BR0108164B1 - Uso de pelo menos uma protease estável em ácido, processo para melhorar o valor nutritivo de um alimento para animal, aditivo de alimento para animal, composição de alimento para animal, e, processo para tratar proteínas vegetais para uso em alimento para animal. - Google Patents

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“USO DE PELO MENOS UMA PROTEASE ESTÁVEL EM ÁCIDO, PROCESSO PARA MELHORAR O VALOR NUTRITIVO DE UM

ALIMENTO PARA ANIMAL, ADITIVO DE ALIMENTO PARA ANIMAL, COMPOSIÇÃO DE ALIMENTO PARA ANIMAL, E, PROCESSO PARA TRATAR PROTEÍNAS VEGETAIS PARA USO EM ALIMENTO PARA ANIMAL”.

Campo Técnico A presente invenção está relacionada ao uso de proteases estáveis em ácido em alimento para animal (in vivo), e ao uso dessas proteases para o tratamento de proteínas vegetais (in vitro).

As proteínas são fatores nutricionais essenciais para animais e humanos. A maior parte das criações e muitos seres humanos obtêm as proteínas necessárias de fontes de proteína vegetais. Importantes fontes de proteínas vegetais são as plantações de sementes oleaginosas, legumes e cereais.

Quando, e.g., a comida de soja é incluída na alimentação de animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas, uma significativa proporção dos sólidos da comida de soja não é digerida. E.g., a digestibilidade da proteína ideal aparente em leitões e porcos em crescimento é de somente em tomo de 80 %. O estômago dos animais monogástricos e de muitos peixes apresentam um pH fortemente ácido. Entretanto, a maior parte da digestão da proteína ocorre no pequeno intestino. Existe portanto a necessidade para uma protease estável em ácido que possa sobreviver à passagem pelo estômago.

Fundamentos da Tecnologia O uso de proteases no alimento para animal, ou para tratamento de proteínas vegetais, é de conhecimento pelos seguintes documentos: O WO95/28850 divulga i.a. um aditivo de alimento para animal que compreende uma fitase e uma enzima proteolítica. Diversas enzimas proteolíticas se acham especificadas na pg. 7. O WO96/05739 divulga um aditivo de alimento para enzima que compreende xilanase e uma protease. As proteases apropriadas se encontram listadas na pg. 25. O W095/02044 divulga i.a. proteases derivadas de Aspergilus aculeatus, bem como o uso do mesmo em alimento para animal. A US 3966971 divulga um processo para a obtenção de proteína de uma fonte de proteína vegetal pelo tratamento com uma fitase ácida e, opcionalmente, uma enzima proteolítica. As proteases apropriadas estão especificadas na coluna 2.

As US 4073884, US 5047240, US 3868448, US 3823072 e a US 3683069 descrevem preparações de proteases derivadas de diversas variedades de Streptomices e seus usos em alimento para animal.

Essas proteases entretanto não são estáveis em ácido e/ou não são homólogas às proteases aqui descritas.

Descrição Resumida da Invenção Foram agora identificadas proteases que foram achadas como sendo muito estáveis em ácido e, presumidamente de desempenho melhorado no alimento para animal.

Descrição Resumida dos Desenhos A presente invenção é ilustrada ainda mais tendo como referência os desenhos que acompanham, nos quais: A Fig. 1 mostra curvas pH - estabilidade, i.e., a atividade residual de protease de cinco proteases (duas proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis, e três proteases de referência (Sub.Novo, e Sub.Novo (Y217L), ambas derivadas de Bacillus amiloliquefaciens, e SAVTNASE™) após incubação por 2 horas, a uma temperatura de 37° C, e valores de pH na faixa de pH 2 a pH 11; a atividade é relativa à atividade residual após uma incubação de 2 horas em um pH 9,0, e a 5o C; A Fig. 2 mostra curvas pH - atividade, i.e, a atividade de protease entre pH 3 e pH 11, em relação à atividade protease em um pH ótimo, das mesmas cinco proteases; e A Fig. 3 mostra curvas temperatura - atividade no pH 9,0, i.e., a atividade de protease no pH 9,0 entre 15° C e 80° C, em relação à atividade de protease na temperatura ótima, das mesmas cinco proteases.

Descrição Detalhada da Invenção O termo protease conforme aqui utilizado é uma enzima que hidrolisa ligações peptídeo (possui atividade protease). As proteases são também denominadas, e.g., peptidases, proteinases, hidrolases de peptídeo, ou ainda enzimas proteolíticas.

As proteases preferidas para uso de acordo com a invenção são o tipo endo- que atuam intemamente nas cadeias de polipeptídios (endopeptidases). As endopeptidases apresentam atividade nos substratos peptídeos bloqueados terminalmente em N- e C- que são relevantes para especificidade da protease em questão.

Estão incluídas na definição acima de protease quaisquer enzimas pertencentes ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das treze sub-classes das mesmas) da lista EC (“Enzyme Nomenclature” 1992, da NC-IUBMB, 1992), conforme se apresenta regularmente suplementada e atualizada, ver e.g., pela Internet (WWW - World Wide Web) em http: //www. chem. gmw. ac .uk/iubmb/enzyme/index .html.

As proteases são classificadas na base dos seus mecanismos catalíticos nos seguintes grupamentos: proteases serinas (S), proteases cisteínas (C), proteases aspárticas (A), metalo-proteases (M), ou desconhecidas, ou também como proteases não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F.

Woessner (eds.), Academic Press (1998), em particular a parte de introdução geral.

As proteases Nocardiopsis aqui divulgadas são proteases serinas.

Em uma forma de realização particular as proteases para uso de acordo com a invenção são proteases serinas. O termo protease serina se refere a peptidases serinas e sua clã conforme se acha definido no Livro de Texto acima. Na versão de 1998 deste livro de texto, as peptidases serinas e sua clã são tratadas nos capítulos 1-175. As proteases serinas podem ser definidas como peptidases nas quais o mecanismo catalítico depende do grupo hidroxila de um radical serina atuando como o nucleófilo que ataca a ligação peptídeo. Os exemplos de proteases serinas para uso de acordo com a invenção são proteases da Clan SE, e.g., Família S2 (Streptogrisin), e.g., Sub- família S2A (protease alfa-litica), conforme definido no livro de texto acima. A atividade da protease pode ser medida utilizando qualquer ensaio, na qual um substrato é empregado, que inclui ligações peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O ensaio no pH e o ensaio na temperatura devem ser da mesma forma adaptados para a protease em questão. Os exemplos de valores para ensaio no pH são pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Os exemplos para ensaio na temperatura são 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70° C.

Os exemplos de substratos de protease são caseína e substratos pNA, tal como o Suc-AAPF-pNA (disponível da Sigma S-7388). As letras maiúsculas neste substrato pNA se referem ao código de uma letra do aminoácido. Outro exemplo é a Protazima AK (caseína reticulada tingida de azurina preparada na forma de comprimidos pela Megazyme T-PRAK). Para os estudos de atividade no pH e estabilidade no pH, o substrato pNA é o preferido, ao passo que para os estudos de atividade na temperatura, o substrato Protazima AK é preferido.

Os exemplos de ensaios de protease estão descritos na parte experimental. Não existem limitações no que se refere à origem da protease para uso de acordo com a invenção. Assim sendo, o termo protease inclui não somente as proteases naturais ou do tipo silvestre, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos, etc., das mesmas, que apresentam atividade de protease, bem como as proteases sintéticas, tais como as proteases misturadas e proteases de consenso. Essas proteases geneticamente engenheiradas podem ser preparadas como é de conhecimento geral nesta tecnologia, e.g., por Mutagênese direcionada a local, por PCR (usando um fragmento PCR contendo a mutação desejada como uma das bases nas reações de PCR), ou por Mutagênese Aleatória. A preparação de proteínas de consenso está descrita na, e.g., EP 897985.

Os exemplos de proteases estáveis em ácido para uso de acordo com a invenção são (i) as proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; (ii) as proteases com pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95 % de identidade de aminoácido a qualquer uma das proteases de (i); (iii) as proteases com pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95 % de identidade com qualquer uma de SEQ ID NO: 1, e/ou SEQ ID NO: 2.

Para o cálculo do percentual de identidade qualquer programa de computador conhecido nesta tecnologia poderá ser usado. Os exemplos desses programas de computador são o algoritmo Clustal V (Higgins, D.G., e Sharp, P.M. (1989), Gene (Amsterdam), 73, 237-244; e o programa GAP proporcionado no pacote de programa GCG versão 8 (Manual de Programa para o Wisconsin Package, Versão 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453.

Quando usado o algoritmo Clustal V para o cálculo do percentual de identidade entre duas seqüências de proteína, uma tabela de peso de resíduos PAM250 é usada, juntamente com as calibrações de ausência do programa MegAlign, v4.03, no pacote de software Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, US).

As calibrações de ausência para alinhamentos múltiplos são uma penalidade 10 de espaçamento e uma penalidade 10 de comprimento de espaçamento.

