇动下于室温将平板温育10分钟，并通过真空除去缓冲液。为了自层析介质释放蛋白酶，添加100μl洗脱缓冲液(50mM乙酸钠、2mM CaCl₂，pH4.3)，并于室温在有力摇动的情况中将滤板温育10分钟。通过真空将含有蛋白酶的洗脱缓冲液转移至96孔板。如下重复洗脱步骤，即添加100μl洗脱缓冲液，于室温摇动l0分钟，并在同一96孔板中收集。将汇合的微纯化蛋白酶贮存于-18℃。

酶蛋白浓度如下文所描述的那样通过活性位点滴定来测定，或者基于A280值和氨基酸序列(氨基酸组成)来计算，其使用S.C.Gill和P.H.von Hippel，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中所概述的原理来进行。也可以通过氨基酸分析来测定酶蛋白浓度，例如如WO 2004/111221的实施例3中所描述的。

如下使用紧密结合性大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂2A(CI-2A；参见Ludvigsen，S.，Shen，H.Y.，Kjaer，M.，Madsen，J.C.，Poulsen，F.M.：Refinement ofthe three-dimensional solution structure of barley serine proteinase inhibitor 2and comparison with the structures in crystals.J.Mol.Biol.，卷222，第621页-第635页，1991)来通过活性位点滴定测定酶浓度。在微量滴定板中，将20μl等分试样的微纯化的蛋白酶(用0.1M Tris、0.0225％Brij 35(聚氧乙烯(23)月桂醚)，pH 8.6适当稀释)与20μl CI-2A(通常用0.1M Tris、0.0225％Brij 35，pH 8.6稀释至2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0μM)混合。在摇动的情况中温育1小时后，通过如下测量剩余活性：添加160μl底物溶液(通常为0.4mg/ml自DMSO中的200mg/ml储液制备的在0.1M Tris，0.0225％Brij 35，pH 8.6中的Suc-Ala-Ala-Ala-pNA)，并每10秒测量405nm处的吸光度达3分钟(Spectramax，Molecular Devices)。从剩余活性对具有(显著)剩余活性的孔的抑制剂浓度的线性回归计算活性蛋白酶浓度。

表1是本发明的选择变体的列表。如下文实施例中所述测试这些蛋白酶。

表1：变体的列表

实施例3：具有改善的pH-比率的蛋白酶

在pH 5.6和pH 8.0测试蛋白酶变体VAR294(SEQ ID NO：6)蛋白酶活性，并如下文所述与参照蛋白酶(SEQ ID NO：1)的相应活性进行比较。

蛋白酶测定法

使用来自Molecular Probes(Invitrogen，产品目录编号E6639)的

蛋白酶测定试剂盒。作为底物，它使用用pH不灵敏的红色荧光

TR-X染料重度标记的酪蛋白衍生物，导致几乎全部猝灭缀合物的荧光。蛋白酶催化的水解释放经荧光BODIPY TR-X染料高度标记的肽。伴随的荧光增强与蛋白酶活性成比例。

试剂：

将针对红色荧光的一管EnzChek蛋白酶测定试剂盒(200μg)在200μl 0.1MNaHCO₃(pH 8)中溶解以给出1mg/mL的储液。

通过用HCl将100mM Tris/碱调节至pH 8.0来制备测定缓冲液pH 8。添加6.25μg/ml经标记的底物。

通过将25ml 0.2M琥珀酸与37.5ml 0.2M NaOH混合来制备测定缓冲液pH5.6(参考文献：Gomori，Meth.Enzymol.1，141(1955))。为了补偿所添加的蛋白酶，为每100ml测定缓冲液添加1.143ml 1M HCl。由此，将缓冲液的pH降低至约5.0。添加5μg/ml经标记的底物。

