PL200047B1 - Zastosowanie trwałych w kwasie proteaz w karmie zwierzęcej, dodatek do karmy i karma zwierzęca - Google Patents

Abstract

Zastosowanie trwa lych w kwasie proteaz homologicznych pochodz acych ze szczepów gatunku Nocardiopsis w karmie dla zwierz at, dodatek do karmy dla zwierz at i karma dla zwierz at zawieraj ace takie proteazy. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania trwałych w kwasie proteaz w karmie zwierzęcej (in vivo) oraz dodatku do karmy i karmy zwierzęcej zawierających takie proteazy.

Białka są podstawowymi składnikami pokarmowymi dla zwierząt i ludzi. Większość zwierząt hodowlanych, oraz wielu ludzi, otrzymuje niezbędne białka z roślinnych źródeł białkowych. Ważnymi roślinnymi źródłami białka są, np. rośliny oleiste, rośliny strączkowe oraz rośliny zbożowe.

Gdy, np. karma dla zwierząt monogastrycznych, takich jak trzoda chlewna oraz drób, zawiera mączkę z nasion soi, znacząca ilość substancji stałych mączki z nasion soi, nie jest trawiona. Tak też, np. rzeczywiste trawienie białek w jelicie cienkim prosiąt i rosnących świń wynosi tylko około 80%.

W żołądku zwierzą t monogastrycznych oraz wielu ryb jest silnie kwasowy odczyn pH. Jednakże większość procesów trawienia białek zachodzi w jelicie cienkim. Zatem istnieje potrzeba znalezienia trwałej w kwasie proteazy, która mogłaby przetrwać przejście przez żołądek.

Zastosowanie proteaz w karmie zwierzęcej lub do obróbki białek roślinnych jest znane z następujących dokumentów:

W WO95/28850 ujawniono, między innymi, dodatek do karmy zwierzęcej zawierający fytazę oraz enzym proteolityczny. Różne enzymy proteolityczne wymieniono na str. 7.

W WO96/05739 ujawniono, między innymi, dodatek do karmy zwierzęcej zawierający ksylanazę i proteazę. Odpowiednie proteazy wymieniono na str. 25.

W WO95/02044 ujawniono, między innymi, proteazy pochodzące z Aspergillus aculeatus, a także zastosowanie ich w karmie zwierzęcej.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3966971 ujawniono sposoby otrzymywania białka z roślinnych źródeł białka przez podziałanie kwasową fytazą i ewentualnie enzymem proteolitycznym. Odpowiednie proteazy wymieniono w kolumnie 2.

W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4073884, 5047240, 3868448, 3823072 i 3683069 opisano preparaty proteazowe pochodzące z różnych szczepów Streptomyces oraz ich zastosowanie w karmie zwierzęcej.

Jednakże proteazy te nie są trwałe w kwasie i nie są proteazami homologicznymi z tu opisanymi.

Odkryto obecnie proteazy, które są bardzo trwałe w kwasie i zgodnie z oczekiwaniami wykazują ulepszone właściwości w karmie zwierzęcej.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie co najmniej jednej trwałej w kwasie proteazy w karmie zwierzęcej, w którym proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z SEQ ID NO 1 i/lub SEQ ID NO 2, przy czym dawka proteazy wynosi 0,01-200 mg białka enzymu proteazy na kg karmy.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie co najmniej jednej trwałej w kwasie proteazy w wytwarzaniu kompozycji do stosowania w karmie zwierzęcej, w którym proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z SEQ ID NO 1 i/lub SEQ ID NO 2, przy czym ilość proteazy wynosi 0,01 mg - 400 g białka enzymu proteazy na kg kompozycji.

Przedmiotem wynalazku jest także dodatek do karmy zwierzęcej zawierający co najmniej jedną trwałą w kwasie proteazę oraz co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w tłuszczach i/lub co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w wodzie i/lub co najmniej jeden pierwiastek śladowy, charakteryzujący się tym, że proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z SEQ ID NO 1 i/lub SEQ ID NO 2, przy czym ilość proteazy wynosi 0,2 mg - 400 g białka enzymu proteazy na kg dodatku.

Korzystnie dodatek do karmy zwierzęcej zawiera ponadto fytazę, ksylanazę, galaktanazę i/lub β-glukanazę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest karma zwierzęca mająca zawartość surowego białka

50-800 g/kg, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jedną trwałą w kwasie proteazę, która to proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z SEQ ID NO 1 i/lub SEQ ID NO 2, przy czym dawka proteazy wynosi 0,01-200 mg białka enzymu proteazy na kg karmy.

Wynalazek zilustrowano przez odniesienie do załączonych rysunków, na których:

Figura 1 przedstawia krzywą trwałości zależną od pH, mianowicie pozostałą aktywność proteazową pięciu proteaz (dwóch trwałych w kwasie proteaz pochodzących z Nocardiopsis oraz trzech proteaz odniesienia (Sub.Novo i Sub.Novo(Y217L), obydwu pochodzących z Bacillus amyloliquefaciens oraz SAVINASE™) po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37°C w wartościach pH z zakresu od pH 2 do pH 11; aktywność wyznaczono względem aktywności pozostałej po 2 godzinach inkubacji w pH 9,0 w 5°C;

PL 200 047 B1

Figura 2 przedstawia krzywą aktywności zależną od pH, mianowicie aktywności proteazowej w pH od 3 - 11, wzglę dem aktywnoś ci proteazowej w optymalnej wartoś ci pH; dla tych samych pię ciu proteaz;

Figura 3 przedstawia krzywą aktywności zależną od temperatury w pH 9,0, a mianowicie aktywności proteazowej w pH 9,0 w temperaturze od 15°C do 80°C, względem aktywności proteazowej w optymalnej temperaturze; dla tych samych pię ciu proteaz;

Stosowane tu określenie proteaza oznacza enzym, który hydrolizuje wiązania peptydowe (o aktywności proteazowej). Proteazy są także nazywane, np. peptydazami, proteinazami, peptydohydrolazami lub enzymami proteolitycznymi.

Korzystne proteazy do zastosowania według wynalazku są typu endo, które działają wewnątrz łańcucha polipetydowego (endopeptydazy). Endopeptydazy wykazują aktywność względem zablokowanych na N- oraz C-końcu substratów peptydowych, które są stosowne względem specyficzności danej proteazy.

Powyższa definicja proteaz obejmuje jakiekolwiek enzymy z grupy enzymatycznej EC 3.4 (włącznie z każdą z jej trzynastu podklas) z listy EC (Enzyme Nomenclature 1992 z NC-IUBMB, 1992), która jest regularnie uzupełniana i uaktualniana, np. w internecie, http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Proteazy sklasyfikowano na podstawie ich mechanizmu katalitycznego dzieląc je na następujące grupy: proteazy serynowe (S), proteazy cysteinowe (C), proteazy asparaginianowe (A), metaloproteazy (M) oraz nieznane lub jeszcze nie sklasyfikowane proteazy (U), patrz Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (red.), Academic Press (1998), w szczególności część ogólnego wstępu.

Ujawnione tu proteazy z Nocardiopsis są proteazami serynowymi.

W szczególnej postaci proteazy do zastosowania według wynalazku są proteazami serynowymi. Określenie proteaza serynowa odnosi się do peptydaz serynowych oraz ich klanu, jak zdefiniowano w powyższym podręczniku. W wersji podręcznika z 1998 roku peptydazy serynowe oraz ich klany opisano w rozdziałach 1-175. Proteazy serynowe można zdefiniować jako peptydazy, których mechanizm katalityczny zależy od grupy hydroksylowej reszty serynowej działającej jako nukleofil, który atakuje wiązanie peptydowe. Przykłady proteaz serynowych do zastosowania według wynalazku obejmują proteazy z Klanu SA, np. z Rodziny S2 (Streptogrizyny), np. Podrodzina S2A (proteazy α-lityczne), jak zdefiniowano w powyższym podręczniku.

Aktywność proteazową można mierzyć stosując test, w którym stosuje się substrat zawierający wiązania peptydowe odpowiednie względem specyficzności danej proteazy. Odczyn pH i temperatura mogą być podobnie dostosowane do badanej proteazy. Przykładowymi testowymi wartościami pH są pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub 11. Przykładami testowymi temperaturami są 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 lub 70°C.

Przykładami substratów proteaz są kazeina oraz substraty pNA, takie jak Suc-AAPF-pNA (dostępny z np. Sigma S-7388). Duże litery w tym substracie pNA odnoszą się do jednoliterowego kodu aminokwasów. Innym przykładem jest Protazyme AK (barwiona azuryną usieciowana kazeina przygotowana w postaci tabletek przez Megazyme T-PRAK). Do badań aktywności zależnej od pH i trwałości zależnej od pH korzystny jest substrat pNA, podczas gdy do badań aktywności zależnej od temperatury, korzystny jest substrat Protazyme AK.

Przykłady testów proteazowych opisano w części doświadczalnej.

Nie ma ograniczeń względem pochodzenia proteazy do zastosowania według wynalazku. Zatem, określenie proteaza obejmuje nie tylko proteazy naturalne lub typu dzikiego, ale także jakiekolwiek ich mutanty, warianty, fragmenty itd. wykazujące aktywność proteazową, a także syntetyczne proteazy, takie jak mieszane proteazy oraz konsensusowe proteazy. Takie proteazy zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej można przygotowywać w sposób ogólnie znany w dziedzinie wynalazku, np. przez ukierunkowaną na miejsce mutagenezę, z użyciem PCR (z zastosowaniem fragmentu PCR zawierającego wymaganą mutację jako jednego ze starterów w reakcjach PCR) lub losową mutagenezę. Przygotowywanie konsensusowych białek opisano w, np. EP 897985.

Przykłady trwałych w kwasie proteaz do zastosowań według wynalazku obejmują:

(i) proteazy pochodzące z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 oraz Nocardiopsis alba;

(ii) proteazy o co najmniej 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 lub co najmniej 95% identyczności sekwencji aminokwasowej z proteazami (i);

(iii) proteazy o co najmniej 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 lub co najmniej 95% identyczności z SEQ ID NO: 1 i/lub SEQ ID NO: 2.

PL 200 047 B1

Do obliczenia procentu identyczności można zastosować jakikolwiek program komputerowy znany w dziedzinie wynalazku. Przykładami takich programów komputerowych są algorytm Clustal V (Higgins, D.G. i Sharp, P.M. (1989), Gene (Amsterdam), 73, 237-244); oraz program GAP dostarczony w pakiecie programowym GCG, wersja 8 (Program Manual for the Wisconsin Package, Wersja 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. i Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453.

Stosując algorytm Clustal V do obliczania procentu identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami białkowymi, stosuje się tabelę mas reszt PAM250, razem z ustawieniami domyślnymi w programie MegAlign v 4.03, w pakiecie programowym Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, Stany Zjednoczone Ameryki). Ustawienia domyślne dla wielokrotnych algorytmów to kara za lukę 10 i kara za długość luki 10. Do obliczenia procentu identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami białkowymi stosuje się następujące ustawienia: Ktuple 1, kara za lukę 3, okno 5 i 5 zachowanych przekątnych.