Para o cálculo do percentual de identidade entre duas seqüências de proteína as seguintes calibrações são usadas: Ktuple de 1, penalidade de espaçamento de 3, janela de 5 e 5 diagonais salvadas.

Quando usado o GAP, as seguintes calibrações são aplicadas para a comparação da seqüência polipeptídio: penalidade de criação GAP de 5,0 e penalidade de extensão GAP de 0,3.

Em uma forma de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção é uma protease microbiana, o termo microbiana indicando que a protease é derivada de, ou se origina de, um microrganismo, ou é um análogo, um fragmento, uma variante, um mutante ou uma protease sintética derivada de um microrganismo. Ela pode ser produzida ou expressa na variedade microbiana do tipo silvestre original, em outra variedade microbiana, ou em uma planta; i.e, o termo cobre a expressão de proteases de ocorrência natural de tipo silvestre, bem como a expressão em quaisquer hospedeiros de proteases sintéticas ou geneticamente engenheiradas, recombinantes. O termo microrganismo conforme aqui usado inclui Archaea, bactéria, fungi, vira, etc.

Os exemplos de microrganismos são bactérias, e.g., bactérias do phylum Actinobacteria phy.nov., e.g., da classe I: Actinobacteria, e.g., da Subclasse V: Actinobacteridae, e.g., da Ordem I: Actinomicetales, e.g., da Subordem XII: Streptosporangineae, e.g., da Família II: Nocardiopsaceae, e.g., do Genus I: Nocardiopsis, e.g., Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; ou mutantes ou variantes dos mesmos apresentando atividade de protease. Esta taxonomia é na base do “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”, 2a edição, 2000, Springer (impressão prévia: “Road Map to Bergey’s”).

Outros exemplos de microrganismos são os fungos, tais como leveduras ou fungos filamentosos.

Em outra forma de realização a protease é uma protease de planta. Um exemplo de protease de origem em planta é a protease do sarcocarpo ou fruta melão (Kaneda et al., J. Biochem. 78, 1287-1296 (1975). O termo animal inclui todos os animais, incluindo os seres humanos. Os exemplos de animais são os não ruminantes e os ruminantes, tais como vacas, carneiros e cavalos. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem os animais monogástricos, e.g., porcos ou suínos (incluindo, mas não limitado a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus e frangos (incluindo, mas não limitado a frangos para corte, poedeiras); bezerros; e peixes (incluindo, mas não limitado a, salmão). O termo alimento ou composição de alimento significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição apropriada, ou pretendida, para ser comida por um animal.

No uso de acordo com a invenção a protease pode ser alimentada ao animal antes, depois ou simultaneamente com a dieta. Este último modo é o preferido.

No presente contexto, o termo estável em ácido significa que, a atividade da protease da enzima protease pura, em uma diluição correspondendo a A2so = 1,0, e seguindo uma incubação por 2 horas a 37° C na seguinte solução tampão: 100 mM de ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X- 100, pH 3,5, é de pelo menos 40 % da atividade de referência, conforme medido usando o ensaio descrito no Exemplo 2C aqui (substrato: Suc-AAPF- pNA, pH 9,0, 25° C).

Em formas de realização particulares da definição acima de estabilidade em ácido, a atividade da protease é de pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos 97 % da atividade de referência. O termo atividade de referência se refere à atividade de protease da mesma protease, em seguida à incubação em uma forma pura, em uma diluição correspondendo a A280 = 1,0, por 2 horas a 5o C na seguinte solução tampão: 100 mM de ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X-100, pH 9,0, onde a atividade é determinada conforme acima descrito.

Em outras palavras, o processo para a determinação da estabilidade em ácido compreende as seguintes etapas: a) a amostra de protease a ser testada (na forma pura, A280 = 1,0) é dividida em duas alíquotas (I e II); b) a alíquota I é incubada por 2 horas a 37° C e pH 3,5; c) a atividade residual da alíquota I é medida (pH 9,0 e 25° C); d) a alíquota II é incubada por 2 horas a 5o C e pH 9,0; e) a atividade residual da alíquota II é medida (pH 9,0 e 25° C); f) o percentual da atividade residual da alíquota I em relação à atividade residual da alíquota II é calculada.

De uma forma alternativa, na definição acima de estabilidade em ácido, o valor do pH do tampão da etapa b) poderá ser de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5,3,0,3,1,3,2,3,3 ou 3,4.

Em outras formas de realização alternativas da definição acima de estabilidade em ácido em relação aos valores de pH do tampão da etapa b) alternativa acima, a atividade residual da protease se comparada com a referência, é de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos 97 %.

Em formas de realização alternativas, os valores de pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 ou 8,5 podem ser aplicados para o tampão da etapa d).

Na definição acima de estabilidade em ácido o termo A280 = 1,0 significa uma concentração tal (diluição) da dita protease pura que dá origem a uma absorção de 1,0 a 280 nm em uma cuba com comprimento de caminho de 1 cm, em relação a um tampão em branco. E na definição acima de estabilidade em ácido, o termo protease pura se refere a uma amostra com uma relação A280/A26o como acima ou igual a 1,70 (ver Exemplo 2E), e a qual por uma varredura com um gel SDS-PAGE Coomassie-manchado é medida para apresentar pelo menos 95 % da sua intensidade de varredura na faixa correspondente à dita protease (ver Exemplo 2A). Na alternativa, a relação A280/A260 é, a acima ou igual a 1,50, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1,80, 1,85 ou, a acima ou igual a 1,90.

Entretanto, para os usos de acordo com a invenção, a protease não necessita ser tão pura; ela poderá incluir, e.g., outras enzimas, e mesmo outras proteases, sendo que neste caso ela poderia ser denominada como uma preparação de protease. Não obstante, é vantajoso uma preparação de protease bem definida. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente a um alimento uma protease que esteja essencialmente livre de interferir ou contaminar outras proteases. O termo dosar corretamente se refere em particular ao objetivo de serem obtidos resultados consistentes e constantes, e a capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Em uma forma de realização particular, a protease, na forma pela qual ela é adicionada à alimentação, ou quando está sendo incluída em um aditivo para alimentação, é bem definida. Bem definida significa que a preparação de protease é pelo menos 50 % pura conforme determinado por cromatografia de exclusão por tamanho (ver Exemplo 8).

Em outras formas de realização particulares, a preparação de protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95 % pura, conforme determinado por este processo.

Em alternativa, o termo bem definida significa que, um fracionamento da preparação de protease em coluna apropriada de exclusão por tamanho, revela somente um componente principal de protease. O trabalhador especializado deverá saber como selecionar uma coluna apropriada para cromatografia de exclusão por tamanho. Ele poderá iniciar com o fracionamento da preparação em uma, e.g., coluna HiLoad26/60 Superdex75pg da Amersham Pharmacia Biotech (ver Exemplo 8). Caso os picos não fiquem claramente separados ele poderá tentar colunas diferentes (e.g., com uma coluna de tamanho de partícula e/ou comprimento de coluna emendados), e/ou ele podería corrigir o volume da amostra. Por meio de processos simples e comuns de tentativa-e-erro ele poderá chegar deste modo a uma coluna com suficiente resolução (clara separação dos picos) na base da qual o cálculo da pureza seja levado a efeito conforme descrito no Exemplo 8. A preparação de protease pode ser (a) adicionada diretamente ao alimento (ou usada diretamente no processo de tratamento das proteínas vegetais), ou (b) ele poderá ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos de alimentos ou pré-misturas que sejam em seguida adicionadas ao alimento (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza da preparação de protease original, usada de acordo tanto como (a) ou como (b) acima.

As preparações de protease com purezas desta ordem de magnitude podem ser obtidas em particular usando processos recombinantes de produção, ao passo que elas não são tão facilmente obtidas, e ainda sujeitas a uma variação muito maior de batelada para batelada, quando a protease é produzida pelos processos tradicionais de fermentação.

Essa preparação de protease poderá ser naturalmente misturada com outras enzimas.

Em uma forma de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção, além de ser estável em ácido, possui também uma atividade no pH ótimo próxima do neutro. O termo atividade no pH ótimo próxima do neutro significa um ou mais do que se segue: que o pH ótimo se acha no intervalo de pH 6.Ο- Ι 1,0, ou pH 7,0-11,0, ou pH 6,0-10,0, ou pH 7,0-10,0, ou pH 8,0-11,0, ou pH 8,0-10,0 (ver Exemplo 2B e Figura 2 aqui).

Em outra forma de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção, além de ser estável em ácido, é também termoestável. O termo termoestável significa um ou mais do que se segue: que a temperatura ótima é de pelo menos 50° C, 52° C, 54° C, 56° C, 58° C, 60° C, 62° C, 64° C, 66° C, 68° C ou pelo menos 70° C, sendo feita referência ao Exemplo 2D e Figura 3 aqui.

Em outra forma de realização particular, a protease para uso de acordo com a invenção é capaz de solubilizar proteínas vegetais de acordo de acordo com o modelo in vitro do Exemplo 4 aqui. O termo proteínas vegetais conforme aqui usado se refere a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclua pelo menos uma proteína derivada ou que se origina de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteínas. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 % (p/p).