样品分析：

将10μl 0.5μM蛋白酶溶液(参照蛋白酶、蛋白酶变体，均一式两份)与40μl各自的缓冲液在384孔板中混合。于室温温育60分钟；以750rpm/分钟有力摇动。在t＝0和t＝60分钟时在荧光微量板读板仪中读取荧光。经BODIPYTR-X标记的肽具有589/617nm的激发/发射最大值。使用标准的荧光素滤光片(filters)(激发＝590nm，发射＝635nm)来检测经BODIPY TR-X染料标记的肽。

计算：

在pH5.6在t＝60分钟的读数必须为与t＝0时相比的4倍高。计算在pH5.6的读数与在pH8的读数之间的比率。所得的数目必须为参照酶的各数目的1.4倍。将变体的比率与每块96孔板上的8个参照孔的平均比率进行比较。对于计算，在这两个pH值时都用t＝60减去t＝0。

结果

下文表2中所列的变体与pH5.6/pH8比率为1.00的参照蛋白酶相比具有不同的在pH 5.6/pH 8.0的活性比率。

表2

实施例4：针对蛋白酶功效的体内筛选测试

在患有诱发性胰腺外分泌机能不全(PEI)的3-4头雌性

迷你猪(Ellegaard)的组中在蛋白酶筛选测试中研究纯化的蛋白酶变体VAR294、VAR295、VAR375、VAR213和VAR307(SEQ ID NO：6、7、8、9和10)。通过结扎胰管在迷你猪中诱发胰腺外分泌机能不全(PEI)，并且它们还配有回-盲肠折返插管(均在异荧烷麻醉下和在约25kg的重量)，如在其它方面记载于Tabeling等(Tabeling等(1999)：“Studies on nutrient digestibilities(pre-caecaland total)in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution”，J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82：251-263)和Gregory等(Gregory等(1999)：“Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs，Effect of enzymesupplementation”in“Biology of the Pancreas in Growing Animals”(SGPierzynowski和R.Zabielski编)，Elsevier Science BV，Amsterdam，第381-393页)的。容许从手术恢复至少4周的一段时间，之后开始研究。研究开始前，经由粪便胰凝乳蛋白酶测试(商业上可以产品目录编号K6990从ImmundiagnostikAG，Wiesenstrasse 4，D-64625 Bensheim，德国得到)来证实每头猪的PEI状态。

测定法

研究过程中，按12：12h光-暗周期将猪圈养在改良的代谢笼中，容许自由获取水，并且每天喂养两餐。

测试餐

测试餐含有21.3％蛋白质、51.9％淀粉、2.6％脂肪，而且具有下列组成(g/100g干物质)：鱼粉3.5、禽类肉粉10.2、小麦粉29.5、带壳稻米(shelled rice)14、马铃薯淀粉11、玉米淀粉14、酪蛋白5.9、纤维素粉4.3、维生素、矿物和痕量元素7.6(按照猪/小猪的营养需要，参见例如WO 01/58276的表A)。

性能

为了评估蛋白酶功效，给猪喂养与1升水、0.625g Cr₂O₃(氧化铬标志物)混合且在喂养前立即向其中混合不同量的SEQ ID NO：1的参照蛋白酶(0mg、20mg、50mg和120mg酶蛋白，等于0、500、1250和3000个FIP U蛋白酶/餐)的单一250g测试餐。

对于试验自身，根据mg酶蛋白(20mg、50mg和120mg/餐)剂量施用本发明的蛋白酶变体，以与参照蛋白酶比较体内功效。

在回肠中第一次出现膳食标志物(绿色食糜)后，在冰上收集回肠食糜总共8小时，并在分析前贮存于-20℃。在分开的测定之间容许至少一天的冲洗。

分析

将冷冻的回肠食糜样品冷冻干燥，磨碎，并分析干物质(DM)和粗制蛋白质。冷冻干燥，接着于103℃温育8小时后按重量评估DM。

以氮(N)乘以因数6.25计算粗制蛋白质，即粗制蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)x6.25，如Animal Nutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh编，Longman Scientific and Technical，1988，ISBN 0-582-40903-9)中所规定的。用Dumas燃烧方法(PG Wiles，IK Gray，RC Kissling，J AOAC Int.1998May-Jun；81(3)：620-32)使用“Vario MAX CNS”元素分析仪(ElementarAnalysensysteme GmbH)来测定氮含量。

