TWI259759B

TWI259759B - Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed

Info

Publication number: TWI259759B
Application number: TW090115232A
Authority: TW
Inventors: Carsten Sjoeholm; Peter Rahbek Oestergaard; Anna-Marie Kluenter
Original assignee: Dam Ip Assets B V
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2006-08-11
Also published as: WO2001058275A3; CN1293191C; PL203212B1; WO2001058276A2; DE60115602D1; AU4236601A; EP1257176B1; WO2001058275A9; MX261332B; DE60133802T2; JP2003521908A; CN101238853A; BR0108165A; CA2395266C; CA2395266A1; BR0108164B1; MXPA02007614A; EP1257175A2; AU777210B2; BR0108164A

Description

A7 1259759 五、發明說明d ) 技術背景本發明係關於枯草桿菌蛋白酶家族之酸安定性絲胺酸蛋白酶用於動物飼料之用途（活體內），以及該等蛋白酶用於處理植物蛋白質之用途（試管內）。蛋白質爲動物及人類之必須營養因子。大部分的家畜和很多人類是從植物蛋白質來源獲得必須的蛋白質。重要的植物蛋白質來源有，例如油籽作物，豆類及榖類。當如黃豆粕被包含於單胃動物，例如豬及家禽，之飼料時’黃豆粕固體中有一顯著的部分無法被消化。例如在小豬及成長的豬中明顯的迴腸的蛋白質消化率僅有大約 80%。單胃動物和很多魚類的胃顯示很強的酸性pH値。然而大部分的蛋白質的消化係發生在小腸。因此需要一種在通過胃後能存活的酸安定性蛋白酶。技術背景將蛋白酶用於動物飼料或用於處理植物蛋白質已見於下列文獻： WO95/28850揭示La·—種包括植酸酶及蛋白水解酵素

之動物飼料添加物。多種蛋白水解酵素被具體說明於第7 胃Q N WO96/05739揭示一種包括木聚糖酶和一種蛋白酶之酵素飼料添加物。合適的蛋白酶被列舉在第25頁。 W095/02044揭示u·衍生自棘孢麴黴（Aspergmus 3 本紙張尺度適用-中國國家標準(CNS〉A4規格（21〇 χ 297公楚） ----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂·丨 ά—φ—ί A7 1259759 ______B7__ 五、發明說明 aculeatus)之蛋白酶，以及其用於動物飼料之用途。 US 3966971揭示一種藉由以一酸性植酸酶及選擇性的一種蛋白水解酵素處理，從植物蛋白質來源得到蛋白質的方法。合適的蛋白酶具體說明在第2欄。 US 4073884，US 5047240，US 3868448，US 3823072 及 US 3693069描述衍生自不同鏈黴菌屬（Streptomyces)之菌株之蛋白酶製劑，及他們用於動物飼料之用途。然而這些蛋白酶不是酸安定的及/或亦非枯草桿菌蛋白酶家族之蛋白酶。發明簡介現已確認數個被發現非常地酸安定的，且預期於動物飼料具增進的效果的蛋白酶。這些蛋白酶屬於已知之枯草桿菌蛋白酶之蛋白酶族群。圖式簡要說明本發明進一步藉由參考所附圖式說明，其中：圖1顯示pH-安定性曲線，即四種蛋白酶（一種衍生自芽孢桿菌（Bacillus sp.) NCIMB 40484之枯草桿菌蛋白酶 .家族的酸安定蛋白酶（PD 498 )，及三種參考蛋白酶（ Sub. Novo及Sub. Novo (Y217L)，兩者均衍生自解澱粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，以及 SAVINASE™) 於37°C的溫度且pH値在pH 2至pH 11的範圍培養2小時後之殘餘蛋白酶活性；該活性係相對於在pH 9.0及5°C培 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- -線|參丨卩· 1259759 A7 ___B7 五、發明說明（）養2小時後之殘餘活性；圖2顯示pH-活性曲線，即相同的四種蛋白酶，相對於其在最適pH之蛋白酶活性，在PH 3及pH 11間之蛋白酶活性；圖3顯示在pH 9.0的溫度-活性曲線，即相同的四種蛋白酶，相對於其在最適溫度之蛋白酶活性’在ΡΗ 9·0 ’ 15 。(:和80°C間之蛋白酶活性；圖4顯示六種其它枯草桿菌蛋白酶家族的酸安定性蛋白酶之類似於圖1之PH-安定性曲線，·其係衍生自於嗜鹼芽孢桿菌（Bacilllus alcalophilus) NCIMB 10438，尖鐮孢（ Fusarium oxysporum) IF〇 4471，擬青黴菌（Paecilomyces lilacinus ) CBS 102449，枝頂孢菌(Acremonium Chrysogenum ) ATCC 48272，基利恩斯枝頂孢菌（乂；

Acremonium kiliense) ATCC 20338 ; 圖5顯示相同於圖4之蛋白酶的類似於圖2之pH-活性曲線；及圖6顯示相同於圖4之蛋白酶的類似於圖3之在pH 9.0的溫度-活性曲線。發明之詳細說明本文所用蛋白酶（protease) —詞，係指可水解肽鍵之酵素（具蛋白酶活性）。蛋白酶又稱爲例如肽酶（ peptidases)，蛋白酶（proteinases)，肽水解酶（peptide hydrolases)，或蛋白水解酵素（proteolytic enzymes)。 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇χ 297公釐） ^ ^----- —Awl I — — — — — — I— ^ · I I I I--I Aw (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1259759 五、發明說明（中）用於本發明較佳之蛋白酶爲內生型，其係作用於多肽鏈的內部（肽鏈內切酶）。肽鏈內切酶顯示在胺基-及羧基 -末端阻斷之肽基質之活性，其與討論中之蛋白酶的特異性有關。任何屬於EC目錄（NC-IUBMB，1992之酵素命名法 1992)中EC 3.4酵素組群（包括其13個次-次類中任一者 )之酵素均被包含於上述蛋白酶之定義，並隨著定期補充與更新，見於如全國資訊網（www ) http://www.chem.Qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html 0 蛋白酶基於其催化機制分成下列類別：絲胺酸蛋白酶 (S)，半胱胺酸蛋白酶（C)，天冬胺酸蛋白酶（A)，金屬蛋白酶（M)，及未知的或尙未分類的蛋白酶（U)，見於 A· L Barrett, N. D. Rawlings, L F. Woessner 編著，學術出版社（1988 )之蛋白水解酵素手冊（Handbook of Proteolytic Enzymes)，特別是在一般介紹的部分。絲胺酸蛋白酶一詞係指如前述手冊所定義之絲胺酸肽酶及其族（clans)，於該手冊1988年版本中，絲胺酸肽酶及其族被討論於第1 一 175章。於一特定具體實施例中，絲胺酸蛋白酶爲肽酶，其催 .化機制決定於絲胺酸殘基上之羥基，其係用作攻擊肽鍵之親核物質。本文所用名詞，枯草桿菌蛋白酶或祜草桿菌蛋白酶家族，意欲包括所有的SB族絲胺酸蛋白酶，特別是其S8家族〈SB族被討論於上述手冊中第93章〉。於枯草桿菌蛋 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I ·ϋ n ·ϋ I if n flu 一 on · n n n an 1_1 n ϋ I 1 ·ϋ ·1 n n n n l n n n ϋ n ϋ ·ϋ n n n n n I 1259759 B7 五、發明說明（f ) 白酶中，催化三元組之順序爲Asp-ms-Ser。三級結構包括 α-螺旋及/3-摺版二者。SB族包括肽鏈內切酶及肽鏈外切酶二者。這些肽酶已知是由細菌，古生菌及真核生物而來 :有一唯一的代表例是從DNA病毒而來。爲了測定所指定的蛋白酶是否爲枯草桿菌蛋白酶’係以前述手冊及其中所示之原則作參考。該種測定可對所有類型的蛋白酶進行，其係天然發生或野生型蛋白酶；或是基因工程的或合成的蛋白酶。或者，可以SSI〈鏈黴菌屬枯草桿菌蛋白酶抑制劑〉來作抑制硏究，而枯草桿菌蛋白酶被定義爲’當以一莫耳過量的SSI抑制時具有高至10%殘餘活性的蛋白酶。此試驗可如實施例8所描述者進行。於此定義之特定具體實施例中，該枯草桿菌蛋白酶具有高至8%，高至6%，或高至 5%的殘餘活性。「高至」一詞，被視爲等同於「少於或等於」。蛋白酶活性之測量，可利用任何分析法，於其中使用一種包含有與討論中之蛋白酶的特異性有關之肽鍵的基質。分析-PH及分析-溫度同樣被適用於討論中之蛋白酶。分析-pH値的例子爲pH5，6，7，8，9，10或11。分析-溫度 ‘的例子爲 25，30，35，37，40，45，50，55，60，65，或 7CTC。蛋白酶基質的例子爲酪蛋白及pNA-基質，例如Sue-AAPF-pNA (例如可從Sigma S-7388得到）。此PNA-基質中之大寫字母係指一個字母的胺基酸碼。另一個例子爲 7 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐) " "~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁> #-------- 訂·！ I Awli A7 1259759 __________B7___ 五、發明說明（"I ) ，90，或至少95%胺基酸同一性之蛋白酶； (in)具有與序列辨識編號：1，序列辨識編號：2，序列辨識編號：3，或序列辨識編號：4中任一者至少7〇， 75 ’ 80 ’ 85，90，或至少95%同一性之蛋白酶； (iv)具有與序列辨識編號：5 (完整序列1 一 397, 或其片段28- 397或118- 397 )，序列辨識編號：6 (完整序列1 一 367，或其片段70- 367或84- 367)或序列辨識編號：7中任一者至少70，75，80，85，90，或至少95% 胺基酸同一性之蛋白酶。對於同一性百分比之計算，可利用此技藝所知道的任何電腦程式，例如，GCG第8版程式套裝（威斯康辛套裝之程式手冊（Program Manual for the Wisconsin Package)，第 8 版，Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison，Wisconsin，USA 53711 )提供之 GAP (Needleman， S.B.及 Wunsch，C.D·，（1970)，分子生物學期刊（Journal 〇f Molecular Biologly)，48，443 — 453 )。利用 GAP 及下列設定作多肽序列比較：GAP creation penalty爲5.0及GAP extension penalty 爲 0.3 0 在一特定具體實施例中，根據本發明所使用之蛋白酶 ‘爲微生物的蛋白酶，該微生物的一詞係指該蛋白酶係衍生自或源自一微生物，或者係衍生自微生物之一類似物、片段、變異體、突變體、或合成的蛋白酶。其可以在原始的野生型微生物菌株、另一微生物菌株、或植物中產生或表現；亦即此一名詞包括野生型、天然存在的蛋白酶之表現 9 ί紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4^規格（210 X 297公楚1 -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •i------訂 i ά—φ—ί A7 1259759 _____B7___ 五、發明說明（/ ) 飼料或飼料組成物一詞意指任何適於或意欲讓動物攝食之化合物，製劑，混合物，或組成物。根據本發明之使用，蛋白酶可在飮食之前、之後、或同時餵予動物；較佳爲後者。在本發明上下文中，酸安定性一詞係指純蛋白酶酵素在相當於A28〇= 1.0之稀釋液，在37°C，於下述緩衝液中 100 mM 琥珀酸，100 mM HEPES，100 mM CHES， 100 mM CABS，1 mM CaCl2，150 mM KC1， 0.01°/〇 Triton® X-100，pH 3.5 培養2小時後之蛋白酶活性至少爲參考活性之40%，其係利用如本文中實施例2C所描述之分析法測得（基質：Sue-AAPF-pNA，pH 9_0，25。。）。在上述酸安定性定義之特定具體實施例中，蛋白酶活性爲參考活性之至少45，50，55，60，65，70，75，80， 85，或至少90%。參考活性一詞係指同一蛋白酶以純的形式，在相當於 A28〇=1.0之稀釋液，在5°C於下述緩衝液中：100 mM琥珀酸，100 mM HEPES，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM CaCl2，150 mM KG，0·0]〇/〇 Triton® X-00，pH 9·0 培養 2 小 .時後之蛋白酶活性，其中該活性係如上所述測定。換言之，測定酸安定性之方法包括下列步驟： a) 欲測試之蛋白酶樣品（以純的形式，Α28〇= 1.0)被分成兩等份試樣（I及II); b) 等份試樣I於37°C及pH 3.5培養2小時； 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·---------訂 i •線丨1'丨 1259759 B7 五、發明說明（（& ) (：)測量等份試樣1之殘餘活性（？^19.0及25°(：); d) 等份試樣II於5°C及pH 9.0培養2小時； e) 測量等份試樣II之殘餘活性（pH 9.0及25°C); f) 計算相對於等份試樣II之殘餘活性的等份試樣I之殘餘活性之百分比。或者，在上述酸安定性之定義中，步驟b)緩衝液pH 値可爲 2.0，2·5，3·0，3·1，3·2，3.3，或 3.4。在上述酸安定性定義有關上述可選擇之步驟b)緩衝液pH値之其他可選擇的具體實施例中，該殘餘蛋白酶活性，當與參考値比較，係至少5，10，15，20，25，30，35 ，40，45，或至少 50°/。。在可選擇之具體實施例中，pH値6.0，6.5，7.0，7.5 ，8.0，或8.5可應用至步驟d)緩衝液。在上述酸安定性定義中，A280= 1.0 —詞意指該純蛋白酶之濃度（稀釋液）可使在1公分光徑之比色杯於280 nm 之光吸收，相對於緩衝液空白對照，提高1.0。又在上述酸安定性定義中，純蛋白酶一詞係指A28。/ Α26α比値高於或等於1.70之樣品（見實施例2E)，且其藉由掃描一考馬斯染色SDS-PAGE凝膠，測得對應於該蛋白 .酶之帶具有其掃描強度的至少95% (見實施例2A)。或者，該 A28。/ A26〇比値係高於或等於 1.5〇，1.60，1.65，1.70， 1.75，1.80，1.85，或高於或等於 1.90。然而’根據本發明之使用，該蛋白酶不需要那麼純；例如它可以含有其它酵素，甚至其它蛋白酶，在此例中， 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