As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tais como legumes e cereais, como por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosas), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tal como comida de soja, comida de tremoço e comida de colza..

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae tal como soja, tremoço, ervilha ou feijão.

Em outra forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, e.g., beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quenopódio.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetais são a colza e repolho. A soja é uma fonte preferida de proteína vegetal.

Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são os cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz e sorgo. O tratamento de acordo com a invenção de proteínas vegetais com pelo menos uma protease estável em ácido resulta em uma solubilização aumentada das proteínas de vegetais. O que se segue são exemplos do % de proteína solubilizada que pode ser obtido usando as proteases da invenção: pelo menos 74,0 %, 74,5 %, 75,0 %, 75,5 %, 76,0 %, 76,5 %, 77,0 % ou pelo menos 77,5 %, sendo feita referência ao modelo in vitro do Exemplo 4 aqui. O termo solubilização de proteínas significa basicamente levar a(s) proteína(s) a uma solução. Essa solubilização pode ser devido à liberação mediada por protease da proteína de outros componentes de composições naturais usualmente complexas tal como os alimentos. A solubilização pode ser medida como um aumento na quantidade de proteínas solúveis, tendo como referência uma amostra sem tratamento com protease (ver Exemplo 4 aqui).

Em uma forma de realização particular de um processo de tratamento a protease(s) em questão se encontra afetando (ou atuando sobre, ou exercendo a sua influência de solubilização nas proteínas vegetais ou fontes de proteínas. Para isto ser obtido, a proteína vegetal ou a fonte de proteína é colocada tipicamente em suspensão em um solvente, e.g., um solvente aquoso tal como água, sendo os valores de pH e temperatura ajustados levando em devida consideração as características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento poderá ocorrer em um valor de pH no qual a atividade relativa da presente protease é de pelo menos 50, ou 60, ou 70, ou 80 ou 90 %. Do mesmo modo, por exemplo, o tratamento poderá ocorrer em uma temperatura na qual a atividade relativa da presente protease é de pelo menos 50, ou 60, ou 70, ou 80, ou 90 % (estas atividades relativas estando definidas como no Exemplo 2 aqui). A reação enzimática é continuada até que o resultado desejado seja obtido, em seguida ao qual ela pode ser ou não interrompida pela inativação da enzima, e.g., por meio de uma etapa de tratamento por calor.

Em outra forma de realização particular de um processo de tratamento da invenção, a ação da protease é sustentada, significando, e.g., que a protease é adicionada às proteínas vegetais ou fontes de proteínas, mas a sua influência solubilizante não é, por assim dizer, ligada, até mais tarde quando desejado, uma vez estando estabelecidas as condições adequadas de solubilização, ou uma vez estando inativados quaisquer inibidores de enzima, ou quaisquer outros meios que possam ter sido aplicados para postergar a ação da enzima.

Em uma forma de realização o tratamento é um pré-tratamento do alimento para animal ou das proteínas vegetais para uso no alimento para animal, i.e., as proteínas são solubilizadas antes de serem ingeridas. O termo melhorar o valor nutritivo de um alimento para animal significa melhorar a disponibilidade de proteínas, levando deste modo a uma extração aumentada de proteínas, a produções mais elevadas de proteínas e/ou uma utilização melhorada da proteína. O valor nutritivo do alimento é portanto aumentado, e a razão de crescimento e/ou o ganho de peso e/ou a conversão do alimento (i.e., o peso de alimento ingerido em relação ao ganho de peso) do animal é/são melhorados. A protease pode ser adicionada ao alimento em qualquer forma, seja ela como uma protease relativamente pura, ou em mistura com outros componentes pretendidos para adição ao alimento para animal, i.e., na forma de aditivos de alimento de animais, tal como as assim denominadas pré-misturas para alimentos de animais.

Aditivos de alimentos para animais Λ A parte da protease estável em ácido, os aditivos de alimentos para animais da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral em traços, e/ou pelo menos um macro mineral.

Outros, opcionais, ingredientes aditivos de alimento são agentes colorantes, compostos para aroma, estabilizantes e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada entre as fitases EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26;

xilanases EC 3.2.1.8; galactanases EC 3.2.1.89; e/ou beta-glucanases EC 3.2.1.4 (EC se refere a Classes de Enzima de acordo com a “Enzyme Nomenclature” 1992 da NC-IUBMB, 1992), ver também a Internet (WWW - World Wide Web) em http://www.chem.gmw.ac.uk/iubmb/enzvme/index.html.

Em uma forma de realização particular essas outras enzimas são bem definidas (conforme definidas e exemplificadas acima para preparações de protease, i.e., com referência ao Exemplo 8).

Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura ou em água, bem como os minerais em traços formam parte de uma assim denominada pré-mistura pretendida para adição ao alimento, ao passo que os minerais macro são usualmente adicionados em separado. Cada um desses tipos de composições, quando enriquecidas com uma protease estável em ácido de acordo com a invenção, é um aditivo para alimento para animais, da invenção.

Em uma forma de realização particular, o aditivo de alimento para animal da invenção é pretendido para ser incluído (ou prescrito como para ser incluído) em dietas para animais ou alimentos em níveis de 0,01 - 10,0 %, e mais particularmente de 0,05 - 5,0 %; ou de 0,2 - 1,0 % (% significando g de aditivo por 100 g de alimento). Isto é também em particular para as pré-misturas.

Em conseqüência, as concentrações dos componentes individuais do aditivo para alimento de animais, e.g., a pré-mistura, podem ser obtidas pela multiplicação da concentração final no alimento do mesmo componente por, respectivamente, 10 - 10000; 20 - 2000; ou 100 - 500 (com referência aos acima três intervalos percentuais de inclusão).

As linhas básicas para as concentrações finais desejadas, i.e., as concentrações no alimento, desses componentes individuais de alimento e aditivos de alimento, se encontram indicadas na Tabela A abaixo. O que se segue são listas não exclusivas de exemplos desses componentes: Os exemplos de vitaminas solúveis em gordura são a vitamina A, vitamina D3, vitamina E e a vitamina K, e.g., a vitamina K3.

Os exemplos de vitaminas solúveis em água são a vitamina BI2, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, e.g., pantotenato-D-Ca.

Os exemplos de minerais em traços são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Os exemplos de minerais macro são cálcio, fósforo e sódio.

Os requerimentos nutritivos desses componentes exemplificado com aves domésticas e leitões/porcos - se acham listados na Tabela A abaixo. Requerimento nutritivo significa que esses componentes deverão ser proporcionados na dieta nas concentrações indicadas. Estes dados são compilados de: NRC, requerimento de nutrientes de suínos, nona edição revisada 1988, subcomitê em nutrição suína, comitê em nutrição animal, conselho de agricultura, conselho nacional de pesquisa. National Academy Press, Washington, D.C., 1988; e NRC, requerimento de nutrientes de aves domésticas, nona edição revisada 1994, subcomitê em nutrição de aves domésticas, comitê em nutrição animal, conselho de agricultura, conselho nacional de pesquisa.

National Academy Press, Washington, D.C., 1994.

Em alternativa, o aditivo de alimento para animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A. Pelo menos um significa um de, um ou mais de um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais.

De um modo mais especifico, este pelo menos um componente individual se acha incluído no aditivo da invenção em uma quantidade tal de modo a proporcionar uma concentração no alimento dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco ou na coluna seis da Tabela A.

Conforme acima explicado, as concentrações correspondentes no aditivo para alimento podem ser obtidas pela multiplicação dos limites de intervalo dessas faixas por 10-10000; 20-2000 ou 100-500. Como um exemplo, considerando qual teor na pré-mistura de vitamina A deverá corresponder ao teor no alimento de 10-10000 IU/kg, esse exercício deverá levar aos seguintes intervalos: 100-108 IU; ou 200-2 x 107 IU ou 1000-5 x 106 IU por kg de aditivo.

Tabela A

Requerimentos de Nutrientes - e faixas preferidas Composições de alimento para animais As composições de alimento para animais ou dietas possuem um teor relativamente elevado de proteína. De acordo com as publicações do National Research Council (NRC) referidas acima, as dietas para aves domésticas e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B abaixo, colunas 2-3. As dietas para peixes podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 da Tabela B. Além disso essas dietas para peixes possuem usualmente um teor bruto de gordura de 200-310 g/kg. Essas dietas para peixes são exemplificadas com dietas para Salmonideos e são projetadas com base no “princípios e práticas de Aquacultura”, ed. T.V.R Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; “Fish nutrition”, segunda edição, ed. John E. Halver, Academic Press Inc., 1989.

Uma composição de alimento para animal de acordo com a invenção possui um teor bruto de proteína de 50-800 g/kg, e além disso compreende pelo menos uma protease conforme aqui reivindicado.

Além disso, ou em alternativa (ao teor bruto de proteína indicado acima), a composição de alimento para animal da invenção possui um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

Em formas de realização particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina se acha dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B abaixo (R. 2-5). A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, i.e., Proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25, conforme estabelecido no “Animal Nutrition”, 4a edição, Capítulo 13 (Eds. P.