Cr₂O₃被氧化成铬酸盐，并经由365nm处的消光(分光光度计)如Petry和Rapp于Zeitung für Tierphysiologie(1970)，卷27，第181-189页(Petry和Rapp1970；Z.Tierphysiol.27；181-189)所述来计算铬含量，。

通过标志物方法根据以下公式进行表观盲肠前蛋白质消化率的计算：

其中Cr₂O₃和蛋白质表示为g/100g干物质。

此外，从个体回归曲线(excel)外推实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)分别所需要的蛋白酶量(mg)。为了更有效地比较参照蛋白酶的50％和60％蛋白质消化率(％CNA)，计算所谓的改善因数“IF”。分别通过用实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)所需要的参照蛋白酶量(mg)除以实现50％和60％蛋白质消化率(％CNA)所需要的变体蛋白酶量(mg)来测定每种蛋白酶变体的IF50和IF60值。

结果和结论

在下文表3中显示了回肠蛋白质消化结果。蛋白酶剂量以每餐的毫克酶蛋白(mg/meal)指明。

还测试了表4中所提及的所有变体。它们都具有0.8或更多的IF。

实施例5：药物蛋白酶组合物

丸剂

如实施例2中所述制备蛋白酶变体VAR295(SEQ ID NO：7)的液体浓缩物。将液体浓缩物进行微生物过滤，喷雾干燥，并测量经干燥的粉末的蛋白酶蛋白含量。优选地，蛋白酶蛋白含量高于50％(根据调节性需要)。将500g干燥的蛋白酶粉末与200g微晶纤维素和300g聚乙二醇4000(Macrogol^TM 4000)一起在商业上可得到的混合器中预先混合。添加足够量的通常使用的润湿剂，并于室温充分混合所得的湿物质(wet mass)。然后在商业上可得到的挤出机中挤出均质化的物质，所述挤出机装有具有某种孔直径(例如约0.8mm)的冲孔模以形成圆柱形丸剂。通过添加必要量的通常使用的湿润剂用商业上可得到的球形化器(spheronizer)将所生成的挤出物圆整为球形丸剂。在商业上可得到的真空干燥器中于约40℃的产品温度干燥丸剂。然后通过使用具有合适大小的筛(例如具有0.7和1.4mm筛)的机械筛分机来分离经干燥的丸剂以获得想要的筛分级分。收集所收集的筛分级分(例如≥0.7mm和≤1.4mm)，并将包含想要的标准化的活性物质含量的部分装入合适大小的胶囊中。

通过应用具有如实施例1中所述省略活化步骤的改良的针对来自胰粉末的蛋白酶的FIP方法来对所得的丸剂测试蛋白水解活性。

然后根据欧洲药典2.9.1.(章节“Disintegration oftablets and capsules”)对所得的丸剂测试崩解(测试溶液：水-500mL，37℃)。