^1 *1 n 一 4 n aa— n n n n aMmt I ·1 —I- II ϋ ·ϋ n n n I ·1 n n I— n n n n n ϋ I 1259759 A7 _ _—— --- B7_ _ 五、發明說明（u) 它可稱作蛋白酶製劑。但是，一個定義明確的蛋白酶製劑爲泪利的。例如’一個實質上沒有其它蛋白酶千擾或污染之蛋白酶較易被正確地給藥至飼料中。正確地給藥一詞特別是指得到一致且固定的結果之目的，及基於所欲效果之最理想劑量的能力。在一特定具體實施例中，呈添加入飼料中之形式，或被包含於一飼料添加物中之蛋白酶係定義明確的。定義明確係指以尺寸-排阻層析法（size-exclusi〇rl chromatography )測定時’該蛋白酶製劑爲至少50%純的（見實施例12) 〇在其它特定的具體實施例中，該蛋白酶製劑以此方法測定時爲至少60，70，80，85，88，90，92，94，或至少 95%純的。或者’定義明確一詞係指該蛋白酶製劑於一適當的尺寸一排阻管柱之劃分分離顯示只有一個主要的蛋白酶成分。熟練的工作者將知道如何選擇合適的尺寸-排阻層析柱。他可起始自例如在一來自Amersham Pharmacia Biotech 之mL〇ad26/60 Supei:dex75pg管柱上劃分分離製劑（見實施例12)。如果尖峰未被淸楚分離，則可試不同的管柱（例 .如具一經修正之管柱顆粒大小及/或柱長），及/或他可修正樣品體積。藉由簡單且一般的嘗試錯誤法，從而達成一具足夠解析力（淸楚分離的尖峰）之管柱，以此爲基礎如實施例12所述進行純度的計算。蛋白酶製劑可（a)直接加入飼料（或直接用於植物蛋 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

--------訂---------^ I AWI A7 1259759 五 '發明說明（/ 白質之處理過程），或（b)可用於製造一或多種中間的組成物，例如隨後加入飼料之飼料添加物或預混物（或用於處理過程）。不論是根據前述（a)或（b)使用，前述之純度係指原始蛋白酶製劑的純度。具有此量級純度之蛋白酶製劑尤其可利用重組的製造方法獲得，鑒於他們不是那麼容易得到，且當蛋白酶係以傳統發酵法製造時，亦容易遭受到非常高的批與批之間之變異性。此種蛋白酶製劑當然可與其它酵素混合。在一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶，除了爲酸安定的，亦具有接近中性的pH-活性最適値。接近中性的pH-活性最適値一詞意指下列一或多者：該PH-最適値在PH 6.0— 11.0之間，或PH 7.0— 11.0之間， 2 pH 6.0 — 1〇·〇之間’或 pH 7.0- 1〇.〇之間，或 pH 8.0 — U.O之間，或pH 8·0 — 10.0之間（見本文中實施例2B及7 ’和圖2及5 )。在另一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶 ’除了爲酸安定的，亦爲耐熱性的。耐熱性的一詞意指下列一或多者：溫度最適値在至少