McDonald, R.A. Edwards e J.F.D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). O teor de nitrogênio é determinado pelo processo de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC). A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação do NRC, Nutrient Requirements of Swine (1988) pgs. 2-6, e da European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen, ISBN 90-71463-12-5. O teor nas dietas, de cálcio, fósforo e aminoácidos em dietas completas para animais é calculado com base nas tabelas de alimentos tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pkLelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de alimento para animais da invenção contém pelo menos uma proteína ou fonte de proteína vegetal, conforme definido acima.

Em ainda outras formas de realização particulares, a composição de alimento para animais da invenção contém 0-80 % de milho; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0- 30 % de aveia; e/ou 0-40 % de comida de soja; e/ou 0-10 % de comida de peixe; e/ou 0-20 % de soro de leite.

As dietas para animais podem ser fabricadas, e.g., como um alimento em massa (não pelotizado) ou um alimento pelotizado. Tipicamente, os materiais do alimento moídos são misturados e as quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzima sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação sólida de enzima é adicionada tipicamente antes ou durante a etapa de mistura; e uma preparação líquida de enzima é adicionada tipicamente após a etapa de pelotização. A enzima poderá ser incorporada também em um aditivo de alimento ou em uma pré-mistura. A concentração final de enzima na dieta se acha dentro da faixa de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg da dieta, por exemplo na faixa de 5-30 mg de proteína de enzima por kg da dieta para animais.

Exemplos de composições de alimento para animais estão mostrados no Exemplo 7.

Tabela B

Faixas de valores para energia, proteína e minerais em dietas para animais Em formas de realização particulares do processo da invenção para o tratamento de proteínas vegetais, uma etapa adicional de adicionar fitase é ainda incluída. E em outras formas de realização particulares, em adição a tratamento combinado com fitase e protease, outras enzimas poderão ser adicionadas também, onde essas enzimas são selecionadas do grupo que compreende outras proteases, fitases, enzimas lipolíticas e enzimas glucosidase/carbohidrase. Os exemplos dessas enzimas estão indicados no WO95/28850. A protease deverá ser aplicada, naturalmente, em uma quantidade efetiva, i.e., em uma quantidade adequada para melhorar a solubilização e/ou melhorar o valor nutritivo do alimento. É contemplado no presente que a enzima é administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01-200; ou 0,01-100; ou 0,05-100; ou 0,05-50; ou 0,10-10 - todas essas faixas sendo em mg de proteína de protease por kg de alimento (ppm).

Para determinar mg de proteína de protease por kg de alimento, a protease é purificada da composição de alimento, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando um ensaio relevante (ver em atividade da protease, substratos e ensaios). A atividade da protease da composição de alimento como tal é determinada também usando o mesmo ensaio e, com base nessas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de protease por kg de alimento é calculada.

Os mesmos princípios se aplicam para a determinação de mg de proteína da protease nos aditivos do alimento.

Naturalmente, caso se ache disponível uma amostra da protease usada para a preparação do aditivo do alimento ou do alimento, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (sem haver necessidade de purificar a protease da composição de alimento ou do aditivo).

Muitos vegetais contêm fatores anti-nutricionais tais como inibidores de lecitina e tripsina. Os fatores anti-nutricionais mais importantes da soja são a aglutinina da lectina da soja (SBA) e o inibidor da tripsina da soja (STI).

As lectinas são proteínas que se ligam a moléculas contendo carbohidratos específicas com uma considerável especificidade e, quando ingeridas, elas se tomam ligadas ao epitélio intestinal. Isto poderá levar a uma viabilidade reduzida das células epiteliais e uma absorção reduzida dos nutrientes. A SBA é uma lectina tetramérica glicosilada com um peso molecular da subunidade de aproximadamente 30 kDa e uma alta afinidade para N-acetilgalactosamina.

Os inibidores de tripsina afetam a proteólise intestinal reduzindo a digestibilidade da proteína, e também aumentam a secreção de enzimas digestivas do pâncreas levando a uma perda de aminoácidos na forma de enzimas digestivas. Um exemplo de um inibidor de tripsina é o inibidor Bowman-Birk, que possui um peso molecular em tomo de 8 kDa, contém 7 pontes bissulfito e possui dois circuitos inibidores específicos para proteases do tipo tripsina e do tipo quimotripsina. Outros exemplos são os assim denominados Inibidores de Fatores Kunitz (e.g., o Inibidor de Tripsina Kunitz de Soja que contém um local de ligação para proteases do tipo tripsina e possui um peso molecular em tomo de 20 kDa).

As proteases para uso de acordo com a invenção têm mostrado hidrolisarem fatores anti-nutricionais como a lecitina SBA, e os inibidores de tripsina Inibidor Bowman Birk e o Fator Kunitz para Soja. Ver a parte experimental, Exemplo 5.

Assim sendo, a invenção está relacionada também ao uso de proteases estáveis em ácido para a hidrólise, ou redução da quantidade, de fatores anti-nutricionais, e.g., lecitina SBA e inibidores de tripsina, tal como o Inibidor Bowman Birk, e Fatores Kunitz, tal como o Fator Kunitz para Soja.

Exemplo 1 Seleção para proteases estáveis em ácido Um grande número de proteases foram analisadas em relação à estabilidade no pH 3, com o objetivo de identificar as proteases que apresentam a estabilidade necessária para passar através do estômago ácido dos animais monogástricos.

As proteases têm sido purificadas por meio de processos cromatográficos convencionais tais como cromatografia por troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão por tamanho (ver, e.g., “Protein Purification, Principies, High Resolution Methods and Applications”. Editores: Jan-Christer Janson, Lars Rydén, VHC

Publishers, 1989). A atividade da protease foi determinada como se segue: a protease foi incubada com caseína Hammarsten a 1,67 % a 25° C, pH 9,0, por 30 minutos, e então TCA (ácido tri-cloro acético) foi adicionado até uma concentração final de 2 % (p/p), e a mistura filtrada para remover o sedimento, sendo o filtrado analisado em relação a grupos amino primários livres (determinado em um ensaio colorimétrico com base em OPA (o-ftal- dialdeído), através da medição da absorbância em 340 nm, usando um padrão serina (“Biochemische Taschenbuch teil II”, Springer-Verlag (1964), pgs. 93 e 102). Uma Unidade de Protease de Caseína (CPU) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 mmol de grupos amino primários solúveis em TCA, por minuto, nas condições padrão, i.e., 25° C e pH 9,5.

As proteases foram diluídas até uma atividade de 0,6 CPU/1 em água e divididas em duas alíquotas sendo que, cada alíquota foi então diluída ainda mais até 0,3 CPU/1 com 100 mM de tampão de citrato, pH 3, e 100 mM de tampão de fosfato, pH 7, respectivamente. As amostras diluídas foram incubadas a 37° C por 1 hora, sendo que 20 μΐ das amostras foram aplicados aos poços, em agarose a 1 %, de placas contendo leite desnatado a 1 %. As placas (pH 7,0) foram incubadas a 37° C durante a noite e as zonas de ajuste medidas.

Diversas proteases tiveram bom desempenho neste ensaio e as duas que se seguem foram agora caracterizadas: as proteases Nocardiopsis alba e a Nocardiopsis sp. NRRL 18282 descritas no exemplo 2. A variedade Nocardiopsis alba foi depositada de acordo com o “Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure” na “DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”, Mascheroder Weg lb, D-38124 BraunSchweig, Alemanha, como se segue.

Data do depósito: 22 de janeiro de 2001 DSM No. : Nocardiopsis alba DSM 14010 O depósito foi feito pela Novozymes A/S e posteriormente cedido para a Hoffmann-La Roche AG.

Exemplo 2 Preparação, caracterização e estudo comparativo das proteases Nocardiopsis Fermentação A Nocardiopsis alba foi inoculada de placas de agar com leveduras triptona em frascos para agitação, cada um contendo 100 ml de meio HG-23 com a seguinte composição: comida de aveia 45 g/1, extrato de leveduras 2 g/1, fosfato de hidrogênio di-sódio 12 g/1, fosfato di-hidrogênio de potássio 6 g/1, Pluronic PE 6100 0,2 ml/1, em água destilada. Essa variedade foi fermentada por 9 dias a 37 graus C.

