ES2349086T3 - Enzimas para uso farmacéutico. - Google Patents
Enzimas para uso farmacéutico. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2349086T3 ES2349086T3 ES05744343T ES05744343T ES2349086T3 ES 2349086 T3 ES2349086 T3 ES 2349086T3 ES 05744343 T ES05744343 T ES 05744343T ES 05744343 T ES05744343 T ES 05744343T ES 2349086 T3 ES2349086 T3 ES 2349086T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protease
- baselineskip
- lipase
- enzyme
- amylase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Proteasa ácido estable de al menos 90% identidad a la SEC ID nº: 1, para uso como un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina, en donde ácido estable significa que la actividad proteasa de la enzima proteasa pura, en una dilución correspondiente a A280 = 1.0, y tras la incubación durante 2 horas a 37ºC en el siguiente tampón: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCl, 0.01% Triton® X-100, pH 3.5; es al menos un 80% de la actividad de referencia.
Description
Enzimas para uso farmacéutico.
La presente invención se refiere al uso
farmacéutico de proteasas relacionadas con una proteasa derivada de
Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEC ID nº: 1), en
combinación opcionalmente con una lipasa y/o una amilasa.
Varios medicamentos comerciales en forma de
suplementos de enzima pancreática se conocen para el tratamiento de
insuficiencia pancreática exocrina. Los ingredientes activos de
estos productos son enzimas digestivas, principalmente amilasa,
lipasa y proteasa, que se producen normalmente en el páncreas y se
excretan a la parte superior del intestino delgado (el duodeno).
Las enzimas usadas en tales medicamentos derivan del páncreas
bovino o porcino.
US 5614189 (EP 600868) describe el uso de
determinadas lipasas microbianas en la terapia de sustitución de
enzimas pancreáticas, por ejemplo en el tratamiento de pacientes que
sufren de fibrosis cística.
WO 00/54799 describe el uso de mezclas
enzimáticas que tienen, actividad lipolitica, proteolitica y
amilolitica en el tratamiento de la diabetes melitosa tipo I y
II.
WO 02/060474 describe el uso de determinadas
lipasas, proteasas y amilasas en el tratamiento de la
maldigestión.
La proteasa derivada de Nocardiopsis sp.
NRRL 18262 (SEC ID nº: 1), al igual que su preparación y varias
aplicaciones industriales de las mismas se describen en WO 88/03947
y WO 01/58276.
La presente invención se refiere a una proteasa
ácido estable de al menos 90% identidad a la SEC ID nº: 1, para uso
como un medicamento para el tratamiento de insuficiencia pancreática
exocrina, en combinación opcionalmente con una lipasa, y/o una
amilasa.
La invención también se refiere al uso de tales
proteasas para la producción de un medicamento para el tratamiento
de IPE (insuficiencia pancreática exocrina), este uso comprendiendo
además opcionalmente el uso de una lipasa, y/o una amilasa.
La invención se refiere además a una composición
farmacéutica comprendiendo tales proteasas, junto con al menos un
material auxiliar farmacéuticamente aceptable, incluyendo
opcionalmente una lipasa y/o una amilasa.
El término "proteasa" se define aquí como
una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier
enzima perteneciente al grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una
de las trece subclases del mismas, estas enzimas siendo referidas,
a continuación como "perteneciente al grupo EC 3.4.-.-"). El
número EC se refiere a la Nomenclatura Enzimática de 1992 de
NC-IUBBM, Academic Press, San Diego, California,
incluyendo los suplementos 1-5 publicados en Eur.
J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995,
232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237,
1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250,
1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264,
610-650; respectivamente. La nomenclatura es
suplementada y actualizada regularmente; véase p. ej. la World Wide
Web en hftp://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
Las proteasas son clasificadas en base a su
mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas/s,
proteasas de cisteína (C), proteasas aspárticas (A),
métalo-proteasas (M), y desconocidas, o como
proteasas todavía sin clasificar (U), véase el Handbook of
Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner
(eds.), Academic Press (1998), en particular la parte de
introducción general.
La presente invención se refiere al uso
farmacéutico de proteasas de al menos 70% identidad a la proteasa
de la SEC ID nº: 1, que se deriva de Nocardiopsis sp. NRRL
18262, y se describe en WO 88/03947 y WO 01/58276.
Las proteasas adicionales de la invención se
divulgan en WO 2004/111220, WO 2004/111221, WO 2004/111222, WO
2004/111223, WO 2005/035747, WO 2004/111219, incorporadas en la
presente por referencia.
Los ejemplos particulares de proteasas de la
invención se derivan de Nocardiopsis Dassonvillei.
subsp. Dassonvillei DSM 43235 (SEC ID nº: 2),
Nocardiopsis alba DSM 15647 (SEC ID nº: 3), Nocardiopsis
prasina DSM 15648 (SEC ID nº: 4), Nocardiopsis prasina
DSM 15649 (SEC ID nº: 5), al igual que fragmentos, mutantes, y
variantes de las mismas, tal como la Proteasa 22 (SEC ID Nº: 6).
Opcionalmente, cada una de las SEC ID Nos: 1-6
tiene una extensión C-terminal consistiendo en uno o
más aminoácidos, por ejemplo aminoácidos no polares o neutros, tal
como uno o más de Q, S, V, A, o P, seleccionado preferiblemente del
grupo que consiste en: QSHVQSAP (SEC ID NO:7), QSAP, QP, TL, TT,
QL, TP, LP, TI, IQ, QP, PI, LT, TQ, QQ, y PQ.
En formas de realización particulares, las
proteasas de la invención se seleccionan del grupo consistiendo
en:
- (a)
- proteasas pertenecientes al grupo enzimático EC 3.4.-.-;
- (b)
- serina proteasas;
- (c)
- serina proteasas de la familia peptidasa S2A;
- (d)
- serina proteasas de la familia peptidasa S1E como se describe en Biochem. J. 290:205-218 (1993) y en la base de datos de proteasas MEROPS, publicación 6.20, 24 de Marzo, 2003, (www.merops.ac.uk). La base de datos se describe en Rawlings, N.D., O'Brien, E. A. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30, 343-346; y
- (e)
- proteasas derivadas de cepas de Nocardiopsis.
Para determinar si una dada proteasa es una
proteasa serina, y una proteasa de la familia S2A, se hace
referencia al mencionado manual y los principios indicados en él.
Tal determinación puede llevarse a cabo para todo tipo de
proteasas, bien sean proteasas de origen natural o tipo salvaje; o
proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.
En formas de realización particulares, el grado
de identidad a la SEC ID nº: 1 es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99%.
La proteasa de la invención es ácido estable, lo
que significa que la actividad de la proteasa de la enzima proteasa
pura, en una dilución correspondiente a A_{280} = 1.0, y después
de la incubación durante 2 horas a 37ºC en el siguiente tampón: 100
mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de
CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0.01% Triton®
X-100, pH 3.5; es al menos 80% de la actividad de
referencia, como se mide usando el ensayo que se describe en el
Ejemplo 2C de WO 01/58276 (sustrato:
Suc-AAPF-pNA, pH 9.0, 25ºC). El
término actividad de referencia se refiere a la actividad proteasa
de la misma proteasa, después de la incubación en estado puro, en
una dilución correspondiente a A_{280} = 1.0, durante 2 horas a
5ºC en el siguiente tampón: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de
HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM
de KCl, 0.01% Triton® X-100, pH 9.0, en donde la
actividad es determinada como se describe anteriormente. El término
A_{280} = 1.0 significa tal concentración (dilución) de dicha
proteasa pura que da lugar a una absorción de 1.0 a 280 nm en una
cubeta de longitud de trayectoria de 1cm en relación al blanco del
tampón. El término proteasa pura se refiere a una muestra con una
proporción A_{280}/A_{260} por encima o igual al 1.70 (véase el
Ejemplo 2E de WO 01/58276), y que por un barrido de un gel de
SDS-PAGE teñido con Coomassie mide tener al menos
un 95% de su intensidad de barrido en la banda correspondiente a
dicha proteasa (véase el ejemplo 2A de WO 01/58276).