5〇 C > 52〇C ^ 54〇C ^ 56〇C ^ 58〇C ^ 60°C j 62〇C ^ 64〇C 5 66〇C ’ 68°C ’或至少70°C，參考本文中實施例2D及7，和圖3 及6。在又一特定具體實施例中，根據本發明所用之蛋白酶，依照本文中實施例4之試管內模型，能夠溶解植物蛋白 __ 14 7紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) "" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂---------線 *#· 1259759 A7 B7 r—— " ........ .............丨 - 五、發明說明（Γ]) 質。本丈所用植物蛋白質一詞係指任何化合物，組成物，製劑或混合物，其包括至少一衍生自或源自植物之蛋白質，包括修飾性蛋白質和蛋白質-衍生物。在特定具體實施例中，該植物蛋白質的蛋白質含量爲至少10，20，30，40， 50，或 60% ( w/w)。植物蛋白質可衍生自植物蛋白質來源，例如豆類及穀類，如來自豆科（Fabaceae，Legummosae)，十字花科，藜科，及木本科植物之材料，例如黃豆粕，羽扇豆粗粉，及油菜籽粕。在一特定具體實施例中，該植物蛋白質來源爲來自一種或多種豆科植物之材料，例如黃豆，羽扇豆，豌豆，或豆。在另一特定具體實施例中，該植物蛋白質來源爲來自一種或多種藜科植物之材料，例如甜菜（bee，sugar beet) ，菠菜或美國野藜。植物蛋白質來源的其它例子爲油菜籽，及甘藍。黃豆爲一較佳的植物蛋白質來源。植物蛋白質來源的其它例子爲穀類，例如大麥，小麥 ’黑麥’燕麥，玉米（maize，corn)，米，及高梁。丰艮據本發明以至少一種枯草桿菌蛋白酶家族之酸安定性蛋白酶處理植物蛋白質會增加植物蛋白質的溶解。下列爲利用本發明蛋白酶可得到之溶解了的蛋白質百分比的例子：至少 76.8% ，77.0% ，77.2% ，77.4°/〇，77.6 15 才、紙張尺度適用中圏國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1259759 五、發明說明（1^ ) %，77.8%，78.0%，78.2%，78.4%，78.6%，或至少 78.8 % ，參考本文中實施例4之試管內模型。蛋白質的溶解一詞基本上意指使蛋白質成爲溶液。該溶解可能是由於蛋白酶居間之蛋白質從通常複合的天然組成物，如飼料，的其它成分的釋放。溶解可經由對照於不經蛋白酶處理之樣品之可溶性蛋白質量之增加來測量（見本文實施例4)。在一處理方法之特定具體實施例中’該討論中之蛋白酶係對植物蛋白質或蛋白質來源，影響（或作用於）或施加它的溶解影響力。爲了達到這個目的，植物蛋白質或蛋白質來源典型地被懸浮於一溶劑，例如水性溶劑，如水中，並注意根據討論中之酵素的特性調整pH及溫度値。例如，該處理可發生在一 pH値，在該pH値該實際蛋白酶之相對活性爲至少50，或60，或70，或80，或90%。同樣地，例如，該處理可發生在一溫度，在該溫度該實際蛋白酶之相對活性爲至少50，或60，或70，或8〇 ,或90% ( 這些相對活性係如本文中實施例2所定義）。持續該酵素反應直至達到所欲的結果。之後可以或不需藉由不活化酵素來停止該酵素反應，例如藉由一熟處理步驟。在另一本發明處理方法之特定具體實施例中，該蛋白酶作用爲緩效的（sustained)，意即，例如蛋白酶被加至植物蛋白質或蛋白質來源，但是它的溶解影響力可說是直到之後被需要時，一旦合適的溶解條件被建立，或一旦任何酵素抑制劑被失活才被啓動，或任何其它已可被應用來 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱)~-- 丨 — rl —--------#ί------訂---------線-· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1259759 五、發明說明（β ) 延遲酵素作用之方法。在一具體實施例中，該處理爲動物飼料或用於動物飼料之植物蛋白質之預處理，即該蛋白質在攝食前被溶解。增進動物飼料之營養價値一詞係指增進蛋白質之可利用性，從而導致增加的蛋白質萃取，較高的蛋白質產率’ 及/或增進蛋白質的利用。因此增加了飼料的營養價値’以及增進了動物的生長率及/或體重增加及/或飼料轉換（即相對於增加的體重之飼料攝取量）。在特定具體實施例中，該體重增加爲對照組之至少、 101% ，102% ，103% ，104% ，105% ，1〇6% ，或至少 106.6%，參考本文中實施例10。在另外的特定具體實施例中，該飼料轉換爲至多（或不多於）99%，98%，97.5%，97%，或至多 96.6%。此相等於一高至99%，98%，97.5%，97%，或高至96.6%之飼料轉換。再一次，參考本文中實施例10與對照組相比較〇蛋白酶可以任何形式加入飼料中，其可爲相當純的蛋白酶，或與其它欲添加入動物飼料之成分成爲混合物，換言之，呈動物飼料添加物的形式，例如所謂之動物飼料預 •混物。動物飼料添加物除了枯草桿菌蛋白酶家族之酸安定性蛋白酶之外，本發明動物飼料添加物含有至少一種脂溶性維生素，及/或至 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1:---.----------------訂--------線 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1259759 A7 --------— B7 —_ 五、發明說明（ίΛ ) 少一種水溶性維生素，及/或至少一種微量礦物質，及/或至少〜種巨量礦物質。力外’選擇性的，飼料添加物成分爲著色劑，香味化合物’女定劑，及/或至少一種選自植酸酶£(： 3. 1. 3. 8或 3· 1· 3· 26 ;木聚糖酶EC 3· 2·丨· 8 ;聚半乳糖酶EC 3· 2· h 89，及/或β —聚葡萄糖酶EC 3· 2.丨.*之其它酵素（EC係指酵素分類，根據NC-IUBMB，1992之酵素命名法1992 )’亦參見全國資訊網 ( WWW ) h|t£i.//wwwxhem.£mw<ac.uk/iubmb/enzvme/index.html 〇在一特定具體實施例中，這些其它的酵素爲定義明確的（如前述對蛋白酶製劑之定義及例示，i.a.參考實施例 12)。通常脂溶性和水溶性維生素，以及微量礦物質形成欲加入飼料之所謂預混物之一部分，而巨量礦物質則通常被分開加入飼料。這些組成物型式之任一者，當以本發明酸安定性枯草桿菌蛋白酶強化時，均爲本發明之動物飼料添加物。在一特定具體實施例中，本發明動物飼料添加物意欲以 0.01—10 % ;更特別爲 0.05 —5.0% ;或 0.2—1.0% 之 .程度（％係指每100克飼料中添加物克數）被包含於（或規定使其被包含於）動物飮食或飼料中。這特別是對預混物而言。因此，動物飼料添加物例如預混物中個別成分之濃度 ’可藉由將同一成分在最終飼料中濃度，分別乘上10- 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂---------線 1· 1259759 A7 ________ B7 五、發明說明（ο) 10000 ; 20- 2000 ;或100- 500而得到（參照前述三個百分比包含間距）。該等個別的飼料及飼料添加物成分之合適的最終濃度 (即飼料中濃度）之基準表示於下表A。下列爲這些成分之非限制性例示：脂溶性維生素的例子有維生素A，維生素D3，維生素 E，及維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子爲維生素B12，生物素及膽鹼，維生素B1，維生素B2，維生素B6，菸鹼酸，葉酸，及泛酸鹽（panthothenate)，例如 Ca-D-泛酸鹽。微量礦物質的例子有鎂，鋅，鐵，銅，碘，硒，及鈷〇巨量礦物質的例子爲鈣，磷，及鈉。這些成分之營養需求量，以家禽及小豬/豬爲例，列於下表A中。營養需求量係指這些成分應以所示濃度提供於飮食中。這些數據係依照： NRC，豬的營養素需求量，第9修訂版1988，豬的營養學次委員會，動物營養學委員會，農業局，國家硏究會，國家學術出版社，華盛頓，D，C，1988 ;及 NRC，家禽的營養素需求量，第9修訂版1994，家禽營養學次委員會，動物營養學委員會，農業局，國家硏究會，國家學術出版社，華盛頓，D, C，1994。或者，本發明動物飼料添加物包括至少一種表A具體說明的個別成分。至少一種係指一種或更多種的，一，或 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 1h I · A7 1259759 ____B7____ 五、發明說明（β) 二，或三，或四等等，直到所有的十三種，或直到所有的十五種個別成分。更具體地，此至少一種個別成分係以一種可提供其飼料中濃度在表Α中欄4，或欄5，或欄6所示範圍內的量，被包含於本發明添加物中。如上述說明，相對應之飼料添加物濃度可藉由將這些範圍之間距範圍乘上10- 10000; 20- 2000;或100- 500 而得到。舉例而言，考慮到維生素A於預混物的含量要相當於10- 10000 IU/公斤之飼料含量。此運用可導致下列間距：每公斤添加物1〇〇- 1〇8 IU ;或200— 2xl07 IU ;或1000 -5><106IU。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂i •線丨“丨 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱) - 1259759 A7 B7 五、發明說明ul)

表A 營養素需求暈-及較佳範圍每kg飮食提供之營養素家禽小豬牡豬範圍1 範圍2 範圍3 脂溶性維生素維生素 A/[IU] -5000 1300—4000 10-10000 50-8000 100—6000 維生素 DV[IU] -1100 150-200 2-3000 5—2000 10-1500 維生素 E/[IU] -12 11 一 22 0.02-100 0.2—80 0.5-50 維生素 K/[mg] 0.5-1.5 -0.5 0. 005-10.0 0.05-5.0 0.1 — 3.0 7iC溶讎生素 Bi2/[mg] -0.003 0.005-0.02 0.0001 -1.000 0.0005 — 0.500 0.001- 0.100 生物素/[mg] 0.100 -0.25 0.05—0.08 0. 001-10.00 0.005 — 5.00 0.01- 1.00 膽鹼/[mg] 800— 1600 300-600 卜10000 5 - 5000 10—3000 微量礦物質鎂/[mg] 一 60 2.0 ~ 4.0 0.1-1000 0.5-500 1.0-100 鋅/[mg] 40—70 50 -100 1-1000 5 — 500 10 - 300 鐵/[mg] 50—80 40 —100 1-1000 5 — 500 10—300 銅/[mg] 6—8 3.0^6.0 0.1 — 1000 0.5-100 1.0—25 碘/[mg] -0.4 一 0.14 0.01-100 0.05-10 0.1 —1.0 5ffi/[mg] 一 0.2 0.10—0.30 0.005 -100 0.01 ~ 10.0 0.05-1.0 巨量礦物質鈣/[g] 8-40 5—9 0.1-200 0.5-150 1 一 100 磷，呈可利用的磷/[g] 3-6 1.5-6 0.1— 200 0.5 -150 1-50 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L51. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1259759 A7 B7 五、發明說明（乂）動物飼料細勿動物飼料組成物或飮食具有一相當高的蛋白質含量。根據前述國家硏究會（NRC)出版物，家禽及豬之飮食可以下列表B，欄2-3所示爲特徵。魚類飮食可以表B，欄 4所示爲特徵。此外，該等魚類飮食通常具有一粗脂肪含量200- 310克/公斤。這些魚類飮食係以鮭魚屬之魚的飮食爲例示，並以Τ· V· R· Pillay編著，Blackwell科學出版有限公司1900年之飼養或栽培水中動植物，原則及實務（ Aquaculture, principles and practice) ; John Ε· Halver 編著 ’學術出版公司1989年之魚類營養學（Fish nutrition)第二版爲其設計基礎。根據本發明之動物飼料組成物具有一粗蛋白質含量50 - 800克/公斤，而且更包括至少一種本文所主張之蛋白酶〇而且，或是或者（除了上述所示之粗蛋白質含量），本發明之動物飼料組成物具有10-30M〗/公斤之可代謝之能量含量；及/或0.1 - 200克/公斤之鈣含量；及/或o.i 一 2〇〇克/公斤之可利用的磷含量；及/或〇·ι 一 1〇〇克/公斤之甲硫胺酸含量；及/或0·1 - 150克/公斤之甲硫胺酸加上半胱胺酸含量；及/或0.5-50克/公斤之離胺酸含量。在特定之具體實施例中，可代謝之能量，粗蛋白質，鈣’磷，甲硫胺酸，甲硫胺酸加上半胱胺酸，及/或離胺酸之含量係在下面表Β範圍2，3，4，或5任一者之範圍內 (R. 2-5) 〇 22 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之沒意事項再填寫本頁) n n ϋ n n II i 一：OJ· n n n n 1« n n I n I n -II -ϋ ϋ n n ϋ 1· ϋ ϋ n ,:'爾_两鱗 A7 1259759 __B7__ 五、發明說明（W ) 粗蛋白質係如動物營養學（Animal Nutrition)第4版第 13 章（P. Mcdonald，R. A. Edwards 及 J· F. D. Greenhalgh 編著，Longman Scientific and Technical，1988 ，：[SBN 0-582-40903-9 )所述，以氮（N)乘上一係數 6·25來計算，即粗蛋白質（克/公斤）=N (克/公斤）X 6.25。該氮之含量係以Kjddahl氏法測定（A.O.A.C·， 1984，官方分析法第14版，官方分析化學家學會，華盛頓 DC)。可謝代之能量的計算可根據NRC出版豬的營養素需求、量（Nutrient Requirements of Swine) ( 1988 )第 2- 6 頁，以及歐洲家禽飼料之能量値表（European Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs)，Spelderholt 家禽硏究及延長之中心，7361 DA Beekbergen，荷蘭。Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen。ISBN 90-71463-12-5 〇在完整的動物飮食中，鈣，可利用的磷，及胺基酸之飮食含量係基於飼料表來計算，例如Veevoedertabel 1997， gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6，8219 pk Lelystad· ISBN 90—72839-13-7 o 在一特定具體實施例中，本發明之動物飼料組成物包含至少一種如前述所定義之植物蛋白質或蛋白質來源。在更進一步之特定具體實施例中，本發明動物飼料組成物包含〇- 80%玉米；及/或0- 80%高梁；及/或0-70 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •—— 訂-丨 1259759 Α7 ___________ Β7 五、發明說明（>v) °/〇小麥；及/或〇- 70%大麥；及/或〇一 30%燕麥；及/或0 一 40%黃豆粕；及/或0- 10%魚粉；及/或〇一 20%乳淸。動物飮食可被製造成例如糊狀飼料（mash feed)(非粒狀的）或粒狀飼料。典型地，將磨成粉的飼料予以混合，並根據對討論中之種類之詳述加入足量之必須維生素和礦物質。酵素可呈固體或液體酵素配方加入。例如，固體酵素配方典型地係在混合步驟之前或期間加入；而液體酵素製劑典型地係在製粒步驟之後加入。該酵素亦可倂入飼料添加物或預混物中。飮食中最終酵素濃度係在每公斤飮食中有0.01 — 200毫克酵素蛋白質之範圍內，例如，每公斤動物飮食中酵素蛋白質在5 - 30毫克之範圍° 動物飼料組成物的例子顯示於實施例11 ° (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂— —線丨 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) ..御嫌 A7 1259759 ______B7 五、發明說明Γ])