Purificação O caldo de cultura foi centrifugado a 10000 x g durante 30 minutos em bechers de 1 litro. Os sobrenadantes foram combinados e a seguir clarificados por meio de uma filtração através de uma placa de filtro profunda Seitz K-250. O filtrado clarificado foi concentrado por ultrafiltração em um cassete de poliéter sulfona em corte de 3 kDa (Filtron). A enzima concentrada foi transferida para 50 mM de H3BO3, 5 mM de ácido 3,3’-dimetil glutárico, 1 mM de CaCl2, Ph 7 (Tampão A) em uma coluna Sephadex G25 (Amersham Pharmacia Biotech), e aplicada a uma coluna de agarose Bacitracin (Upffont Chromatography A/S) equilibrada com Tampão A. Após lavagem da coluna Bacitracin com o Tampão A para remover a proteína não ligada, a protease foi eluída da coluna usando o Tampão A suplementado com 2-propanol a 25 % e cloreto de sódio 1M. As frações com atividade de protease foram agrupadas e transferidas para 20 mM de CH3COOH/NaOH, 1 mM de CaCl2, pH 4,5 (Tampão B) por cromatografia em uma coluna Sephadex G25 (Amersham Pharmacia Biotech). O agrupamento de protease trocado com o tampão foi aplicado a uma coluna SOURCE 30S (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada com o Tampão B. Após lavagem da coluna SOURCE 30S com o Tampão B, a protease foi eluída com um gradiente de NaCl linear crescente (0 a 0,25 M) no Tampão B. As frações da coluna foram testadas em relação a atividade de protease e as frações contendo protease foram analisadas por SDS-PAGE. As frações puras foram agrupadas e usadas para caracterização adicional. A protease da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 foi preparada usando processos convencionais, conforme descrito em geral acima para a protease da Nocardiopsis.

Caracterização A protease derivada da Nocardiopsis alba foi descoberta como possuindo um peso molecular de Mr - 21 kDa (SDS-PAGE), e a seqüência de aminoácido (N-terminal (MVS)) parcial a seguir foi determinada: ADIIGGLAYTMGGRCSV (SEQID NO: 2). A protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 possui a seguinte seqüência de 188 aminoácidos: ADIIGGL A YTMGGRC S VGF AATNA AGOPGF VT AGHGG

RVGTQVTIGNGRGVFEQSVFPGNDAAFVRGTSNFTLTNLVSRYNTGG

Y ATV AGHNQAPIGS S V CRSGSTTG WHCGTIQ ARGQS V S YPEGT VTNM

TRTTVCAEPGDSGGSYISGTQAQGVTSGGSGNCRTGGTTFYQEVTPM VNSWGVRLRT (SEQ ID NO: 1) A finalidade dessa caracterização foi a de estudar os seus perfis de estabilidade no pH, atividade no pH e atividade na temperatura, em comparação com as Sub.Novo, Sub.Novo(Y217L) e SAVINASE™.

Sub.Novo é subtilisina do Bacillus amiloliquefaciens, e a Sub.Novo(Y217L) é mutante da mesma que se acha divulgada no WO96/05739. A Sub.Novo foi preparada e purificada de uma cultura de variedade do tipo silvestre usando os processos convencionais, ao passo que o mutante foi preparado conforme descrito nos Exemplos 1-2, e 15-16 da EP 130756. A SAVINASE™ é uma subtilisina derivada do Bacillus clausii (anteriormente Bacillus lentus NCIB 10309), comercialmente disponível da Novozymes A/S, Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca. A sua preparação está descrita na Patente US No. 3723250.

Exemplo 2A

Determinação da pureza SDS-PAGE de amostras de protease A pureza SDS-PAGE de amostras de protease foi determinada por meio do seguinte procedimento: 40 μΐ de solução de protease (concentração A2so = 0,025) foram misturados com 10 μΐ de TCA (ácido tricloro acético) a 50 % (p/v) em um tubo Eppendorf, em gelo. Após meia hora no gelo o tubo foi centrifugado (5 minutos, 0o C, 14000 x g) e o sobrenadante cuidadosamente removido. 20 μΐ de tampão de amostra SDS-PAGE (200 μΐ Tris-Glicina SDS Tampão de Amostra (2x) (125 mM Tris/HCl, pH 6,8, 4 % (p/v) SDS, 50 ppm de azul bromofenol, 20 % (v/v) Glicerol, LC2676 da NOVEX™) + 160 μΐ água destilada + 20 μΐ beta-mercaptoetanol + 20 μΐ de Tris Base não tamponada 3M (Sigma T-1503) foram adicionados ao precipitado e o tubo fervido por 3 minutos. O tubo foi centrifugado por um curto período e 10 μΐ de amostra foram aplicados a um gradiente 4-20 % de gel pré-moldado de Tris-Glicina da NOVEX™ (gel em gradiente de poliacrilamida com base na química de Laemmli mas sem SDS no gel (Laemmli, R.U., (1970) Nature, vol. 227, pgs. 680-685), EC60255). A eletroforese foi conduzida com tampão corrente Tris- Glicina (2,9 g Tris Base, 14,4 g Glicina, 1,0 g SDS, água destilada para 1 litro) em ambos os reservatórios de tampão a uma voltagem constante de 150 V até que o corante de marcação azul bromofenol alcançou o fundo do gel.

Após a eletroforese, o gel foi lavado 3 vezes, 5 minutos de cada vez, com 100 ml de água destilada com uma agitação suave. O gel foi então suavemente agitado com o Reagente de Tingimento Azul Gelcode (produto Comassie G- 250 coloidal da PIERCE, PIERCE cat. No. 24592) por uma hora, e em seguida lavado com agitação suave por 8 a 16 horas com água destilada e diversas mudanças dessa água destilada. Para finalizar, o gel foi seco entre 2 pedaços de celofane. Os géis secos assim foram submetidos a varredura com um varredor Arcus II da AGFA equipado com um programa Fotolook 95 v2.08 e importado para o programa CREAM™ de avaliação de imagem para o Windows (catálogo nos. 990001 e 990005, Kem-En-Tec, Dinamarca) pelo comando File/Acquire com os seguintes ajustes (do Fotolook 95 v2.08): Original = Refletivo, Mode = Cor RGB, resolução do Scan = 240 ppi, resolução de saída =120 lpi, fator de escala = 100 %, Range = Histogram com seleção Global e Min = 0 e Max = 215, ToneCurve = Nenhuma, Sharpness = Nenhuma e Flavor = Nenhum, deste modo produzindo um arquivo de imagem *.img do gel SDS-PAGE, o qual foi usado para avaliação do CREAM™. O arquivo de imagem *.img foi avaliado com o comando no menu Analysis/l-D. Duas linhas de varredura foram colocadas no arquivo de imagem *.img com uma Lane Place Tool: uma linha de varredura de Amostra e uma linha de varredura de Fundo. A linha de varredura de Amostra foi colocada no meio de uma faixa de amostra (com a protease em questão) a partir de logo abaixo da fenda de abertura até logo acima da posição do corante de marcação Azul Bromofenol. A linha de varredura de Fundo foi colocada paralela à linha de varredura da Amostra, mas em uma posição no gel SDS-PAGE em imagem onde nenhuma amostra foi aplicada, os pontos de início e fim para a linha de varredura de Fundo eram perpendiculares aos pontos de início e fim da linha de varredura da Amostra. A linha de varredura do Fundo representa o verdadeiro fundo do gel. A largura e a forma das linhas de varredura não foram ajustadas. A intensidade ao longo das linhas de varredura foram então anotadas com o comando de menu 1-DlScan com uma sensibilidade Média. Usando o comando de menu 1-DIEditor, a varredura de Fundo foi subtraída da varredura de Amostra. A seguir o comando de menu 1-D/Results foi selecionado e o % da Área do pico da protease, conforme calculado pelo programa CREAM™, foi usado como a pureza SDS-PAGE das proteases.

Todas as amostras de protease tinham uma pureza SDS-PAGE de acima de 95 %.

Exemplo 2B

Ensaio de atividade no pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) foi usado para obter os perfis de atividade no pH.

Tampão do ensaio: 100 mM ácido succínico (Merck 1,00682), 100 mM HEPES (Sigma H-3375) 100 mM CHES (Sigma C-2885), 100 mM CABS (Sigma C-5580), 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X-100, ajustado para valores de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou 11,0 com HC1 ou NaOH.

Temperatura do ensaio: 25° C.

Uma amostra de protease de 300 μΐ (diluída em 0,01 % Triton® X-100) foi misturada com 1,5 ml do tampão do ensaio no pH de ensaio respectivo, trazendo o pH da mistura para o pH do tampão do ensaio. A reação foi iniciada pela adição de 1,5 ml de substrato pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DNSO e diluído ainda mais 45x com 0,01 % Triton® X-100) sendo que, após a mistura, o aumento em A405 foi monitorado por meio de um espectrômetro como uma medida da atividade da protease no pH em questão. O ensaio foi repetido com o tampão do ensaio nos outros valores de pH, sendo as medições de atividade plotadas na forma de atividade relativa contra o pH. As atividades relativas foram normalizadas com a atividade mais elevada (pH ótimo), i.e., ajustando a atividade no pH ótimo em 1, ou em 100 %. As amostras de protease foram diluídas para assegurar que todas as medições de atividade se enquadrassem dentro da parte linear da curva dose-resposta para o ensaio.

Exemplo 2C

Ensaio de estabilidade no pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) foi usado para obter os perfis de estabilidade no pH.

Tampão do ensaio: 100 mM ácido sucínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X-100, ajustado para valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou 11,0 com HC1 ou NaOH.

Cada amostra de protease (em 1 mM de ácido sucínico, 2 mM

CaC12, 100 mM NaCl, pH 6,0 e com uma absorção em A280 >10) foi diluída no tampão do ensaio em cada valor de pH testado para A280 = 1,0. As amostras de protease diluídas foram incubadas por 2 horas a 37° C. Após a incubação, as amostras de protease foram diluídas em 100 mM ácido sucínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X-100, e pH 9,0, levando o pH de todas as amostras para o pH 9,0.