En todavía más formas de realización
particulares, una proteasa adicional puede ser usada opcionalmente,
por ejemplo una proteasa mamífera, por ejemplo en forma de extracto
del páncreas del ganado porcino, o una proteasa microbiana,
derivada por ejemplo de cepas bacterianas o fúngicas, tal como
Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus, o Rhizopus. La
proteasa puede ser derivada en particular de una cepa de
Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae o
Aspergillus melleus, en particular el producto Prozyme
6^{TM} (proteasa alcalina neutra EC 3.4.21.63) que está
disponible comercialmente de Amano Pharmaceuticals, Japón.
La proteasa de la invención puede ser usada en
combinación con una lipasa.
En el contexto actual, una lipasa significa una
hidrolasa éster carboxílica EC 3.1.1.-, que incluye actividades
tales como triacilglicerol lipasa EC 3.1.1.3, fosfolipasa A1 EC
3.1.1.4, lisofosfolipasa EC 3.1.1.5, galactolipasa EC 3.1.1.26,
fosfolipasa A1 EC 3.1.1.32, feruloil esterasa EC 3.1.1.73. En una
forma de realización particular, la lipasa es una triacilglicerol
lipasa EC 3.1.1.3.
En formas de realización particulares, la lipasa
es una lipasa mamífera, por ejemplo en forma de extracto del
páncreas del ganado porcino, o una lipasa microbiana, por ejemplo
derivada de cepas bacterianas o fúngicas, tal como Bacillus,
Pseudomonas, Aspergillus, o Rhizopus. La lipasa puede
ser derivada en particular de una cepa de Rhizopus, tal como
Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae, o Rhizopus
delemar, por ejemplo el producto Lipasa D Amano 2000^{TM}
(también designada Lipasa D2^{TM}) que está disponible
comercialmente de Amano Pharmaceuticals, Japón.
En más formas de realización particulares, la
lipasa para el uso en la presente invención es una lipasa
microbiana producida de forma recombinante, por ejemplo derivada de
un hongo tal como Humicola o Rhizomucor, de una
levadura tal como Candida, o de una bacteria tal como
Pseudomonas. En una forma de realización preferida, la
lipasa es derivada de una cepa de Humicola lanuginosa o
Rhizomucor miehei.
La lipasa de Humicola lanuginosa
(sinónimo Thermomyces lanuginosus) (SEC ID Nº: 8) se describe
en EP 305216, y variantes de lipasa particulares se describen en,
por ejemplo, WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577,
WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770,
WO 02/055679, y WO 02/066622. Todavía más ejemplos de lipasas fúngicas son la cutinasa de Humicola insolens que se describe en EP 785994, y la fosfolipasa de Fusarium oxysporum que se describe en EP 869167. Ejemplos de las lipasas de la levadura son la lipasa A y B de Candida antarctica de las que la lipasa A se describe en EP 652945, y la lipasa B se describe por, por ejemplo, Uppenberg et al en Structure, 2 (1994), 293. Un ejemplo de una lipasa bacteriana es la lipasa derivada de Pseudomonas Cepacia, que se describe en EP 214761.
WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770,
WO 02/055679, y WO 02/066622. Todavía más ejemplos de lipasas fúngicas son la cutinasa de Humicola insolens que se describe en EP 785994, y la fosfolipasa de Fusarium oxysporum que se describe en EP 869167. Ejemplos de las lipasas de la levadura son la lipasa A y B de Candida antarctica de las que la lipasa A se describe en EP 652945, y la lipasa B se describe por, por ejemplo, Uppenberg et al en Structure, 2 (1994), 293. Un ejemplo de una lipasa bacteriana es la lipasa derivada de Pseudomonas Cepacia, que se describe en EP 214761.
En una forma de realización preferida, la lipasa
es al menos 70% idéntica a la lipasa de la SEC ID nº: 8. En formas
adicionales de realización preferidas, el grado de identidad a la
SEC ID nº: 8 es al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,
79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99%. En formas de
realización alternativas, el grado de identidad a la SEC ID Nº: 8
es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,
58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, o al menos
69%.
En una forma de realización todavía más
preferida, la lipasa, como la lipasa pancreática mamífera, es una
lipasa de 1,3-posición específica.
La proteasa de la invención, con o sin una
lipasa como se describe anteriormente, también puede ser usada en
combinación con una amilasa.
En el contexto actual, una amilasa es una enzima
que cataliza la endo-hidrólisis del almidón y otros
oligo- y polisacáridos lineales y ramificados. La parte de amilosa
del almidón es rica en enlaces
1,4-alfa-glucosídicos, mientras la
parte de amilopectina es más ramificada, conteniendo no sólo enlaces
1,4-alfa- sino que también enlaces
1,6-alfa-glucosídicos. En una forma
de realización particular, la amilasa es una enzima del grupo EC
3.2.1.1.
En formas de realización particulares la amilasa
es una amilasa mamífera, por ejemplo en forma de extracto del
páncreas del ganado porcino, o una amilasa microbiana, por ejemplo
derivada de cepas bacterianas o fúngicas, tal como Bacillus,
Pseudomonas, Aspergillus, o Rhizopus.
La amilasa puede derivar en particular de una
cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae o Aspergillus melleus, por ejemplo
cualquiera de los productos Amilasa A1^{TM} derivados de
Aspergillus oryzae que está disponible comercialmente de
Amano Pharmaceuticals, Japón, o amilasa EC^{TM} derivada de
Aspergillus melleus que está disponible comercialmente de
Extract-Chemie, Alemania.
Otros ejemplos de amilasas fúngicas son la
amilasa de Aspergillus niger (SWISSPROT P56271), que también
se describe en el ejemplo 3 de WO 89/01969, y la amilasa de
Aspergillus oryzae (SEC ID nº: 9). Ejemplos de las variantes
de la amilasa de Aspergillus oryzae se describen en WO
01/34784.
La alfa-amilasa derivada de
Bacillus licheniformis es un ejemplo de una
alfa-amilasa bacteriana. Esta amilasa por ejemplo,
se describe en WO 99/19467, junto con otras
alfa-amilasas homólogas bacterianas derivadas de,
por ejemplo, Bacillus amyloliquefaciens, y Bacillus
stearothermophilus, al igual que variantes de las mismas. Los
ejemplos de variantes adicionales de amilasa son aquellos que se
describen la patente estadounidense nº. 4,933,279; EP 722490, y EP
904360.
En una forma de realización particular, la
amilasa es al menos 70% idéntica a la amilasa de la SEC ID Nº: 9.
En formas preferidas de realización adicionales, el grado de
identidad a la SEC ID Nº: 9 es de al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99%.
En formas de realización alternativas, el grado de identidad a la
SEC ID Nº: 9 es al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%,
55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, o al menos 69%.
Generalmente, las enzimas proteasa, lipasa, y
amilasa (de aquí en adelante "las enzima/s") para el uso según
la invención pueden ser enzimas naturales o de tipo salvaje
obtenidas de animales, en particular mamíferos, por ejemplo enzimas
humanas o porcinas; de plantas, o de microorganismos, pero también
de cualquier mutante, variantes, fragmentos etc. de los mismos
exhibiendo la actividad enzimática deseada, al igual que enzimas
sintéticas, tal como enzimas transpuestas, y enzimas de
consenso.
En una forma de realización específica, las
enzima/s son variantes poco alergénicas, diseñadas para invocar una
respuesta inmunológica reducida cuando se exponen a los animales,
incluido el hombre. El término respuesta inmunológica se ha de
entender como cualquier reacción por el sistema inmunológico de un
animal expuesto a la/s enzima/s. Un tipo de respuesta inmunológica
es una respuesta alérgica conduciendo a niveles aumentados de IgE
en el animal expuesto. Las variantes poco alergénicas pueden ser
preparadas usando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo
la/s enzima/s puede/n ser conjugada/s con fracciones poliméricas
protegiendo las partes o epítopos de las enzima/s implicadas en una
respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar
el acoplamiento químico in vitro del polímero a la/s
enzima/s, p. ej. como se describe en WO 96/17929, WO 98/30682, WO
98/35026, y/o WO 99/00489. La conjugación, de forma adicional o como
alternativa a ella, puede implicar el acoplamiento in vivo
de polímeros a la/s enzima/s. Tal conjugación puede lograrse por la
modificación genética de la secuencia de nucleótidos que codifica
la/s enzima/s, insertando secuencias de consenso que codifican
emplazamientos de glicosilación adicionales en la/s enzima/s y que
expresan la/s enzima/s en un huésped capaz de la glicosilación de
las enzima/s, véase p. ej. WO 00/26354. Otra manera de proporcionar
variantes poco alergénicas, es la modificación genética de la
secuencia de nucleótidos que codifica la/s enzima/s para causar la
auto-oligomerización de las enzimas, ocasionando que
los monómeros enzimáticos puedan proteger los epítopos de otros
monómeros enzimáticos y así reducir la antigenicidad de los
oligómeros. Tales productos y su preparación se describen p. ej. en
WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica
pueden ser identificados por varios métodos, tal como el método de
exposición en fago que se describe en WO 00/26230 y WO 01/83559, o
el enfoque aleatorio que se describe en EP 561907. Una vez que se
ha identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos puede ser
alterada para producir propiedades inmunológicas alteradas de la/s
enzima/s por técnicas de manipulación génica conocidas tal como la
mutagénesis dirigida (véase p. ej. WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO
00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede ser realizada con
proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al
epítopo.