表B 勳物飲食中_能量，蛋白質及礦物質之範圍値營養素家禽小豬廢 /牡豬魚類 R. 1 R.2 R.3 R.4 R.5 最小値最小値最小値最大値最大値最大値可代謝之 12.1 12.9 14 一 10— 11 一 11 一 12— 能量一一 25 30 28 26 25 MJ/kg 13.4 13.5 粗蛋白質 124- 120 - 300— 50— 75- 100— 110— 120— g/kg 280 240 480 800 700 600 500 490 鈣 8-40 5—9 10— 0.1 — 0.5 — 1 一 100 4-50 g/kg 15 200 150 可利用的 2.1 - 1.5—5.5 3 -12 0.1- 0.5- 1- 1-50 1 一 25 磷 g/kg 6.0 200 150 100 甲硫胺酸 3.2- 一 12— 0.1- 0.5 - 1 一 50 1 一 30 g/kg 5.5 16 100 75 甲硫胺酸 4一 9 13-6.8 一 0.1- 0.5- 1-80 加半胱胺 150 125 酸 g/kg 離胺酸 2.5 — 6—14 12-22 0.5-50 0.5-40 1-30 g/kg 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨鲁-------訂---------線！在本發明用於處理植物蛋白質之方法的特定具體實施例中，亦包括另一添加植酸酶之步驟。而於另外的特定具體實施例中，除了以植酸酶及蛋白酶合倂處理之外，亦可添加另外的酵素，其中，這些酵素係選自包括其它蛋白酶 ’植酸酶，脂肪分解酵素，及葡萄糖苷酶/醣酶酵素之族群。該等酵素的例子示於WO95/28850。該蛋白酶當然應以一有效量施用，即以一足以增進溶 25 本紙張尺度適用f關家標準<CNS)A4規格C 297公爱)"~" . Jo:. ' 1259759 Α7 Β7 五、發明說明（/f) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 参訂i 解及/或增進飼料營養價値的量施用。目前預期酵素係以一種或更多種的下列數量（劑量範圍）施予：0.01 - 200 ;或 0.01— 100 ;或 0.05 — 100 ;或 0.05 — 50 ;或 0· 10 — 10—所有的這些範圍均爲每公斤飼料中之蛋白酶蛋白質毫克數（ ppm) 〇爲測定每公斤飼料中之蛋白酶蛋白質毫克數，將蛋白酶自飼料組成物中純化，而該經純化的蛋白酶之比活性係利用相關分析測定（見於蛋白酶活性，基質，及分析的部分）。該飼料組成物本身之蛋白酶活性亦利用相同分析法測定，而以這兩個測定爲基礎，計算每公斤飼料中蛋白酶蛋白質毫克數劑量。相同的原理用於測定飼料添加物中蛋白酶蛋白質毫克數。當然，如果有一可利用的用於製備飼料添加物或飼料之蛋白酶之樣品，則測定該樣品之比活性（不需要將蛋白酶從該飼料組成物或添加物中純化出來）。許多植物含有抗營養因子，例如植物凝血素及胰蛋白酶抑制劑。黃豆中最重要的抗營養因子爲植物凝血素黃豆凝集素（lectin soybean agglutinin，SBA)和黃豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI)。植物凝血素爲具有相當大特異性之結合至特定含醣分子之蛋白質，且當攝取後他們變成結合至腸的上皮細胞。這會導致減少上皮細胞之可行性及減少營養素的吸收。 SBA爲一糖基化、具亞單位分子量約30 kDa之四聚 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1259759 A7 B7 五、發明說明（〜<) 體的植物凝血素，且對N-乙醯半乳糖胺具高度親合力。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) φ 訂i ά—φ—ί 胰蛋白酶抑制劑影響腸的蛋白水解作用’減低蛋白質可消化性，且亦增加從胰臟分泌消化酵素’導致呈消化酵素形式之胺基酸的減少。胰蛋白酶抑制劑的一個例子爲鮑曼-伯克抑制劑（Bowman—Birk inhibitor)，其具有約8 kDa之分子量，含有7個雙硫橋聯和兩個對胰蛋白酶類及胰凝乳蛋白酶類蛋白酶具特異性之抑制環。其它例子有所謂之孔尼茲抑制因子（Kunitz Inhibit〇rs of Factors)(例如黃豆孔尼茲胰蛋白酶抑制劑，其包含一個對胰蛋白酶類之蛋白酶的結合位置，並具有約20 kDa之分子量）。根據本發明所用之蛋白酶已顯示可水解抗營養因子如 SBA植物凝血素，以及胰蛋白酶抑制劑，鮑曼-伯克抑制劑及黃豆孔尼茲因子。見實驗部分，實施例5。因此，本發明亦係關於酸安定性絲胺酸蛋白酶於水解或減少抗營養因子的量之用途，抗營養因子例如SBA植物凝血素以及胰蛋白酶抑制劑，如鮑曼-伯克抑制劑，及孔尼茲因子如黃豆孔尼茲因子。實施例1 .篩潠酸安定件蛋白醃分析大量的蛋白酶在pH 3之安定性，其目的在於確認具有通過單胃動物酸性的胃所必需的安定性的蛋白酶。該等蛋白酶已以一般的層析法純化，例如離子交換層析法，疏水性作用層析法（hydrophobic interaction 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） . .,.·... .. A7 1259759 五、發明說明) chromatography )及尺寸-排阻層析法（size exclusion chromatography )(見於例如蛋白質純化，原理，局解析方法及應用（Protein Purification，Principles，High Resolution Methods, and Applcations )。編者：以11一 Christer Janson，Lars Ryd0n，VCH 出片反社，1989 ) 〇蛋白酶活性測定如下··蛋白酶在25°C，pH 9.5，以 1.67% Hammarsten氏酪蛋白培養30分鐘，然後加入TCA (三氯醋酸）至最終濃度爲2% (w/w)，將混合物過濾以移除沉積物，分析濾液中之游離初級胺基（以比色分析法測定，以OPA (〇-phthal-dialdehyde)爲基礎，藉由測量在 34〇 nm的光吸收，使用一絲胺酸標準物（Bi〇chemische Taschenbuch teil II, Springer—verlag (1964)第 93 禾Q第 ι〇2 頁）。一個酪蛋白蛋白酶單位（CPU)被定義爲在標準情況下，即在25°c及pH 9·5，每分鐘釋放1 mm〇1 TCA—可溶性初級胺基之酵素的量。將蛋白fe於水中稀釋至活性爲0.6 CPU/升，分成兩等份’而每一寺份丨女者再分別以pH 3、1 〇Q mM檸檬酸鹽緩衝液及pH 7、100 mM磷酸鹽緩衝液稀釋至〇·3 CPU/升。經稀釋之樣品在37t培養1小時，並將2〇μ1樣品施加至，含有1 %脫脂牛乳之1 %瓊脂醋平板的孔洞中。該平板（ pH 7·0)於37°C下隔夜培養並測量透明區域。在此試驗中42種蛋白酶表現良好。其中一些已被定性，見實施例2 , 6，7及8。這些蛋白酶均屬於絲胺酸蛋白酶之枯草桿菌蛋白酶家族。 w ' 28 本紙張尺度i用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參-------訂---------線- 1259759 A7 ____B7__ 五、發明說明) 實施例2 (請先閱讀背面之泫意事項再填寫本頁) 衍生自芽孢.桿菌NCIMB 40484之枯草桿菌蛋白蘭的定性及比較硏究衍生自芽孢桿菌NCIMB 4〇484之蛋白酶係依 W〇93/24623中實施例1的描述製備。此定性之目的在於硏究其相較於Sub. Novo，Sub.

Novo (Y217L)及 SAVINASETM 之 PH-安定性，pH-活性及溫度-活性之量變曲線。

Sub. Novo係來自解澱粉芽孢桿菌之枯草桿菌蛋白酶，而Sub· Novo ( Y2HL )爲其突變體，其揭示於 WO96/05739。Sub. Novo係以一般方法自野生型菌株培養中製備及純化，而該突變體係如EP 130756實施例1一 2及 15 - 16所述製備。 SAVINASETM 爲一衍生自 Bacillus clausii (先前之遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus) NCIB 10309)之枯草桿菌蛋白酶，商業上可得自 Novozymes A/S，Krogshoejvej，DK-2880 Bagsvaerd，丹麥。其製備已描述於美國專利第 3723250 號。