Przy stosowaniu GAP używa się następujących ustawień do porównania sekwencji polipeptydowych: kara za utworzenie GAP 5,0 oraz kara za przedłużenie GAP 0,3.

W szczególnej postaci, proteaza do zastosowania według wynalazku jest proteazą mikrobową, gdzie określenie mikrobowy oznacza proteazę wyprowadzoną z lub pochodzącą od mikroorganizmu lub będącą jej analogiem, fragmentem, wariantem, mutantem lub syntetyczną proteazą wyprowadzoną z mikroorganizmu. Może ona być wytwarzana przez ekspresję w oryginalnym szczepie bakteryjnym typu dzikiego, w innym szczepie bakteryjnym lub w roślinie, tj. określenie obejmuje ekspresję naturalnie występujących proteaz typu dzikiego, a także ekspresję, w jakimkolwiek gospodarzu, proteaz zrekombinowanych, zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej lub syntetycznych.

Użyte tu określenie mikroorganizm obejmuje Archaea, bakterie, grzyby, wirusy itd.

Przykładami mikroorganizmów są bakterie, np. bakterie z typu phy. nov., np. z klasy I: Actinobacteria, np. z Podklasy V Actinobacteridae, np. z Rzędu I: Actinomycetales, np. z Podrzędu XII: Streptosporangineae, np. z Rodziny II: Nocardiopsaceae, np. z Rodzaju I: Nocardiopsis, np. Nocardiopsis sp. NRRL 18262 oraz Nocardiopsis alba; lub ich mutanty lub warianty wykazujące aktywność proteazową. Ta taksonomia oparta jest na Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, wyd. 2, 2000, Springer (preprint: Road Map to Bergey's).

Dalsze przykłady mikroorganizmów obejmują grzyby, takie jak drożdże lub grzyby nitkowate.

W innej postaci proteaza jest proteazą roślinną. Przykładem proteazy pochodzenia roślinnego jest proteaza z miąższu owocu melona (Kaneda i inni, J. Biochem. 78, 1287-1296 (1975).

Określenie zwierzę obejmuje wszystkie zwierzęta, w tym ludzi. Przykładami zwierząt są zwierzęta nie przeżuwające, zwierzęta przeżuwające, takie jak krowy, owce i konie. W szczególnej postaci zwierzę jest zwierzęciem nie przeżuwającym. Zwierzęta nie przeżuwające obejmują zwierzęta monogastryczne, np. świnie lub trzodę chlewną (w tym, lecz nie wyłącznie, prosięta, rosnące świnie oraz maciory); drób, taki jak indyki i kury (w tym, lecz nie wyłącznie, kurczaki brojlery, nioski); młode cielęta oraz ryby (w tym, lecz nie wyłącznie, łosoś).

Określenie karma lub preparat karmy oznacza jakikolwiek związek, preparat, mieszaninę lub kompozycję odpowiednią do, lub przeznaczoną do, spożywania przez zwierzę.

W zastosowaniu według wynalazku zwierzę można nakarmić proteazą przed, po lub równocześnie z karmą. Korzystna jest ostatnia możliwość.

W znaczeniu tu stosowanym określenie trwała w kwasie oznacza, ż e aktywność proteazową czystego enzymu proteazy w rozcieńczeniu odpowiadającym A280 = 1,0 i po inkubacji przez 2 godziny w 37°C w następującym buforze: 100 mM kwas bursztynowy, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® K-100, pH 3,5, wynosi co najmniej 40% aktywności wzorcowej, co mierzy się z zastosowaniem testu opisanego tu w przykładzie 2C (substrat: Suc-AAPF-pNA, pH 9,0, 25°C).

W szczególnych postaciach powyższej trwałości w kwasie, aktywność proteazowa wynosi co najmniej 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 lub co najmniej 97% aktywności wzorcowej.

Określenie aktywność wzorcowa oznacza aktywność proteazową tej samej proteazy po inkubacji w czystej postaci, w rozcieńczeniu odpowiadającym A280 = 1,0 przez 2 godziny w 5°C w następującym buforze: 100 mM kwas bursztynowy, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 9,0, gdzie aktywność wyznacza się jak opisano powyżej.

Innymi słowy, sposób wyznaczania trwałości w kwasie obejmuje następujące etapy:

a) Badaną próbkę proteazy (w czystej postaci, A280 = 1,0) dzieli się na dwie równe próbki (I i II);

PL 200 047 B1

b) Próbkę 1 inkubuje się przez 2 godziny w 37 °C w pH 3,5;

c) Mierzy się pozostałą aktywność próbki I (pH 9,0 i 25°C);

d) Próbkę II inkubuje się przez 2 godziny w 5°C w pH 9,0;

e) Mierzy się pozostałą aktywność próbki II (pH 9,0 i 25°C);

f) Oblicza się procent pozostałej aktywności próbki I względem pozostałej aktywności próbki II.

Alternatywnie, w powyższej definicji trwałość w kwasie w etapie b) wartość pH buforu może wynosić 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3 lub 3,4.

W innych alternatywnych postaciach powyż szej definicji trwał o ś ci w kwasie w odniesieniu do powyższych alternatywnych wartości pH z etapu b), pozostała aktywność proteazowa w porównaniu z aktywnoś cią wzorcową wynosi co najmniej 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 lub co najmniej 97%.

W alternatywnej postaci, w buforze z etapu d) można zastosować wartości pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 lub 8,5.

W powyższej definicji trwałości w kwasie, okreś lenie A280 = 1,0 oznacza takie stężenie (rozcieńczenie) wspomnianej czystej proteazy, które daje wartość absorpcji równą 1,0 przy 280 nm w kuwetach o długości drogi światła 1 cm względem ślepej próby buforowej.

Ponadto, w powyższej definicji trwałości w kwasie, określenie czysta proteaza oznacza próbkę z proporcją A230/A260 równą 1,70 lub wię cej (patrz przykł ad 2E) oraz która po ze skanowaniu ż elu SDS-PAGE barwionego Coomassie posiada co najmniej 95% intensywności w prążku odpowiadającym wspomnianej proteazie (patrz przykład 2A). Inaczej, proporcja A280/A260 wynosi ponad lub jest równa 1,50, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1,80, 1,85 lub wynosi ponad lub jest równa 1,90.

Jednakże, do zastosowań według wynalazku, proteaza nie musi być tak czysta, może ona, np. zawierać inne enzymy, nawet inne proteazy, w którym to przypadku może ona być nazwana preparatem proteazowym. Niemniej jednak, dobrze określony preparat proteazowy jest korzystny. Tak też, np. dużo twiejsze jest prawidłowe dawkowanie do karmy proteazy, która jest zasadniczo wolna od wpływu lub zanieczyszczenia innymi proteazami. Określenie prawidłowego dawkowania odnosi się w szczególnoś ci do przedmiotu uzyskiwania spójnych i stałych wyników, oraz zdolności optymalizacji dawkowania w oparciu o wymagany efekt.

W szczególnej odmianie proteaza, w postaci w jakiej jest dodawana do karmy, lub gdy jest składnikiem dodatku do karmy, jest dobrze zdefiniowana. Dobrze zdefiniowana oznacza, że preparat proteazowy jest co najmniej w 50% czysty, co wyznacza się drogą chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (patrz przykład 8).

W innych szczególnych odmianach, preparat proteazowy jest co najmniej w 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 lub co najmniej w 95% czysty, co wyznacza się tą samą metodą.

Alternatywnie, określenie dobrze zdefiniowane oznacza, że frakcjonowanie preparatu proteazowego na odpowiedniej kolumnie do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek ujawnia tylko jeden główny składnik proteazowy.

Fachowiec w dziedzinie wynalazku będzie wiedział jak dobrać stosowną kolumnę do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. Można zacząć od frakcjonowania preparatu na, np. kolumnie HiLoad26/60 Superdex75pg z Amersham Pharmacia Biotech (patrz przykład 12). Gdy piki nie zostaną wyraźnie rozdzielone należy spróbować zastosować inne kolumny (np. ze zmienionym rozmiarem cząstek kolumny i/lub długością kolumny) i/lub zmienić objętość próbki. Z użyciem prostych i często stosowanych metod prób i błędów można dojść do kolumny o odpowiedniej rozdzielczości (wyraźne rozdzielenie pików), na podstawie czego wykonuje się obliczenia czystości, jak opisano w przykładzie 8.

Preparat proteazowy może być (a) bezpośrednio dodany do karmy (lub zastosowany bezpośrednio w procesie obróbki białek roślinnych) lub (b) może być zastosowany do wytwarzania jednego lub większej liczby pośrednich środków, takich jak dodatki do karmy lub przedmieszki, które następnie dodaje się do karmy lub stosuje w procesie obróbki). Stopień czystości opisany powyżej odnosi się do czystości oryginalnego preparatu proteazowego, bez względu na to czy jest on stosowany według powyższego punktu (a) lub (b).

Preparaty proteazowe o czystości tego rzędu wielkości są w szczególności uzyskiwane z użyciem rekombinacyjnych metod produkcji, podczas gdy nie da się ich w tak łatwy sposób uzyskać i podlegają one duż o większym zmianom pomiędzy partiami, gdy są wytwarzane tradycyjnymi metodami fermentacyjnymi.

PL 200 047 B1

Takie preparaty proteazowe można oczywiście mieszać z innymi enzymami.

W jednej szczególnej postaci, proteaza do zastosowania według wynalazku, oprócz cechy trwałości w kwasie, posiada także optymalną aktywność zależną od pH zbliżonego do obojętnego.

Określenie optymalna aktywność zależna od pH zbliżonego do obojętnego oznacza jedną lub większą liczbę z poniższych cech: optymalna wartość pH mieści się w zakresie pH 6,0-11,0 lub pH 7,0-11,0 lub pH 6,0-10,0 lub pH 7,0-10,0 lub pH 8,0-11,0 lub pH 8,0-10,0 (patrz poniżej przykład 2B oraz fig. 2).

W innej szczególnej postaci, proteaza do zastosowania wedł ug wynalazku, oprócz trwał o ś ci w kwasie wykazuje także trwałość termiczną.

Określenie trwałość termiczna oznacza jedną lub większą liczbę z poniższych cech: optymalna temperatura wynosi co najmniej 50°C, 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C lub co najmniej 70°C, jak w przykładzie 2D oraz na fig. 3.

Proteaza jest zdolna do rozpuszczania białek roślinnych zgodnie z modelem in vitro z poniższego przykładu 4.

Określenie białka roślinne w stosowanym tu znaczeniu oznacza jakikolwiek związek, środek, preparat lub mieszaninę zawierającą co najmniej jedno białko z lub pochodzące z rośliny, włącznie z białkami zmodyfikowanymi i pochodnymi biał ek. W szczególnych postaciach zawartość biał ka w białkach roś linnych wynosi co najmniej 10, 20, 30, 40, 50 lub 60% (wag.).

Białka roślinne mogą być z roślinnych źródeł białka, takich jak rośliny strączkowe i rośliny zbożowe, np. z materiałów z roślin z rodziny Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae oraz Poaceae, takich jak mączka z nasion soi, mączka łubinowa, mączka z nasion rzepaku.