En formas de realización particulares las
enzimas proteasa, lipasa, y/o amilasa son (i) estables a pH
4-8, preferiblemente también a pH
3-4, más preferiblemente a pH 3.5; (ii) activas a pH
4-9, preferiblemente 4-8, más
preferiblemente a pH 6.5; (iii) estables contra la degradación por
pepsina y otras proteasas digestivas (tal como proteasas del
páncreas, es decir, principalmente tripsina y quimotripsina); y/o
(iv) estables y/o activas en presencia de sales biliares.
El término "en combinación con" se refiere
al uso combinado según la invención de la proteasa, lipasa, y/o
amilasa. El uso combinado puede ser simultáneo, de superposición, o
secuencial, estos tres términos siendo generalmente interpretados a
la luz de la prescripción hecha por el médico.
El término "simultáneo" se refiere a
circunstancias bajo las que las enzimas están activas al mismo
tiempo, por ejemplo cuando son administradas al mismo tiempo como
uno o más productos farmacéuticos por separado, o si son
administrados en una y la misma composición farmacéutica.
El término "secuencial" se refiere a tales
casos donde una y/o dos de las enzimas están actuando primero, y la
segunda y/o tercera enzima con posterioridad. Una acción secuencial
puede ser obtenida administrando las enzimas en cuestión, como
formulaciones farmacéuticas por separado con los intervalos
deseados, o como una composición farmacéutica en la que las enzimas
en cuestión, son formuladas diferentemente (compartimentadas), por
ejemplo con el fin de obtener un tiempo de liberación diferente,
proporcionando una mejorada estabilidad del producto, o para
optimizar la dosificación enzimática.
El término "de superposición" se refiere a
tales casos donde los períodos de actividad enzimática no son ni
completamente simultáneos ni completamente secuenciales, a saber,
hay un cierto periodo en el que las enzimas son ambas, o todas,
activas.
El término "a", cuando es usado por ejemplo
en el contexto de la proteasa, lipasa, y/o amilasa de la invención,
significa al menos una. En formas de realización particulares,
"una", "una o más", o "al menos una", una vez más
significa una, dos, tres, cuatro, cinco etc.
Por propósitos de la presente invención el grado
de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado por
el programa "align" que es un alineamiento de
Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento
global). Las secuencias son alineadas por el programa, usando la
matriz de puntuación por defecto BLOSUM50. La penalización para el
primer residuo de un espacio es 12, y para más residuos de un
espacio las penalizaciones son 2.
"Align" es parte de la versión del paquete
FASTA v20u6 (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved
Tools for Biological Sequence Analysis" PNAS
85:2444-2448, y W.R. Pearson (1990) "Rapid and
Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in
Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de
proteínas con FASTA usan el algoritmo
Smith-Waterman sin limitación en el tamaño del
espacio (véase "Smith-Waterman algorithm",
T.F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol.
147:195-197).
La actividad de la/s enzima/s de la invención
puede ser medida usando cualquier ensayo adecuado. Generalmente, el
pH y temperatura del ensayo han de adaptarse a la enzima en
cuestión. Ejemplos de los valores de pH del ensayo son pH 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Ejemplos de las temperaturas de ensayo
son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, o 95ºC.
Por ejemplo, la actividad de la proteasa puede
ser medida usando cualquier ensayo, en el que un sustrato es
empleado, que incluye enlaces peptídicos relevantes para la
especificidad de la proteasa en cuestión.
Ejemplos de ensayos enzimáticos adecuados se
incluyen en la parte experimental. Otros ejemplos son los ensayos
Ph.Eur para actividad lipasa y amilasa.
En el presente contexto, el término
"medicamento" significa un compuesto, o mezcla de compuestos,
que trata, impide y/o alivia los síntomas de enfermedad. El
medicamento puede ser recetado por un médico, o puede ser un
producto sin receta médica.
El aislamiento, purificación, y concentración de
la/s enzima/s de la invención se puede realizar por medios
convencionales.
En una forma de realización particular,
preparaciones sólidas o líquidas concentradas de cada una de la/s
enzima/s son preparadas por separado. Estos concentrados también
pueden, al menos en parte, ser formulados por separado, como se
explica en más detalle a continuación.
En una forma de realización particular más, la/s
enzima/s es/son incorporada/s en las composiciones farmacéuticas de
la invención en forma de concentrados sólidos. La/s enzima/s puede/n
ser llevada/s a estado sólido por varios métodos, como se conoce en
la materia. Por ejemplo, el estado sólido bien puede ser cristalino,
dónde las moléculas enzimáticas están dispuestas en una forma
altamente ordenada, o un precipitado, dónde las moléculas
enzimáticas están dispuestas en una forma menos ordenada, o,
desordenada.
La cristalización puede, por ejemplo, ser
realizada a un pH cerca del pl de la/s enzima/s y a baja
conductividad, por ejemplo 10 mS/cm o menos, como se describe en EP
691982 (véase también aquí el ejemplo 2).
Varios métodos de precipitación se conocen en la
materia, incluyendo la precipitación con sales, tal como sulfato de
amonio, y/o sulfato de sodio; con solventes orgánicos, tal como
etanol, y/o isopropanol; o con polímeros, tal como PEG
(polietilenglicol). En la alternativa, las enzima/s pueden ser
precipitadas de una solución eliminando el solvente (típicamente
agua) por varios métodos conocidos en la técnica, p. ej.
liofilización, evaporación (por ejemplo a presión reducida), y/o
secado por atomización.
En una forma de realización particular más, el
concentrado sólido de la/s enzima/s tiene/n un contenido de
proteína enzimática activa de al menos 50% (p/p) por referencia al
contenido total de proteína del concentrado sólido. En todavía más
formas de realización particulares, el contenido de proteína
enzimática activa, en relación con el contenido de proteína del
concentrado sólido es al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o al
menos 95% (p/p). El contenido de proteína puede ser medido como se
conoce en la técnica, usando por ejemplo un kit comercial, tal como
Protein Assay ESL, solicitud nº. 1767003, que está disponible
comercialmente de Roche, o sobre la base del método que se describe
en el ejemplo 8 de WO 01/58276.
Una composición farmacéutica de la invención
comprende la/s enzima/s, preferiblemente en forma de preparaciones
enzimáticas concentradas, más preferiblemente concentrados sólidos,
junto con al menos un material auxiliar, o, subsidiario
farmacéuticamente aceptable tal como (i) al menos un portador y/o
excipiente; o (ii) al menos un portador, excipiente, diluyente, y/o
adyuvante. Ejemplos no limitativos de otros ingredientes opcionales,
todos farmacéuticamente aceptables, son desintegradores,
lubricantes, sustancias tampón, agentes hidratantes, conservantes,
agentes aromatizantes, solventes, agentes solubilizantes, agentes de
suspensión, emulsionantes, estabilizadores, propulsores, y
vehículos.
Generalmente, dependiendo inter alia, de
la indicación médica en cuestión, la composición de la invención
puede ser diseñada para todas las formas de administración conocidas
en la técnica, incluyendo la administración enteral (a través del
canal alimentario), y administración parenteral, por ejemplo por
inyección (tal como, subcutánea, intramuscular, o intravenosa,
etc.). Así, la composición puede ser en forma sólida,
semi-sólida, líquida, o gaseosa, tal como en
comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, microesferas, pomadas,
cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones,
inhaladores, geles, microesferas, lociones, y aerosoles.