.實施例2A 蛋白醃樣品SDS-PAGE純度之測定蛋白酶樣品之SDS-PAGE純度係由下列步驟測定： 4〇μ1蛋白酶溶液（A2S〇濃度=〇·〇25 )於冰上 Eppendorf之試管中與10μ1 50% (w/v) TCA (三氯醋酸） 29 本紙張尺度ϋ中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " ' ~ A7 1259759 ____B7___ 五、發明說明（>β) 混合。於冰上半小時後，將該試管予以離心（5分鐘，Ot ，14.000 X g)並將上澄液小心移除。將20μ1 SDS-PAGE 樣品緩衝液（ 200μ1 Tns-甘胺酸SDS樣品緩衝液（2x)( 125mM Tris/HCl，pH 6.8，4% (w/v) SDS，50 ppm 溴藍，20% (v/v)甘油，LC2676 來自 NOVEX™) +160μ1 蒸餾水+ 20μ1/3-锍基乙醇+ 20μ1 3Μ未緩衝之Tris Base ( sigma T-1503 )加入沉澱物並將試管煮沸3分鐘。將該試管予以短暫離心並將1〇μ1樣品加至購自NOVEXTM2 4 — 20%梯度Tris-甘胺酸預澆鑄凝膠（基於Laemmli chemistry 之聚丙醯胺梯度凝膠但在凝膠中不含有SDS (Laemmli，英國（1970)自然（Nature)，第 227 卷第 680 - 685 頁） EC60255 )。電泳於兩個緩衝液貯存槽中均以Tris-甘胺酸分離膠體緩衝液（2.9克Tris Base，14.4克甘胺酸，1.0克 SDS，蒸餾水定容至1升）在150V固定電壓進行，直到溴酚藍追蹤染料達到凝膠底部。電泳後，該凝膠以1〇〇毫升蒸餾水藉由溫和搖盪被沖洗3次，每次5分鐘。然後該凝膠與Gdcode®藍色染料試劑（得自PIERCE之膠狀考馬斯 G-250產品，PIERCE目錄編號24592)溫和搖盪1小時，然後以蒸餾水藉由溫和搖盪8至16小時且更換蒸餾水數 .次予以淸洗。最後，該凝膠在兩張玻璃紙間乾燥。乾的凝膠以Aixus II掃描儀掃描，其係得自AGFA，配有 Fotolook 95 ν2·08 軟體及藉由下列設定（Fotolook 95 ν2·08 的設定）之檔案/取得指令，輸入視窗之影像評估軟體 CREAMtm (目錄號碼 990001 和 990005，Kem-En-Tec， 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-------訂·--------I 1259759 A7 B7 λ； ' ------------- 五、發明說明（> ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁> 丹麥）：原始的=反射的，模式二顏色RGB，掃描解析度 =240 ppi，輸出解析度二1201 pi，比例因數二1〇〇% ’範圍二具球狀選擇之矩形圖且最小値=0而最大値= 215 ,色調曲線=無，淸晰=無，去掃描=無，及風味二無，由此產生SDS-PAGE凝膠之*.img圖片檔，其係用於CREAM™ 之g平估。該*.img圖片檔係以選單指令分析/i-D評估。以泳道放置工具（Lane Place Tool)將兩條掃描線置於*.img 圖片檔上：一樣品掃描線和一背景掃插線。樣品掃描線係置於樣品泳道（sample lane)(具討論中之蛋白酶）的中間，從剛好低於施用狹縫到剛好高於溴酚藍追蹤染料位置。背景掃描線係與樣品掃描線平行放置，但是是在圖片 SDS-PAGE凝膠上沒有施用樣品的位置，背景掃描線之起點和終點係與樣品掃描線之起點和終點垂直。背景掃描線代表凝膠之真正的背景。掃描線的寬度和形狀未被調整。沿著掃描線之強度現以具介質敏感性之1-D/掃描選單指令記錄。利用1 - D/編輯選單指令，將背景掃描自樣品掃描減去。然後選擇1 - D/結果選單指令，然後以CREAM™ 軟體計算蛋白酶尖峰之面積％，作爲蛋白酶SDS-PAGE純度。 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1259759 --—-— —___ B7 五、發明說明（fp ) 得到下列結果：蛋白酶 SDS-PAGE 純度（面積°/〇) 來自芽孢桿菌NCIMB 40484 96.3 Sub. Novo 95.5 Sub. Novo (Y217L) 96.0 Savinase® 99.2 實施例2B βΗ-活件分析使用 Sue-AAPF-pNA (Sigma®S-7388 )以得到 pH-活性量變曲線。分析緩衝液·· 100 mM琥珀酸（Merk 1.00682)，100 mM HEPES (Sigma H-3375 )，100 mM CHES ( Sigma C -2885 )，100 mM CABS (Sigma C—5580 )，1 mM 氯化鈣，150 mM氯化鉀，0.01% Triton⑧X-100，以鹽酸或氫氧化鈉調整至 pH 3.0，4·0，5.0，6.0，7·0，8.0，9.0，10.0，或 11.0 〇分析溫度：25°C。將300μ1蛋白酿樣品（稀釋於〇·〇ι% Triton® X-100中 )與1·5毫升各個pH値之分析緩衝液混合，使得混合物之 pH値爲分析緩衝液之pH値。藉由加入1.5毫升pna基質 (50毫克溶於1·〇毫升DMSO，且進一步以0.01% Trito’X-100稀釋45χ)開始反應，且於混合後，以分光光度§十監測八心5之增加，作爲在討論中値之蛋白酶活 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I -------訂---------線丨 1259759 a7 ___J7____ 五、發明說明（M) / 性的測量。以其它pH値之分析緩衝液重複此分析試驗’ 並將活性測量値作成相對活性對PH之圖表。將相對活性以最高活性（pH-最適値）標準化’換言之’將PH-最適値之活性設爲1，或100% °將蛋白酶樣品稀釋以確保所有的活性測量値均落於此分析劑量-反應曲線之線性部分。實施例2C pH-安定件分析使用 Sue-AAPF-pNA (Sigma® S-7388 )以得到 pH-安定性量變曲線。分析緩衝液：1〇〇 mM琥珀酸’ 100 mM HEPES ’ 100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM 氯化鈣，150 mM 氯化鉀，0.01% Triton® X-100，以鹽酸或氫氧化鈉調整至pH値 2.0 ， 2.5 ， 3.0 ， 3.5 ， 4.0 ， 4.5 ， 5.0 ， 6.0 ， 7.0 ， 8.0 ， 9·0 ， 10.0，或 11·0。各蛋白酶樣品（於1 mM琥珀酸，2 mM氯化鈣，100 mM氯化鈉，pH 6.0中且A28G之光吸收> 1〇)於各測試pH 値之分析緩衝液中稀釋至Α28〇= 1·〇。經稀釋之蛋白酶樣品在37°C培養2小時。培養之後，蛋白酶樣品稀釋於1〇〇. mM 琥珀酸，100 mM HEPES，1〇〇 mM CHES， 1〇〇 mM CABS，1 mM 氯化鈣，150 mM 氯化鉀，〇·〇ΐ% Tdton⑧ X— 100，pH 9.0中，使所有樣品之PH値爲9.0。在下列活性測量中，溫度爲25°C。將：>00μ1經稀釋之蛋白酿樣品與1.5毫升pH 9.0分析 33 本紙張尺度適用中闕家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）' -------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •--------訂---------線丨- 1259759 B7 五、發明說明（緩衝液混合，並藉由加入1.5毫升pNA基質（50毫克溶於 1.0毫升DMSO，且進一步以〇.〇U Tnton⑧X-1〇〇稀釋 45x)開始活性反應，且於混合後，以分光光度計監測a4〇5 之增加，作爲（殘餘）蛋白酶活性的測量。在不同的pH 値進行37°C的培養，並將活性測量値作成殘餘活性對pH 之圖表。將殘餘活性以一平行培養（對照組）之活性標準化，對於平行培養，該蛋白酶在活性測量前，如同其它培養一樣，以pH 9·0之分析緩衝液稀釋至A28G= 1.0，且在5 °C培養2小時。在活性測量前將蛋白酶樣品稀釋以確保所有的活性測量値均落於此分析之劑量-反應曲線的線性部分 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·1 實施例2D 溫度-活件分析 •線丨丨使用Protazyme AK錠劑以得到溫度量變曲線。 Protazyme AK錠劑是由Megazyme製成呈錠劑之天青色苯胺染料（azudne)染色的交聯酪蛋白。分析緩衝液：1〇〇 mM號班酸，1〇〇 mM HEPES，100 mM CHES，100 mM CABS，1 mM 氯化鈣，15〇 mM 氯化鉀，0.01% Triton® X-100，以氫氧化鈉調整至pH 9·0。將Protazyme ΑΚ錠劑藉由溫和攪拌懸浮於2.0毫升 0·01% Triton® X-100。500 μΐ 該懸浮液與 500 μΐ 分析緩衝液於Eppendorf試管中混合並置於冰上。加入2〇 μΐ蛋白酶樣品（稀釋於0.01% Triton X-100 )。該分析係藉由將 34 本紙張尺Ϊ適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 " 1259759 A7 R7 五、發明說明（了》

Eppendorf試管移至設在分析溫度之Eppendorf熱攪拌器而開始。該試管在Eppendorf熱攪拌器上，在它的最高振盪速度下培養15分鐘。藉由將試管移回冰浴停止分析培養。該試管於冰-冷的離心機中離心數分鐘並用分光光度計讀取上澄液之A65Q。一緩衝液盲試樣被包含於此分析中（代替酵素）。A65q(蛋白酶）—a65。(盲試樣）爲蛋白酶活性之測量値。在不同的溫度下進行分析，並將該等活性測量値以相對活性對培養溫度作圖。將相對活性以最高活性（溫度-最適値）標準化。將蛋白酶樣品稀釋以確保所有的活性測量値均落於此分析劑量-反應曲線之近線性部分。活性最適値（pH-和溫度活性）之綜述見於表i。PH-安定性，pH-活性，及溫度—活性量變曲線見於圖1-3，蛋白酶在酸性pH-値之pH-安定性數據之詳細比較見於表2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂---- 表.丄多種蛋白酿之及總度最適値