Roślinnym źródłem białka jest materiał z jednej lub większej liczby roślin z rodziny Fabaceae, np. soi, łubinu, grochu lub fasoli.

Roślinnym źródłem białka jest materiał z jednej lub większej liczby roślin z rodziny Chenopodiaceae, np. buraka, buraka cukrowego, szpinaku lub komosy ryżowej.

Innymi przykładami roślinnych źródeł białka są rzepak i kapusta.

Soja jest korzystnym roślinnym źródłem białka.

Innymi przykładami roślinnych źródeł białka są rośliny zbożowe, takie jak jęczmień, pszenica, żyto, owies, kukurydza, ryż oraz sorgo.

Obróbka białek roślinnych co najmniej jedną trwałą w kwasie proteazą wywołuje zwiększoną rozpuszczalność białek roślinnych.

Poniżej zamieszczono przykładowy % rozpuszczonych białek uzyskanych w wyniku zastosowania proteaz omawianych w wynalazku: co najmniej 74%, 74,5%, 75%, 76,0%, 76,5%, 77,0% lub co najmniej 77,5%, odnośnie do modelu in vitro z poniższego przykładu 4.

Określenie rozpuszczalność białek zasadniczo oznacza wprowadzenie białka (białek) do roztworu. Taka rozpuszczalność może wynikać z kierowanego proteazą uwalniania białek z innych składników zazwyczaj złożonego naturalnego środka, takiego jak karma. Rozpuszczalność można mierzyć jako wzrost ilości rozpuszczonych białek w odniesieniu do próbki nie traktowanej proteazą (patrz przykład 4).

Proteaza (proteazy) wpływa na (lub działa na lub wywiera swój wpływ rozpuszczający na) roślinne białka lub źródła białek. Aby to osiągnąć, roślinne białka lub źródła białek, zazwyczaj zawiesza się w rozpuszczalniku, np. w wodnym rozpuszczalniku, takim jak woda, a wartości pH i temperatury ustawia się biorąc pod uwagę charakterystykę badanego enzymu. Tak też, np. obróbka może być wykonywana w wartości pH, w której względna aktywność danej proteazy wynosi co najmniej 50 lub 60 lub 70 lub 80 lub 90%. Podobnie, np. obróbka może być wykonywana w temperaturze w której względna aktywność danej proteazy wynosi co najmniej 50 lub 60 lub 70 lub 80 lub 90% (te względne aktywności definiuje się jak w poniższym przykładzie 2). Reakcję enzymatyczną można kontynuować do czasu uzyskania wymaganego rezultatu, po czym może ona zostać, lub nie, zatrzymana przez inaktywację enzymu, np. w etapie obróbki termicznej.

Działanie proteazy może być przedłużone, co oznacza, np. że proteazę dodaje się do roślinnych białek, lub źródeł białka, ale jej wpływ rozpuszczający nie jest uruchomiony do czasu gdy jest to wymagane, gdy ustalą się odpowiednie warunki rozpuszczania lub gdy inhibitory enzymu zostaną inaktywowane lub gdy inne środki będą mogły zostać zastosowane do opóźnienia działania enzymu.

Obróbka może być wstępną obróbką karmy zwierzęcej lub roślinnych białek do zastosowania w karmie zwierzęcej, tj. białka rozpuszcza się przed spoż yciem.

PL 200 047 B1

Określenie ulepszanie wartości odżywczych karmy zwierzęcej oznacza ulepszanie dostępności białek, co prowadzi do zwiększonej ekstrakcji białek, większej wydajności uzyskiwania białek i/lub ulepszonego wykorzystywania białek. Zatem wartość odżywcza karmy jest zwiększana oraz u zwierzęcia polepsza się tempo wzrostu i/lub przybieranie na wadze i/lub przetwarzanie pokarmu (tj. ciężar spożytego pokarmu względem wzrostu masy).

Proteazę można dodać do karmy w jakiejkolwiek postaci, jako względnie czystą proteazę lub w mieszaninie z innymi składnikami przeznaczonymi do dodania do karmy zwierzę cej, tj. w postaci dodatku do karmy zwierzęcej, takiego jak tzw. przedmieszki do karmy zwierzęcej.

Oprócz trwałej w kwasie proteazy, dodatki do karmy zwierzęcej według wynalazku obejmują co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w tłuszczach i/lub co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w wodzie i/lub co najmniej jeden pierwiastek ś ladowy i/lub co najmniej jeden makroelement.

Dalej, dodatkowo, składnikami dodatków do karmy są środki barwiące, środki zapachowe, stabilizatory i/lub co najmniej jeden enzym wybrany z fytaz EC 3.1.3.8 lub 3.1.3.26; ksylanaz EC

3.2.1.8; galaktanaz EC 3.2.1.89; i/lub β-glukanaz EC 3.2.1.4 (EC klasy enzymów według Enzyme Nomenclature 1992 z NC-IUBMB, 1992), patrz także strona internetowa (WWW) http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

W szczególnej postaci te inne enzymy są dobrze zdefiniowane (jak zdefiniowano i poparto przykładami powyżej dla preparatów proteazowych, tj. przez odniesienie do przykładu 8).

Zazwyczaj witaminy rozpuszczalne w tłuszczach lub w wodzie, a także pierwiastki śladowe tworzą część tzw. przedmieszki, która jest przeznaczona do dodania do karmy, podczas gdy makroelementy zazwyczaj dodaje się do karmy osobno. Każdy z typów tych preparatów, gdy zostanie wzbogacony trwałą w kwasie proteazą według wynalazku, stanowi dodatek do karmy według wynalazku.

W szczególnej postaci, dodatek do karmy zwierzęcej według wynalazku z przeznaczenia jest zawarty (lub przepisany jako taki, który ma być zawarty) w pokarmach lub karmach zwierzęcych w ilości 0,01-10,0%; w szczególności 0,05-5,0%; lub 0,2-1,0% (% oznacza g dodatku na 100 g karmy). Odnosi się to w szczególności do przedmieszek.

Zgodnie z tym, stężenia poszczególnych składników dodatku do karmy zwierzęcej, np. przedmieszki, można ustalić przez pomnożenie końcowego stężenia tego samego składnika w karmie przez, odpowiednio 10-10000; 20-2000; lub 100-500 (odnośnie do powyższych trzech zakresów procentu zawartości).

Wskazówki względem wymaganych stężeń końcowych, tj. stężeń w karmie, takich poszczególnych składników karmy i dodatków do karmy, zamieszczono poniżej w tabeli A.

Poniżej zamieszczono nie wykluczającą listę przykładów tych składników:

Przykłady witamin rozpuszczalnych w tłuszczach obejmują witaminę A, witaminę D3, witaminę E oraz witaminę K, np. witaminę K3.

Przykłady witamin rozpuszczalnych w wodzie obejmują witaminę B12, biotynę i cholinę, witaminę B1, witaminę B2, witaminę B6, niacynę, kwas foliowy i pantotenian, np. D-pantotenian wapnia.

Przykłady pierwiastków śladowych obejmują mangan, cynk, żelazo, miedź, jod, selen i kobalt.

Przykłady makroelementów obejmują wapń, fosfor i sód.

Wymagania pokarmowe względem tych składników - na przykładzie drobiu i prosiąt/świń - wymieniono w tabeli A poniżej. Wymagania pokarmowe oznaczają, że te składniki powinny być dostarczone w pożywieniu we wskazanych stężeniach. Dane te stosują się do:

NRC, Nutrient requirements in swine, wydanie dziewiąte poprawione 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; oraz

NRC, Nutrient requirments in poultry, wydanie dziewiąte poprawione 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D.C. 1994.

Alternatywnie, dodatek do karmy zwierzęcej według wynalazku zawiera co najmniej jeden z poszczególnych składników wymienionych w tabeli A. Co najmniej jeden oznacza jeden lub większą liczbę, co obejmuje jeden lub dwa lub trzy lub cztery itd. ponad cztery aż do wszystkich trzynastu lub aż do wszystkich piętnastu poszczególnych składników.

Bardziej szczegółowo, ten co najmniej jeden poszczególny składnik jest zawarty w dodatku według wynalazku w ilości takiej, aby wytworzyć stężenie w karmie z zakresu wskazanego w kolumnie czwartej, kolumnie piątej lub w kolumnie szóstej tabeli A.

PL 200 047 B1

Jak wyjaśniono powyżej, odpowiednie stężenia dodatków do karmy można wyznaczyć mnożąc limity tych zakresów przez 10-10000; 20-2000; lub 100-500. Przykładowo, rozważając jaka ilość witaminy A w przedmieszce odpowiada zawartości w karmie 10-10000 lU/kg, z obliczenia otrzyma się następujące zakresy: 100-10⁸ IU; lub 200-2x10⁷IU; lub 1000-5x10⁶ na kg dodatku.

Ta b e l a A

Wymagania pokarmowe oraz korzystne zakresy

Składniki odżywcze dostarczane na kg karmy	Drób	Prosięta (Świnie) Maciory	Zakres 1	Zakres 2	Zakres 3
Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach
Witamina A/[IU)	-5000	1300-4000	10-10000	50-8000	100-6000
Witamina D3/[IU]	-1100	150-200	2-3000	5-2000	10-1500
Witamina E/[IU]	-12	11-22	0,02-100	0,2-80	0,5-50
Witamina K/[mg]	0,5-1,5	-0,5	0,005-10,0	0,05-5,0	0,1-3,0
Witaminy rozpuszczalne w wodzie
B12/[mg]	-0,003	0,005-0,02	0,0001-1,000	0,0005-0,500	0,001-0,100
Biotyna/[mg]	0,100-0,25	0,05-0,08	0,001-10,00	0,005-5,00	0,01-1,00
Cholina/[mg]	800-1600	300-600	1-10000	5-5000	10-3000
Pierwiastki śladowe
Mangan/[mg]	-60	2,0-4,0	0,1-1000	0,5-500	1,0-100
Cynk/[mg]	40-70	50-100	1-1000	5-500	10-300
Żelazo/[mg]	50-80	40-100	1-1000	5-500	10-300
Miedź/[mg]	6-8	3,0-6,0	0,1-1000	0,5-100	1,0-25
Jod/[mg]	-0,4	-0,14	0,01-100	0,05-10	0,1-1,0
Selen/[mg]	-0,2	0,10-0,30	0,005-100	0,01-10,0	0,05-1,0
Makroelementy
Wapń/[g]	8-40	5-9	0,1-200	0,5-150	1-100
Fosfor, jako dostępny-fosfor/[g]	3-6	1,5-6	0,1-200	0,5-150	1-50

Kompozycje karmy zwierzęcej lub pokarmu mają względnie dużą zawartość białka. Według powyżej wymienionych publikacji National Research Council (NRC), karmy dla drobiu i świń można scharakteryzować jak wskazano w tabeli B poniżej, kolumny 2-3. Pokarm dla ryb można scharakteryzować jak wskazano w kolumnie 4 tabeli B. Dalej, takie pokarmy dla ryb zazwyczaj zawierają 200-310 g/kg surowych tłuszczy. Przykładami takich pokarmów dla ryb są pokarmy dla ryb łososiowatych i opracowuje się je w oparciu o Aquaculture, principles and practices, red. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, wydanie drugie, red. John E. Halver, Academic Press Inc. 1989.

