KR20120024539A

KR20120024539A - 젖-기반 단백질 가수분해물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20120024539A
Application number: KR1020117023640A
Authority: KR
Inventors: 피터 알. 외스터가드; 스테펜 언스트; 기테 비. 린글레브
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2012-03-14
Also published as: DK2413720T3; US20100255153A1; CN105661553A; EP2413720B1; EP2413720A1; BRPI1013708B1; CA2773686A1; AU2010230165A1; JP2012522498A; US9259023B2; JP5782021B2; KR101739326B1; NZ595062A; WO2010112546A1; BRPI1013708A2; AU2010230165B2; CA2773686C; CN102378581A

Abstract

본 발명은 젖-기반 단백질 가수분해물을 만들기 위한 효소적 방법 및 이런 가수분해물의, 예컨대, 유아용 조제식 조성물에서의 용도에 관한 것이다.

Description

젖-기반 단백질 가수분해물의 제조 방법{PROCESS FOR MAKING A MILK-BASED PROTEIN HYDROLYSATE}

서열목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터로 판독가능한 형태로 서열목록을 함유한다. 컴퓨터로 판독가능한 형태는 참고문헌으로써 본원에 포함된다.

유아의 모유 수유의 대체를 허용하는 유아용 조제식이 개발되었다.

이런 유아용 조제식은 적당한 보충 급식을 도입할 때까지 유아의 영양적 요구를 완전히 만족시켜야만 한다. 나아가, 적어도 부모가 쓰지 않은 맛을 갖는 유아용 조제식을 선호하기 때문에, 맛이 중요하다. 보통 소의 젖 대신에 가수분해된 우유 단백질, 예컨대 부분 가수분해된 유장 단백질 또는 광범위하게 가수분해된 카제인을 포함하는 유아용 조제식은, 이런 조제식이 덜 자극성이고 여전히 수용가능한 맛을 가지고 있기 때문에 종종 사용된다.

문헌에서 기술된 부분 가수분해물의 제조 방법은 돼지 췌장 조직의 추출에 의해 생산된 트립신 제조와 같은 췌장 효소의 사용을 종종 포함한다(예컨대, WO9304593 A1, US5039532 A를 보라). 기술된 방법 중 일부는 트립신 및 키모트립신의 혼합물의 사용을 포함한다. 예컨대, EP0353122 A는 트립신 및 키모트립신의 혼합물을 사용한 저자극성 유장 단백질 가수분해물의 제조 방법을 개시하고, 키모트립신/트립신 활성의 비율은 1.5 및 3.0 사이이다. EP0631731 A1에서, USP 유니트로 1.3 내지 18, 더욱 바람직하게는 4 내지 6의 트립신 대 키모트립신의 비율을 갖는 트립신 및 키모트립신의 혼합물은 원하는 특성의 가수분해물을 전형적으로 야기하는 것으로 전해진다.

몇 가지 이유에 있어서, 미생물로부터 생산된 단백질 가수 분해성 효소의 사용이 이익을 줄 수 있다. 예를 들어, 미생물로부터의 효소 생산은 효율적이고, 조절하기 쉽다. 그러므로 이런 효소는 대량 및 고순도로 생산할 수 있다. 또한, 미생물 효소의 사용은 동물 공급원으로부터의 효소의 추출에 관한 QA 관련 어려움의 증가를 극복하는 것을 도울 것이다.

본 발명자들의 한 목적은 저자극성을 갖는 미생물 생산 효소로 젖-기반 단백질 가수분해물을 만드는 방법을 개발하는 것이었다. 다른 목적은 트립신 및 키모트립신을 포함하는 추출된 표본과 비교하여 가수분해물의 단백질 단편 프로파일에 대하여 유사성을 갖는 단백질 단편 프로파일을 갖는 미생물 생산 효소로 젖-기반 단백질 가수분해물을 만드는 방법을 개발하는 것이었다. 다른 목적은 수용가능한 맛을 갖는 미생물에서 생산된 효소를 사용하여 젖-기반 단백질 가수분해물을 만드는 방법을 개발하는 것이다. 특히, 저자극성이고, 트립신 및 키모트립신을 포함하는 추출된 표본으로 제조된 가수분해물의 단백질 단편 프로파일과 유사성을 갖는 단백질 단편 프로파일을 갖고, 및/또는 특히 쓴맛에 관하여 수용가능한 맛을 갖는 부분 유장 단백질 가수분해물을 갖는 것이 매우 바람직할 것이다.