蛋白酶 PH-最適値 (pNA-® 質）溫度-最適値在 pH 9.0 (Protazyme AK) 來自芽孢桿菌 NCIMB 40484 9 6CTC Sub. Novo1 10 70°C Sub. Novo (Y217L)2 9 7(TC SAVINASE™3 9 70°C •線丨丨 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1259759 A/ ___B7_ 五、發明說明表2 多種蛋白醃之pH-安定性，介於pH 2.0至5.0之間蛋白酶 pH 2.0 pH 2.5 pH 3.0 pH 3.5 PH 4.0 PH 4.5 pH 5.0 來自芽孢桿菌 NCIMB 40484 0.001 0.001 0.428 0.940 0.991 0.989 0.991 Sub. Novo 0.007 0.003 0.000 0.000 0.024 0.784 0.942 Sub. Novo (Y217L) 0.000 0.000 0.002 0.003 0.350 0.951 0.996 Savinase® 0.001 0.001 0.001 0.003 0.338 0.929 0.992 實施例2E 經純化的蛋白醃樣品之光吸收純度比値之測定經純化的蛋白酶樣品之A28Q/A26()比値測定如下。 A26〇表示蛋白酶樣品相對於一緩衝液空白對照於1公分光徑比色杯中在260nm之光吸收。A28〇表示同一蛋白酶樣品相對於一緩衝液空白對照於1公分光徑比色杯中在 280 nm之光吸收。從實施例2及6得到的經純化的蛋白酶之樣品以緩衝液稀釋直到分光光度計A28Q之讀數在它的反應曲線之線性部分範圍內。a2SQ/a26()比値係由這些讀數決定。 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） r先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂i 丨線丨丨_ A7 1259759 五、發明說明（測試基質，即所謂黃豆殘餘物’係以一種模仿單胃動物消化道之方法製造，其包括一在PH 2之胃蛋白酶處理，及一在pH 7之膜酿處理。在胰酶處理步驟中，加入高劑量之一個範圍的商業酵素用以降解可爲現行商業酵素使用之SBM成分。加入下列酵素，其均爲商業上可得自N〇v〇zymes A/s ，丹麥：ALCALASETM 2.4 L，NEUTRASEtm 0·5 L ’ FLAVOURZYME™ 1000 L，ENERGEX™ L，BIOFEED™ Plus L，PHYTASE NOVO™ L。所使用的SBM爲一用於飼料之標準48%蛋白質SBM，其已製成粒狀。在處理之後，只有總蛋白質的5%被留在所產生的黃豆殘餘物中。 FITC標記方法該殘餘物隨後以FITC (分子探針，F-143)標記如下 :將黃豆殘餘物（25克溼，〜5克乾）懸浮於1〇〇毫升0.1 Μ碳酸鹽緩衝液，pH 9，並在40°C攪拌1小時。將該懸浮液冷卻至室溫並在暗處以螢光素5-異硫氰酸鹽（FITC)隔夜處理。未偶聯之探針以超過濾（10.000 Mw截止）移除〇 ‘ FITC -分析使用經FITC標記之黃豆殘餘物測試蛋白酶降解黃豆殘餘物之能力，其係利用下列分析法：在37°C將〇·4毫升蛋白酶樣品（具A28()=〇.l)與0·4毫升FITC-黃豆殘餘物 (1〇毫克/毫升於0.2 Μ磷酸鈉緩衝液，pH 6.5，的懸浮液 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---- 線丨_丨-丨 1259759 A7 _B7 " ~ — —-— 五、發明說明（f /) )混合，並在培養〇小時後及在22小時後，測量相對之營光單位（RFU 485/535nm ;激發/監測波長）。在測定RFU 之則，將樣品在20.000 X G離心1分鐘並將250微升上濟液轉移至一黑色微量滴定盤（micro-titer tray )。丨吏帛 VICTOR 1420多標記計數器（試管內，丹麥）進行測量。 RFU經Iain D. Johnson槪括說明於：螢光技術入門，螢光探針及硏究化學品手冊，分子探針（Introduction t0 Fluorescence Techniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Dhemicals, Molecular Probes) ，Richard P.

Haugland，第 6 版，1996 ( ISBN 0-9652240-0-7 )。藉由添加0.4毫升緩衝液代替酵素樣品來製備盲樣品〇 RFU樣品=△RFU樣品一△RFU盲樣品，其中△RFU = RFU(22 小時）-RFU(0 小時）所產生的FITC値（RFU樣㊣値）顯示於下表3。該 FITC値一般具誤差幅度+ /— 20.000。和蛋白酶I及蛋白酶 II相反的，衍生自芽孢桿菌NCIMB 4〇484之蛋白酶會降解黃豆殘餘物至一顯著的程度。 .表3 蛋白醃降解黃豆殘餘物之能力蛋白醃 FITC (+/—20000) 芽孢桿菌NCIMB 40484 61900 蛋白酶I -9200 蛋白酶II -1200 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---訂----- 線！ A7 1259759 _____Β7____ 五、發明說明 mmmjr 近芽孢捍菌NCIMB 40484之蛋白酶的試管內試驗衍生自芽孢桿菌NCIMB 40484之蛋白酶與其它枯草桿囷蛋白酿如 SubNovo，SubNovo (Y217L) ，SAVINASE™ 及ALCALASETM—起測試其在自動化試管內消化系統（模擬單胃動物之消化作用）中溶解玉米-SBM (玉米-黃豆粕 )蛋白質的能力。對於空白處理，係將玉米-SBM在缺乏外源性枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶下培養。該試管內系統由30個燒瓶構成，於其中，玉米-SBM 基質最初以HC1/胃蛋白酶培養-模擬胃的消化作用-然後以胰酶-模擬腸的消化作用。在胃的培養期間的最後，移除試管內消化之樣品並分析溶解了的蛋白質。基質使用10克之玉米-SBM比例爲6 : 4 (w/w)之玉米一 SBM飮食。蛋白質含量在SBM爲43% (w/w)而在玉米粗粉中爲8.2% (w/w)。在10克玉米-SBM飮食中蛋白質之總量爲2.21克。消化酵素胃蛋白酶（Sigma P - 7000 ; 539 U/毫克，固體），胰酶（Sigma P-7545 ; 8 XU.S.P· (US Pharmacopeia))。 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I -------訂·-------· 丨 A7 1259759 ______B7 sc7 五、發明說明（Ί丨）試管內消化步驟槪要加入燒瓶中的成分 pH 溫度時間過程模擬的消化階段 l〇g玉米-SBM飮食（6:4)， HC1/胃蛋白酶(3000U/g飮食），蛋白酶（0.1 mg蛋白酶酵素蛋白質/g 飮食） 3.0 40°C t=0 分鐘胃的 NaOH 6.8 40°C t=60 分鐘腸的 NaHCCW胰酶（8 mg/g 飮食） 6.8 40°C t=90 分鐘停止培養，移除整分部分 7.0 0°C t=330 分鐘 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酵素蛋白質測定蛋白酶酵素蛋白質的量係以A28〇値及胺基酸序列（胺基酸組成物）爲基礎，利用S. C. Gill & P.H. von Hipped 分析生物化學（Analytical Biochemistry) 182，319—326 (1989 )槪述之原理來計算。試管內樽型之實驗步驟 1. 稱取10克基質到100毫升燒瓶中。 2. 在時間0分鐘，於混合下，將含有胃蛋白酶（3000 U/克飮食）之46毫升HC1 (0.1M)，及1毫升蛋白酶（ 0.1毫克酵素蛋白質/克飮食）加至該燒瓶。該燒瓶在40°C 下培養。 3. 在時間30分鐘，測量pH。 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^---------^ I ^_wl.---.-------- A7 1259759 五、發明說明（年L:) 4. 在時間45分鐘，加入Μ毫升H20。 5. 在時間60分鐘，加入7毫升Na〇H(0.39M)。 6·在時間90分鐘，加入含有胰酶（8.0毫克/克飮食）之 NaHC03 ( 1 M) 5 毫升。 7·在時間120分鐘，測量pH。 8·在時間300分鐘，測量pH。 9·在時間330分鐘，移除30毫升樣品，並在離心（ 10000 X g，10分鐘，)前置於冰上，移除上澄液並儲存於-20°C。以凝膠過濾HPLC評估溶解了的蛋白質來自試管內消化後樣品的上澄液中之溶解了的蛋白質含量，係利用凝膠過濾HPLC定量粗蛋白質（CP)來評ί古。將上澄液解凍後，以0.45 μιη聚碳酸酯過濾器（ Sartorius)過濾，然後以水稀釋（1 : 50，ν/ν)。稀釋後樣品以HPLC層析分離，使用Supeniex Peptide ΡΕ ( 7.5x300 mm)凝膠過濾管柱（Global)。用於同溶劑洗脫 (isocratic elution)之洗脫液爲含有150 mM氯化鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.0)。洗脫液每次之總體積爲26 •毫升而流速爲0.4毫升/分鐘。在214 nm記錄洗脫曲線並以積分決定曲線下之總面積。爲了從積分面積估量蛋白胃含量，製作一校正曲線（R2= 0.9993 )，其係由一具已知總蛋白質含量之試管內消化的參考玉米-SBM樣品的一稀釋系列製得。此參考樣品之蛋白質測定係經由Kjeldahl氏 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ ir---------線！ 1259759 A7 B7 五、發明說明（⑹）法完成（氮的百分比之測定；A.O.A.C. ( 1984 )官方分析法第14版，華盛頓DC)。結果，即在試管內多種蛋白酶對蛋白質溶解度之影響，顯示於下表4。溶解了的蛋白質之相對應量之計算’係以試管內消化反應期間溶於75毫升總體積之10克玉米-SBM飮食（ 2.21克蛋白質）之蛋白質總量爲基礎。假設完全的蛋白質溶解（100% )，上澄液中之蛋白質含量會是每體積2·95% 重量。以變異數之單向分析（ρ= 0.0001 )分析結果。SD二標準偏差；η=每種處理之重複數目° 衍生自芽孢桿菌NCIMB 40484之蛋白酶與其它蛋白酶相較，在蛋白質溶解作用上具有顯著較佳之效果。 &Α 酵素可溶性CP ) SD 來自芽孢桿菌NOMB 40484之蛋白酿 78.8a 0.48 Sub. Novo 76.7b 0.37 ALCALASE™ 73.9C 1.04 Sub. Novo (Y217L) 75.8b 0.91 SAVINASE™ 75.8b Ί 0.85 空白對照 76.68 0.88 A，Β，C :未共同使用同一指示字母的數値有顯著差異 (ρ < 0.05 ) 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂·-------1 I ----- A7 1259759 κ 五、發明說明（l·-) 實施例5 植物凝血素SBA及黃豆鮑尋-伯克與孔尼茲抑制胃丨丨夕降解作用測試來自芽孢桿菌NCIMB 40484之蛋白酶水解黃豆凝集素（SBA)以及黃豆鮑曼-伯克和孔尼茲胰蛋白酶抑制劑之能力。在 pH 6.5，37。(：下，將純的 SBA ( Fluka 61763 )，鮑曼-伯克抑制劑（Sigma T-9777)或孔尼茲抑制劑（來自黃豆之胰蛋白酶抑制劑，Boehringer Mannheim 109886)與蛋白酶一起培養2小時（蛋白酶··抗營養因子=1 : 10，以 A28〇爲基礎）。培養緩衝液：5(3 mM二甲基戊二酸，150 mM 氯化鈉，1 mM 氯化銘，0.01% Triton X-100，pH 6.5 ο 蛋白酶降解SBA及蛋白酶抑制劑的能力係由在SDS-PAGE凝膠上，該天然SBA或胰蛋白酶抑制劑區帶的消失以及低分子量降解產物的出現來評估。凝膠係以考馬斯藍染色並藉掃描測定區帶強度。該結果，如抗營養因子降解之百分比，顯示於下表5 〇可考慮的是，降解黃豆中抗營養因子的能力亦可在將黃豆粕與候選蛋白酶予以培養後，以對抗SBA，鮑曼-伯克抑制劑或孔尼茲抑制劑之抗體，應用Western技術來評估 (見於 WO98/56260)。 44 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂·--------'^丨· 1259759 B7 五、發明說明蛋白酶 SBA 鮑曼〆白克孔尼茲衍生自抑制劑抑制劑芽孢桿菌NCIMB 40484 21 41 100 ΜΜΜΛ 另外牧酸安定性枯草桿菌蛋白酺之製備 pf鹼芽_孢桿菌蛋白醃之製備將嗜鹼芽孢桿菌NCIMB 10438自冷凍乾燥培養物接種至搖動燒瓶中，每個燒瓶含有100毫升具下列組成之BPX 培養基：於自來水中，馬鈴薯澱粉100克/升，大麥麵粉 50 克/升，BAN 800 MG (可得自 Novozymes A/S ) 0.05 克/ 升，酪蛋白鈉10克/升，黃豆粕20克/升，磷酸氫二鈉9 克/升，普盧藍尼克（Pluronic) PE 6100 〇·1毫升/升。在培養之前，每一搖動燒瓶以1〇毫升1 Μ二碳酸氫鈉將pH 調整爲9·7。該菌株在300 rpm，30°C下發酵4天。由此培養物接種於含有1〇〇毫升BPX培養基之新的搖動燒瓶，並發酵3天。純化該培養液在1升之燒杯中於1〇⑼〇 X g離心30分鐘。將上澄液合倂然後進一步藉由通過Seitz K-250深之濾板過濾而予以澄淸。將該淸澈的濾液在一 3kDa截止聚醚楓卡式盒（Filtron)上超過濾來濃縮。濃縮後之酵素於G25 45 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 ϋ n an n n I— n 一-^^ I ϋ n n n n «I ϋ I n n n n n n n 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) A7 1259759 _______B7___ 五、發明說明（ί.Γ〔）