Na atividade de medição a seguir, a temperatura era de 25° C.

Uma amostra de protease de 300 μΐ foi misturada com 1,5 ml do tampão do ensaio no pH 9,0 sendo que a reação de atividade foi iniciada pela adição de 1,5 ml de substrato pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DNSO e diluído ainda mais 45x com 0,01 % Triton® X-100) e, após a mistura, o aumento em A405 foi monitorado por meio de um espectrômetro como uma medida da atividade da protease residual. A incubação a 37° C foi levada a efeito nos diferentes valores de pH e as medições de atividade foram plotadas na forma de atividades residuais contra o pH. As atividades residuais foram normalizadas com a atividade de uma incubação paralela (controle), onde a protease foi diluída para A280 = 1,0 no tampão do ensaio no pH 9,0 e, incubada por 2 horas a 5o C antes da medição da atividade, como as outras incubações. As amostras de protease foram diluídas antes da medição da atividade com a finalidade de assegurar que todas as medições de atividade estivessem enquadradas dentro da parte linear da curva dose-resposta para o ensaio.

Exemplo 2D

Ensaio de atividade na temperatura Comprimidos de Protazyme AK foram usados para a obtenção dos perfis de temperatura. Os comprimidos de protazyme AK são caseína reticulada tingidas com azurina preparada na forma de comprimidos pela Megazyme.

Tampão do ensaio: 100 mM ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KC1, 0,01 % Triton® X-100, ajustado para pH 9,0 com NaOH.

Um comprimido de Protazyme AK foi posto em suspensão em 2,0 ml de 0,01 % Triton® X-100, com agitação suave. 50 μΐ desta suspensão e 500 μΐ do tampão do ensaio foram misturados em um tubo Eppendorf que foi colocado em gelo. Foram adicionados 20 μΐ da amostra de protease (diluídos em 0,01 % Triton® X-100). O ensaio foi iniciado transferindo o tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, o qual foi ajustado para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado por 15 minutos no termomisturador Eppendorf na sua razão de agitação mais elevada. Pela transferência do tubo de volta para o banho de gelo, a incubação do ensaio foi interrompida. O tubo foi centrifugado em uma centrífuga gelada durante uns poucos minutos e a A650 do sobrenadante foi lida por meio de um espectrômetro. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez de enzima).

A650 (protease) - A650 (cego) era uma medida da atividade da protease. O ensaio foi conduzido em diferentes temperaturas e as medições de atividade foram plotadas como atividades relativas contra a temperatura de incubação.

As atividades relativas foram normalizadas com a atividade mais elevada (temperatura ótima). As amostras de protease foram diluídas para assegurar que todas as medições de atividade estivessem enquadradas dentro da parte linear da curva dose-resposta para o ensaio.

Uma vista geral da atividade ótima (atividade no pH e na temperatura) pode ser observada na Tabela 1. Os perfis de estabilidade no pH, atividade no pH e atividade na temperatura são vistos nas figuras 1-3, e uma comparação detalhada dos dados pH-estabilidade para as proteases em valores ácidos de pH pode ser vista na Tabela 2.

Tabela 1 pH e temperatura ótimos de diversas proteases Tabela 2 Estabilidade no pH de diversas proteases, entre pH 2.0 e 5.0 Exemplo 2E

Pureza da absorção de amostras de protease purificada Determinação da relação AWAmi A relação A280/A26o de amostras de protease purificada foi determinada como se segue. A260 significa a absorção de uma amostra de protease em 260 nm em uma cuba com comprimento de percurso de 1 cm em relação a um tampão em branco. A280 significa a absorção da mesma amostra de protease em 280 nm em uma cuba com comprimento de percurso de 1 cm em relação a um tampão em branco.

Amostras das proteases purificadas do Exemplo 2 foram diluídas no tampão até que a leitura no espectrômetro em A280 se encontrasse na parte linear da sua curva de resposta. A relação A280/A26o foi determinada a partir das leituras: para a Nocardiopsis sp. NRRL 18262, 1,83, e para a Nocardiopsis alba, 1,75.

Exemplo 3 Capacidade da protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 em degradar partes insolúveis de Comida de Soia ÍSBM) A protease da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 foi testada em relação à sua capacidade de tomar as partes insolúveis/não digeríveis da SBM acessíveis às enzimas digestivas e/ou enzimas exógenas adicionadas. O seu desempenho foi comparado com duas proteases aspartato, Protease I e Protease II, preparadas conforme descrito no WO

95/02044. Este documento divulga também o seu uso em alimentos. A

Protease I é uma protease do tipo Aspergilopepsina II, e a Protease II é uma protease do tipo Aspergilopepsina I (ambas proteases de aspartato, i.e., proteases não subtilisina) de Aspergilus aculeatus (sendo feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima referido). O substrato de teste, o assim denominado resíduo de soja, foi produzido em um processo que imita o trato digestivo dos animais monogástricos, incluindo um tratamento com pepsina em um pH 2, e um tratamento com pancreatina em um pH 7.

Na etapa de tratamento com pancreatina, uma faixa de enzimas comerciais foi adicionada em dosagens elevadas, com a finalidade de degradar os componentes SBM que são acessíveis às enzimas comerciais existentes.

As enzimas a seguir, todas elas disponíveis comercialmente da Novozymes A/S, Dinamarca, foram adicionadas: ALCALASE™ 2,4L, NEUTRASE™ 0,5L, FLAVOURZYME™ 1000L, ENERGEX™ L, BIOFEED™ Plus L, PHYTASE NOVO™ L. A SBM usada foi uma SBM proteína 48 % padrão para alimento, que tinha sido pelotizada.

Após o tratamento somente 5 % da proteína total foi deixada no resíduo de soja resultante.

Protocolo de identificação com FITC O resíduo foi em seguida identificado com FITC (Sensores Moleculares, F-143) como se segue: o resíduo de soja (25 g molhado, ~ 5 g seco) foi posto em suspensão em 100 ml de tampão de carbonato 0,1 M, pH 9, e agitado por 1 hora a 40° C. A suspensão foi resfriada até a temperatura ambiente e tratada com fluoresceina 5-isotiocianato (FITC) durante a noite, no escuro. O sensor não acoplado foi removido por meio de ultrafiltração (corte em Pm 10000).

Ensaio - FITC O resíduo de soja identificado com FITC foi usado para testar a capacidade das proteases em degradar o resíduo de soja, usando o seguinte ensaio: 0,4 ml de amostra da protease (com A2so = 0,1) foram misturados com 0,4 ml de resíduo FITC-soja (suspensão de 10 mg/ml em tampão sódio- fosfato 0,2 M, pH 6,5) a 37° C, e as unidades de fluorescência relativa (RFU 485/535 nm; comprimento de onda de excitação/monitoramento) medidas após 0 horas e após 22 horas de incubação. Antes da determinação das RFU as amostras foram centrifugadas por 1 min a 20000 x G e 250 microlitros de sobrenadante foram transferidos para uma bandeja de micro-titulação preta.

As medições foram conduzidas usando um contador VICTOR 1420 Multilabel (In vitro, Dinamarca). A RFU é descrita em geral por Iain D.

Johnson em : “Introduction to Fluorescence Techniques”, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P.

Haugland, 6a edição, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7).

Uma amostra cega foi preparada pela adição de 0,4 ml de tampão em vez de amostra de enzima. RFUamostra = ARFUamostra - ARFUcego, onde ARFU = RFU (22 horas) - RFU (0 horas).

Os valores FITC resultantes (valores RFUamostra) se acham mostrados na Tabela 3 abaixo. Os valores FITC são geralmente com uma margem de erro de +/- 20000. Ao contrário da Protease I e da Protease II, a protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 degradou o resíduo de soja até uma significativa extensão.

Tabela 3 Capacidade das proteases em degradar resíduo de soia Exemplo 4 Teste in vitro da protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 A protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 foi testada, juntamente com uma protease derivada do Bacilus sp. NCIMB 40484 (“PD498”, preparada como descrito no Exemplo 1 do W093/24623), e juntamente com FLAVOURZYME™, uma preparação de enzima contendo protease do Aspergilus orizae (disponível comercialmente da Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), em relação à sua capacidade de solubilizar proteínas de milho-SBM (milho-Comida de Soja), em um sistema de digestão in vitro (que simula a digestão em animais monogástricos). Para os tratamentos em branco, o milho-SBM foi incubado na ausência de proteases exógenas.

Esboço do modelo in vitro Substrato Foram usados 10 g da dieta milho-SBM com uma relação milho-SBM de 6:4 (p/p). O teor de proteína era de 43 % (p/p) na SBM e 8,2 % (p/p) na comida de milho. A quantidade total de proteína em 10 g da dieta milho-SBM era de 2,21 g.

Enzimas digestivas Pepsina (Sigma P-7000; 539 U/mg, sólida), pancreatina (Sigma P-7545; 8xUSP (US Pharmacopeia)).

Determinação da proteína de enzima A quantidade de proteína de enzima na protease é calculada na base dos valores A280 e das seqüências de aminoácidos (composições de aminoácidos) usando os princípios delineados em S.C. Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989).

Procedimento experimental para o modelo in vitro 1. 10 g do substrato são pesados dentro de um frasco de 100 ml. 2. No tempo 0 min, 46 ml de HC1 (0,1 M) contendo pepsina (3000 U/g de dieta) e 1 ml de protease (0,1 mg de proteína de enzima/g de dieta, exceto para FLAVOURZYME™: 3,3 mg/g de dieta) são adicionados ao frasco com agitação. O frasco é incubado a 40° C. 3. No tempo 20-25 min, o pH é medido. 4. No tempo 45 min, 16 ml de H20 são adicionados. 5. No tempo 60 min, 7 ml de NaOH (0,4 M) são adicionados. 6. No tempo 80 min, 5 ml de NaHCCb (1 M) contendo pancreatina (8,0 mg/g de dieta) são adicionados. 7. No tempo 90 min, o pH é medido. 8. No tempo 300 min, o pH é medido. 9. No tempo 320 min, alíquotas de 30 ml são removidas e centrifugadas (10000 x g, 10 min, 0o C). 10. O total de proteína solúvel nos sobrenadantes é determinado.

Determinação da proteína Os sobrenadantes são analisados em relação ao teor de proteína utilizando o processo Kjeldahl (determinação do % de nitrogênio; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC). Cálculos Para todas as amostras, a solubilidade da proteína in vitro foi calculada usando as equações abaixo.

Quantidade de proteína na amostra da dieta: 22,1 % de 10 g = 2,21 g.

Caso toda a proteína se solubilizasse nos 75 ml do líquido, a concentração da proteína no sobrenadante seria de: 2,21 g/75 ml % 2,95 %.

Deve ser observado que os sobrenadantes incluem também as enzimas digestivas e exógenas. Com a finalidade de determinar a solubilidade, a contribuição de proteínas das enzimas digestivas e exógenas deverá ser subtraída das concentrações de proteína nos sobrenadantes sempre que possível.

% de proteína da pancreatina (X mg/g de dieta) e pepsina (Y U/g de dieta = ((X mg pancreatina/g de dieta x 10 g de dieta x 0,69 x 100%)/(1000 mg/g x 75 g)) + ((YU pepsina/g de dieta x 10 g de dieta x 0,57 χ 100%)/(539 U/mg χ 1000 mg/g χ 75 g)), onde 0,69 e 0,57 se referem aos teores de proteína nas preparações de pancreatina e pepsina usadas (i.e., 69 % da pancreatina, e 57 % da pepsina é proteína, como determinado pelo processo de Kjeldahl acima referido). % de proteína de enzimas exógenas (Z mg EP/g de dieta) = (Z mg EP/g de dieta x 10 g de dieta χ 100%)/(1000 mg/g x 75 g) % de proteína corrigido no sobrenadante = % de proteína no sobrenadante como analisado - (% de proteína de enzimas digestivas + % de proteína de enzimas exógenas) Solubilização da proteína (%) = (% de proteína corrigido no sobrenadante x 100 %)/2,95 %.

Os resultados abaixo mostram que a protease derivada da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 apresenta um efeito significativamente melhor na solubilização da proteína se comparado com o branco e também se comparado com a protease do Bacillus sp. NCIMB 40484. a,b,c Valores dentro de uma coluna que não compartilham em comum de uma letra sobrescrita são significativamente diferentes, P < 0,05. SD é desvio padrão; n é o número de observações.

Exemplo 5 Degradação da lecitina SBA e dos Inibidores Bowman-Birk e Kunitz de soía A capacidade das proteases do Nocardiopsis sp. NRRL 18262 e do Bacilus sp. NCIMB 40484 em hidrolisar aglutinina (SBA) e os inibidores de tripsina Bowman-Birk e Kunitz de soja foi testada. SBA pura (Fluka 61763), Inibidor Bowman-Birk (Sigma T- 9777) ou Inibidor Kunitz (Inibidor de Tripsina de soja, Boehringer Mannheim 109886) foram incubados com a protease por 2 horas, 37° C, no pH 6,5 (protease: fator anti-nutricional = 1:10, com base em A28o)· Tampão de incubação: 50 mM de ácido dimetil glutárico, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,01 % Triton X-100, pH 6,5. A capacidade das proteases degradarem SBA e os inibidores de protease foi estimada a partir do desaparecimento das faixas de SBA nativa ou do inibidor de tripsina, e o aparecimento de produtos de degradação de baixo peso molecular nos géis SDS-PAGE. Os géis foram tingidos com azul Coomassie sendo que a intensidade das faixas foi determinada por varredura.

Os resultados, na forma de % de fator anti-nutricional degradado, estão mostrados na Tabela 4 abaixo. r E ainda contemplado que a capacidade de degradar os fatores anti-nutricionais na soja pode ser também estimada aplicando a técnica Western com anticorpos contra SBA, Inibidor Bowman-Birk ou Inibidor Kunitz após a incubação da comida de soja com as proteases candidatas (ver WO98/56260).

Tabela 4 Exemplo 6 Efeitos das proteases Nocardiopsis estáveis em ácido no desempenho do crescimento em frangos para corte A experiência é levada a efeito de acordo com as instruções oficiais Francesas para experiências com animais vivos. Os frangos para corte de um dia (‘Ross PM3’), separados por sexo, são supridos por uma chocadeira comercial.

Os frangos são abrigados em gaiolas com piso de arame que são mantidas em uma sala com ambiente controlado. O alimento e a água da torneira são proporcionados ad libitum.

No dia 8, os frangos são divididos por peso em grupos de 6 aves, os quais são alocados a ou ao tratamento de controle, recebendo a dieta experimental sem enzimas, ou ao tratamento com enzimas, recebendo a dieta experimental suplementada com 100 mg de proteína de enzima da protease por kg de alimento.

Cada tratamento é replicado com 12 grupos, sendo 6 grupos de cada sexo. Os grupos são pesados nos dias 8 e 29. O consumo de alimento do período intermediário é determinado sendo o ganho de peso do corpo e a razão de conversão calculados. A dieta experimental é baseada em amido de milho e comida de soja (44 % de proteína bruta) como os ingredientes principais (Tabela 5). O alimento é pelotizado (configuração da matriz: 3 x 20 mm) a aproximadamente 70° C. Uma quantidade apropriada da protease é diluída em uma quantidade fixa de água e pulverizada sobre o alimento pelotizado. Para o tratamento de controle, quantidades adequadas de água são usadas para conduzir os tratamentos do mesmo modo.

Para a avaliação estatística, uma análise de dois fatores de variação (fatores: tratamento e sexo) é levada a efeito, usando o procedimento GLM para o pacote SAS (SAS Institute Inc., 1985). Onde significativos efeitos do tratamento (p < 0,05) se acham indicados, as diferenças entre os meios de tratamento são analisados com o ensaio Duncan.

Um ganho de peso melhorado, e/ou uma melhor conversão do alimento, e/ou um valor nutritivo melhorado da comida de soja são esperados (levando em consideração que o amido de milho é um ingrediente altamente digerível).

Referências EEC (1986): Instruções da Comissão de 9 de abril de 1985 que fixam o método de cálculo do valor energético dos alimentos compostos destinados a aves. “Journal Officiel des Comunautés Européennes”, L130, 53-54. SAS Institute Inc. (1985): SAS® User’s Guide, Versão 5a Edição. Cary NC.

Tabela 5 Composição da dieta experimental 1 teor analisado: 90,6 % de matéria seca, 45,3 % proteína bruta, 2,0 % gordura bruta, 4,9 % fibra bruta 2 correspondeu a 90 mg lasalocid-Na / kg de alimento como um anticoccidiose calculado na base do teor de nutrientes analisado (equação EC; EEC, 1986).

Fornecedores dos ingredientes do alimento Amido de milho: Roquettes Frères, F-62136 Lestrem, França Comida de soja 44: Rekasan GmbH, D-07338 Kaulsdorf, Alemanha Sebo: Fondoirs Gachot SA, F-67100 Strasbourg, França DL-Metionina: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, França MCP: Brenntag Lorraine, F-54200 Toul, França Sal: Minoterie Modeme, F-68560 Hirsingue, França Aglutinante: Minoterie Modeme, F-68560 Hirsingue, França Pré-mistura (AM vol chair NS 4231): Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse, França Avatec: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, França Exemplo 7 Pré-misturas e dietas para pems e salmonideos suplementadas com proteases Nocardiopsis estáveis em ácido Uma pré-mistura com a seguinte composição é preparada (teor por quilo): 5000000 IE Vitamina A 1000000 IE Vitamina D3 13333 mg Vitamina E 1000 mg Vitamina K3 750 mg Vitamina BI 2500 mg Vitamina B2 1500 mg Vitamina B6 7666 mg Vitamina B12 12333 mg Niacina 33333 mg Biotina r 300 mg Acido Fólico 3000 mg Pantotenato-Ca-D 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mgl 66 mg Se 5,8 % Cálcio A esta pré-mistura a protease da Nocardiopsis sp. NRRL 18262 é adicionada (preparada conforme descrito no Exemplo 2), em uma quantidade correspondente a 10 g de proteína de enzima protease/kg.