实施例6：体外毒性

使用用人结肠腺癌细胞系的细胞测定法来进行蛋白酶毒性的体外筛选。测定法测量细胞的代谢能力，因此测量成活力。

用HT-29和Caco-2细胞进行的体外毒性测定法

将HT-29细胞(来自德国微生物和细胞培养物中心(German collection ofmicro-organisms and Cell Cultures)，DSMZ的ACC 299)在补充有10％FBS(Sigma，产品目录编号F-6178)的McCoy氏5A培养基(Cambrex)中培养。对于该实验，在96孔培养板中以4·10⁴个细胞/孔/200μl的密度培养细胞。使细胞适应各孔24小时后，在补充有0.5g/l Probumin(Millipore)、1％胰岛素/运铁蛋白/硒补充物(Invitrogen)和1％青霉素和链霉素(Invitrogen)的无血清培养基(DMEM：F12，Invitrogen)中以2倍稀释一式三份以9种不同浓度(重量/体积酶蛋白)添加测试组分(蛋白酶)，并再温育24小时。通过细胞的代谢能力来测量成活力，其通过使用Alamar蓝(Invitrogen)测量来实现。将Caco-2细胞在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的DMEM(Invitrogen11960-044)中培养，并在湿润的5％CO₂大气中培养。对于该实验，在96孔板中以3·10⁴个细胞/孔/200μl的密度培养细胞。适应各孔24小时后，在无血清培养基中添加测试组分以避免蛋白酶受血清中存在的蛋白酶抑制剂的结合，并再温育24小时，其后测量成活力。通过测量细胞代谢Alamar蓝的能力来测量细胞成活力。在无血清条件下完成关于测试蛋白酶变体的所有实验。

在不添加任何蛋白酶的孔中观察到最大代谢活性(并设为100％)。用对所测试的蛋白酶获得最大代谢活性的50％所处的浓度除以对参照蛋白酶获得最大代谢活性的50％所处的浓度，并将所得的“毒性比率”从下表4中显而易见。浓度越高，毒性越小；而且对参照蛋白酶的比率越高，降低的毒性越多。因而，蛋白酶VAR203的毒性与参照蛋白酶相比是降低的。已经对Caco-2和HT-29细胞两者测试变体。

表4

实施例7：体外消化性能

包括1小时pH 3(胃)步骤以及2小时pH 6(肠的)步骤的体外消化模型中测定表4中所提及的蛋白酶VAR203(SEQ ID NO：11)和其它变体的性能，并与参照蛋白酶(SEQ ID NO：1)的性能进行比较。如实施例2中所述纯化蛋白酶，并通过A₂₈₀测量以mg/ml计的酶蛋白含量。

将饮食(其与实施例4的测试餐相同)在0.1M HCl中溶解，给出0.2g饮食/ml的工作浆体。用HCl将pH调节至pH 2.5。将100μl饮食浆体添加至MTP(微量滴定板)中的每孔，并与20μl胃蛋白酶(Merck VL 317492437，产品目录号1.0792.0001，700mg/l，终浓度93μg/ml)和30μl稀释的酶(稀释至10μM(0.2mg/ml))混合。所有孔中的最终pH是2.8至3.0。对每种酶(在20mM乙酸盐，0.01％Triton X-100，pH5中稀释)制备一式两份4种浓度(0.2、0.1、0.05和0.025mg/ml)。这于37℃，750rpm(Eppendorf恒温混合器)温育1小时，并定义为体外消化模型的胃步骤。

为了开始肠步骤，通过将25μl缓冲液(0.8M MES、0.8M咪唑、0.8M乙酸盐，40％/60％混合，pH 5/9)添加至每孔将pH提高至6.0至6.05。另外，将25μl胆汁盐(在去离子水，Millipore milliQ中溶解的80mM胆汁盐，来自SolvayPharmaceuticals，批次176.01-PA-7374的胆汁盐混合物)添加至10mM的终浓度，接着于37℃，750rpm温育2小时。通过如下终止肠步骤：通过以2700rpm，于4℃离心10分钟来分开蛋白酶与饮食浆体。

通过使用OPA方法(邻苯二醛(o-phthaldialdehyde))定量上清液中的游离氨基来测定蛋白酶活性。减去“仅有胃蛋白酶”的孔的具有酶的孔中的游离氨基酸数目反映蛋白酶性能。将上清液在酶稀释缓冲液(20mM乙酸盐pH5，0.01％Triton X-100)中稀释10x，并将20μl稀释的上清液与200μl OPA试剂(混合3.81g十水合四硼酸二钠、1mL 10％SDS、88mg DTT，并添加80mg在2mL 96％乙醇中溶解的OPA，之后添加去离子水至总体积100ml)混合。包括丝氨酸稀释列(将0.5mg/ml储液稀释2倍)作为定量游离氨基的标准。测量340nm处的吸光度。

通过使针对无酶进行修正的水解氨基的绝对数据(通过OPA测定获得的)与三参数逻辑斯谛方程(logistic equation)拟合来实施所测试变体相对于参照蛋白酶的表观改善因数(IF)的计算：

其中NH₂是游离氨基的量(mM)，NH₂(最大)是蛋白酶能自饮食释放的游离氨基的最大量，浓度是蛋白酶浓度(mg酶每餐(250g))，斜率是平行曲线(参见下文)的斜率，而I(50)是计算IF的变量。倒置的V意味着指数(exp)。使用极高剂量的参照蛋白酶以实验方法将NH₂(最大)确定至20mM。

为了使所获得的数据与此方程拟合，进行两种假设。第一，假设所有获得的经水解氨基对剂量添加的mg酶的曲线是平行的(斜率恒定)。第二，底物可用性是活性的限制因素，并且因此在明显高的酶浓度时会获得经水解氨基量的平稳状态(NH₂(最大))。改善因数(IF)定义为：

IF＝I(50)(参照)/I(50)(变体)

其中I(50)(参照)指为了获得半数NH₂(最大)所需要的参照酶的浓度而I(50)(变体)指为了获得半数NH₂(最大)所需要的变体浓度。

蛋白酶变体VAR203具有2.6的改善因数，参照蛋白酶(根据定义)具有1.0的改善因数。这意味着为了获得与参照蛋白酶类似的效果需要低2.6倍量(2.6timeslower amount)的VAR203蛋白酶。表4中所列的所有变体具有0.7以上的IF。

实施例8

使用胃插入导管的大鼠模型进行的毒物学评估

测试系统

经验已经显示，通过对大鼠进行蛋白酶管饲进行口服施用后，测试物品反流(regurgitation)的风险升高，随后有非故意暴露于肺的风险。因此，使用专门的实验方法来区别蛋白酶变体与野生型(SEQ ID No：1)对胃肠道的体内毒性。在这些实验中使用由Charles River Laboratories Germany GmbH提供的胃插入导管的大鼠。经由胃导管每天将测试物品直接施用入胃中达14天，这消除向气管中误剂量添加(mis-dosing)的风险，而且降低从胃反流测试物品的风险。施用体积对于所有蛋白酶为10mL/kg，并在施用前约4小时撤出食物，并在剂量添加后4小时再提供。单独地圈养动物，并防止导管阻塞；每次施用后且每周一次在下午用自来水对它进行冲洗。

测量

剂量添加前和后个别地对大鼠观察行为变化、对处理的反应或疾病的任何体征。研究过程中在剂量添加前(pre-dose)和剂量添加后1小时时用肛门探测器测量所有动物的体温三次。以每周的时间间隔测量体重和食物消耗，而通过每日目视检查水瓶来测量水消耗。

在终止时，对所有动物进行详细的尸检(autopsy)，并对潜在的靶器官(包括胃、气管和肺)实施组织病理学(研究)。

结果

本研究中所观察到的死亡率主要与测试物品向呼吸道中的回流有关，而且还与技术问题(包括从施用位点(胃)泄露测试物品)有关。死亡率在700mg/kg剂量水平在经野生型蛋白酶处理的组中最为显著。