Kompozycja karmy zwierzęcej według wynalazku zawiera 50-800 g/kg surowego białka i ponadto zawiera co najmniej jedną zastrzeganą proteazę.

Ponadto lub alternatywnie (względem zawartości surowego białka wskazanej powyżej), kompozycja karmy zwierzęcej według wynalazku zawiera 10-30 MJ/kg metabolizowalnej energii; i/lub 0,1-200 g/kg wapnia; i/lub 0,1-200 g/kg dostępnego fosforu; i/lub 0,1-100 g/kg metioniny; i/lub 0,1-150 g/kg metioniny plus cysteiny; i/lub 0,5-50 g/kg lizyny.

W szczególnej postaci, zawartość metabolizowalnej energii, surowego biał ka, wapnia, fosforu, metioniny, metioniny plus cysteiny i/lub lizyny jest w jakimkolwiek z zakresów 2, 3, 4 lub 5 z tabeli B poniżej (Z. 2-5).

Surowe białko oblicza się jako azot (N) pomnożony przez czynnik 6,25, tj. surowe białko (g/kg) = N (g/kg) x 6,25, jak wskazano w Animal Nutrition, wydanie 4, Rozdział 13 (red. P. McDonald, R. A. Edwards i J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9).

PL 200 047 B1

Zawartość azotu wyznacza się z zastosowaniem metody Kjeldahla (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, wydanie 14 red., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Metabolizowalną energię można obliczyć na podstawie publikacji NRC, Nutrient Requirements of Swine (1988) str. 2-6 oraz European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holandia. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen, ISBN 90-71463-12-5.

Zawartość wapnia, dostępnego fosforu oraz aminokwasów w kompletnych karmach dla zwierząt oblicza się na podstawie tabel karm, takich jak Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Kompozycja karmy zwierzęcej może zawierać co najmniej jedno roślinne białko lub źródło białka, jak zdefiniowano powyżej.

Karma zwierzęca może zawierać 0-80% kukurydzy, i/lub 0-80% sorgo; i/lub 0-70% pszenicy; i/lub 0-70% jęczmienia; i/lub 0-30% owsa; i/lub 0-40% mączki sojowej; i/lub 0-10% maczki rybnej; i/lub 0-20% serwatki.

Karmy zwierzęce można wytwarzać w postaci, np. papek (nie w postaci granulek) lub w postaci granulek karmy. Zazwyczaj, zmielone materiały pokarmowe miesza się i dodaje wystarczające ilości niezbędnych witamin i minerałów, według specyfikacji dla danego gatunku. Enzymy można dodawać w postaci preparatów stałych lub płynnych. Przykładowo, stały preparat enzymu zazwyczaj dodaje się przed lub podczas etapu mieszania, a płynny preparat enzymu zazwyczaj dodaje się po etapie granulowania. Enzym można także wprowadzić w dodatku do karmy lub przedmieszce. Końcowe stężenie enzymu w pokarmie wynosi 0,01-200 mg białka enzymu na kg karmy, np. w zakresie 5-30 mg białka enzymu na kg karmy zwierzęcej.

Przykłady preparatów karmy zwierzęcej przedstawiono poniżej w przykładzie 7.

T a b e l a B

Zakresy wartości energii, białka i minerałów w karmach zwierzęcych.

Składnik odżywczy	Drób	Prosięta/ Świnie/Maciory	Ryby	Z. 1	Z. 2	Z. 3	Z. 4	Z. 5
	Min-Maks	Min-Maks	Min-Maks
Metabolizowalna energia, MJ/kg	12,1-13,4	12,9-13,5	14-25	10-30	11-28	11-26	12-25
Surowe białko, g/kg	124-280	120-240	300-480	50-800	75-700	100-600	110-500	120-490
Wapń, g/kg	8-40	5-9	10-15	0,1-200	0,5-150	1-100	4-50
Dostępny fosfor, g/kg	2,1-6,0	1,5-5,5	3-12	0,1-200	0,5-150	1-100	1-50	1-25
Metionina, g/kg	3,2-5,5	-	12-16	0,1-100	0,5-75	1-50	1-30
Metionina plus cysteina, g/kg	4-9	2,3-6,8	-	0,1-150	0,5-125	1-80
Lizyna, g/kg	2,5-11	6-14	12-22	0,5-50	0,5-40	1-30

Obróbka białek roślinnych zawiera także kolejny etap dodania fytazy. Dodatkowo poza łączoną obróbką fytazą i proteazą można dodać kolejne enzymy, gdzie te enzymy są wybrane z grupy obejmującej inne proteazy, fytazy, enzymy lipolityczne oraz enzymy glukozydaza/karbohydraza. Przykłady takich enzymów wskazano w WO95/28850. Proteazę powinno się, oczywiście, stosować w skutecznej ilości, tj. w ilości stosownej do polepszenia rozpuszczalności i/lub polepszenia wartości odżywczej karmy. Obecnie uważa się, że enzymy powinno dodawać się w jednej lub większej z poniższych ilości (zakresów dawek): 0,01-200; lub 0,01-100; lub 0,05-100; lub 0,05-50; lub 0,10-10 - wszystkie te zakresy oznaczają mg białka proteazy na kg karmy (ppm).

Aby wyznaczyć mg białka proteazy na kg karmy proteazę oczyszcza się z preparatu karmy, a następnie wyznacza się specyficzną aktywność oczyszczonej proteazy stosując odpowiedni test

PL 200 047 B1 (patrz aktywność proteazowa, substraty oraz testy). Aktywność proteazową preparatu karmy, jako taką, wyznacza się także stosując ten sam test i na podstawie tych dwóch oznaczeń oblicza się dawkę w mg białka proteazy na kg karmy.

Te same zasady można zastosować do wyznaczenia mg białka proteazy w dodatkach do karmy.

Oczywiście, gdy dostępna jest próbka proteazy stosowanej do przygotowywania dodatku do karmy lub karmy, specyficzną aktywność wyznacza się z tej próbki (nie ma potrzeby oczyszczania proteazy z preparatu karmy lub dodatku do karmy).

Wiele roślin zawiera czynniki przeciwodżywcze, takie jak lektyny i inhibitory trypsyny. Najważniejszymi czynnikami przeciwodżywczymi soi są lektyna, aglutynina sojowa (SBA) oraz inhibitor trypsyny sojowej (STI).

Lektyny są białkami wiążącymi specyficzne cząsteczki zawierające węglowodany ze znaczną specyficznością i po spożyciu wiążą się z nabłonkiem jelita. Może to prowadzić do zmniejszonej żywotności komórek nabłonka i zmniejszonej absorpcji składników odżywczych.

SBA jest glikozylowaną, tetrameryczną lektyna z podjednostką o masie cząsteczkowej około 30 kDa z dużym powinowactwem do N-acetylogalaktozaminy.

Inhibitory trypsyny działają na proteolizę w jelicie i zmniejszają trawienie białek, a także powodują wzrost wydzielania enzymów trawiennych z trzustki, co prowadzi do utraty aminokwasów w postaci enzymów trawiennych. Przykładem inhibitora trypsyny jest inhibitor Bowmana-Birka, który ma masę cząsteczkową około 8 kDa, zawiera 7 mostków dwusiarczkowych i zawiera dwie pętle inhibitorowe specyficzne względem proteaz trypsyno-podobnych i chymotrypsyno-podobnych. Inne przykłady obejmują tzw. inhibitory lub czynniki Kunitza (np. inhibitor trypsyny sojowej Kunitza zawierający jedno miejsce wiązania trypsyno-podobnych proteaz i posiadający masę cząsteczkową około 20 kDa).

Wykazano, że proteazy do zastosowania według wynalazku hydrolizują przeciwodżywcze czynniki, takie jak lektyna, SBA oraz inhibitory trypsyny: inhibitor Bowmana-Birka i czynnik sojowy Kunitza. Patrz część doświadczalna, przykład 5.

Można stosować trwałe w kwasie proteazy do hydrolizowania lub zmniejszania ilości czynników przeciwodżywczych, np. lektyny, SBA oraz inhibitorów trypsyny, takich jak inhibitor Bowmana-Birka oraz czynniki Kunitza, takie jak czynnik sojowy Kunitza.

P r z y k ł a d 1

Poszukiwanie trwałych w kwasie proteaz

Zanalizowano wiele proteaz pod względem trwałości w pH 3, w celu zidentyfikowania proteaz, które posiadają trwałość potrzebną do przejścia przez kwasowe środowisko żołądka zwierząt monogastrycznych.

Proteazy oczyszczono zwykłymi metodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia jonowymienna, chromatografia z oddziaływaniem hydrofobowym oraz chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (patrz np. Protein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications, red.: Jan-Christer Janson, Lars Ryden, VCH Publishers, 1989).

Aktywność proteazową wyznaczano w następujący sposób: Proteazę inkubowano z 1,67% kazeiną Hammarsten w 25°C, pH 9,5 przez 30 minut, następnie dodawano TCA (kwas trichlorooctowy) do końcowego stężenia 2% (wag.), a następnie mieszaninę filtrowano w celu usunięcia osadu, a następnie przesącz analizowano pod względem zawartości wolnych pierwszorzędowych grup aminowych (wyznaczanych w teście kolorymetrycznym opartym na OPA (o-ftalodialdehyd) mierząc absorpcję przy 340 nm, stosując serynę jako wzorzec (Biochemische Taschenbuch teil II, Springer-Verlag (1964), str. 93 oraz str. 102). Jedną jednostkę Proteazy Kazeiny (CPU) definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 1 mmol rozpuszczalnych w TCA pierwszorzędowych grup aminowych, na minutę w standardowych warunkach, tj. 25°C i pH 9,5.

Proteazy rozcieńczano do aktywności 0,6 CPU/l w wodzie, podzielono na dwie próby, a następnie każdą z prób dalej rozcieńczano do 0,3 CPU/l odpowiednio 100 mM buforem cytrynianowym, pH 3 i 100 mM buforem fosforanowym, pH 7. Rozcień czone próbki inkubowano w 37°C przez 1 godzinę i po 20 μ l próbek naniesiono do studzienek pł ytek z 1% agarozą zawierają cych 1% odtł uszczonego mleka. Płytki (pH 7,0) inkubowano w 37°C przez noc i zmierzono strefy rozjaśnienia.

Wiele proteaz zachowywało się dobrze w tym teście i dwie poniższe scharakteryzowano: proteazy z Nocardiopsis alba i Nocardiopsis sp. NRRL 18262 opisane w przykładzie 2. Szczep Nocardiopsis alba zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapesztańskim O Międzynarodowym Uznawaniu Depozytów Mikroorganizmów. Do Celów Postępowania Patentowego w DSMZ-Deutsche Sammlung

PL 200 047 B1 von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, jak poniżej:

Data zdeponowania : 22 stycznia 2001

Nr DSM : Nocardiopsis alba DSM 14010

Depozyt został złożony przez Novozymes A/S i później scedowany na Hoffmann-La Roche AG.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie, charakteryzacja i badanie porównawcze proteaz Nocardiopsis

Fermentacja

Nocardiopsis alba zaszczepiono z płytek agarowych z drożdżowym tryptonem do kolb do wytrząsania zawierających 100 ml pożywki HG-23 o poniższym składzie: płatki owsiane 45 g/l, ekstrakt drożdżowy 2 g/l, wodorofosforan disodowy 12 g/l, diwodorofosforan potasowy 6 g/l, Pluronic PE 6100 0,2 ml/l w destylowanej wodzie. Szczep hodowano przez 9 dni w 37°C.