Dietas pelotizadas para início e crescimento de perus, com uma composição conforme mostrada na tabela abaixo (na base de Leeson e Summers, 1997, mas recalculadas sem comida de carne com o uso do AGROSOFT®, programa de otimização) e com 100 mg de proteína de enzima protease por kg, são preparadas como se segue: o milho moído, a comida de soja, a comida de peixe e a gordura vegetal são misturados em um misturador em cascata. Calcário, fosfato de cálcio e o sal são adicionados, juntamente com a pré-mistura acima, em uma quantidade de 10 g/kg de dieta, seguido de mistura. A mistura resultante é pelotizada (condicionamento com vapor seguido da etapa de pelotização).

Duas dietas para Salmonideos são também preparadas, conforme delineado acima em geral. As composição reais estão indicadas na Tabela abaixo (compilada de Refstie et al. (1998), Aquaculture, vol. 162, pg. 301-302). O teor estimado de nutrientes é recalculado usando o programa de otimização de alimentos Agrosoft®. A protease derivada da Nocardiopsis alba, preparada conforme descrito no Exemplo 2, é adicionada às dietas em uma quantidade que corresponde a 100 mg de proteína de enzima protease por kg.

Exemplo 8 Determinação da pureza de produtos de enzima contendo protease A pureza de produtos de enzima contendo protease, e.g., preparações de protease tais como produtos comerciais de enzima de múltiplos componentes, pode ser determinada por um processo baseado no fracionamento do produto de enzima contendo protease em uma coluna de exclusão por tamanho. A cromatografia de exclusão por tamanho, também conhecida como cromatografia de filtração em gel, é baseada em uma matriz de gel poroso (contido em uma coluna) com uma distribuição de tamanho de poros comparável em tamanho às moléculas da proteína a serem separadas.

As moléculas de proteína relativamente pequenas podem se difundir para dentro do gel a partir da solução circundante, enquanto as moléculas maiores serão evitadas pelo seu tamanho de se difundirem para dentro do gel em um mesmo grau. Como resultado, as moléculas de proteína são separadas de acordo com seus tamanhos, com as moléculas maiores eluindo da coluna antes das menores.

Ensaio de concentração de proteína A concentração de proteína nos produtos de enzima contendo protease é determinada com um conjunto de ensaio de proteína com BCA da PIERCE (idêntico ao PIERCE cat. No. 23225). O sal de sódio do ácido Bicinchonínico (BCA) é um composto solúvel em água, estável, capaz de formar um complexo intensamente púrpura com íon cuproso (Cu1+) em um meio alcalino. O reagente BCA forma a base do conjunto para ensaio de proteína com BCA, capaz de monitorar os íons cuprosos produzidos na reação da proteína com Cu alcalino (reação Biureto). A cor produzida por esta reação é estável e aumenta de maneira proporcional com o aumento das concentrações da proteína (Smith, P.K., et al. (1985), Analytical Biochemistry, vol. 150, pgs. 76-85). A solução de trabalho de BCA é produzida pela mistura de 50 partes do reagente A com 1 parte do reagente B (o reagente A é o PIERCE cat. No. 23223, e contém o BCA e tartarato em um tampão de carbonato alcalino; o reagente B é o PIERCE cat. No. 23224, e contém CuS04*5H20 a 4 %). 300 μΐ de amostra são misturados com 3,0 ml da solução de trabalho de BCA. Após 30 minutos a 37° C, a amostra é resfriada até a temperatura ambiente e a A490 é lida como uma medida da concentração de proteína na amostra. Diluições de albumina de soro Bovino (PIERCE cat. No. 23209) estão incluídas no ensaio como um padrão.

Pré-tratamento da amostra Caso o produto de enzima contendo protease seja um sólido, o produto é primeiramente dissolvido/suspenso em 20 volumes de 100 mM de H3BO3, 10 mM de ácido 3,3’-dimetilglutárico, 2 mM de CaCl2, e pH 6 (Tampão A), durante pelo menos 15 minutos a 5o C e, caso a enzima neste estágio seja uma suspensão, essa suspensão é filtrada através de um filtro de 0,45 μ para proporcionar uma solução límpida. A solução é, a partir deste ponto, tratada então como um produto líquido de enzima contendo protease.

Caso o produto de enzima contendo protease seja um líquido, o produto é primeiramente dializado em um tubo de diálise SpectraPor de corte em 6-8000 Da (No. Cat. 132670 da Spectrum Medicai Industries) contra 100 volumes de Tampão A + 150 mM de NaCl (Tampão B) durante pelo menos 5 horas a 5o C, para remover produtos químicos da formulação que poderíam proporcionar produtos líquidos de enzima contendo protease com uma elevada viscosidade, o que podería vir a ser prejudicial para a cromatografia de exclusão por tamanho. O produto de enzima contendo protease dializado é filtrado através de um filtro de 0,45 μ, caso um precipitado tenha se formado durante a diálise. A concentração de proteína no produto de enzima dializado é determinada com o ensaio para concentração de proteína acima descrito e o produto de enzima é diluído com o Tampão B, para proporcionar uma amostra pronta para cromatografia de exclusão por tamanho com uma concentração de proteína de 5 mg/ml. Caso o produto de enzima apresente uma concentração de proteína mais baixa que 5 mg/ml após a diálise, ele poderá ser usado como se encontra.

Cromatografia de exclusão por tamanho Uma coluna HiLoad26/60 Superdex75pg de 300 ml (Amersham Pharmacia Biotech) é equilibrada com Tampão B (Fluxo: 1 ml/min). 1,0 ml da amostra de enzima contendo protease é aplicado à coluna, sendo a coluna eluída com Tampão B (Fluxo: 1 ml/min). Frações de 2,0 ml são coletadas da saída da coluna até que toda a amostra aplicada tenha eluído da coluna. As frações coletadas são analisadas em relação ao teor de proteína (ver o ensaio acima para concentração da Proteína) e para atividade da protease, por meio dos ensaios apropriados. Um exemplo de ensaio apropriado é o ensaio Suc-AAPF-pNA (ver Exemplo 2B). Outros ensaios apropriados são, e.g., o ensaio CPU (ver Exemplo 1), e o ensaio Protazyme AK (ver Exemplo 2D). As condições, e.g., pH, para os ensaios de atividade da protease, são ajustadas para medir tantas proteases quanto possíveis na amostra fracionada. As condições dos ensaios acima referidas são exemplos de condições apropriadas. Outras condições apropriadas se acham mencionadas acima na seção que trata da medição da atividade da protease.

Um pico de proteína com atividade em um ou mais dos ensaios de protease é definido como um pico de protease. A pureza do pico de protease é calculada como a quantidade de proteína no pico dividido pela quantidade total de proteína em todos os picos de protease identificados. A pureza do produto de enzima contendo protease é calculada como a quantidade de proteína no pico de protease estável em ácido dividido com a quantidade de proteína em todos os picos de protease identificados usando o procedimento acima.

T TSTAGEM DE SEOUENCIA

Claims (12)

1. Uso de pelo menos uma protease estável em ácido, caracterizado pelo fato de ser em alimento para animal em que a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQIDNO: l,e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

2. Uso de pelo menos uma protease estável em ácido, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para uso em alimento para animal, em que a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQIDNO: l,e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dosagem da protease é de 0,01-200 mg de proteína de enzima protease por kg de alimento.

4. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dosagem pretendida da protease é de 0,01-200 mg de proteína de enzima protease por kg de alimento.

5. Processo para melhorar o valor nutritivo de um alimento para animal, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma protease estável em ácido é adicionada ao alimento, e onde a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQIDNO: 1, e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

6. Aditivo de alimento para animal, caracterizado pelo fato de que compreende (a) pelo menos uma protease estável em ácido; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (d) pelo menos um mineral em traços, e/ou (e) pelo menos um mineral macro; em que a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQ ID NO: 1, e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

7. Aditivo de alimento para animal de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de protease corresponde a uma adição pretendida de 0,01-200 mg de proteína protease por kg de alimento.

8. Aditivo de alimento para animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fitase, xilanase, galactanase e/ou beta-glucanase.

9. Composição de alimento para animal, caracterizada pelo fato de que possui um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg e que compreende pelo menos uma protease estável em ácido, em que a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQ ID NO: l,e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

10. Composição de alimento para animal de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a quantidade da protease é de 0,01-200 mg de proteína protease por kg de alimento.

11. Processo para o tratamento de proteínas vegetais para uso em alimento para animal, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adicionar pelo menos uma protease estável em ácido a pelo menos uma fonte de proteína ou proteína vegetal, em que a protease possui a sequência descrita na: (i) SEQ ID NO: 1, e/ou (ii) SEQ ID NO: 2.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a soja está incluída entre pelo menos uma fonte de proteína vegetal.