Ell 下列部份的胺基酸序列被測定：序gL遵識編號：1 衍生自枝頂孢菌（Acremonium Chrysogenum) ATCC 48272 之蛋白酶之胺基末端：ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSm* 序列遵識編號：2 衍生自嗜驗芽孢桿菌（Bacilllus alcalophilus) NCIMB 10438之蛋白酶之胺基末端：NQVTPWGITRVQAPTAW'· 序列辨識編號：3 衍生自擬青黴菌（Paecil〇myces Hiacinus ) CBS 1〇2449之蛋白酶之胺基末端：aytqqpgapwglgrish; 序列辨識編號=4 衍生自尖鐮孢（Fusarium oxysporum) IFO 4471 之蛋白翻之胺基木牺 ALTTQSGAT WGLGT VS HRS RGS. 衍生自芽孢桿菌NCIMB 40484之蛋白酶的胺基酸序列，存本文爲序列辨識編號：5，在先前已經測定（見於US 專利號5,650,326，序列辨識編號：4 ’ 6和8)。於公開的蛋白質資料庫搜尋相關的序列顯示如下：序列辨識編號=6

Geneseqp/ r65936 (參考 EP 623672 之擬青黴菌（ 47 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公·« ) (請先閱讀背*之土意事項再填寫本頁) Φ---- 訂---------線！ A7 1259759 __B7 —__

I 五、發明說明（^/) 嘗施例8 以鏈球菌屬枯草桿菌蛋白酿抑制激（SSI)抑制蛋良酶.， pNA 基質：Sue-AAPF-pNA (Sigma⑧ S-7388 )係在抑制作用後用於測量殘餘活性。分析緩衝液：1〇〇 mM琥珀酸（Merk 1.00682 ) ’ 100 mM HEPES ( Sigma Η-3375 )，100mMCHES(SigmaC-2885 )，100 mM CABS (Sigma C-5580 )，1 mM CaCl2 ，150 mM KC卜 0.01% Triton⑧ X-100，pH 9.0。分析溫度：25°C。利用層析法自白淺灰鏈黴菌（StrePt〇myces albogriseolus) FERM P-1205 (S-3253 )發酵上澄液中將 SSI純化出來。所用之SSI製劑具有高於95%之純度-純度係依實施例2A所描述之步驟測定。或者，SSI可由日本之 Wako 獲得，目錄編號 303-05201，由 Daiwa Kasei K. K. 製造（見方令如：h印://search.wakcM：hemxo.jp/lifedb一e/lifedocs—e/44834.asp )° 在下面抑制分析之前，SSI以0.01% Triton X-100稀釋至A28G濃度= 0.010。蛋白酶：所用之蛋白酶具高於95%之純度-純度係依 ‘實施例2A所描述之步驟測定。在下面抑制分析之前，蛋白酶以 0.01% Triton X-100 稀釋至 A28〇濃度=0.010 〇以下列步驟測定鏈球菌屬枯草桿菌蛋白酶抑制劑（SSI )對蛋白酶之抑制作用：

將300μ1蛋白酗樣品（A28〇濃度=0.010 )與3〇〇μ1 SSI 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ' -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

一OJ. n n n n ϋ n κϋ I n I n ϋ n n n ϋ n I— I— n in n n ·1 n ϋ —.1 ϋ I 1259759 A7 R7 ~ ----—__ 五、發明說明照處理’ ί守到不3酵素之貫驗用飮食，或者是分配至酵奉處理’得到每公斤飼料補充有100毫克芽孢桿菌NCIMb 40484蛋白酶之酵素蛋白質的實驗用飮食。每一種處理以12組重複之，每種性別6組。每組在第 8及第29天稱重。測定期間之飼料消耗量，並計算體重之增加及飼料轉換率。以玉米澱粉及黃豆粕（44%粗蛋白質）作爲主要成分 (表9)爲基礎之貫驗用飮食係於CRNA製備。該飼料在約70 °C製粒（f旲結構：3X20毫米）。適量之芽孢桿菌 NCIMB 40484蛋白酶以一固定量的水稀釋，並噴灑於粒狀飼料上。封於封照處理’用適量的水以同樣的方法來作處理。關於統計評估，使用SAS成套軟體（SAS Institute Inc.，1985 )之GLM步驟進行二因素變異數分析（因素·· 處理和性別）。處理平均値間之不同係以Duncan試驗分析，並指出顯著的處理效果（p < 0.05)。由於技術性原因，一籠酵素處理被排除在統計評估之外。肉雞從8到29天生長成果的結果列於表2。處理與性別之間並未有互相影響，因此提出兩種性別之共同的結果 .。於實驗飼料中補充芽孢桿菌NCIMB 4〇484蛋白酶在數字上增進了體重之增加6.6%。蛋白酶之添加稍微增加飼料攝取率3.1%，芽孢桿菌NCIMB 40484蛋白酶顯著增進肉雞之飼料轉換3.4%。考慮到玉米澱粉爲一高度可消化的成分，可假設所觀 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n Jf · H·· ·ϋ ϋ— n n ϋ ΛΜΜ9 I «1 m ·1 nf n imw HI n n n mMMt i «_1 f I l_i «ϋ an an i «n n i_l Hi - 1259759 A7 ___ B7 ____ 五、發明說明（t）察到的效果主要是由於酵素對黃豆粕之作用。因此’結果顯示芽孢桿菌NCIMB 40484蛋白酶增進了黃豆粕的營養價値。總之，此硏究結果顯示於含有高量黃豆粕之肉雞飼料中，以每公斤飼料100毫克酵素蛋白質的量補充芽孢桿菌 NCIMB 40484蛋白酶，會造成體重增加之數字上的增加，以及飼料轉換的顯著增進。參考資料 EEC ( 1986 ) · Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur energetique aes aliments composes destines a la volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53 — 54. SAS Institute Inc. ( 1985 ) : SAS®使用者指南，第 5 版，Cary NC 〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂·--------*5^ 丨 1259759 A7 五、發明說明表實驗用敗食成分（％玉米澱粉黃豆粕441 動物脂黃豆油 DL-甲硫胺酸

MCP 鹽黏結劑維生素及礦物質預混物 Avatec® 15% CC2 ---------·—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分析的含量：粗蛋白質U ) ME，N-校正的（MJ / kg) 麵旨肪（％ )

1分析的含量：90.6%乾物質，45.3%粗蛋白質，2.0%粗脂肪，4.9%粗纖維訂線 2相當於90毫克拉薩里菌素—Na /公斤飼料作爲抗球蟲的 .3以分析的營養素含量爲基礎計算（EC-equation; EEC， 1986) 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1259759 A7 ___B7__ 五、發明說明（θ) f司料成分供應者玉米澱粉：Roquettes FrSres，F-62136 Lestrem，法國黃豆粕 44 : Rekasan GmbH, D-07338 Kaulsdorf，德國動物脂：Fondoirs Gachot SA· F-67100 Strasbourg，法國黃豆油：Ewoco Sarl，F-68970 Guemar ^ 法國 DL-甲硫胺酸·· Produit Roche SA，F-92521 Neuilly-sur-Seine，法國 MCP : Brenntag Lorraine，F-54200 Toul，法國鹽：Minoterie Moderne，F-68560 Hirsingue，法國黏結劑：Minoterie Moderne，F-68560 Hirsingue，法國預混物（AM vol Chair NS 4231 ) : Agrobase，F-01007