Oczyszczanie

Brzeczkę odwirowano przy 10000 x g przez 30 minut w jednolitrowych zlewkach. Supernatanty połączono i dalej oczyszczano przez zagłębioną płytkę filtrującą Seitz K-250. Czysty filtrat zatężono drogą ultrafiltracji na odcinającej 3kDa kasecie z polieterosulfonu (Filtron). Zagęszczony enzym przeniesiono do 50 mM H3BO3, 5 mM kwasu 3,3'-dimetyloglutarowego, 1 mM CaCl2, pH 7 (bufor A) na kolumnie G25 Sephadex (Amersham Pharmacia Biotech) i naniesiono na kolumnę agarozową Bacitracin (Upfront Chromatography A/S) równoważoną buforem A. Po przemyciu kolumny Bacitracin buforem A, w celu usunięcia białka, proteazę wymyto z kolumny z użyciem buforu A uzupełnionego 25% 2-propanolem i 1M chlorkiem sodu. Frakcje z aktywnością proteazową połączono i przeniesiono do 20 mM CH3COOH/NaOH, 1 mM CaCl2, pH 5 (bufor B) przez chromatografię na kolumnie G25 Sephadex (Amersham Pharmacia Biotech). Frakcję proteazową w wymienionym buforze naniesiono na kolumnę SOURCE 30S (Amersham Pharmacia Biotech) równoważoną buforem B. Po przemyciu kolumny SOURCE 30S buforem B wymyto proteazę wzrastającym liniowym gradientem NaCl (0 do 0,25M) w buforze B. Frakcje z kolumny zbadano pod względem aktywności proteazowej i frakcje zawierające proteazę zanalizowano z użyciem SDS-PAGE. Czyste frakcje połączono i stosowano do dalszej charakteryzacji.

Proteazę z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 przygotowano zwykłymi metodami, jak ogólnie opisano powyżej dla proteazy z Nocardiopsis.

Charakteryzacja

Stwierdzono, że proteaza pochodząca z Nocardiopsis alba ma masę cząsteczkową Mr = 21 kDa (SDS-PAGE) i wyznaczono następującą częściową (N-koniec (MVS)) sekwencję aminokwasową: ADIIGGLAYTMGGRCSV (SEQ ID NO: 2).

Proteaza pochodząca z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 ma poniższą sekwencję 188 aminokwasów:

ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNAAGQPGFVTAGHCGRVGTQVTIGNGRGVFEQSV FPGNDAAFVRGTSNFTLTNLVSRYNTGGYAAVAGHNQAPIGSSVCRSGSTTGWHCGTIQAR GQSVSYPEGTVTNMTRTTVCAEPGDSGGSYISGTQAQGVTSGGSGNCRTGGTTFYQEVTPM VNSWGVRLRT (SEQ ID NO: 1).

Celem tej charakteryzacji było zbadanie profili ich trwałości zależnej od pH, aktywności zależnej od pH i aktywności zależnej od temperatury w porównaniu z Sub.Novo, Sub.Novo(Y217L) i SAVINASE™.

Sub.Novo jest subtylizyną z Bacillus amyloliguefaciens oraz Sub.Novo(Y217L) jest jej mutantem ujawnionym w WO96/05739. Sub.Novo przygotowano i oczyszczono z hodowli dzikiego szczepu stosując standardowe metody, podczas gdy mutanta przygotowano jak opisano w przykładach 1-2 i 15-16 EP 130756.

SAVINASE™ jest subtylizyną pochodzącą z Bacillus clausii (poprzednio Bacillus lentus NCIB 10309), dostępną w handlu z Novozymes A/S, Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dania. Jej przygotowanie opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3723250.

P r z y k ł a d 2A

Wyznaczanie czystości próbek proteazy z użyciem SDS-PAGE

Czystość próbek proteazy z użyciem SDS-PAGE wyznaczono stosując następującą procedurę:

μ! roztworu proteazy (stężenie A₂₈₀ = 0,025) zmieszano z 10 μ! 50% (wag./obj.) TCA (kwas trichlorooctowy) w probówce typu Eppendorfa na lodzie. Po pół godzinie na lodzie probówkę odwiro12

PL 200 047 B1 wano (5 minut, 0°C, 14000 x g) i ostrożnie usunięto supernatant. Do osadu dodano 20 μΐ buforu do próbek do SDS-PAGE (200 ul buforu do próbek Tris-Glicyna SDS (2x) (125 mM Tris/HCl, pH 6,8, 4% (wag./obj.) SDS, 50 ppm błękitu bromofenolowego, 20% (obj.) glicerolu, LC2676 z NOVEX™)) + 160 μl wody destylowanej + 20 μl β-merkaptoetanolu + 20 μl 3M niebuforowanej zasady Tris (Sigma T-1503) i zawartość probówki gotowano przez 3 minuty. Następnie probówkę krótko odwirowano i próbkę 10 μl naniesiono na gotowy 4-20% gradientowy żel Tris-Glicyna z NOVEX™ (gradientowy żel poliakrylamidowy oparty na chemii Laemmli, ale bez SDS w żelu (Laemmli, U.K., (1970) Nature, tom 227, str. 680-685), EC60255). Elektroforezę prowadzono w buforze do elektroforezy (2,9 g zasady Tris, 14,4 g glicyny, 1,0 g SDS, destylowana woda do 1 litra) w obu zbiornikach do buforu przy 150 V stałego napięcia do czasu, gdy barwnik błękit bromofenolowy dotarł do dołu żelu. Po elektroforezie żel przemyto trzy razy, za każdym razem po 5 minut w 100 ml destylowanej wody z delikatnym wytrząsaniem. Następnie żel delikatnie wytrząsano z reagentem Gelcode® Blue Stain (koloidalny produkt Comassie G-250 z PIERCE, PIERCE nr katalogowy 24592) przez godzinę i przemyto z delikatnym wytrząsaniem przez 8 do 16 godzin destylowaną wodą z kilkoma zmianami destylowanej wody. Ostatecznie żel wysuszono pomiędzy dwoma kawałkami celofanu. Wysuszone żele skanowano z użyciem skanera Arcus II z AGFA wyposażonego w oprogramowanie Fotolook 95 v 2.08 i importowano do programu do oceny obrazu CREAM™ dla Windows (nr katalogowe 990001 i 990005, Kem-En-Tec, Dania) z użyciem komendy File/Acquire z następującymi ustawieniami (dla Fotolook 95 v 2.08): Original = Reflective, Mode = Color RGB, Scan resolution = 240 ppi, Output resolution = 120 Ipi, Scale factor = 100%, Range = Histogram with Global Selection Min=0 i Max=215, ToneCurve = None, Sharpness = None, Descreen = None oraz Flavor = None, w ten sposób wytwarzając plik *.img obrazu żelu SDS-PAGE, który następnie używano do oceny w CREAM™. Plik *.img obrazu oceniano z użyciem polecenia menu Analysis/1-D. Dwie linie skanujące umieszczano na obrazie pliku *. img z użyciem narzędzia Lane Place Tool: Linię skanowania próbki i linię skanowania tła. Linię skanowania próbki umieszczano w środku linii próbki (z badaną proteazą) od miejsca tuż poniżej miejsca naniesienia do miejsca tuż powyżej miejsca dojścia barwnika błękitu bromofenolowego. Linię skanowania tła umieszczano równolegle do linii skanowania próbki, ale w pozycji obrazu żelu SDS-PAGE, gdzie nie została naniesiona żadna próbka, punkty startu i stopu dla linii skanowania tła leżały prostopadle do punktów startu i zakończenia linii skanowania próbki. Linia skanowania tła stanowi rzeczywiste tło żelu. Szerokość i kształt linii skanowania nie były ustawiane. Następnie intensywność wzdłuż linii skanowania zmierzono z użyciem polecenia 1-D/Scan z menu ze średnią (Medium) czułością. Stosując polecenie 1-D/Editor z menu, skan tła został odjęty od skanu próbki. Następnie wybrano polecenie 1-D/Results z menu i % powierzchni (Area %) piku proteazy, co wyznaczono z użyciem programu CREAM™, zastosowano do oznaczenia czystości proteaz z użyciem SDS-PAGE.

Wszystkie próbki proteazy miały czystość powyżej 95% wyznaczoną z użyciem SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 2B

Test aktywności zależnej od pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) zastosowano do uzyskania profili aktywności zależnej od pH

Bufor do testu: 100 mM kwas bursztynowy (Merck 1.00682), 100 mM HEPES (Sigma H-3375), 100 mM CHES (Sigma C-2885), 100 mM CABS (Sigma C-5580), 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® X-100, ustawione wartości pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 lub 11,0 z użyciem HCl lub NaOH.

Temperatura testu: 25°C.

300 μl próbki proteazy (rozcieńczonej w 0,01% Triton® X-100) zmieszano z 1,5 ml buforu do testu o odpowiedniej wartości pH, doprowadzając pH mieszaniny do wartości pH buforu do testu. Reakcje rozpoczęto przez dodanie 1,5 ml substratu pNA (50 mg rozpuszczono w 1,0 ml DMSO i dalej rozcieńczono 45 x w 0,01% Triton® X-100) a następnie, po zmieszaniu, z użyciem spektrofotometru monitorowano wzrost A405 jako miary aktywności proteazy w badanym pH. Test powtórzono w buforze do testów o innych wartościach pH i pomiary aktywności wykreślono jako zależność aktywności od pH. Względne aktywności normalizowano względem najwyższej aktywności (przy optymalnym pH), tj. oznaczając aktywność w optymalnej wartości pH jako 1 lub 100%. Próbki proteazy rozcieńczono, aby wszystkie pomiary aktywności znajdowały się w liniowej części krzywej odpowiedzi na dawkę dla testu.

P r z y k ł a d 2C

Test trwałości zależnej od pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) zastosowano do uzyskania profili trwałości zależnej od pH

PL 200 047 B1

Bufor do testu: 100 mM kwas bursztynowy, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® X-100, ustawione wartości pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 lub 11,0 z użyciem HCl lub NaOH.

Każdą próbkę proteazy (w 1 mM kwasie bursztynowym, 2 mM CaCl2, 100 mM NaCl, pH 6,0 oraz o absorpcji A280 > 10) rozcieńczono w buforze do testu o każdej badanej wartości pH do A280 = 1,0. Rozcieńczone próbki proteaz inkubowano 2 godziny w 37°C. Po inkubacji, próbki proteaz rozcieńczono w 100 mM kwasie bursztynowym, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 9,0, doprowadzając pH wszystkich próbek do 9,0.

W poniższych pomiarach aktywności, temperatura wynosiła 25°C.

300 μΐ rozcieńczonej próbki proteazy zmieszano z 1,5 ml buforu do testu o pH 9,0 i reakcje rozpoczęto drogą dodania 1,5 ml substratu pNA (50 mg rozpuszczono w 1,0 ml DMSO i dalej rozcieńczono 45 x w 0,01% Triton® X-100), a następnie, po zmieszaniu, z użyciem spektrofotometru monitorowano wzrost A405 jako miarę aktywności proteazy (pozostałej). Inkubację w 37°C prowadzono przy różnych wartościach pH i pomiary aktywności wykreślono jako zależność pozostałej aktywności względem pH. Pozostałe aktywności normalizowano względem równoległej inkubacji (kontrolnej), gdzie proteazę rozcieńczono do A280 = 1,0 w buforze do testu pH 9,0 i inkubowano przez 2 godziny w 5°C, przed wykonaniem pomiaru aktywności tak jak dla innych inkubacji. Próbki proteazy rozcieńczono przed pomiarem aktywności aby wszystkie pomiary aktywności znajdowały się w liniowej części krzywej odpowiedzi na dawkę dla testu.

P r z y k ł a d 2D

Test aktywności zależnej od temperatury

Tabletki Protazyme AK zastosowano do uzyskania profili temperaturowych. Tabletki Protazyme AK jest to kazeina sprzężona z barwnikiem azurynowym wytwarzana w postaci tabletek przez Megazyme.

Bufor do testu: 100 mM kwas bursztynowy, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCl, 0,01% Triton® X-100, pH doprowadzone do 9,0 z użyciem NaOH.

Tabletkę Protazyme AK zawieszano w 2,0 ml 0,01% Triton® X-100 w trakcie delikatnego mieszania. 500 μl tej zawiesiny i 500 μl buforu do testu zmieszano w probówce Eppendorfa i umieszczono na lodzie. Dodano po 20 μl próbki proteazy (rozcieńczonej w 0,01% Triton X-100). Test rozpoczęto przenosząc probówki Eppendorfa do termomiksera Eppendorfa ustawionego na temperaturę testu. Probówkę inkubowano przez 15 minut w termomikserze Eppendorfa ustawionym na najwyższą częstotliwość wytrząsania. Inkubację testową zatrzymano przenosząc probówki z powrotem do łaźni lodowej. Probówki odwirowano w ochłodzonej wirówce przez kilka minut i z użyciem spektrofotometru odczytano A650 supernatantu. Do testu włączono ślepą próbę z buforem (zamiast enzymu). Wartość A650 (proteaza) - A650 (ślepa) była miarą aktywności proteazy. Test prowadzono w różnych temperaturach i pomiary aktywności wykreślono jako zależność aktywności względem temperatury inkubacji. Względne aktywności normalizowano względem najwyższej aktywności (przy optymalnej temperaturze). Próbki proteazy rozcieńczono aby wszystkie pomiary aktywności znajdowały się w liniowej części krzywej odpowiedzi na dawkę dla testu.

Przegląd optymalnych aktywności (aktywności zależnej od pH i temperatury) przedstawiono w tabeli 1. Profile trwałości zależnej od pH, aktywności zależnej od pH i aktywności zależnej od temperatury przedstawiono na fig. 1-3, a szczegółowe porównanie danych trwałości zależnej od pH w kwasowych wartościach pH przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 1

Optymalne wartości pH i temperatury różnych proteaz

Proteaza	Optymalna wartość pH (substrat pNA)	Optymalna temperatura przy pH 9,0 (Protazyme aK)
Nocardiopsis sp. NRRL 18262	10	70°C
Nocardiopsis alba	11	70°C
Sub.Novo1	10	70°C
Sub.Novo(Y217L)2	9	70°C
SAVINASE™3	9	70°C

PL 200 047 B1

T a b e l a 2

Trwałość w zależności od pH różnych proteaz, w pH 2,0-5,0

Proteaza	pH 2,0	pH 2,5	pH 3,0	pH 3,5	pH. 4,0	pH 4,5	pH 5,0
Nocardiopsis sp. NRRL 18262	0,779	1,000	1,029	0,983	0,991	1,019	1,004
Nocardiopsis alba	0,929	0,993	1,009	1,005	0,969	1,037	0,992
Sub.Novo	0,007	0,003	0,000	0,000	0,024	0,784	0,942
Sub.Novo(Y217L)	0,000	0,000	0,002	0,003	0,350	0,951	0,996
Savinase	0,001	0,001	0,001	0,003	0,338	0,929	0,992

P r z y k ł a d 2E

Czystość absorpcyjna oczyszczonych próbek proteazy

Wyznaczenie proporcji A280/A260

Proporcję A280/A260 oczyszczonych próbek proteazy wyznaczono w następujący sposób.

A260 oznacza absorpcję próbki proteazy przy 260 nm w kuwetach o drodze optycznej 1 cm względem ślepej próby buforowej. A280 oznacza absorpcję próbki proteazy przy 280 nm w kuwetach o drodze optycznej 1 cm względem ślepej próby buforowej.

Próbki oczyszczonych proteaz z przykładu 2 rozcieńczono w buforze do czasu gdy odczyt ze spektrofotometru przy A280 znajdował się w liniowej części krzywej odpowiedzi. Proporcję A280/A260 wyznaczono z odczytów: dla Nocardiopsis sp. NRRL 18262 1,83, a dla Nocardiopsis alba 1,75.

P r z y k ł a d 3 (porównawczy)

Zdolność proteazy wyprowadzonej z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 do degradowania nierozpuszczalnych części mączki z nasion soi (SBM)

Proteazę z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 zbadano pod względem zdolności do sprawiania, że nierozpuszczalne/nietrawione części SBM są dostępne dla enzymów trawiennych i/lub dodanych enzymów egzogennych.

Jej sprawność porównano z dwoma proteazami asparaginianowymi, Proteaza I i Proteaza II, przygotowanymi jak opisano w WO95/02044. Dokument ten także ujawnia ich zastosowanie w karmie. Proteazą I jest proteazą typu Aspergillopepsyny II, a Proteazą II jest proteazą typu Aspergillopepsyny I (obydwie są proteazami asparaginianowymi, tj. proteazami niesubtylizynowymi) z Aspergillus aculeatus (zgodnie z Handbook of Proteolytic Enzymes, wspomnianym wyżej).

Badany substrat, tzw. pozostałość sojową, wytworzono w procesie naśladującym przewód pokarmowy zwierząt monogastrycznych, włącznie z działaniem pepsyną w pH 2 i działaniem pankreatyną w pH 7.

W etapie działania pankreatyną dodano wiele dostępnych w handlu enzymów w dużych dawkach w celu rozłożenia składników SBM, które są dostępne dla istniejących dostępnych w handlu enzymów.

Dodano poniższe enzymy, wszystkie dostępne w handlu z Novozymes A/S, Dania,: ALCALASE™ 2.4L, NEUTRASE™ 0.5L, FLAVOURZYME™ 1000L, ENERGEX™ L, BIOFEED™ Plus L, PHYTASE NOVO™ L. Zastosowana SBM standardowo zawierała 48% białka SBM na karmę, która była granulowana.

Po obróbce tylko 5% całkowitego białka pozostało w powstałej pozostałości sojowej.

Protokół znakowania FITC

Następnie pozostałość wyznakowano FITC (Molecular Probes, F-143) w następujący sposób: pozostałość sojową (25 g mokrej masy, około 5 g suchej masy) zawieszono w 100 ml 0,1 M buforu węglanowego, pH 9 i mieszano przez 1 godzinę w 40°C. Zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej i poddano działaniu 5-izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) przez noc w ciemności. Niesprzężony znacznik usunięto drogą ultrafiltracji (filtry odcinające cząsteczkę o masie cząsteczkowej powyżej 10000).

Test FITC

Znakowaną FITC pozostałość sojową zastosowano do zbadania zdolności proteaz do rozkładania pozostałości sojowej z użyciem następującego testu: 0,4 ml próbki proteazy (o A280 = 0,1) zmieszano z 0,4 ml znakowanej FITC pozostałości sojowej (zawiesina 10 mg/ml w 0,2 M buforze fosforanowo-sodowym, pH 6,5) w 37°C i względne jednostki fluorescencji (RFU 485/535 nm; wzbudzenie/monitorowanie długości fali) zmierzono po inkubacji przez 0 godzin i przez 22 godziny. Przed wyznaczeniem RFU, próbki odwirowano przez 1 minutę przy 20000 x G i 250 μl supernatantu przeniePL 200 047 B1 siono do czarnej płytki do mikromianowania. Pomiary wykonano z użyciem !icznika VICTOR 1420 Mu!ti!abe! (in vitro, Dania). RFU ogó!nie opisał Iain D. Johnson w: Introduction to F!uorescence Techniques, Handbook of F!uorescent Probes and Research Chemica!s, Mo!ecu!ar Probes, Richard P. Haug!and, wydanie 6, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7).

Ś!epe próby wykonano przez dodanie 0,4 m! buforu zamiast próbki enzymu.

RFUpróby= ARFUpróby - ARFUśiepe i próby gdzie ARFU = RFU (22 godziny) - RFU(0 godzin) Wyznaczone wartości FITC (wartości RFUpróby) przedstawiono w tabe!i 3 poniżej. Wartości FITC ogó!nie wyznaczono z marginesem błędu +/- 20000. Przeciwnie do Proteazy I i Proteazy II, proteaza pochodząca z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 rozkładała pozostałość sojową w znaczącym stopniu.

T a b e ! a 3

Zdo!ność proteaz do rozkładania pozostałości sojowej

Proteaza	FITC (±20000)
Nocardiopsis sp. NRRL 18262	61900
Proteaza I	-9200
Proteaza II	-1200

P r z y k ł a d 4 (porównawczy)

Testy in vitro proteazy pochodzącej z Nocardiopsis sp. NRRL 18262

Proteazę pochodzącą z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 zbadano razem z proteaza z Bacillus sp. NCIMB 40484 („PD498”, przygotowaną jak opisano w przykładzie 1 WO 93/24623) oraz razem z FLAVOURZYME™, preparatem enzymatycznym zawierającym proteazę z Aspergillus oryzae (komercyjnie dostępnym z Novozymes, A/S, Bagsvaerd, Dania), pod wzg!ędem zdo!ności do rozpuszczania białek z mieszanki kukurydza-SBM (mączki z kukurydzy i nasion soi) w automatycznym układzie trawiennym in vitro (symu!ującym trawienie u zwierząt monogastrycznych). W ś!epych próbach, mieszankę kukurydza-SBM inkubowano przy braku egzogennych proteaz.

Zarys procedury trawienia in vitro

Składniki dodane do kolby	Punkt czasowy
10 g karmy kukurydza-SBM (60:40) + HC!/pepsyna (3000 U/g karmy) + proteaza (0,1 mg białka enzymu proteazy/g karmy) lub 3,3 mg FLAVOURZYME™/g karmy), T = 40°C, pH = 3,0	t = 0 min
NaOH, T = 40°C, pH 6	t = 60 min
NaHCO3/pankreatyna (8,0 mg/g karmy), T = 40°C, pH 6-7	t =80 min
Przerwanie inkubacji, pobranie próbek, T = 0°C	t = 320 min

Substraty

Stosowano 10 g karmy kukurydza-SBM z proporcją kukurydza:SBM wynoszącą 6:4 (wag.). Zawartość białka wynosiła 43% (wag.) w SBM i 8,2% (wag.) w mączce kukurydzianej. Całkowita zawartość białka w 10 g karmy kukurydza-SBM wynosiła 2,21 g.

Enzymy trawienne

Pepsyna (Sigma P-7000; 539 U/mg; stała), pankreatyna (Sigma P-7545; 8xU.S.P. (US Pharmacopeia)).

Wyznaczanie białka enzymu

I!ość białka enzymu proteazy ob!iczono na podstawie wartości A280 i sekwencji aminokwasowych (składu aminokwasowego) stosując zasady wskazane w S.C. Gi!i i P.H. von Hippe!, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989).

Procedura doświadcza!na d!a mode!u in vitro

1. 10 g substratu zważono w 100 m! ko!bie.

2. W punkcie czasowym 0 min do ko!by dodano mieszając 46 m! HC! (0,1 M) zawierającego pepsynę (3000 U/g karmy) i 1 m! proteazy (0,1 mg białka enzymu/g karmy) z wyjątkiem 3,3 mg/g karmy FLAVOURZYME™. Ko!bę inkubowano w 40°C.

3. W punkcie czasowym 30 min zmierzono pH.

4. W punkcie czasowym 45 min dodano 16 m! H2O.

5. W punkcie czasowym 60 min dodano 7 m! NaOH (0,4 M).

PL 200 047 B1

6. W punkcie czasowym 80 min dodano 5 ml NaHCO3 (1 M) zawierającego pankreatynę (8,0 mg/g karmy).

7. W punkcie czasowym 90 min zmierzono pH.

8. W punkcie czasowym 300 min zmierzono pH.

9. W punkcie czasowym 320 min, usunięto próbki po 30 ml i odwirowano (10000 x g, 10 min, 4°C).

10. Oznaczono całkowite rozpuszczalne białko w supernatantach.

Oznaczenie białka

Supernatanty analizowano pod względem zawartości białka z zastosowaniem metody Kjeldahla (oznaczenie % azotu; A. O. A. C. (1984) Official Methods of Analysis, wydanie 14, Washington DC).

Obliczenia

Dla wszystkich białek obliczono rozpuszczalność białek in vitro stosując poniższe równania. Ilość białka w próbce karmy: 22,1% z 10 g = 2,21 g.

Gdy wszystkie białka zostały rozpuszczone w 75 ml cieczy, stężenie białka w supernatancie powinno wynosić:

2,21 g/75 ml « 2,95%.

Należy zwrócić uwagę, że supernatanty zawierają także enzymy trawienne i egzogenne. W celu oznaczenia rozpuszczalności wkład białkowy enzymów trawiennych i egzogennych powinien zostać odjęty od stężeń białek w supernatantach, gdy tylko jest to możliwe.

% białka z pankreatyny (X mg/g karmy) i pepsyny (Y U/g karmy) = ((X mg pankreatyny/g karmy x 10 g karmy x 0,69 x 100%)/(1000 mg/g x 75 g)) + ((Y U pepsyny/g karmy x 10 g karmy x 0,57 x 100%)/(539 U/mg x 1000 mg/g x 75 g)), przy czym 0,69 i 0,57 odnoszą się do zawartości białka w zastosowanych preparatach pankreatyny i pepsyny (tj. 69% pankreatyny i 57% pepsyny stanowi białko, co wyznaczono metodą Kjeldahla, jak wyżej).

% białko z egzogennych enzymów (Z mg EP/g karmy) = (Z mg EP/g karmy x 10 g karmy x 100%)/(1000 mg/g x 75 g) % poprawiony białka w supernatancie = % białka w supernatancie według analizy - (% białka z enzymów trawiennych + % białka z enzymów egzogennych)

Rozpuszczalność białka (%) = (% poprawiony białka w supernatancie x 100%)/2,95 %

Wyniki poniżej pokazują, że proteaza pochodząca z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 wywiera istotnie lepsze działanie na rozpuszczalność białek w porównaniu z próbą ślepą i w porównaniu z proteaza z Bacillus sp. NCIMB 40484.

Enzym	Rozpuszczone białko (% całkowitego)	SD	n
Ślepa próba (brak egzogennych enzymów)	73,8c	0,87	10
+ proteaza pochodząca z Nocardiopsis sp. NRRL 1 8262	77,5a	0,50	10
+ proteaza pochodząca z Bacillus sp. NCIMB 40484	75,6b	1,52	5
+ FLAVOURZYME™	74, c	0,23	4

a, b, c wartości w kolumnie nie posiadające takiej samej litery w indeksie górnym są istotnie różne, P < 0,05. SD oznacza odchylenie standardowe; n oznacza liczbę obserwacji.

P r z y k ł a d 5 (porównawczy)

Degradacja lektyny, SBA i sojowych inhibitorów Bowmana-Birka i Kunitza

Zdolność proteaz z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 i Bacillus sp. NCIMB 40484 do hydrolizowania sojowej aglutyniny (SBA) i sojowych inhibitorów trypsyny Bowmana-Birka i Kunitza.

Czyste SBA (Fluka 61763), Inhibitor Bowmana-Birka (Sigma T-9777) lub Inhibitor Kunitza (inhibitor trypsyny z soi, Boehringer Mannheim 109886) inkubowano z proteazą przez 2 godziny, 37°C, w pH 6,5 (proteaza:czynnik przeciwodżywczy = 1:10, w oparciu o A280). Bufor do inkubacji - 50 mM kwas dimetyloglutarowy, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,01% Triton X-100, pH 6,5.

Zdolność proteazy do rozkładania SBA oraz inhibitorów proteazy wyznaczono przez zanik prążków natywnej SBA lub inhibitora trypsyny oraz pojawianie się niskocząsteczkowych produktów rozkładu w żelach SDS-PAGE. Żele wybarwiono błękitem Coomassie i intensywność prążków wyznaczono przez zeskanowanie.

Wyniki, jako % rozłożonego czynnika przeciwodżywczego, przedstawiono poniżej w tabeli 4.

PL 200 047 B1

Uważa się, że zdolność do rozkładania czynników przeciwodżywczych soi można także wyznaczyć stosując technikę Western z przeciwciałami przeciw SBA, inhibitorowi Bowmana-Birka lub inhibitorowi Kunitza po inkubacji mączki sojowej z badanymi proteazami (patrz WO98/56260).

T a b e l a 4

Proteaza pochodząca z	SBA	Inhibitor Bowmana-Birka	Inhibitor Kunitza
Nocardiopsis sp. NRRL 18262	75	25	100
Bacillus sp. NCIMB 40484	21	41	100

P r z y k ł a d 6

Wpływ trwałych w kwasie proteaz z Nocardiopsis na wzrost kurczaków brojlerów

Próbę przeprowadzono zgodnie z oficjalnymi francuskimi instrukcjami dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach. Jednodniowe kurczaki brojlery ('Ross PM3'), rozdzielone pod względem płci, dostarczyła komercyjna wylęgarnia.

Kurczaki hodowano w zespolonych klatkach z metalową siatką na podłodze w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach. Karma i woda by ł y dostarczane do woli.

Dnia ósmego kurczaki podzielono uwzględniając wagę na grupy po 6 ptaków, które przydzielono do grupy kontrolnej, otrzymującej karmę doświadczalną bez enzymów lub grupy doświadczalnej, otrzymującej karmę doświadczalną uzupełnioną 100 mg białka enzymu proteazy na kg karmy.

Każdą próbę powtórzono w 12 grupach, po 6 grup z każdej płci. Grupy ważono dnia 8 i 29. Spożycie karmy w okresie przejściowym zostało wyznaczone i obliczono tempo nabierania masy i przetwarzania pokarmu.

Pokarm doświadczalny był oparty na skrobi kukurydzianej i mączce sojowej (44% surowego białka) jako głównych składnikach (tabela 5). Karmę zgranulowano (kształt: 3 x 20 mm) w około 70°C. Odpowiednią ilość proteazy rozcieńczono w ustalonej ilości wody i rozpylono na karmę w postaci granulek. W grupie kontrolnej, zastosowano te same ilości wody, aby obie grupy traktować w ten sam sposób.

Do obliczeń statystycznych, wykonano dwuczynnikową analizę wariancji (czynniki: traktowanie i płeć ) z użyciem procedury GLM pakietu SAS (SAS Institute Inc., 1985). Tam gdzie wykazano istotne skutki traktowania (p < 0,05) zanalizowano różnice pomiędzy średnimi z użyciem testu Duncana. Przewidywano polepszony przyrost masy i/lub polepszone przekształcanie pokarmu i/lub polepszone wartości odżywcze mączki sojowej (biorąc pod uwagę, że skrobia kukurydziana jest składnikiem w duż ym stopniu trawionym).

Literatura

EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53-54

SAS Institute Inc. (1985): SAS® User's Guide, wersja 5 red. Cary NC

T a b e l a 5

Skład karmy doświadczalnej

Składniki	(%)
1	2
Skrobia kukurydziana	45,80
Mączka sojowa 441	44,40
Łój zwierzęcy	3,20
Olej sojowy	1,00
DL-metionina	0,18
MCP	0,76
Sól	0,05
Środek wiążący	1,00
Przedmieszka witaminowa i mineralna	3,55
Avatec® 15% CC2	0,06

PL 200 047 B1 cd. tabeli 5

1	2
Zanalizowana zawartość:
Surowe białko (%)	19,3
ME, N-poprawiona (MJ/kg)3	12,2
Surowy tłuszcz (%)	5,3

₁ ¹ zanalizowana zawartość: 90,6% suchej masy, 45,3% surowego biał ka, 2,0% surowego tł uszczu, 4,9% surowego błonnika ² odpowiada 90 mg Lasalocid-Na/kg karmy jako środek przeciw kokcydiom ₃ ³ obliczono na podstawie zanalizowanej zawartości składników pokarmowych (EC-equation; EEC, 1986)

Dostawcy składników do karmy:

Skrobia kukurydziana: Roquettes Freres, F-62136 Lestrem, Francja.

Mączka sojowa 44: Rekasan GmbH, D-07338 Kaulsdorf, Niemcy

Łój zwierzęcy: Fondoirs Gachot SA, F-67100 Strasbourg, Francja

Olej sojowy: Ewoco Sarl, F-68970 Guemar, Francja

DL-metionina: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francja

MCP: Brenntag Lorraine, F-54200 Toul, Francja

Sól: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francja

Środek wiążący: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francja

Przedmieszka (AM vol chair NS 4231) : Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse, Francja

Avatec: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francja

P r z y k ł a d 7

Przedmieszka i karmy dla indyków i łososiowatych wzbogacone trwałą w kwasie proteazą z Nocardiopsis.

Przygotowano przedmieszkę o następującym składzie (zawartość na kilogram):

5000000	IE	Witamina A
1000000	IE	Witamina D3
13333	mg	Witamina E
1000	mg	Witamina K3
750	mg	Witamina B 1
2500	mg	Witamina B2
1500	mg	Witamina B6
7666	mg	Witamina B12
12333	mg	Niacyna
33333	mg	Biotyna
300	mg	Kwas foliowy
3000	mg	D-pantotenian wapnia
1666	mg	Cu
16666	mg	Fe
16666	mg	Zn
23333	mg	Mn
133	mg	Co
66	mg	1
66	mg	Se
5,8	%	Wapń

PL 200 047 B1

Do tej przedmieszki dodano proteazę z Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (przygotowaną jak opisano w przykładzie 2) w ilości odpowiadającej 10 g białka enzymu proteazy/kg.

Karmy w postaci granulek dla indyków początkowa i wzrostowa o składzie przedstawionym poniżej w tabeli (na podstawie Leeson i Summers, 1997, ale przeliczonym tak by nie dodawać mączki mięsnej z użyciem AGROSOFT®, programu optymalizującego) oraz z 100 mg białka enzymu proteazy na kg przygotowano w następujący sposób:

Zmieloną kukurydzę, mączkę sojową, mączkę rybną i tłuszcz roślinny zmieszano w mikserze kaskadowym. Dodano wapienia, fosforanu wapnia oraz soli razem z przedmieszką w ilości 10 g/kg karmy, a następnie zmieszano. Otrzymaną mieszaninę zgranulowano (kondycjonowanie parą, a następnie etap granulowania).

Składnik	Karma początkowa, g/kg	Wzrostowa, g/kg	Końcowa
Kukurydza	454,4	612,5	781,0
Mączka sojowa	391	279	61,7
Mączka rybna	70	29,9	70
Tłuszcz roślinny	21	21	46
Wapień	19	16,9	9
Fosforan wapnia	30	25,9	16,8
Sól (NaCl)	2	2	2
Przedmieszka witaminowa i mineralna	10	10	10
Lizyna	1,3	1,49
Metionina	1,3	1,3	3,6
Obliczone składniki odżywcze
Surowe białko g/kg	279	213	152
Metabolizowalna energia MJ/kg	12,3	12,7	14,1
Wapń, g/kg	15,8	12,7	9
Dostępny fosfor, g/kg	8,2	6,4	4,6
Lizyna, g/kg	17,6	12,8	7,5
Metionina, g/kg	6,1	4,9	6,9

Przygotowano także dwie karmy dla łososiowatych, ogólnie tak jak opisano powyżej. Dokładny skład wskazano w tabeli poniżej (opracowany z Refstie i inni, (1998), Aquaculture, tom 162, str. 301-302). Wyznaczoną zawartość składników odżywczych obliczono stosując program do optymalizacji karmy Agrosoft®.

Do karm dodano proteazy pochodzącej z Nocardiopsis alba, przygotowanej jak opisano w przykładzie 2, w ilości odpowiadającej 100 mg białka enzymu proteazy na kg.

Składnik	Zwykła karma z mączką rybną	Alternatywna karma z mączką sojową
1	2	3
Pszenica	245,3	75,2
Mączka rybna	505,0	310,0
Mączka sojowa	-	339,0
Olej rybny	185,0	200,0
DL-Metionina	13,9	23,0
Fosforan monowapnia	-	2,0

PL 200 047 B1 cd. tabeli

1	2	3
Przedmieszka witaminowa i mineralna + środek wiążący do granulacji i astaksantyna	50,8	50,8
Obliczone składniki odżywcze (na podstawie świeżej masy)
Surowe białko g/kg	401	415
Surowy tłuszcz g/kg	232	247
Metabolizowalna energia MJ/kg	16,9	16,5
Wapń, g/kg	13,9	9,8
Fosfor, g/kg	10,8	9,0
Lizyna, g/kg	27,7	26,7
Metionina, g/kg	24,4	31,6

P r z y k ł a d 8

Oznaczenie czystości produktów enzymatycznych zawierających proteazę

Czystość produktów enzymatycznych zwierających proteazę, np. preparatów proteazy, takich jak dostępne w handlu wieloskładnikowe produkty enzymatyczne, można wyznaczyć metodą opartą na frakcjonowaniu produktu enzymatycznego zawierającego proteazę na kolumnie do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, znana także jako chromatografia z filtracją żelową, jest oparta na porowatym złożu żelowym (upakowanym w kolumnie) z rozmieszczonymi porami o rozmiarze porównywalnym do rozmiaru cząsteczek, które mają być rozdzielone. Względnie małe cząsteczki mogą przeniknąć do żelu z otaczającego roztworu, podczas gdy większe cząsteczki, ze względu na swój rozmiar, nie mogą wejść do żelu w tym samym stopniu. W wyniku tego cząsteczki białek są rozdzielane według swoich rozmiarów, przy czym większe cząsteczki są wymywane z kolumny przed mniejszymi.

Test stężenia białka

Stężenie białka w produktach enzymatycznych zawierających proteazę wyznaczono z użyciem zestawu do badania białek BCA z PIERCE (identyczny z PIERCE nr katalogowy 23225). Sól sodowa kwasu bicynchoninowego (BCA) jest trwałym, rozpuszczalnym w wodzie związkiem zdolnym do tworzenia intensywnie purpurowego kompleksu z jonami miedzi (Cu¹⁺) w środowisku zasadowym. Odczynnik BCA stanowi podstawę zestawu do badania białek BCA z użyciem którego można monitorować jony miedzi wytwarzane w reakcji białka z zasadową Cu²⁺ (reakcja biuretowa). Kolor powstały w wyniku tej reakcji jest trwały i wzrasta w proporcjonalny sposób wraz ze wzrostem stężenia białka (Smith, P.K. i inni, (1985), Analytical Biochemistry, tom 150, str. 76-85). Roztwór roboczy BCA przygotowuje się przez zmieszanie 50 części odczynnika A z 1 częścią odczynnika B (Odczynnik A PIERCE nr katalogowy 23223, zawiera BCA i winian w zasadowym buforze węglanowym; odczynnik B PIERCE nr katalogowy 23224, zawiera 4% CuSO₄x5H₂O). 300 μ! próbki zmieszano z 3,0 ml roztworu roboczego BCA. Po 30 minutach w 37°C, próbkę ochłodzono do temperatury pokojowej i odczytano A490 jako miarę stężenia białka w próbce. Jako wzorzec w test włączono rozcieńczenia surowiczej albuminy bydlęcej (PIERCE nr katalogowy 23209).

Wstępna obróbka próbki

Gdy produkt enzymatyczny zawierający proteazę był stały, był początkowo rozpuszczany/zawieszany w 20 objętościach 100 mM H3BO3, 10 mM kwasu 3,3'-dimetylo-glutarowego, 2 mM CaCl2, pH 6 (bufor A) przez co najmniej 15 minut w 5°C, a gdy enzym był w postaci zawiesiny, zawiesinę przefiltrowano przez filtr 0,45μ i otrzymano czysty roztwór. Roztwór od tego momentu traktowano jak płynny produkt enzymatyczny zawierający proteazę.

Gdy produkt enzymatyczny był płynny, początkowo był dializowany w odcinającej 6-8000 Da rurce dializacyjnej Spectra-Por (nr katalogowy 132 670 z Spectrum Medical Industries) wobec 100 objętości buforu A + 150 mM NaCl (bufor B) przez co najmniej 5 godzin w 5°C aby usunąć z preparatu chemikalia, które mogłyby spowodować, że produkt enzymatyczny zawierający protezę byłby bardzo lepki, co jest szkodliwe w chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek.

Przedializowany produkt enzymatyczny zawierający proteazę przefiltrowano przez filtr 0,45μ, gdy podczas dializy wytworzył się wytrącony osad. Stężenie białka w przedializowanym produkcie

PL 200 047 B1 enzymatycznym wyznaczono z użyciem opisanego powyżej testu oznaczania stężenia białka i produkt enzymatyczny rozcieńczono w buforze B, tak by otrzymać próbkę o stężeniu 5 mg/ml gotową do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. Gdy produkt enzymatyczny po dializie miał stężenie białka niższe niż 5 mg/ml stosowano go w takiej postaci jak otrzymano.

Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek

Kolumnę HiLoad26/60 Superdex75pg (Amersham Pharmacia Biotech) o objętości 300 ml równoważono buforem B (przepływ: 1 ml/min). 1,0 ml próbki enzymatycznej zawierającej proteazę naniesiono na kolumnę i kolumnę przemywano buforem B (przepływ: 1 ml/min). Zbierano 2,0 ml frakcje z wylotu kolumny. Zebrane frakcje analizowano pod względem zawartości białka (patrz test stężenia białka) i aktywności proteazowej z użyciem stosownych testów. Przykładem stosownego testu jest test Suc-AAPF-pNA (patrz przykład 2B). Inne odpowiednie testy obejmują, np. test CPU (patrz przykład 1), oraz test Protazyme AK (patrz przykład 2D). Warunki, np. pH, w testach aktywności proteazowej ustawiono tak, by zmierzyć w frakcjonowanej próbce tak wiele proteaz jak to tylko było możliwe. Warunki testów wymienionych powyżej są przykładami odpowiednich warunków. Inne odpowiednie warunki wymieniono powyżej w części dotyczącej pomiaru aktywności proteazowej. Pik białkowy o aktywności w jednym lub większej liczbie testów proteazowych definiowano jako pik proteazy. Czystość piku proteazy obliczano jako ilość białka w piku podzieloną na całkowitą ilość białka we wszystkich zidentyfikowanych pikach proteazowych.

Czystość produktu enzymatycznego zawierającego protezę obliczono jako ilość białka w piku proteaz trwałych w kwasie podzieloną przez ilość białka we wszystkich zidentyfikowanych pikach proteazowych stosując powyższą procedurę.

Claims (5)

1. Zastosowanie co najmniej jednej trwałej w kwasie proteazy w karmie zwierzęcej, gdzie ta proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z (i) SEQ ID NO 1 i/lub (ii) SEQ ID NO 2 przy czym dawka proteazy wynosi 0,01-200 mg białka enzymu proteazy na kg karmy.

2. Zastosowanie co najmniej jednej trwałej w kwasie proteazy w wytwarzaniu kompozycji do stosowania w karmie zwierzęcej, gdzie ta proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z (i) SEQ ID NO 1 i/lub (ii) SEQ ID NO 2 przy czym ilość proteazy wynosi 0,01 mg - 400 g białka enzymu proteazy na kg kompozycji.

3. Dodatek do karmy zwierzęcej zawierający (a) co najmniej jedną trwałą w kwasie proteazę oraz (b) co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w tłuszczach i/lub (c) co najmniej jedną witaminę rozpuszczalną w wodzie i/lub (d) co najmniej jeden pierwiastek śladowy;

znamienny tym, że proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z (i) SEQ ID NO 1 i/lub (ii) SEQ ID NO 2 przy czym ilość proteazy wynosi 0,2 mg - 400 g białka enzymu proteazy na kg dodatku.

4. Dodatek do karmy zwierzęcej według zastrz. 3, znamienny tym, że ponadto zawiera fytazę, ksylanazę, galaktanazę i/lub β-glukanazę.

5. Karma zwierzęca mająca zawartość surowego białka 50-800 g/kg, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną trwałą w kwasie proteazę, która to proteaza jest identyczna w co najmniej 70% z