Los siguientes métodos y materiales auxiliares
son meramente ejemplares y no son de ninguna manera limitativos.
Para preparaciones orales sólidas, las enzima/s
pueden ser usadas solas o en combinación con aditivos apropiados
para hacer comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo,
con portadores convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón
de maíz, o almidón de patata; con excipientes o ligantes, tales como
cristalinos, o microcristalinos, celulosa, derivados de celulosa,
acacia, almidón de maíz, o gelatinas; con desintegradores, tales
como el almidón de maíz, almidón de patata, o carboximetilcelulosa
sódica; con lubricantes, tal como la cera carnauba, cera blanca,
goma laca, sílice de coloide seco, macrogol 6000, povidona, talco,
monoleína, o estearato de magnesio; y si se desea, con, diluyentes,
adyuvantes, soluciones tampón, agentes humectantes, conservantes
tales como metilparahidroxibenzoato (E218), agentes colorantes tales
como dióxido de titanio (E171), y agentes aromatizantes tales como
sacarosa, sacarina, aceite de naranja, aceite de limón, y
vainillina. Las preparaciones orales son ejemplos de preparaciones
preferidas para el tratamiento de la indicación médica de IPE.
La/s enzima/s, también pueden, bastante
generalmente, ser formuladas en preparaciones para inyección, o en
las preparaciones orales líquidas, por disolución, suspensión, o
emulsión de las mismas en un solvente acuoso tal como agua, o en
solventes no acuosos tal como aceite vegetal u otros similares,
glicéridos de ácido sintético alifático, ésteres de ácidos
alifáticos superiores, propilenglicol, polietilenglicol tal como PEG
4000, o alcoholes inferiores tal como alcoholes
C1-C4 lineales o ramificados, por ejemplo
2-propanol; y si se desea, con materiales o
aditivos convencionales subsidiarios tales como solubilizantes,
adyuvantes, diluyentes, agentes isotónicos, agentes de suspensión,
agentes emulsionantes, estabilizadores, y conservantes.
La/s enzima/s puede/n además, todavía bastante
generalmente, ser utilizada/s en la formulación de aerosoles para
ser administrada/s mediante inhalación, por ejemplo por formulación
en propulsores presurizados aceptables tal como
diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.
Además, la/s enzima/s puede/n generalmente,
hacerse en supositorios para administración rectal por la mezcla
con una variedad de bases tal como bases emulsionantes o bases
hidrosolubles. El supositorio puede incluir vehículos tal como la
manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se derriten a
temperatura corporal, sin embargo se solidifican a temperatura
ambiente.
El uso de liposomas como vehículo de entrega es
otro método de posible interés general. Los liposomas se fusionan
con las células del sitio objetivo y entregan el contenido del lumen
intracelularmente. Los liposomas se mantienen en contacto con las
células por tiempo suficiente para la fusión, usando varios medios
para mantener el contacto, tal como el aislamiento, agentes
ligantes, y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas
están diseñados para ser aerosolizados para la administración
pulmonar. Los liposomas pueden ser preparados con proteínas
purificadas o péptidos que median la fusión de membranas, tales como
el virus Sendai o virus de la influenza, etc. Los lípidos pueden
ser cualquier combinación útil de lípidos que forman liposomas,
incluyendo lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tales como
fosfatidilcolina. Los restantes lípidos normalmente serán lípidos
neutros o acídicos, tal como colesterol, fosfatidil serina,
fosfatidil glicerol, y similares. Para preparar los liposomas, el
procedimiento que se describe por Kato et al. (1991) J. Biol.
Chem. 266:3361 puede ser utilizado.
Las formas de dosificación unitaria para
administración oral o rectal tal como jarabes, elixires, polvos, y
suspensiones pueden ser proporcionadas en donde cada unidad de
dosificación, por ejemplo, una cucharadita, cucharada, cápsula,
pastilla o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la/s
enzima/s. De forma similar, las formas de dosificación unitaria
para administración por inyección o intravenosa puede comprender
la/s enzima/s en una composición como una solución en agua estéril,
solución salina normal, u otro portador farmacéuticamente
acepta-
ble.
ble.
El término "forma de dosificación
unitaria", como se utiliza aquí, se refiere a unidades
físicamente indivisibles adecuadas como dosificaciones unitarias
para sujetos humanos y animales, cada unidad conteniendo una
cantidad predeterminada de enzima/s en una cantidad suficiente para
producir el efecto deseado.
En una forma de realización particular, la
composición farmacéutica de la invención es para la administración
enteral, preferiblemente oral.
En otras formas de realización particulares, la
composición oral es (i) una composición líquida conteniendo
cristales de la/s enzima/s; (ii) una suspensión líquida de
sedimentos de enzima/s (altamente) purificada/s; (iii) un gel
conteniendo la/s enzima/s en forma sólida o solubilizada; (iv) una
suspensión líquida de enzima/s inmovilizada/s o de enzimas
adsorbidas a las partículas y similares; o (v) una composición
sólida en forma de polvos conteniendo enzima/s, granulados,
gránulos, o microesferas, si se desea en forma de comprimidos,
cápsulas, o similares, que están opcionalmente recubiertas, por
ejemplo con un recubrimiento ácido-estable.
En otra forma de realización particular de la
composición, la/s enzima/s está/n compartimentadas, es decir,
separadas unas de otras, por ejemplo por medio de recubrimientos por
separado.
En todavía otra forma más de realización
particular de la composición, la proteasa está separada de otros
componentes enzimáticos de la composición, tal como la lipasa, y/o
la amilasa.
La dosificación de la/s enzima/s variará
ampliamente, dependiendo de la/s enzima/s específicas por
administrar, la frecuencia de administración, la forma de
administración, la gravedad de los síntomas, y la susceptibilidad
del sujeto a efectos secundarios, y similares. Algunas de las
enzimas específicas pueden ser más potentes que otras.
Los enlaces amida (peptídicos), al igual que los
términos amino y carboxi, pueden ser modificados para mayor
estabilidad en la administración oral. Por ejemplo, el término
carboxi puede ser amidado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteasas de la invención, en combinación
opcionalmente con una lipasa, y/o una amilasa (la/s enzima/s de la
invención), es útil en el tratamiento terapéutico, y/o, profiláctico
de varias diferentes enfermedades o trastornos en animales. El
término "animal" incluye todos los animales, y en particular
seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes,
tales como ovejas, cabras, caballos, y ganado, p. ej. ganado bovino,
vacas, y terneros jóvenes. En una forma de realización particular,
el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes
incluyen animales mono-gástricos, p. ej. cerdos o
ganado porcino (incluyendo, pero no limitado a, lechones, cerdos en
crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollos
(incluyendo pero no limitado a pollos tipo Broiler, ponedoras);
terneros jóvenes; animales domésticos tales como gatos, y perros; y
peces (incluyendo pero no limitados a salmón, trucha, tilapia,
siluro y carpas; y crustáceos (incluyendo pero no limitado a
langostinos y gambas). En una forma de realización particular, el
animal es un mamífero, más en particular un ser humano.
Por ejemplo, la/s enzima/s es/son útil/es en el
tratamiento de trastornos digestivos como la mala digestión o
dispepsia que a menudo son causados por una producción deficitaria
y/o secreción en el tracto gastrointestinal de enzimas digestivas
normalmente secretadas de, inter alia el estómago, y el
páncreas.
Además, la/s enzima/s son particularmente útiles
en el tratamiento de IPE. La IPE puede ser verificada usando,
inter alia la prueba Borgström (JOP. J Pancreas (Online)
2002, 3(5):116-125), y puede ser provocada
por enfermedades y condiciones tales como cáncer pancreático,
cirugía pancreática y/o gástrica, p. ej. la resección total o
parcial del páncreas, gastrectomía, postcirugía de bypass
gastrointestinal (p. ej. gastroenterostomía de Billroth II);
pancreatitis crónica; síndrome de Shwachman Diamond; obstrucción
ductal del páncreas o conducto biliar común (p. ej. de neoplasma);
y/o fibrosis cística (una enfermedad heredada en la que una
mucosidad espesa bloquea los conductos del páncreas). La/s enzima/s
también puede/n ser útil/es en el tratamiento de la pancreatitis
aguda.
El efecto de la/s enzima/s en trastornos
digestivos pueden ser medidos como se describe generalmente en EP
0600868, en el que el ejemplo 2 describe una prueba de
digestibilidad in vitro para medir la prueba de estabilidad
lipásica bajo condiciones gástricas, y el ejemplo 3 una prueba de
digestibilidad in vitro para la actividad lipásica en
presencia de sales biliares. Correspondientes pruebas pueden ser
compuestas para las proteasas y amilasas. También WO 02/060474
divulga pruebas adecuadas, por ejemplo (1) una prueba in
vitro para medir la digestión lipídica en una alimentación de
prueba en ganado porcino, y (2) una prueba in vivo en ganado
porcino con páncreas insuficiente en el que la digestibilidad de la
grasa, proteína y almidón es medida.
En una forma de realización particular, el
efecto de la proteasa de la invención se mide usando el modelo de
digestión de insuficiencia páncreática in vitro del ejemplo 1
aquí, en el que varios otros sustratos pueden ser usados según se
desee, por ejemplo proteína animal, otras proteínas vegetales,
cereales, grasas animales o vegetales y aceites, además de
cualquier mezcla de los mismos.
En otras formas de realización particulares, el
efecto de la proteasa de la invención se mide usando la prueba de
tamizaje in vivo de la eficacia de la proteasa del ejemplo 4,
o el ensayo de digestibilidad in vivo completo del ejemplo
5.
Como un ejemplo más, la/s enzima/s son útiles en
el tratamiento de la Diabetes Mellitus tipo I, y/o de tipo II, en
particular para el tratamiento adyuvante en una terapia de diabetes
de trastornos digestivos que normalmente acompañan esta enfermedad,
con vista a disminuir las complicaciones tardías.
El efecto sobre la Diabetes mellitus de las
enzima/s se puede determinar por uno o más de los métodos que se
describen en WO 00/54799, por ejemplo controlando el nivel de
hemoglobina glicosilada, el nivel de glucosa en sangre, ataques
hipoglucémicos, el estatus de vitaminas liposolubles como vitaminas
A, D y E, la dosificación diaria requerida de insulina, el índice
de peso corporal, y períodos glucémicos.
La invención que se describe y reivindica aquí
no ha de estar limitada en su ámbito de aplicación por las formas
de realización específicas aquí divulgadas, ya que estas formas de
realización están previstas como ilustraciones de varios aspectos
de la invención. Cualquiera de las formas de realización
equivalentes están destinadas a estar dentro del ámbito de
aplicación de esta invención. En verdad, varias modificaciones de
la invención además de aquellas que se muestran y describen aquí
resultarán aparentes para aquellos expertos en la técnica de la
precedente descripción. Tales modificaciones también están
destinadas a entrar dentro del ámbito de aplicación de las
reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, la presente
divulgación incluyendo las definiciones, lo controlará.
Varias referencias están citadas aquí, cuyas
indicaciones están incorporadas como referencia en su
totalidad.
Ejemplo
1
Una preparación purificada de la proteasa
derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEC ID nº: 1) fue
preparada como se describe generalmente en el Ejemplo 2 de WO
01/58276, y probada en un modelo in vitro simulando la
digestión en individuos sufriendo de insuficiencia pancreática.
El sistema in vitro consiste en 24
matraces en los que un sustrato (basado en maíz y harina de soja
(SBM)) fue incubado inicialmente con HCl/pepsina (simulando la
digestión gástrica), y posteriormente con dos niveles reducidos de
pancreatina, simulando la digestión intestinal de un individuo con
insuficiencia pancreática parcial y completa. Un experimento de
control positivo también fue incluido con un nivel normal de
pancreatina.
10 de los matraces fueron dosificados con la
proteasa al principio de la fase gástrica mientras que los matraces
restantes sirvieron como blancos. Al final de la fase de incubación
intestinal muestras de digestiones in vitro fueron retiradas
y analizadas para proteína solubilizada y digerida.
Sustrato: 4 g SBM, 6 g maíz
(pre-mezclado)
HCl:0.105 M durante 1.5 horas (es decir, 30 min
de premezcla del sustrato-HCl)
Pepsina: Sigma P-7000, 3000 U/g
sustrato durante 1 hora
Pancreatina: Sigma P-7545, 0, 4,
o 8 mg/g sustrato durante 4 horas (siendo el nivel asumido normal de
pancreatina 8 mg/g)
Proteasa: 100 mg proteína de enzima proteásica
(EP)/kg de sustrato (la proteína enzimática fue calculada sobre la
base de los valores A280 y las secuencias de aminoácidos
(composiciones de aminoácidos) usando los principios esquematizados
en S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182,
319-326; (1989)
pH: 3.0 fase estomacal/6.8-7.0
fase intestinal
Temperatura: 40ºC
Reproducciones: 5 (4)
\vskip1.000000\baselineskip
0.39 M NaOH
0.105 M HCl
0.105 M HCl conteniendo 6000 U de pepsina por
cada 5 ml
1 M NaHCO_{3} conteniendo 16 mg de pancreatina
por cada 5 mls
125 mM tampón-NaAc, pH 6.0
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento experimental fue según el
esquema mencionado. El pH fue medido a tiempos de 1, 2.5, y 5.5
horas. Las incubaciones fueron terminadas después de 6 horas y
muestras de 30 ml fueron retiradas y colocadas sobre hielo antes
del centrifugado (10000 X g, 10 min, 4ºC). Los sobrenadantes fueron
retirados y almacenados a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las muestras fueron analizadas por
contenido de proteína solubilizada y digerida usando filtración en
gel.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de proteína solubilizada en los
sobrenadantes de muestras digeridas in vitro fue estimado
cuantificando la proteína cruda (PC) usando la filtración en gel
HPLC. Los sobrenadantes fueron deshelados, filtrados a través de
filtros de policarbonato de 0.45 \mum y diluidos (1:50; v/v) con
H_{2}O. Las muestras diluidas fueron cromatografiadas por HPLC
usando una columna de filtración en gel Superdex peptídica PE (7.5
X 300 mM)(Global). El eluyente usado para la elución isocrática fue
50 mM tampón de fosfato sódico (pH 7.0) conteniendo 150 mM de NaCl.
El volumen total de eluyente por cada ejecución fue de 26 ml y la
velocidad del caudal fue de 0.4 ml/min. Los esquemas de elución
fueron registrados a 214 nm y el área total bajo los esquemas fue
determinada por integración. Para estimar el contenido de proteína
de las áreas integradas, fue hecha una curva de calibración
(R^{2} =0.9993) de una serie de dilución de una muestra maíz/-SBM
de referencia digerida in vitro con el contenido de proteína
total conocido. La determinación de proteína en esta muestra de
referencia se efectuó usando un método estándar (en este caso el
método Kjeldahl para la determinación de % de nitrógeno; A.O.A.C.
(1984). Official Methods of Analysis, 14ª ed., Washington
DC).
DC).
El contenido de proteína digerida fue estimado
integrando la zona del cromatograma correspondiente a péptidos y
aminoácidos con una masa molecular de 1500 Dalton o inferior
(Savoie, L.; Gauthier, S.F. Dialysis Cell For The
In-vitro Measurement Of Protein
Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498;
Sabinszky, L.; Van, D.M.J.M.; Boer, H.; Den, H.L.A. An
In-vitro Method for Prediction of The
Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sci. Food Agr.
1990, 50, 173-178; Boisen,S.; Eggum, B.O. Critical
Evaluation of In-vitro Methods for
Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.
Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). Para
determinar la línea divisoria 1500 Dalton, la columna de filtración
en gel fue calibrada usando citocromo C (Boehringen; Alemania),
aprotinina, gastrina I, y sustancia P (Sigma Aldrich, EEUU), como
estándares de masa molecular.
Los resultados experimentales se muestran en la
tabla 1 y también se visualizan en la Fig. 1. En la tabla 1, la
columna "Enzima" muestra la cantidad de pancreatina (abreviada
"pan") por cada gramo de sustrato, al igual que la cantidad de
proteasa de Nocardiopsis (entre corchetes). En la siguiente
columna, "n" es el número de réplicas de cada experimento. La
siguiente agrupación de columnas muestra el porcentaje de proteína
digerible cruda (abreviado % dig.CP), incluyendo la desviación
estándar (SD), y la letra de significado superíndice según se
explica en la nota al pie de la tabla. Y finalmente, el último
agrupamiento de columnas muestra el porcentaje de proteína cruda
soluble (abreviado %sol.CP), incluyendo también SD y letras de
significado superíndices.
Tal y como aparece en la tabla 1, hay una fuerte
tendencia (P<0.10) para la adición de la proteasa de
Nocardiopsis a mejorar el porcentaje de proteína
solubilizada, al igual que digerible, y esto es así en el
experimento con 4 mg/g pancreatina, al igual que en el experimento
con 0 mg/g de pancreatina (compárese "4 mg pan, [100]" con
"4 mg pan, [0]"; y "0 mg pan, [100]" con "0 mg pan,
[0]"). Esto significa que la proteasa de Nocardiopsis es
capaz de compensar la ausencia parcial o completa de
pancreatina.
Ejemplo
2
La proteasa de la SEC ID nº: 1 fue fermentada
como se describe en el ejemplo 1, y el caldo con contenido de
proteasa fue cosechado en un centrifugador a pH 4.5. El resultante
sobrenadante fue sometido a ultrafiltración usando una membrana con
una válvula interruptora de 6 kDal, y a diafiltración hasta una
conductividad de 2 mS/cm en la solución con contenido de proteasa.
El contenido de proteasa fue de aproximadamente 100 mg/ml.
La solución de proteasa concentrada y
diafiltrada es cristalizada, ajustando el pH con hidróxido sódico a
pH 8.5, es decir cerca del pl de la proteasa (que es 9.3). Después
del ajuste del pH la solución se deja durante toda la noche a
temperatura ambiente, y la cristalización tiene lugar.
Al día siguiente la proteasa cristalizada es
cosechada por centrifugación.
Ejemplo
3
- Sustrato: Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388).
- Tampón de ensayo: 100 mM ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl_{2}, 150 mM KCl, 0.01% Triton® X-100 ajustado a pH 9.0 con HCl o NaOH.
- Temperatura del ensayo: 25ºC.
300 \mul de la muestra diluida de proteasa fue
mezclada con 1.5 ml del tampón del ensayo y la reacción de la
actividad fue iniciada añadiendo 1.5 ml de sustrato de pNA (50 mg
disueltos en 1.0 ml DMSO y diluido 45x más con 0.01% Triton®
X-100) y, después de la mezcla, el aumento en
A-_{405} fue monitorizado por un espectrofotómetro
como medición de la actividad de proteasa. Las muestras de proteasa
fueron diluidas antes de la medición de la actividad a fin de
asegurar que todas las mediciones de actividad entraban en la parte
lineal de la curva de dosis-respuesta para el
ensayo.
La actividad de la proteasa también puede ser
determinada usando el ensayo FIP (Federation Internationale
Pharmaceutique), 1 unidad-FIP = 1
unidad-Ph.Eur. (Farmacopea europea). Este ensayo se
describe, junto con otros ensayos FIP en: Federation Internationale
Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for
the standardisation of pharmaceutical enzymes. a) "Pharmaceutical
Enzymes", Editors: R. Ruyssen y A. Lauwers, E. Story Scientia,
Ghent, Bélgica (1978), b) Farmacopea europea. Véase también
Deemester et al en Lauwers A, Scharpé S (Eds):
Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p.
343-385.
Principio: la caseína de sustrato es hidrolizada
por la proteasa a pH 7.5 y a una temperatura de 35ºC. La reacción
es detenida por la adición de ácido tricloroacético, y la caseína no
degradada es eliminada por filtración. La cantidad de péptidos que
quedan en la solución es determinada por espectrofotometría a 275
nm.
Definición de la actividad: la actividad de la
proteasa es determinada como la cantidad de péptidos no
precipitados por una solución de 5.0% (peso/vol, es decir 5.0 g/100
ml) de ácido tricloroacético, por referencia a un polvo de
referencia pancreática (estándar de referencia de proteasa) de
actividad FIP conocida.
1.25 g caseína (sustancia seca), p. ej.
Calbiochem nº. 218680, es suspendido en agua hasta que es obtenida
una solución prácticamente transparente. El pH es ajustado a 8.0, y
la solución es diluida con agua a un volumen final de 100 ml. Aquí
y a continuación, agua se refiere a agua desionizada.
2.5 gramos de cloruro sódico, 2.85 gramos de
tetraborato disódico y 10.5 gramos de ácido bórico se disuelven en
900 ml de agua, el pH es ajustado a pH 7.5+/-0.1 y diluido a 1000
ml con agua.
Filtros plegados con un diámetro de 125 mm, p.
ej. Schleichen & Schuell nº. 1573^{1}/_{2}. Prueba de papel
de filtro: filtrar 5 ml de 5.0% ácido acético de tricloro a través
del filtro. La absorción a 275 nm del filtrado debería ser menos de
0.04, usando solución ácida tricloroacética sin filtrar como
blanco.
La proteasa (páncreas) disponible comercialmente
de la International Comission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for
Standards, Harelbekestraat 72; B-9000 Ghent,
Bélgica. El estándar tiene una actividad marcada (a) en
unidades/gr. de FIP/Ph.Eur. Pesar con precisión una cantidad
correspondiente a aprox. 130 unidades de
proteasa-FIP/Ph.Eur. Añadir una punta de espátula
de arena de mar, mojar con unas gotas de 0.02M cloruro de calcio
helado (pH 6.0-6.2), y triturar la totalidad con
una varilla de vidrio de extremo plano. Diluir con aprox. 90 ml de
la misma solución helada de cloruro de calcio y agitar la
suspensión durante 15 a 30 minutos en un baño de hielo. El pH es
ajustado a 6.1 y el volumen es ajustado a 100 ml con la misma
solución de cloruro de calcio. 5.0 ml de esta suspensión es
diluida con tampón de borato pH 7.5 a 100 ml. Para la prueba de
actividad, 1.0, 2.0 y 3.0 ml de esta solución son usados como
referencia (a continuación designado S1, S2, y S3, S para
estándar).
Preparar una suspensión de la muestra como se
describe anteriormente para el estándar de referencia de proteasa,
usando una cantidad de muestra equivalente a aprox. 260 unidades
FIP/Ph.Eur. El pH es ajustado a 6.1 y agua es añadida a 100 ml.
5.0 ml de esta solución se mezcla con 5 ml de solución de cloruro
de calcio. 5 ml de esta dilución es diluida adicionalmente a 100
ml con tampón de borato. Usar 2.0 ml de esta solución para el
ensayo (a continuación la muestra es designada Un, muestra de
actividad desconocida, número n).
El ensayo se realiza para las tres suspensiones
de referencia (S1, S2; S3) y para la suspensión de muestra (Un),
todo por triplicado. Un blanco por muestra es suficiente (designado
S1b, S2b, S3b, y Unb, respectivamente). Un ciego (b) es preparado
sin muestra/estándar como líquido de compensación para el
espectrofotómetro. El tampón de borato se añade a tubos como a
continuación: ciego (b) 3.0 ml; (Un) muestra 1.0 ml; estándares
(S1, S2 y S3) 2.0, 1.0 y 0 ml, respectivamente. El estándar de
proteasa de referencia se añade a S1, S2 y S3 como a continuación:
1.0, 2.0, y 3.0 ml, respectivamente. La suspensión de prueba es
añadida a los tubos de muestra como a continuación (Un): 2.0 ml. 5
ml ácido tricloro acético es añadido a todos los ciegos (S1b, S2b,
S3b, Unb y B) seguido de la agitación inmediata. Todos los tubos se
detienen con un tapón de vidrio y se colocan junto con la solución
de sustrato en un baño de agua a temperatura constante (35+/-0.5ºC).
Cuando se alcanza el equilibrio de la temperatura, a tiempo zero,
2.0 ml de solución de caseína es añadida a los tubos S1, S2, S3 y
Un, seguido de la mezcla inmediata. Exactamente 30 minutos después,
5.0 ml. de ácido tricloro acético es añadido a cada uno de los
tubos S1, S2, S3 y Un, seguido de la mezcla inmediata. Los tubos se
sacan del baño de agua y se dejan reposar a temperatura ambiente
durante 20 minutos para completar la precipitación de las
proteínas. El contenido de cada tubo es filtrado dos veces a través
del mismo filtro, y la absorción de los filtrados es medida a 275
nm usando el filtrado del tubo B como líquido de compensación. La
actividad de la muestra (Un) en unidades FIP es calculada en
relación a la conocida actividad marcada (A) de los estándares (S1,
S2, S3). Los valores de absorción menos los respectivos ciegos (p.
ej. la absorción de S1 menos la absorción de S1b) deben estar en el
intervalo de 0.15-0.60.
Sustrato: para-nitrofenil (pNF)
valerato
pH del ensayo: 7.7
Temperatura del ensayo: 40ºC
Tiempo de reacción: 25 min
El producto digerido con color amarillo tiene
una absorbencia característica a 405nm. Su cantidad es determinada
por espectrofotometría. Una unidad de lipasa es la cantidad de
enzima que libera 1 micromol de ácido butírico valorable por cada
minuto bajo las dadas condiciones del ensayo. Una descripción más
detallada del ensayo, AF95/6-GB, está disponible a
petición de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880
Bagsvaerd, Dinamarca.
Sustrato: comprimidos de Phadebas (Pharmacia
Diagnostics; polímero de almidón entrecruzado, insoluble de color
azul, que es mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia
de tampón, y fabricado en comprimidos)
Temperatura del ensayo: 37ºC
pH del ensayo: 4.3
Tiempo de reacción: 20 min
Tras la suspensión en agua el almidón es
hidrolizado por la alfa-amilasa, dando fragmentos
azules solubles. La absorbencia de la resultante solución azul,
medida a 620 nm, es una función de la actividad
alfa-amilasa. Una unidad de
alfa-amilasa fúngica (1 UAF) es la cantidad de
enzima que descompone 5.26 g de almidón (Merck, Amylum solubile
Erg. B. 6, lote 9947275) por cada hora en las condiciones estándares
del ensayo. Una descripción más detallada del ensayo,
APTSMYQI-3207, está disponible a petición de
Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd,
Dinamarca.
Ejemplo
4
La proteasa descrita en ejemplo 1 fue evaluada
en cerdos enanos hembra Göttingen (Ellegaard). En los cerdos
enanos, el conducto pancreático fue ligado para inducir
Insuficiencia Pancreática Exocrina (PEI), y dotados con con una
cánula reentrante ileo-cecal, todos bajo anestésico
halotano y a un peso de aproximadamente 25 kg, como se describe en
Tabeling et al., J. 1999, Studies on nutrient
digestibilities (pre-caecal and total) in
pancreatic duct-ligated pigs and the effects of
enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim.utr. 82:
251-263 (de ahora en adelante referido como
"Tabeling 1999"); y en Gregory et al., J. 1999. Growth
and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme
supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing
Animals" (SG Pierzynowski & R.Zabielski, eds), Elsevier
Science BV, Amsterdam, págs. 381-393 (de ahora en
adelante referido como "Gregory et al 1999"). Un periodo
de al menos 4 semanas fue permitido para la recuperación de la
cirugía, antes de que comenzaran los estudios. Antes del inicio del
estudio, el estado de PEI (Insuficiencia pancreatica exocrina) de
cada cerdo fue confirmado mediante la prueba de quimiotripsina en
las heces (disponible comercialmente de Immundiagnostik Ag,
Wiesenstrasse 4; D-64625 Bensheim, Alemania, con el
catálogo nº. K 6990).
Durante los estudios, los cerdos fueron alojados
en jaulas de metabolismo modificado en un ciclo 12:12
claro-oscuro y permitidos el libre acceso a agua y
alimentados dos comidas/día. Para valorar la eficacia de la
proteasa, los cerdos fueron alimentados con un alimento de prueba de
250 g mezclado con 1 litro de agua, 0.625 g de Cr_{2}O_{3}
(marcador óxido crómico) y en la que distintas cantidades de
proteasa (0, 1000, 2500, 6000 FIP U proteasa/alimento (unidades FIP
de proteasa, véase el ejemplo 3)) fueron mezcladas inmediatamente
antes de la alimentación. El alimento de prueba contenía 21.4% de
proteína, 51.9% de almidón, 2.6% de grasa, y tenía la siguiente
composición (g/100 g de materia seca): alimento de pescado 3.5,
alimento de carne de ave 10.2, harina de trigo 29.5, arroz
descascarado 14, almidón de patata 11, almidón de maíz 14, caseína
5.9, polvo de celulosa 4.3, vitaminas, minerales y elementos traza
7.6 (como por el requisito nutritivo para cerdos/lechones, véase p.
ej. la tabla A de WO 01/58276).
Quimo ileal fue recogido sobre hielo durante un
total de 8 h tras la primera aparición del marcador en el íleon
(quimo verde) y almacenado a -20ºC antes del análisis. Al menos un
día de lavado fue permitido entre las determinaciones por
separado.
En resumen, las muestras congeladas fueron
liofilizadas y analizadas por materia seca (DM) y proteína cruda.
La DM fue estimada por peso tras la liofilización seguida de 8 h de
incubación a 103ºC. La proteína cruda fue calculada como nitrógeno
(N) multiplicado por un factor 6.25, es decir proteína cruda (g/kg)=
N (g/kg) x 6.25 como se indica en Animal Nutrition, 4ª edición,
capítulo 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards y J. F. D. Greenhalgh,
Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN
0-582-40903-9). El
contenido de nitrógeno fue determinado por el método Kjedahl
(Naumann y Bassler, 1993, Die chemische Untersuchung von
Futtermitteln. 3ª Edición VDLUFA-Verlag, Darmstadt,
Germany (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher
Untersuchungs-und Forschungsanstalten).
El cálculo de la digestibilidad aparente de
proteína prececal, fue hecho según la fórmula:
en la que Cr_{2}O_{3} y la
proteína, fueron expresadas como g/100 g de materia
seca.
Ejemplo
5
La proteasa que se describe en el ejemplo 1 fue
probada en cerdos enanos Göttingen hembra (Ellegaard) en los que el
conducto pancreático fue ligado para inducir PEI, y fueron dotados
con una cánula ileo-cecal reentrante, todo bajo
anestesia de halotano y a un peso de aproximadamente 25 kg, tal y
como se ha descrito anteriormente (Tabeling 1999; Gregory et
al 1999). Cerdos enanos de control fueron preparados de manera
similar, pero el conducto pancreático fue dejado intacto. Un
periodo de al menos 4 semanas fue permitido, para la recuperación
de la cirugía, antes de que fueran iniciados los estudios. Antes del
inicio del estudio, el estado de PEI de cada cerdo fue confirmado
mediante la prueba de quimotripsina en las heces (véase ejemplo
4).
Los cerdos fueron permitidos libre acceso a agua
y alimentados con dos comidas/día de 250 g, a las 08.00 y 20.00 h,
de una dieta finamente molida (como en el ejemplo 4), mezclada con 1
litro de agua, 0.625 g Cr_{2}O_{3} y en la que distintas
cantidades de proteasa (0, 6000 U FIP Proteasa/alimento) fueron
mezcladas inmediatamente antes de la alimentación. Cada dosis fue
alimentada a los cerdos durante 2 semanas y quimo ileal fue
recogido sobre hielo durante 12 h durante los 3 días finales. Las
muestras fueron almacenadas a -20ºC hasta el análisis.
En resumen, las muestras congeladas fueron
liofilizadas y analizadas por materia seca (DM) y proteína cruda.
La DM y proteína cruda fue estimada y la digestibilidad de proteína
prececal (digestibilidad aparente) calculada como se describe en el
ejemplo 4.
La digestibilidad de proteína prececal fue
aprox. 80% en los cerdos enanos de control (pancreático
suficientes) sobre la dieta usada. En el cerdo enano no tratado de
PEI, la digestibilidad de la proteína fue reducida seriamente en
comparación con estos valores de control, pero la suplementación
enzimática con pancreatina o la proteasa microbiana mejoró
vigorosamente la digestibilidad, que se aproximó a valores de
control (véase los resultados en la tabla 3 a continuación).