Bourg-en-Bresse，法國

Avatec : Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine，法國 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·丨丨丨丨丨丨.丨線」本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1259759 ^ A/ _B7 五、發明說明（^) 表10 肉雞從8到29天之成果兩種件別之共同結果；平均値±標準偏差產品每kg飼料之劑量籠X隻數對照組 0 12X6 芽孢桿菌 NCIMB 40484 蛋白酶 100 mg酵素蛋白質 11X61 增加的體重 1155 A 1231A (g/隻） ±94 ±98 (% ) 100.0 106.6 飼料攝取 1941A 2002 A (g/隻） ±108 ±145 (% ) 100.0 103.1 飼料轉換 1·684Α 1.627 B (g飼料/ g增加的體重） ±0.069 ±0.031 (% ) 100.0 96.6 (請先閱讀背面之>!-意事項再填寫本頁) ;#--------訂---------線！同一列中之平均値未享有共同的上標者爲顯著不同的 (p < 0.05 ) 1由於技術性原因，有一籠被排除在統計評估之外。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1259759 ___B7_________ 五、發明說明（t^|) 亶座例11 n今火雞及鮭魚屬之魚的補充有酸菌蛋白_藍混物及飮食製備下列組成物之預混物（每公斤之含量）： 5000000 正維生素A 1000000 m 維生素D3 13333 mg 維生素E 1000 mg 維生素K3 750 mg 維生素B1 2500 mg 維生素B2 1500 mg 維生素B6 7666 mg 維生素B12 12333 mg 菸鹼酸 33333 mg 生物素 300 mg 葉酸 3000 mg Ca-D-泛酸鹽 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Μη 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5.8 °/o 鈣於此預混物中加入如實施例2之描述所製備之芽孢桿 .菌NCIMB 4〇484蛋白酶，其量相當於每公斤1〇克蛋白酶酵素蛋白質。如下所述製備具有下表（以Leeson and Summers， 1997爲基礎，但使用AGROSOFT®最佳化程式，在不含肉粉下重新計算）所示之組成物及每公斤含100毫克蛋白酶 59 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 一 -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · I ϋ n n n n n fl u n n n n ·.1 i-i I I I n 1 l· I n ϋ I n ϋ n n n I n n n It n n n 1259759 A7 ___________ B7___五、發明說明（j) 酵素蛋白質之粒狀火雞起始飮食（starter)及生長飮食（ grower diet )：於階式混合器內混合輾碎的玉米、黃豆粕、魚粉及植物脂。加入石灰石、磷酸鈣及鹽，以及10克/公斤飮食之量的上述預混物，再予混合。將所得混合物造粒。（蒸氣調質後接著造粒步驟）成分起始飮食，生長飮食完成品 g/kg g/kg (Finisher) 玉米 454.4 612.5 781.0 黃豆粕 391 279 61.7 魚粉 70 29.9 70 植物脂 21 21 46 石灰石 19 16.9 9 磷酸鈣 30 25.9 16.8 鹽（NaCl) 2 2 2 維生素及礦物質預 10 10 10 混物離胺酸 1.3 1.49 甲硫胺酸 1.3 1.3 3.6 計算的營養素粗蛋白質g/kg 279 213 152 可代謝之能量 MJ/kg 12.3 12.7 14.1 錦，g/ kg 15.8 12.7 9 可利用的磷，g/ks 8.2 6.4 4.6 離胺酸，g/ kg 17.6 12.8 7.5 甲硫胺酸，g/kg 6.1 4.9 6.9 兩種用於鮭魚屬之魚的飮食，大體上依照前面之槪述亦予以製備。實際的組成顯示於下表（依照Refstie等人（ 1988 )，飼養或栽培水中動植物（Aquaculture)，卷162 ’桌301 — 302頁）。使用Agrosoft®飼料最佳化程式重新 60

本紙張尺度適用中國國家標準（(:¾規格⑽x 297 /i^T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂---------線L 1259759 A7 B7 五、發明說明（^：)

I 計算估計的營養素含量。將依實施例2之描述所製得之衍生自芽孢桿菌NCIMB 40484的蛋白酶，以相當於每公斤100毫克蛋白酶酵素蛋白質的量加入飮食中。成分具魚粉之 -般飮食具黃豆粕之替代飮食小麥 245.3 75.2 魚粉 505.0 310.0 黃豆粕一 339.0 魚油 185.0 200.0 DL-甲硫胺酸 13.9 23.0 磷酸二氫鈣一 2.0 維生素及礦物質預混物+ 粒狀物黏結劑及還原蝦紅素 50.8 50.8 計算的營養素（根據新鮮重量）粗蛋白質g/kg 401 415 粗脂肪g/kg 232 247 可代謝之能量MJ/ kg 16.9 16.5 鈣 g/kg 13.9 9.8 Mg/ kg 10.8 9.0 離胺酸g/kg 27.7 26.7 甲硫胺酸g/kg 24.4 31.6 實施例12 含蛋白醃酵素產品之純度的測定含蛋白酶酵素產品，例如蛋白酶製劑如商業的多成分酵素產品，其純度可以基於在尺寸-排阻管柱上劃分分離含 61 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

•--------訂---------線L 1259759 A7 _ _ ί '— —----— 五、發明說明（¢:+) 蛋白酶酵素產品的方法來測定。尺寸-排阻層析法亦即已知之凝膠過濾層析法，係以具有大小尺寸可使蛋白質分子分離之孔徑分佈的多孔凝膠基質（裝塡於一管柱中）爲基礎。相對小的蛋白質分子可自周圍溶液擴散進入凝膠，而較大的分子因其尺寸大小被阻止以同樣程度擴散進入凝膠。結果，蛋白質分子根據他們的大小被分離，而較大的分子會比較小的分子先洗脫出管柱。蛋白質濃度分析含蛋白酶酵素產品之蛋白質濃度係以來自PIERCE之 BCA蛋白質分析套組（與PIERCE目錄號碼23225相同）測定。Bicinchoninic acid (BCA)之鈉鹽爲一安定的水溶性化合物，其可在鹼性環境與亞銅離子（Cuit)形成強烈的紫色錯合物。BCA試劑形成BCA蛋白質分析套組能監測在蛋白質與鹼性Cu2+反應（雙縮脲反應）中產生的亞銅離子之基礎。從此反應產生的顏色係穩定的，且與增加的蛋白質濃度係成比例的方式增加（Smith，P. K.等人（1985 )，分析生物化學（Analytical Biochemistry)，卷 150，第76- 85頁）。BCA作用溶液係由混合50份試劑A與1 .份試劑B製得（試劑A爲PIERCE目錄號碼23223，於驗性碳酸鹽緩衝液中含有BCA及酒石酸鹽；試劑B爲 PIERCE 目錄號碼 23224，含有 4% CuS04*5H20 )。將 300μ1樣品與3.0毫升BCA作用溶液混合。在37°C30分鐘後，該樣品冷卻至室溫並讀取A49〇作爲樣品中蛋白質濃度 62 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

· n n n n ϋ n n I I n -I I n n I 1 n n n 1 n n n I n n n n ϋ n ϋ I 1259759 A7 ____B7___ 五、發明說明（u) 之測量。牛血淸白蛋白（PIERCE目錄號碼23209 )之稀釋液被包含於此分析中作爲標準品。樣品前處珲如果含蛋白酶酵素產品爲一固體，先在5°C將該產品溶解/懸浮於20倍體積之100 mM H3B〇3，10 mM 3, 3’-二甲基戊二酸，2 mM CaCl2，pH 6 (緩衝液A)至少15分鐘，又如果該酵素在此階段爲一懸浮液，則將該懸浮液通過〇.45μ過濾器過濾以產生一澄淸溶液。從此處起，該溶液被視爲一液體含蛋白酶酵素產品。如果含蛋白酶酵素產品爲一液體’先將該產品在5°C 於6— 8000 Da截止SpectraPor透析管（光譜醫學工業（ Spectrum Medical Industries)目錄號碼 132 670) d 100 倍體積緩衝液A+ 150 mM NaCl (緩衝液B)透析至少5小時，以移除可給予液體含蛋白酶酵素產品高黏度之配方化學品，其對尺寸-排阻層析法爲有害的。如果在透析期間產生沉澱物，將該經透析的含蛋白酶酵素產品通過〇.45μ過濾器過濾。利用前述之蛋白質濃度分析法測定經透析的酵素產品中蛋白質濃度’並將酵素產 .品以緩衝液Β稀釋，以產生具有5毫克/毫升蛋白質濃度之適於尺寸-排阻層析法之樣品。如果在透析之後酵素產品具有低於5毫克/毫升之蛋白質濃度，則直接使用它。尺_寸-排限層析法 63 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) AW---1----訂·--------I 一 1259759 A7 __B7__ 五、發明說明（Μ )

Paecilomyces lilacinus)，寄存編號 CCRC 930048。 65 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I--------訂---------*5^ 1^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

1259759 x ..4:上iV I ' ' 六、甲請專利範圍 1. 一種至少一種酸安定性蛋白酶於動物飼料之用途’ 其中該蛋白酶 (!)爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (Π)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 (Iii.)該蛋白酶在37°c及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少 40% ，該蛋白酶是以純的形式培養，A28Q = 1 ·0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-pNA上測量。 2. —種至少一種酸安定性蛋白酶於製備用於動物飼料之組成物之用途，其中該蛋白酶 (1)爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (π)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 (in)該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少40% ，該蛋白酶是以純的形式培養，A28Q= 1.0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-pNA上測量。 3. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中蛋白酶之劑量爲每公斤飼料0.01 - 200毫克蛋白酶酵素蛋白質。 4. 根據申請專利範圍第2項之用途，其中預期的蛋白酶之劑量爲每公斤飼料0.01 - 2〇〇毫克蛋白酶酵素蛋白質。 5. —種增進動物飼料營養價値的方法，其中至少一種酸安定性蛋白酶被加入飼料中，且其中該蛋白酶 ⑴爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (ii)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 ----------------------·取---------------訂................線# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國S家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1259759 BS C8 D8 六、申請專利範圍 (π1)該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.〇下培養2小時後之殘餘活性的至少4〇 % ’該蛋白酶是以純的形式培養，A28() = 1.0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25它下於Sue-AAPF-pNA上測量。 6.—種動物飼料添加物，包括 (a) 至少一種酸安定性蛋白酶；及 (b) 至少一種脂溶性維生素，及/或 (c) 至少一種水溶性維生素，及/或 (d) 至少一種微量礦物質；其中該蛋白酶 (1)爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (π)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 (ni)該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少 4〇% ’該蛋白酶是以純的形式培養，A28Q = 1 .〇，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°c下於Sue-AAPF-pNA上測量。根據申請專利範圍第6項之動物飼料添加物，其中該蛋白酶的量相當於每公斤飼料預期添加〇.〇1 一 2〇0毫克蛋白酶蛋白質。 8·根據申請專利範圍第6- 7項中任一項之動物飼料添加物，其進一步包括植酸酶，木聚糖酶，聚半乳糖酶，及/ 或β -聚葡萄糖酶。 9.一種動物飼料組成物，具有粗蛋白質含量50〜8()q 克/公斤及包括至少一種酸安定性蛋白酶，其中該蛋白_ __ X 本紙張格（210 x_297 公釐)一 1259759 1 D8 丨六、申請專利範圍 ⑴爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (Π)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 (111)該蛋白酶在37°c及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少 40% ，該蛋白酶是以純的形式培養，A28Q== 1_0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-pNA上測量。 10·根據申請專利範圍第9項之動物飼料組成物，其中該蛋白酶之量爲每公斤飼料0.01-2〇〇毫克蛋白酶蛋白質。 11. 一種處理植物蛋白質之方法，包括將至少一種酸安定性蛋白酶加到至少一種植物蛋白質或蛋白質來源的步驟，其中該蛋白酶 ⑴爲枯草桿菌蛋白酶家族；及/或 (π)當以SSI抑制時，具少於10%殘餘活性，及其中 (in)該蛋白酶在37°C及pH 3.5下培養2小時後之殘餘活性爲在5°C及pH 9.0下培養2小時後之殘餘活性的至少 40% ，該蛋白酶是以純的形式培養，A2SQ = 1.0，且該殘餘活性是在pH 9.0及25°C下於Sue-AAPF-pNA上測量。 12. 根據申請專利範圍第11項之方法，其中黃豆係被包含於該至少一種植物蛋白質來源之中。本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) ------------------------0^.!!……——1T----------------綾，· (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁)