CN102378581A - 用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法 - Google Patents

用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的酶促方法及此类水解产物的用途，例如在婴儿配方组合物中。

Description

用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法
关于序列表
本申请包括计算机可读形式的序列表。通过述及将该计算机可读形式收入本文。
发明领域
本发明涉及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的酶促方法及此类水解产物的用途，例如在婴儿配方组合物中。
发明背景
已经开发了婴儿配方，其容许取代母乳喂养婴儿。
此类婴儿配方应当完全满足婴儿的营养要求，直到引入适宜的补充喂食。另外，味道是重要的，因为至少家长更喜欢没有苦味的婴儿配方。代替普通牛奶，包含水解的乳蛋白质(例如部分水解的乳清蛋白质或广泛水解的酪蛋白)的婴儿配方常常用作此类配方，变应原性较低且仍具有可接受的味道。
文献中记载的用于制备部分水解产物的方法常常包括使用胰酶，诸如通过对猪胰组织的提取生产的胰蛋白酶制备物(参见例如WO9304593 A1，US5039532 A)。记载的一些方法包括使用胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物。例如EP0353122 A披露了一种使用胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物来制备低变应原性乳清蛋白质水解产物的方法，其中糜蛋白酶/胰蛋白酶活性的比例为1.5-3.0。在EP0631731 A1中，以USP单位计，具有1.3至18、更优选4至6的胰蛋白酶对糜蛋白酶比例的胰蛋白酶和糜蛋白酶混合物据说通常产生具有期望特性的水解产物。
出于几个原因，使用自微生物生成的蛋白水解酶可赋予益处。例如，自微生物生产酶高效且易于控制。因此，可大量地且高纯度地生产此类酶。还有，使用微生物酶会有助于克服在自动物来源提取酶方面与QA升高有关的困难。
本发明的发明人的一个目标是开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的基于乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的蛋白质水解产物具有低变应原性。另一个目标是开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的基于乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的蛋白质水解产物具有与用包含胰蛋白酶和糜蛋白酶的提取制备物制备的水解产物的蛋白质片段谱相似的蛋白质片段谱。另一个目标是开发一种用由微生物生成的酶来制备如下的基于乳的蛋白质水解产物的方法，该基于乳的蛋白质水解产物具有可接受的味道。特别地，非常希望获得如下的部分乳清蛋白质水解产物，其具有低变应原性，具有与用包含胰蛋白酶和糜蛋白酶的提取制备物制备的水解产物的蛋白质片段谱相似的蛋白质片段谱，和/或具有可接受的味道，特别是在苦味方面。
发明概述
本发明的发明人令人惊讶地发现由微生物生成的酶可用于生产基于乳的蛋白质水解产物，例如供包括在婴儿配方中。
因此，本发明涉及一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，其包括用a)自微生物生成的胰蛋白酶样内肽酶和b)至少一种自微生物生成的其它内肽酶处理基于乳的蛋白质材料(proteinaceous material)的溶液。
附图简述
图1显示与猪胰蛋白酶(上部描记线)相比，镰孢属(Fusarium)胰蛋白酶(底部描记线)的UV层析图，而且显示了一些主峰的肽序列身份。
图2显示与牛糜蛋白酶(上部描记线)相比，小枝孢属(Brachysporiella)蛋白酶(底部描记线)的UV层析图，而且显示了一些主峰的肽序列身份。
发明详述
在依照本发明的方法中，使用基于乳的蛋白质材料作为起始材料。此类基于乳的蛋白质材料可例如由基于乳清的蛋白质材料、酪蛋白或基于乳清的蛋白质材料和酪蛋白的混合物组成。基于乳清的蛋白质材料可来源于自奶酪制备获得的乳清，特别是甜乳清诸如用粗制凝乳酶(rennet)使酪蛋白凝固而产生的。基于乳清的蛋白质材料也可以在35-80％蛋白质的范围中的浓缩物的形式使用，如通过超滤(UF乳清)或自乳清蛋白质分离物获得的。任选地，此基于乳清的蛋白质材料也可通过离子交换和/或电渗析(ED乳清)来去除矿物质。在一个优选的实施方案中，基于乳的蛋白质材料是乳清蛋白质浓缩物(WPC)。
酪蛋白来源可以是酸性酪蛋白或无脂乳固体。
基于乳清的蛋白质材料和/或该酪蛋白可以如液体浓缩物或粉的形式使用。
在一个优选的实施方案中，基于乳的蛋白质材料是基于乳清的蛋白质材料。在一个更优选的实施方案中，此类基于乳清的蛋白质材料的来源是已去除酪蛋白-糖-巨肽(CGMP)的甜乳清或乳清蛋白质分离物。在一个甚至更优选的实施方案中，此类基于乳清的蛋白质材料的来源是已去除酪蛋白-糖-巨肽的甜乳清。
自甜乳清去除CGMP产生苏氨酸含量接近人乳的蛋白质材料。然后可给此经修饰甜乳清补充含量低的那些氨基酸(主要是组氨酸和精氨酸)。EP880902中记载了一种用于自甜乳清去除CGMP的方法。
对于本发明的方法，将蛋白质材料稀释或重建成溶液或悬浮液，优选地包含以重量计2-35％左右、更优选以重量计5-30％左右的蛋白质材料。
在本发明的方法中，用至少两种均自微生物生成的内肽酶处理基于乳的蛋白质材料。
要在本发明的方法中使用的此类内肽酶可以是自任何属的微生物生成的。就本发明而言，如本文中与给定生物体联合使用的，术语“自...生成”应当表示依照本发明使用的多肽是通过给定生物体的细胞的发酵而生成的。多肽对于生成它的生物体可以是天然的，或者它可以自其中插入有编码该多肽的核苷酸序列的宿主生物体异源生成。
要在依照本发明的方法中使用的内肽酶之一是胰蛋白酶样内肽酶。术语“胰蛋白酶样内肽酶”在本文中定义为优先在精氨酸和/或赖氨酸的L-异构体的C端侧处切割肽或蛋白质的内肽酶。
在一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶优先在精氨酸和赖氨酸的C端侧处切割肽或蛋白质。这表示内肽酶对于在精氨酸和赖氨酸二者后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶优先在精氨酸或赖氨酸的C端侧处切割肽或蛋白质。这表示内肽酶对于在精氨酸或赖氨酸任一后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶优先在精氨酸的C端侧处切割肽或蛋白质。这表示内肽酶对于在精氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶优先在赖氨酸的C端侧处切割肽或蛋白质。这表示内肽酶对于在赖氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶特异性地在精氨酸和赖氨酸的C端侧处切割肽或蛋白质。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的胰蛋白酶样内肽酶具有超过100的胰蛋白酶比例，其中该胰蛋白酶比例是以在Arg或Lys(无论哪个更大)后面切割时酶的活性除以在Ala、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Phe或Val(无论哪个更大)任一后面切割时酶的活性测定的。即，在一个优选的实施方案中，依照本发明的胰蛋白酶样内肽酶对于在Arg或Lys(无论哪个更大)后面的切割具有特异性，其为在Ala、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Phe或Val(无论哪个更大)任一后面的切割的特异性的至少100倍。此类测定胰蛋白酶比例的活性测量应当在内肽酶的活性为该内肽酶在其最适pH时的活性的至少一半的pH值实施。胰蛋白酶比例可以如本申请实施例1所述来测定。
通常，此类胰蛋白酶样内肽酶在约6.0至约11.0的pH、优选在约8至约10的pH，及在约40℃至约70℃的温度、优选在约45℃至约65℃或约45℃至约60℃的的温度具有最佳蛋白水解活性。
在一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶是真菌内肽酶。在一个更优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶源自镰孢属，优选尖镰孢(Fusariumoxysporum)的菌株。例如，它可具有本申请的SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸序列(SWISSPROT No.P35049)。具有如SEQ ID NO：2的氨基酸25-248所示的氨基酸序列的来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶先前已有记载(US5,288,627；US5,693,520)。
在一个实施方案，胰蛋白酶样内肽酶源自茄病镰孢(Fusarium solani)，例如具有如本申请的SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的AP977S(GENESEQP：ADZ80577)。在另一个实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶源自茄病镰孢(Fusariumcf.solani)，例如具有如本申请的SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的AP971。
就本发明而言，如本文中与源自给定来源(即生物学生物体)的多核苷酸或多肽联合使用的术语“源自...”可表示多核苷酸(或编码多肽的多核苷酸)与该来源生物体中天然存在的多核苷酸序列相同或是其变体，不管是否将多核苷酸序列插入另一生物体或是否由另一生物体生成多肽。
在一个优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶是自真菌生成的。在一个更优选的实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶是自镰孢属的菌株生成的。
在本发明的一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶选自下组：
i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4或6任一的成熟多肽具有至少60％同一性；
ii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和
iv)SEQ ID NO：2、4或6任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
术语“成熟多肽”在本文中定义为具有内肽酶活性的多肽，其处于翻译和任何翻译后修饰(诸如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式。
术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有内肽酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2的成熟多肽可以是氨基酸25-248。SEQ ID NO：4的成熟多肽可以是氨基酸26-251。SEQ ID NO：6的成熟多肽可以是氨基酸18-250。
就本发明而言，使用EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选3.0.0或更晚版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定两种氨基酸序列之间的同一性程度。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(EMBOSS版本的BLOSUM62)取代矩阵。使用Needle标示“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的输出作为百分比同一性且如下计算：
(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，使用EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)(优选3.0.0或更晚的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两种脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(EMBOSS版本的NCBI NUC4.4)取代矩阵。使用Needle标示“最长同一性”(使用-nobrief选择获得)的输出作为百分比同一性且如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口的总数)
在本发明的一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸25至248。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ ID NO：2的氨基酸25至248组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含与SEQ IDNO：4的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：4的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸26至251。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ ID NO：4的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ IDNO：4的氨基酸26至251组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含与SEQ IDNO：6的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：6的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶包含SEQ ID NO：6的氨基酸18至250。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ ID NO：6的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由SEQ IDNO：6的氨基酸18至250组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选地中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选地中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在本发明的语境中，很低至很高严格条件定义为，遵循标准Southern印迹规程，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml经剪切且经变性的鲑鱼精DNA、和用于很低和低严格性的25％甲酰胺、用于中等和中等-高严格性的35％甲酰胺、或用于高和很高严格性的50％甲酰胺任一中预杂交和杂交最佳12至24小时。最终使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟，优选在45℃(很低严格性)、更优选在50℃(低严格性)、更优选在55℃(中等严格性)、更优选在60℃(中等-高严格性)、甚至更优选在65℃(高严格性)、和最优选在70℃(很高严格性)。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，该胰蛋白酶样内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶是SEQ ID NO：2、4或6任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
在本发明的语境中，此类变体可以是等位(天然)变体，或者它可以是人工变体。它可在成熟多肽中包含一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。优选地，氨基酸变化是性质上较不重要的，即对蛋白质的折叠和/或活性没有显著影响的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常是一个至约30个氨基酸；小氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；长达约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来便于纯化的小延伸，诸如多组氨酸束、抗原表位或结合域。
胰蛋白酶样内肽酶的浓度优选为1,000-1,000,000、更优选5,000-500,000、和最优选地25,000-250,000USP胰蛋白酶单位每g基于乳的蛋白质。
一个USP胰蛋白酶单位为使用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙基酯氢氯化物(BAEE)作为底物，在pH 7.6和25℃，引起253nm处的吸光度改变0.003的活性。
比活性在不同胰蛋白酶样内肽酶间可相当显著地变化，但是技术人员会轻易地能够确定要使用的胰蛋白酶样内肽酶的量，例如基于水解程度。
胰蛋白酶样内肽酶对基于乳的蛋白质的比例优选为0.01-10％重量/重量、更优选0.01-5％、更优选0.05-2.5％、甚至更优选0.5-1％、和最优选0.75％左右。
在依照本发明的方法中，用胰蛋白酶样内肽酶和至少一种其它内肽酶处理基于乳的蛋白质材料。
在一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶是丝氨酸内肽酶。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶具有低于胰蛋白酶样内肽酶特异性的活性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶具有与哺乳动物糜蛋白酶，例如自猪胰组织提取的糜蛋白酶的活性类似的活性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶对于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或组氨酸任一的羧基末端侧处的切割具有比在任何其它天然氨基酸羧基末端侧上的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶对于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或组氨酸羧基至少一种的末端侧处的切割具有特异性，其为在丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸任一的羧基末端侧处的切割的特异性的至少3倍、优选至少5倍。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶对于在来自由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸组成的组的至少三种氨基酸每一种的羧基末端侧处的切割具有比在精氨酸的羧基末端侧上的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶对于在来自由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸组成的组的至少三种氨基酸每一种的羧基末端侧处的切割具有比在赖氨酸的羧基末端侧上的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶对于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸每一种的羧基末端侧处的切割具有比在精氨酸和赖氨酸二者的羧基末端侧上的切割更高的特异性。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶具有至少3、优选至少5的糜蛋白酶比例。至少5的糜蛋白酶比例表示在Phe、Leu或Met(无论哪个更大)之一后面切割时酶的活性是在Ala、Arg、Asp、Glu、Ile、Lys或Val(无论哪个更大)任一后面切割时的活性的至少5倍。即，该至少一种其它内肽酶对于在Phe、Leu或Met(无论哪个更大)之一后面的切割具有特异性，其为在Ala、Arg、Asp、Glu、Ile、Lys或Val(无论哪个更大)任一后面的切割的特异性的至少3倍、优选至少5倍。此类测定糜蛋白酶比例的活性测量应当在内肽酶的活性为该内肽酶在其最适pH时的活性的至少一半的pH值实施。糜蛋白酶比例可以如本申请实施例1所述来测定。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶是细菌内肽酶。在一个更优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的菌株、优选自拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262(先前记载于例如WO 88/03947)。例如，它可具有本申请的SEQ ID NO：8的成熟多肽的氨基酸序列。源自拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列先前已经公开于例如DK专利申请No.1996 00013。
在另一个更优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶源自绿僵菌属(Metarhizium)、优选金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，例如具有本申请的SEQ ID NO：10的成熟多肽的氨基酸序列的(TREMBL：Q9Y843)。在另一个更优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶源自小枝孢属、优选美丽小枝孢(Brachysporiella gayana)，例如具有本申请的SEQ ID NO：12的成熟多肽的氨基酸序列(CGMCC 0865)。源自金龟子绿僵菌和美丽小枝孢的蛋白酶的DNA和氨基酸序列先前已经公开于例如WO04072279。
在另一个优选的实施方案中，该至少一种其它内肽酶是自细菌生成的。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶选自下组：
i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8、10或12任一的成熟多肽具有至少60％同一性；
ii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和
iv)SEQ ID NO：8、10或12任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
SEQ ID NO：10的成熟多肽可以是氨基酸187-374。SEQ ID NO：12的成熟多肽可以是氨基酸190-375。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含与SEQID NO：8的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQID NO：8的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQ ID NO：8的氨基酸1至188。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：8的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：8的氨基酸1至188组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含与SEQID NO：10的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQID NO：10的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQ ID NO：10的氨基酸187至374。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：10的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：10的氨基酸187至374组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含与SEQID NO：12的成熟多肽具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的氨基酸序列。在本发明的一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQID NO：12的成熟多肽的氨基酸序列。在本发明的另一个更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶包含SEQ ID NO：12的氨基酸190至375。在本发明的一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：12的成熟多肽的氨基酸序列组成。在本发明的另一个甚至更优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由SEQ ID NO：12的氨基酸190至375组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述寡核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ IDNO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述寡核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：9的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ IDNO：9的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述寡核苷酸在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：11的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：11的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：9的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，该至少一种其它内肽酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：11的成熟多肽编码序列具有至少60％、优选至少70％或至少80％、更优选至少85％或至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，胰蛋白酶样内肽酶是SEQ ID NO：8、10或12任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
该至少一种其它内肽酶的浓度优选为100-100,000、更优选500-50,000、和最优选1,000-20,000USP糜蛋白酶单位每g基于乳的蛋白质。
一个USP糜蛋白酶单位为使用N-乙酰基-L-酪氨酸乙基酯(ATEE)作为底物，在pH 7.0和25℃，引起237nm处的吸光度改变0.0075的活性。
比活性在不同内肽酶间可相当显著地变化，但是技术人员会轻易地能够确定要使用的该至少一种其它内肽酶的量，例如基于水解程度。
该至少一种其它内肽酶对基于乳的蛋白质的比例优选为0.001-1％重量/重量、更优选0.001-0.5％、更优选0.005-0.25％、甚至更优选0.02-0.1％、和最优选0.05％左右。
优选地，基于内肽酶的重量，以胰蛋白酶样内肽酶添加浓度的2％-50％，更优选5％-20％，甚至更优选5％-15％，和最优选约10％的浓度添加该至少一种其它内肽酶。
优选地，以USP胰蛋白酶单位测量的胰蛋白酶样内肽酶活性为以USP糜蛋白酶单位测量的该至少一种其它内肽酶活性的5倍-500倍、更优选10倍-200倍。
在水解之前的一个任选初步步骤是预加热基于乳的蛋白质材料的溶液或悬浮液，例如为了确保乳清蛋白质级分，例如血清清蛋白(BSA)、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和免疫球蛋白(特别是IgG)的变性。此步骤通常导致在通过免疫化学评估时残余抗原性降低(如下所述)。在一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在约75-95℃加热蛋白质材料约5-30分钟。在另一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在135℃以上加热蛋白质材料约1-5秒钟。在另一个优选的实施方案中，实施预处理步骤，其包括在约130℃加热蛋白质材料约30-60秒钟。
技术人员会知道优选将哪些条件应用于水解反应。例如，可以如US5039532或EP0631731A1中披露的那样进行。例如，可以在约40℃至60℃的温度，在6.5至8.5，优选6.5至8范围内的pH值在1至6小时的过程中进行。
在一个优选的实施方案中，在用肽酶进行第一处理之后，对蛋白质材料进一步进行第二蛋白水解，之后是内肽酶灭活。在一个更优选的实施方案中，在第一和第二蛋白水解之间对蛋白质材料进行热处理，如US5039532中披露的。
不管水解的条件，优选对水解产物进行灭活内肽酶的额外步骤。在一个优选的实施方案中，此肽酶灭活包括在约70至110℃、优选75至95℃的温度约0.1至30分钟的热处理。或者，可通过超高温灭菌(例如在约130℃约30-60秒钟)来灭活内肽酶。
可进一步澄清获得的蛋白质水解产物。它可以液体状态贮藏。也可将水解产物超滤，可将它浓缩，例如通过蒸发，而且可将它干燥，例如通过喷雾干燥或冻干。
在一个优选的实施方案中，获得的蛋白质水解产物具有中等(moderate)水解程度。在另一个优选的实施方案中，获得的蛋白质水解产物是部分水解产物。在另一个优选的实施方案中，获得的蛋白质水解产物具有5-30％、优选10-25％和更优选12-20％的水解程度。特别优选的水解程度是14％左右。另一种特别优选的水解程度是15％左右。
水解程度(DH)表示通过该方法获得的蛋白质水解的程度。在本发明的语境中，水解程度(DH)定义如下：
DH＝(被切割肽键的数目/肽键的总数)x100％
获得的蛋白质水解产物的水解程度(DH)可依照Church，F.C.等(1983)Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination ofProteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins，J.Dairy Sci.66：1219-1227的方法通过分光光度法来测量。
可测定获得的蛋白质水解产物中肽的分子量分布，例如通过大小排阻层析(SEC)进行。在一个优选的实施方案中，本发明的水解产物由肽构成，其中以重量计，少于1％具有20,000kDa以上的分子量。
通过本发明的方法获得的水解产物优选没有可检测的完整乳蛋白质。水解产物中完整乳蛋白质的缺失可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来证明。可在同一凝胶中进行水解产物和未水解的蛋白质起始材料之间的直接比较。在一个优选的实施方案中，本发明的水解产物由肽构成，其中以重量计，少于1％是完整的基于乳的蛋白质。
通过本发明的方法获得的水解产物的残余抗原性可使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。以落在该测定法建立的线性剂量响应范围内的浓度在固相上固定化未水解的乳蛋白质。类似地固定化水解产物制备物。随后，与家兔抗牛乳蛋白质和对家兔IgG有反应性的酶缀合物的序贯温育揭示作为抗原可识别的蛋白质和肽的存在。以质量为基础，比较用水解产物获得的结果与用未水解的蛋白质起始材料获得的结果。然后计算水解产物的百分比抗原性降低。
在一个优选的实施方案中，根据ELISA的测量，通过依照本发明的方法获得的蛋白质水解产物的抗原性相对于相应的未水解的基于乳的蛋白质材料具有至少约80％、优选至少约85％、更优选至少约90％或至少约95％、最优选至少约98％的降低、和甚至最优选抗原性的降低为至少约99％。
在一个优选的实施方案中，通过依照本发明的方法获得的蛋白质水解产物用于婴儿配方组合物。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于制备婴儿配方组合物的方法，其包括如上所述获得基于乳的蛋白质水解产物的步骤，且进一步包括将基于乳的蛋白质水解产物包括在婴儿配方组合物中的步骤。
此类婴儿配方组合物可处于粉、浓缩液、或随时可用的液体的形式。
此类婴儿配方组合物优选含有为了达到人类婴儿的营养需要而设计的组分。如此，在依照本发明的方法获得的蛋白质水解产物之外，婴儿配方应当优选含有脂质来源、碳水化合物来源、和其它营养诸如维生素和矿物质。典型地，可将动物油、植物油、淀粉、蔗糖、乳糖和/或玉米糖浆固体添加至配方以供应部分或所有上述营养。
优选的是，本发明的包含蛋白质水解产物的婴儿配方组合物是营养完全的。术语“营养完全”表示组合物含有足够的营养以使健康人生命维持延长的时段。
在一个优选的实施方案中，本发明的包含蛋白质水解产物的婴儿配方组合物另外包括量为以蛋白质重量计0.1至2％的游离精氨酸和/或量为以蛋白质重量计0.1至3％的游离组氨酸。如果在本发明的方法中使用经过修饰的甜乳清或乳清蛋白质分离物作为基于乳的蛋白质材料的话，添加游离精氨酸和/或游离组氨酸是特别优选的。
在另一个优选的实施方案中，本发明的包含蛋白质水解产物的婴儿配方组合物处于营养完全组合物的形式，其包含至少5％干固体、优选约10至30％干固体的量的基于乳的蛋白质水解产物。
实施例
实施例1：自猪胰提取的胰蛋白酶制备物的微生物代替物
胰的胰蛋白酶Novo 6.0S(可得自Novozymes A/S-下文称作PTN)是通过提取猪胰组织而生产的产品。PTN中的主要成分是胰蛋白酶和糜蛋白酶，胰蛋白酶∶糜蛋白酶的比例为至少12.5∶1(以活性计，即USP胰蛋白酶单位：USP糜蛋白酶单位)。
为了鉴定提取的酶制备物像PTN的合适的微生物代替物，对10种不同Suc-AAPX-pNA底物(可得自Bachem)(X＝A、R、D、E、I、L、K、M、F和V)测量了不同微生物蛋白酶在pH 9的活性。基于这些测量，计算了每种微生物蛋白酶的胰蛋白酶比例(TR)和糜蛋白酶比例(CR)。胰蛋白酶比例和糜蛋白酶比例定义如下：
TR＝对Suc-AAP(R/K)-pNA的最大活性/对Suc-AAPnon(R/K)-pNA的最大活性
CR＝对Suc-AAP(F/L/M)-pNA的最大活性/对Suc-AAPnon(F/L/M)-pNA的最大活性
胰蛋白酶比例：
胰蛋白酶是在精氨酸残基或赖氨酸残基任一的羧基末端侧上切割的特异性丝氨酸内肽酶，即它们严格地偏爱P1位置中的R或K。因此，胰蛋白酶样蛋白酶的一种合理限定为胰蛋白酶比例＞100，表示对任何其它8种Suc-AAPnon(R/K)-pNA底物的活性小于对最佳Suc-AAP(R/K)-pNA底物的活性的1％。
糜蛋白酶比例：
已知糜蛋白酶不太严格地偏爱在芳香族氨基酸残基(Trp、Tyr或Phe)或疏水性氨基酸残基Leu、Met和His任一的羧基末端侧上切割。与胰蛋白酶相比，糜蛋白酶是一种不太特异的内肽酶，糜蛋白酶样蛋白酶的一种合理限定为糜蛋白酶比例＞5，表示对任何其它7种Suc-AAPnon(F/L/M)-pNA底物的活性小于对最佳Suc-AAP(F/L/M)-pNA底物的活性的20％。
Suc-AAPX-pNA测定法：
蛋白酶：PTN
猪胰蛋白酶(UNIPROT：P00761)
镰孢属胰蛋白酶(来自尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶，SEQ ID NO：2)
牛经TLCK处理的糜蛋白酶(Sigma，C-3142)
Alcalase(可得自Novozymes A/S)
Bacillopeptidase F(来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，UNIPROT：Q65JX1)
小枝孢属蛋白酶(来自美丽小枝孢，SEQ ID NO：12)
Esperase(可得自Novozymes A/S)
绿僵菌属蛋白酶(来自金龟子绿僵菌，SEQ ID NO：10)
拟诺卡氏菌属蛋白酶(来自拟诺卡氏菌NRRL 18262，SEQ ID NO：8)
Savinase(可得自Novozymes A/S)
底物：Suc-AAPA-pNA(Bachem L-1775)
Suc-AAPR-pNA(Bachem L-1720)
Suc-AAPD-pNA(Bachem L-1835)
Suc-AAPE-pNA(Bachem L-1710)
Suc-AAPI-pNA(Bachem L-1790)
Suc-AAPL-pNA(Bachem L-1390)
Suc-AAPK-pNA(Bachem L-1725)
Suc-AAPM-pNA(Bachem L-1395)
Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)
Suc-AAPV-pNA(Bachem L-1770)
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mMCaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。
测定法：在微量滴定板的孔中放置20μl肽酶稀释液(在0.01％Triton X-100中稀释)。通过添加200μl pNA底物(在1.0ml DMSO中溶解50mg，并用测定缓冲液稀释90倍)来启动测定。监测OD405的初始升高，作为肽酶活性的量度。如果在4分钟测量时间中没有实现线性(或接近线性)曲线图的话，将肽酶进一步稀释并重复测定。
数据：
Figure BDA0000095307580000171
表中为每种内肽酶报告的活性数据是相对于对最佳Suc-AAPX-pNA底物的活性的。
结论：
使用上文对胰蛋白酶样蛋白酶作为具有＞100的胰蛋白酶比例的蛋白酶的限定，猪胰蛋白酶(TR＝1750)和镰孢属胰蛋白酶(TR＞10,000)是胰蛋白酶样蛋白酶。其余测试的蛋白酶不是胰蛋白酶样蛋白酶。
使用上文对糜蛋白酶样蛋白酶作为具有＞5的糜蛋白酶比例的蛋白酶的限定，牛糜蛋白酶(CR＝160)、Alcalase(CR＝40)、小枝孢属蛋白酶(CR＝22)、Esperase(CR＝6.2)、绿僵菌属蛋白酶(CR＝27)、拟诺卡氏菌属蛋白酶(CR＝7.7)和Savinase(CR＝9.7)是糜蛋白酶样蛋白酶。其余测试的蛋白酶不是糜蛋白酶样蛋白酶。
对糜蛋白酶样蛋白酶的另一种限定会是计算对糜蛋白酶的相对活性差异的平方和。使用此限定，绿僵菌属蛋白酶成为最像糜蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，接着是小枝孢属蛋白酶、拟诺卡氏菌属蛋白酶、Savinase和Alcalase(数据未显示)。
实施例2：用微生物内肽酶组合水解WPC
下一步是看当以相等剂量使用两种酶混合物时使用微生物内肽酶混合物是否有可能得到与PTN所能获得的相同的乳清蛋白质浓缩物(WPC)水解程度(DH)。
水解实验：
我们实施的水解测定法是两步水解规程。在pH 8.0缓冲液中悬浮8.4％WPC(含有80％的乳清蛋白质)。第一水解步骤通过添加一半的酶剂量并将溶液在搅动中在55℃温育2小时来实施。然后通过短加热处理(在90℃5分钟)使部分水解的乳清蛋白质底物变性。第二水解步骤通过添加另一半的酶剂量并将溶液在搅动中在55℃温育30分钟来实施。最后，终止酶反应，并通过另一短加热处理(在90℃10分钟)来灭活酶。乳清蛋白质/肽的终浓度为6.4％WP。通过使用此测定法，我们应当能够比较PTN与微生物代替物。
由于在碱性范围中在水解期间生成H+，因此我们对一些最高酶剂量检查了pH。我们没有检测到任何pH下降，指示我们的pH 8.0缓冲液的强度足以在水解期间控制pH。
首先，我们测试了4种不同PTN剂量(0.625、1.25、2.5和5.0mg胰蛋白酶/g乳清蛋白质)。对于最低剂量，乳清蛋白质水解产物非常粘，而且几乎不可能从Eppendorf管取出，因此对此水解产物没有测定DH。PTN水解产物的SDS-PAGE分析显示了至少对于5.0mg胰蛋白酶/g乳清蛋白质剂量，大部分完整蛋白质得到降解。在后续的SDS-PAGE凝胶上，在每条道上加载等量的蛋白质/肽。5.0mg胰蛋白酶/g乳清蛋白质PTN剂量的DH＝9.4％。
然后，我们用纯化的胰蛋白酶(猪胰蛋白酶和镰孢属胰蛋白酶)进行了一些水解实验。我们未能得到大约6.5％以上的DH，甚至在相对较高的剂量。见下文数据部分。
最后，我们进行了第三系列的水解实验，其中我们保持镰孢属胰蛋白酶的剂量恒定于5.0mg胰蛋白酶/g乳清蛋白质并改变糜蛋白酶样蛋白酶剂量(0.25、0.5和1.0mg蛋白酶/g乳清蛋白质)。在此，我们获得了与相等剂量的PTN相同范围中的DH值(DH＝9.4％)。
看来提高第二糜蛋白酶样蛋白酶的剂量对DH的影响取决于第二蛋白酶具有不同影响。镰孢属胰蛋白酶和来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰基肽酶BL(它不是糜蛋白酶样蛋白酶)的组合看来变平(level off)，正如对单独的镰孢属胰蛋白酶看到的。
DH值(见下文数据部分)和SDS-PAGE凝胶上乳清蛋白质水解产物的外观之间有关联。镰孢属胰蛋白酶和拟诺卡氏菌属蛋白酶的组合看来(根据SDS-PAGE凝胶-未显示)是自WPC底物去除完整蛋白质的最佳丝氨酸蛋白酶组合。
水解测定法：
使用的内肽酶：
Figure BDA0000095307580000191
为了计算PTN 6.0S中的胰蛋白酶和糜蛋白酶含量，我们使用了猪胰蛋白酶的比活性＝7000USP/mg和猪糜蛋白酶的比活性＝4500USP/mg。根据A280/E280来估算其它制备物中的酶浓度。在20mM HEPES/NaOH，5mMCaCl2，pH 8中溶解PTN。在融化后“原态”使用其它酶。
水解：
在pH 8.0的1.0M HEPES/NaOH、50mM CaCl2中悬浮84mg/ml WPC(LactProdan80，来自Arla，包含总干物质约80％的蛋白质)，并用27％NaOH将pH调整至pH 8.0。在冰上在Eppendorf管中放置1000μl此悬浮液。添加25μl肽酶溶液，并将Eppendorf管转移至预热至55℃的Eppendorf热混合仪。将管在热混合仪(55℃，1400rpm)上温育120分钟。然后将管转移至另一预热至90℃的Eppendorf热混合仪，并在此热混合仪(90℃，1400rpm)上温育5分钟。将管转移回第一55℃Eppendorf热混合仪，并在5分钟后(使水解混合物回至55℃)添加25μl肽酶溶液，并将管在该热混合仪(55℃，1400rpm)上温育30分钟。最后，再次将管转移至90℃热混合仪，在此热混合仪(90℃，1400rpm)上温育10分钟。
通过SDS-PAGE(未显示)来分析水解产物(含64mg/ml乳清蛋白质)并使用OPA方法来测量DH。
SDS-PAGE：
将水解产物在0.1％SDS中稀释5倍。将20μl此稀释液与20μl含还原剂的2x SDS-PAGE样品缓冲液混合。将此混合物煮沸并将10μl应用于4-20％Tris-甘氨酸凝胶。
用于测量DH的OPA方法：
将水解产物在0.01％Triton X-100中稀释80倍。将30μl此稀释液转移至微量滴定板(MTP)并添加225μl新鲜制备的OPA试剂并在2分钟后在MTP读数仪中读取340nm处的吸光度。将未知样品的响应与丝氨酸标准稀释系列比较并表述为mg/ml丝氨酸。以“mg/ml水解产物中的丝氨酸”相对于“mg/ml底物”来计算“OPA响应”。为了计算DH，减去酶空白的“OPA响应”。
OPA试剂：
在80ml去离子水中溶解3.81g四硼酸二钠(Merck 6308)和1.00g SDS(BIO-RAD 161-0301)。临使用前，添加在2.0ml乙醇中溶解的80mg邻酞二醛(Merck 821027)和1.0ml 10％(w/v)DTE(Merck 24511)。最后，用去离子水将体积调整至100ml。
数据：
Figure BDA0000095307580000211
结论：
看来有可能使用微生物PTN代替物(剂量与PTN一样)给出相同的WPC水解程度(DH)。根据结果显然的是，单独的胰蛋白酶样蛋白酶不能给出与PTN相同的DH。
实施例3：镰孢属胰蛋白酶和小枝孢属内肽酶的切割特异性分析
引言：
将微生物胰蛋白酶样内肽酶，镰孢属胰蛋白酶的蛋白水解切割特异性与猪胰蛋白酶进行了比较。而且，将来自小枝孢属的微生物糜蛋白酶样内肽酶的蛋白水解切割特异性与经TLCK处理的猪糜蛋白酶的蛋白水解特异性进行了比较。(TLCK灭活胰蛋白酶活性，而对糜蛋白酶没有影响)。
实施了切割特异性分析，即，将所述内肽酶与变性模式底物牛β-乳球蛋白A一起温育。通过与用于蛋白质鉴定的串联质谱数据分析程序(SEQUEST)和只含有牛β-乳球蛋白A的数据库组合的在线RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS来测定所得蛋白水解肽的序列。
样品：
蛋白酶：猪胰蛋白酶(UniProt编号：P00761)
镰孢属胰蛋白酶(来自尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶，SEQ ID NO：2)
牛经TLCK处理的糜蛋白酶(Sigma，C-3142)
小枝孢属蛋白酶(来自美丽小枝孢，SEQ ID NO.12)
底物：β-乳球蛋白A，来自牛乳(Sigma L7880 097K7010)
蛋白水解：
β-乳球蛋白A的变性：
在1ml缓冲液(100mM乙酸铵、1mM CaCl2 pH8)中溶解大约11mg量的来自牛乳(Sigma L7880 097K7010)的β-乳球蛋白A。通过添加二硫苏糖醇(DTT，CAS No.3483-12-3)至终浓度20mM来还原β-乳球蛋白的二硫桥。将混合物于室温(25℃)温育30分钟。随后，添加2-碘乙酰胺(CAS No.144-48-9)至终浓度55mM。将后一混合物在黑暗中在室温温育30分钟。
在与蛋白酶一起温育之前，将变性β-乳球蛋白A缓冲液交换至100mM乙酸铵、1mM CaCl2 pH8。缓冲液交换是在来自GE-healthcare的PD-10脱盐柱(Sephadex G-25柱材料)上实施的。首先，用25ml的100mM乙酸铵、1mMCaCl2 pH8平衡柱。用平衡缓冲液将β-乳球蛋白样品体积调整至终体积2.5ml，并加载到柱上。用3.5ml的100mM乙酸铵、1mM CaCl2 pH8洗脱β-乳球蛋白A。通过估算的消光(A280)系数1和280nm处的分光光度法分析，测定缓冲液交换的β-乳球蛋白的蛋白质终浓度为2mg/ml。
蛋白水解温育：
将与190μl溶液对应的400μg量的β-乳球蛋白与下述量的蛋白酶一起在40℃温育：
Figure BDA0000095307580000231
18小时后通过添加10％三氟乙酸(TFA，CAS No.76-05-1)水溶液至样品中TFA终浓度1％来终止蛋白水解过程。在通过LC-MS/MS来分析之前，将所有样品贮藏于-20℃。
LC-MS/MS方法：
在由Waters C18柱(ACQUITY
Figure BDA0000095307580000232
BEH C18，1.7μm，2.1x100mm)、Accela液体层析系统(来自Thermo Scientific)和LTQ Orbitrap XL ETD混合质谱仪(来自Thermo Scientific)组成的RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS系统上分析了所有蛋白水解样品。将20μl体积注射到柱上。通过下述梯度将肽分开：溶剂A：UHQ水中的0.1％甲酸(CAS No.64-18-6)和溶剂B：乙腈(CAS No.75-05-8)中的0.1％甲酸
 时间(min)  ％B溶剂
 0  5
 2  5
 49  50
 51  90
 53  90
 55  5
 60  5
通过UV检测仪在214nm在线地，随后通过质谱仪以MS/MS模式在线地监测洗脱肽。所得UV-层析图显示于图1和2。在质谱仪中，以30,000(FWHM)的分辨率检测前体离子，以15,000(FWHM)的分辨率检测片段离子。用SEQUEST软件(美国专利6,017,693和5,538,897的算法)经Proteome Discoverer(1.0版，Thermo Fisher Scientific)针对β-乳球蛋白分析了所得MS和MS/MS谱。切割酶定义为具有“非特异的”切割特异性的“无-酶”。鉴定了一些高强度UV峰的蛋白水解片段，如图1和2所示。
结果：
为了比较，在图1中，与猪胰蛋白酶测定法(上部描记线)一起显示了镰孢属胰蛋白酶测定法的UV层析图(底部描记线)，而且显示了一些主要肽的序列身份。类似地，在图2中，与牛糜蛋白酶(上部描记线)一起显示了小枝孢属蛋白酶测定法的UV层析图(底部描记线)。在所有情况中，在上部和底部描记线中都检测出所鉴定的肽。
结论：
在图1中，对镰孢属胰蛋白酶和猪胰蛋白酶检测出牛β-乳球蛋白A的常见蛋白水解肽，因此这两种内切蛋白酶都具有胰蛋白酶样特异性。在图2中，对小枝孢属蛋白酶和牛糜蛋白酶检测出牛β-乳球蛋白A的一些常见蛋白水解肽。
Figure IDA0000095307620000011
Figure IDA0000095307620000021
Figure IDA0000095307620000051
Figure IDA0000095307620000061
Figure IDA0000095307620000071
Figure IDA0000095307620000091

Claims (15)

1.一种用于制备基于乳的蛋白质水解产物的方法，其包括用a)自微生物生成的胰蛋白酶样内肽酶和b)至少一种自微生物生成的其它内肽酶处理基于乳的蛋白质材料的溶液。
2.依照权利要求1的方法，其中该胰蛋白酶样内肽酶源自镰孢属(Fusarium)的菌株。
3.依照前述权利要求任一项的方法，其中该胰蛋白酶样内肽酶选自下组：
i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4或6任一的成熟多肽具有至少60％同一性；
ii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、3或5任一的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和
iv)SEQ ID NO：2、4或6任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
4.依照前述权利要求任一项的方法，其中胰蛋白酶样内肽酶对基于乳的蛋白质的比例为0.01-10％重量/重量、优选0.01-5％、更优选0.05-2.5％、甚至更优选0.5-1％。
5.依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶对在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和组氨酸的羧基末端侧处的切割具有比在精氨酸和赖氨酸的羧基末端侧上的切割更高的特异性。
6.依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶具有至少3的糜蛋白酶比例。
7.依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶是源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、绿僵菌属(Metarhizium)或小枝孢属(Brachysporiella)的菌株。
8.依照前述权利要求任一项的方法，其中该至少一种其它内肽酶选自下组：
i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8、10或12任一的成熟多肽具有至少60％同一性；
ii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少低严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：7、9或11任一的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和
iv)SEQ ID NO：8、10或12任一的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入的变体。
9.依照前述权利要求任一项的方法，其中至少一种其它内肽酶对基于乳的蛋白质的比例为0.001-1％重量/重量、优选0.001-0.5％、更优选0.005-0.25％、甚至更优选0.02-0.1％。
10.依照前述权利要求任一项的方法，其中基于内肽酶的重量，以胰蛋白酶样内肽酶添加浓度的2％-50％的浓度添加该至少一种其它内肽酶。
11.依照前述权利要求任一项的方法，其中在约40℃至60℃的温度，在范围6.5至8.5的pH值在1至6小时的过程中进行水解。
12.依照前述权利要求任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物具有5-30％、优选10-25％和更优选12-20％的水解程度。
13.依照前述权利要求任一项的方法，其中获得的蛋白质水解产物由肽构成，其中以重量计，少于1％具有20,000kDa以上的分子量。
14.依照前述权利要求任一项的方法，其中根据ELISA的测量，获得的蛋白质水解产物的抗原性相对于相应的未水解的基于乳的蛋白质材料具有至少约80％、优选至少约85％、更优选至少约90％或至少约95％、最优选至少约98％、和甚至最优选至少约99％的降低。
15.依照前述权利要求任一项的用于制备婴儿配方组合物的方法，其进一步包括将获得的基于乳的蛋白质水解产物包括在婴儿配方组合物中的步骤。
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