\bullet US 5614189 A [0003]
\bullet EP 600868 A [0003]
\bullet WO 0054799 A [0004] [0077]
\bullet WO 02060474 A [0005] [0073]
\bullet WO 8803947 A [0006] [0012]
\bullet WO 0158276 A [0006] [0012] [0018]
[0053] [0080] [0111]
\bullet WO 2004111220 A [0013]
\bullet WO 2004111221 A [0013]
\bullet WO 2004111222 A [0013]
\bullet WO 2004111223 A [0013]
\bullet WO 2005035747 A [0013]
\bullet WO 2004111219 A [0013]
\bullet EP 305216 A [0024]
\bullet WO 9205249 A [0024]
\bullet WO 9219726 A [0024]
\bullet WO 9425577 A [0024]
\bullet WO 9522615 A [0024]
\bullet WO 9704079 A [0024]
\bullet WO 9707202 A [0024]
\bullet WO 9942566 A [0024]
\bullet WO 0032758 A [0024]
\bullet WO 0060063 A [0024]
\bullet WO 0183770 A [0024]
\bullet WO 02055679 A [0024]
\bullet WO 02066622 A [0024]
\bullet EP 785994 A [0024]
\bullet EP 869167 A [0024]
\bullet EP 652945 A [0024]
\bullet WO 8901969 A [0031]
\bullet WO 0134784 A [0031]
\bullet WO 9919467 A [0032]
\bullet US 4933279 A [0032]
\bullet EP 722490 A [0032]
\bullet EP 904360 A [0032]
\bullet WO 9617929 A [0035]
\bullet WO 9830682 A [0035]
\bullet WO 9835026 A [0035]
\bullet WO 9900489 A [0035]
\bullet WO 0026354 A [0035]
\bullet WO 9616177 A [0035]
\bullet WO 0026230 A [0035]
\bullet WO 0183559 A [0035]
\bullet EP 561907 A [0035]
\bullet WO 0022103 A [0035]
\bullet EP 691982 A [0051]
\bullet EP 0600868 A [0073]
\bulletEur. J. Biochem., 1994,
vol. 223, 1-5 [0010]
\bulletEur. J. Biochem., 1995,
vol. 232, 1-6 [0010]
\bulletEur. J. Biochem., 1996,
vol. 237, 1-5 [0010]
\bulletEur. J. Biochem., 1997,
vol. 250, 1-6 [0010]
\bulletEur. J. Biochem., 1999,
vol. 264, 610-650 [0010]
\bullet Handbook of Proteolytic Enzymes.
Academic Press, 1998 [0011]
\bulletBiochem. J., 1993, vol.
290, 205-218 [0015]
\bulletRawlings, N.D.; O'Brien,
E. A.; Barrett, A.J. MEROPS: the protease database.
Nucleic Acids Res., 2002, vol. 30,
343-346 [0015]
\bulletUppenberg et al.
Structure, 1994, vol. 2, 293 [0024]
\bullet W. R. Pearson; D. J.
Lipman. Improved Tools for Biological Sequence Analysis.
PNAS, 1988, vol. 85, 2444-2448
[0043]
\bullet W. R. Pearson. Rapid and
Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods in
Enzymology, 1990, vol. 183, 63-98
[0043]
\bullet T. F. Smith; M. S.
Waterman. Smith-Waterman algorithm. J.
Mol. Biol., 1981, vol. 147, 195-197
[0043
\bulletKato et al. J. Biol.
Chem., 1991, vol. 266, 3361 [0061]
\bullet JOP. J Pancreas, 2002,
vol. 3 (5), 116-125 [0072]
\bullet S.C. Gill; P.H. von
Hippel. Analytical Biochemistry, 1989, vol.
182, 319-326 [0084]
\bullet A.O.A.C. (1984) Official
Methods of Analysis. 1984 [0088]
\bulletSavoie, L.; Gauthier,
S.F. Dialysis Cell For The In-vitro
Measurement Of Protein Digestibility. J. Food Sci.,
1986, vol. 51, 494-498 [0089]
\bulletSabinszky, L.; Van, D. M. J.
M.; Boer, H.; Den, H. L. A. An
In-vitro Method for Prediction of The
Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sci. Food
Agr., 1990, vol. 50, 173-178 [0089]
\bulletBoisen, S.; Eggum, B.O.
Critical Evaluation of In-vitro Methods for
Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.
Nutrition Research Reviews, 1991, vol. 4,
141-162 [0089]
\bulletPharmaceutical Enzymes.
1978 [0097]
\bulletDeemester et al.
Pharmaceutical Enzymes. Marcel Dekker, 1997,
343-385 [0097]
\bulletTabeling et al. Studies
on nutrient digestibilities (pre-caecal and total)
in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of
enzyme substitution. J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr.,
1999, vol. 82, 251-263 [0110]
\bulletGrowth and digestion in
pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation.
Gregory et al. Biology of the Pancreas in Growing Animals.
Elsevier Science BV, 1999, 381-393
[0110]
\bullet Animal Nutrition. Longman Scientific
and Technical, 1988 [0113]
<110> Novozymes A/S
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas para uso farmacéutico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10627.204-wo
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> especie Nocardiopsis NRRL 18262
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(188)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis dassonvillei
subsp. Dassonvillei DSM 43235
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(188)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis alba DSM
15647
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(188)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15648
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(188)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardiopsis prasina DSM
15649
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptidico
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(188)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(196)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERISTICA_MISC.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> extensión
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermomyces lanuginosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptidico
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..()
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(478)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
Claims (12)
1. Proteasa ácido estable de al menos 90%
identidad a la SEC ID nº: 1, para uso como un medicamento para el
tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina, en donde
ácido estable significa que la actividad proteasa de la enzima
proteasa pura, en una dilución correspondiente a A_{280} = 1.0, y
tras la incubación durante 2 horas a 37ºC en el siguiente tampón:
100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM
de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0.01% Triton®
X-100, pH 3.5; es al menos un 80% de la actividad
de referencia.
2. Proteasa según la reivindicación 1, en
combinación con una lipasa o una amilasa, para el uso como un
medicamento.
3. Proteasa según la reivindicación 1, en
combinación con una lipasa y una amilasa, para el uso como un
medicamento.
4. Uso de una proteasa como se define en la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de insuficiencia pancreática exocrina.
5. Uso según la reivindicación 4, comprendiendo
además el uso de una lipasa o una amilasa.
6. Uso según la reivindicación 4, comprendiendo
además el uso de una lipasa y una amilasa.
7. Composición farmacéutica comprendiendo una
proteasa como se define en la reivindicación 1, preferiblemente en
forma de un concentrado sólido, junto con al menos un material
auxiliar farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de
insuficiencia pancreática exocrina.
8. Composición según la reivindicación 7,
comprendiendo además una lipasa o una amilasa, preferiblemente en
forma de un concentrado sólido.
9. Composición según la reivindicación 7,
comprendiendo además una lipasa y una amilasa, preferiblemente en
forma de concentrado sólido.
10. Proteasa según la reivindicación 1 para el
uso en el tratamiento de insuficiencia pancreática exocrina.
11. Proteasa según la reivindicación 10,
comprendiendo además el uso de una lipasa o una amilasa.
12. Proteasa según la reivindicación 10,
comprendiendo además el uso de una lipasa y una amilasa.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200400810 | 2004-05-24 | ||
| DK200400810 | 2004-05-24 | ||
| DK200500101 | 2005-01-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2349086T3 true ES2349086T3 (es) | 2010-12-27 |
Family
ID=38063663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05744343T Active ES2349086T3 (es) | 2004-05-24 | 2005-05-24 | Enzimas para uso farmacéutico. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1956728A (es) |
| ES (1) | ES2349086T3 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010094773A2 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Novozymes A/S | A brewing method |
-
2005
- 2005-05-24 ES ES05744343T patent/ES2349086T3/es active Active
- 2005-05-24 CN CNA2005800166839A patent/CN1956728A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1956728A (zh) | 2007-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2389504C2 (ru) | Ферменты для фармацевтического применения | |
| US8017351B2 (en) | Amylases for pharmaceutical use | |
| US20090047266A1 (en) | Lipases for Pharmaceutical Use | |
| RU2420578C2 (ru) | Протеазы для фармацевтического применения | |
| RU2385736C2 (ru) | Композиции, содержащие липазу, протеазу и амилазу, предназначенные для лечения недостаточности поджелудочной железы | |
| US8455235B2 (en) | Protease variants for pharmaceutical use | |
| ES2349086T3 (es) | Enzimas para uso farmacéutico. |