在组织病理学检查中，认为与上皮的鳞状上皮细胞增生有关的前胃炎症是靶标毒性。基于这些测试物品诱导的对胃粘膜的局部影响，野生型蛋白酶与作为组的变体相比更具毒性。

总之，组合的死亡率和组织病理学数据显示，野生型比变体更具毒性。

表5：在14天毒性研究中的野生型和变体的死亡率

蛋白酶	剂量(mg/kg/天)	大鼠死亡的/治疗的	％死亡率
蛋白酶	剂量(mg/kg/天)	大鼠死亡的/治疗的	％死亡率	对照(阴性)		0/11	0
野生型	700	4/6	67	对照(阴性)		0/11	0
野生型	700	4/6	67	G12D	810	1/8	13
G12N，T22A，N23D，N47T，R165H	1000	0/6	0	G12D	810	1/8	13
G12N，T22A，N23D，N47T，R165H	1000	0/6	0	R14I，R38T，T151I	1000	0/6	0
N47H，G48D	1000	0/6	0	R14I，R38T，T151I	1000	0/6	0

表6：胃插入导管的雄性大鼠中的组织病理学刺激发现(以受影响动物的数目给出)

	对照(阴性)	野生型	G12D	G12N，T22A，N23D，N47T，R165H	R14I，R38T，T151I	N47H，G48D
	对照(阴性)	野生型	G12D	G12N，T22A，N23D，N47T，R165H	R14I，R38T，T151I	N47H，G48D	剂量(mg/kg/天)		500	500/810	1000	1000	1000
数目	11	17	8/8	6	6	6	剂量(mg/kg/天)		500	500/810	1000	1000	1000
数目	11	17	8/8	6	6	6	鳞状上皮细胞增生	0	11	0/0	3	6	5
单核细胞浸润	2	3	0/0	1	1	0	鳞状上皮细胞增生	0	11	0/0	3	6	5
单核细胞浸润	2	3	0/0	1	1	0	前胃炎症	0	8	0/0	1	1	2

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

索尔维医药有限责任公司(Solvay Pharmaceuticals GmbH)

<120>供药学应用的蛋白酶变体

<130>11144.204-WO

<160>11

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>188

<212>PRT

<213>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(1)..(188)

<400>1

Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser

1 5 10 15

Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr

20 25 30

Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly

35 40 45

Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe

50 55 60

Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr

65 70 75 80

Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile

85 90 95

Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly

100 105 110

Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val

115 120 125

Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr

165 170 175

Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr

180 185

<210>2

<211>274

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的变体(T231R+N233R)

<220>

<221>PROPEP

<222>(1)..(5)

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(6)..(274)

<400>2

Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn

5 -1 1 5 10

Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp

15 20 25

Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu

30 35 40

Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

45 50 55

Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu

60 65 70 75

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly

80 85 90

Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys

95 100 105

Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr

110 115 120

Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg

125 130 135

Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala

140 145 150 155

Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr

160 165 170

Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val

175 180 185

Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val

190 195 200

Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

205 210 215

Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile

220 225 230 235

Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn

240 245 250

Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr

255 260 265

Cys Leu

<210>3

<211>481

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)淀粉酶的变体

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(1)..(481)

<400>3

Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp

1 5 10 15

Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp

20 25 30

Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser

35 40 45

Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu

50 55 60

Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu

65 70 75 80

Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr

85 90 95

Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp

100 105 110

Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser

115 120 125

Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg

130 135 140

Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly

145 150 155 160

Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln

165 170 175

Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp

180 185 190

Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala

195 200 205

Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp

210 215 220

Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg

225 230 235 240

Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr

245 250 255

Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu

260 265 270

Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr

275 280 285

Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys

290 295 300

Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr

305 310 315 320

Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr

325 330 335

Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg

340 345 350

Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys

355 360 365

Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro

370 375 380

Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr

385 390 395 400

Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser

405 410 415

Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly

420 425 430

Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His

435 440 445

Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly

450 455 460

Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln

465 470 475 480

Arg

<210>4

<211>483

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)淀粉酶的变体

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(1)..(483)

<400>4

His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser

20 25 30

Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp

35 40 45

Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly

85 90 95

Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp

100 105 110

Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn

115 120 125

Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp

130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr

145 150 155 160

His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg

165 170 175

Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu

180 185 190

Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His

195 200 205

Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn

210 215 220

Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly

245 250 255

Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala

260 265 270

Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp

275 280 285

Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn

290 295 300

Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro

305 310 315 320

Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu

325 330 335

Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile

370 375 380

Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn

385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn

405 410 415

Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala

420 425 430

Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val

435 440 445

Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp

465 470 475 480

Val Asn Lys

<210>5

<211>513

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)淀粉酶的变体

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(1)..(486)

<400>5

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly

180 185 190

Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu

195 200 205

Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr

210 215 220

Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser

225 230 235 240

Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro

245 250 255

Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His

260 265 270

Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro

275 280 285

Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp

290 295 300

Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu

305 310 315 320

Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu

325 330 335

Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile

340 345 350

Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr

355 360 365

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370 375 380

Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr

385 390 395 400

Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu

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Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly

420 425 430

Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr

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Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro

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485 490 495

Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp

500 505 510

Pro

<210>6

<211>188

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体E125D

<220>

<221>mat_peptide(成熟肽)

<222>(1)..(188)

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<213>人工的

<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体R38T

<220>

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<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体(T44K+S99P)

<220>

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<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体S69T

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<210>10

<211>188

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体R165S

<220>

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<222>(1)..(188)

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<211>188

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)蛋白酶的变体(S69T+E125D)

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<222>(1)..(188)

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180 185

Claims

1.一种蛋白酶，其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且其与SEQ ID NO：1的氨基酸1-188相比包含选自下列取代的至少一个取代：A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。

2.根据权利要求1的蛋白酶，其包含至少一个下列取代：G12D，N，H；R38T；N47H，T，S；E125D和R165S，H，G，T。

3.根据权利要求2的蛋白酶，其包含至少一个下列取代或取代组合：G12D；和(N47H+G48D)。

4.根据权利要求1的蛋白酶，其包含至少一个下列取代或取代组合：R38T、(T44K+S99P)、S69T、(S69T+E125D)、E125D和R165S。

5.根据权利要求1的蛋白酶，其用作药物。

6.根据权利要求1的蛋白酶，其与脂肪酶或淀粉酶组合用作药物。

7.根据权利要求6的与脂肪酶或淀粉酶组合的蛋白酶，其中

(i)所述脂肪酶与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70％的同一性；和/或

(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶有至少70％的同一性：

a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，

b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶，和

c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶。

8.根据权利要求1的蛋白酶，其用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。

9.根据权利要求8的蛋白酶，其与脂肪酶或淀粉酶组合。

10.根据权利要求9的与脂肪酶或淀粉酶组合的蛋白酶，其中

(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％的同一性：

a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，

b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶，和

c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶。

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1中所限定的蛋白酶连同至少一种药学可接受的辅助性材料。

12.根据权利要求11的组合物，其进一步包含脂肪酶或淀粉酶。

13.根据权利要求12的组合物，其中

(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％的同一性：

a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，

b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶，和

c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶。

14.一种用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通过施用治疗有效量的如权利要求1-2任一项中所限定的蛋白酶来进行。

15.根据权利要求14的方法，其进一步包括施用治疗有效量的脂肪酶或淀粉酶。

16.根据权利要求15的方法，其中

(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％的同一性：

a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，

b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶，和

c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶。

17.如权利要求1中所限定的蛋白酶用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。

18.根据权利要求17的用途，其进一步包括使用脂肪酶或淀粉酶。

19.根据权利要求18的用途，其中

(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70％的同一性：

a)具有SEQ ID NO：3的氨基酸1-481的淀粉酶，

b)具有SEQ ID NO：4的氨基酸1-483的淀粉酶，和

c)具有SEQ ID NO：5的氨基酸1-513的淀粉酶。