발명의 개요

본 발명자들은 놀랍게도 미생물에서 생산된 효소를 젖-기반 단백질 가수분해물의 생산을 위해, 예컨대, 유아용 조제식으로의 포함을 위해 사용할 수 있음을 발견하였다.

그러므로 본 발명은 젖-기반 단백질성 물질의 용액을

a) 미생물로부터 생산된 트립신-유사 엔도펩티다아제, 및

b) 미생물로부터 생산된 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하는 젖-기반 단백질 가수분해물의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1은 돼지 트립신(상부 자취)과 비교한 푸자리움(Fusarium) 트립신(하부 자취)의 UV-크로마토그램을 보여주고, 일부 주요 피크의 펩티드 서열 동일성을 나타낸다.
도 2는 소 키모트립신(상부 자취)과 비교한 브라키스포리엘라(Brachysporiella) 프로테아제(하부 자취)의 UV-크로마토그램을 보여주고, 일부 주요 피크의 펩티드 서열 동일성을 나타내었다.

본 발명에 따른 방법에서, 젖-기반 단백질성 물질이 시작 물질로서 사용된다. 이런 젖-기반 단백질성 물질은 예컨대, 유장-기반 단백질성 물질, 카제인, 또는 유장-기반 단백질성 물질 및 카제인의 혼합물로 구성될 수 있다. 유장-기반 단백질성 물질은 치즈 제조로부터 얻어진 유장, 특히 응유 효소(rennet)에 의한 카제인의 응고에서 야기된 것과 같은 달콤한 유장으로부터 공급될 수 있다. 또한, 유장-기반 단백질성 물질은 한외 여과(UF 유장)에 의해 수득된 것과 같이, 또는 유장 단백질 분리물로부터 35-80%의 범위에서 농축액의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 대안으로, 이 유장-기반 단백질성 물질은 이온 교환 및/또는 전기투석(ED 유장)에 의해 탈무기질화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 젖-기반 단백질성 물질은 유장 단백질 농축액(WPC)이다.

카제인의 공급원은 산 카제인 또는 무지방 유고형분일 수 있다.

유장-기반 단백질성 물질 및/또는 카제인이 예컨대, 액체 농축액 또는 분말의 형태로 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 젖-기반 단백질성 물질은 유장-기반 단백질성 물질이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 이런 유장-기반 단백질성 물질의 공급원은 카제이노-글리코-마크로펩티드(CGMP)가 제거된 달콤한 유장 또는 유장 단백질 분리물이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 이런 유장-기반 단백질성 물질의 공급원은 카제이노-글리코-마크로펩티드가 제거된 달콤한 유장이다.

달콤한 유장으로부터의 CGMP의 제거는 단백질 물질이 인간 젖의 것에 가까운 트레오닌 함유량으로 있게 한다. 이 변형된 달콤한 유장은 이후 낮은 함유량을 갖는 이들 아미노산으로 보충될 수 있다(주로 히스티딘 및 아르기닌). 달콤한 유장으로부터 CGMP를 제거하는 방법은 EP 880902에서 기술한다.

본 발명의 방법에 있어서, 단백질성 물질은 바람직하게는 단백질성 물질의 중량으로 약 2-35%, 더욱 바람직하게는 중량으로 약 5-30%를 포함하는, 용액 또는 현탁액으로 희석 또는 복원된다.

본 발명의 방법에서, 젖-기반 단백질성 물질은 모두 미생물로부터 생산된 적어도 두 가지의 엔도펩티다아제로 처리된다.

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 이런 엔도펩티다아제는 임의의 속의 미생물로부터 생산될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 주어진 유기체와 관련하여 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "~로부터 생산된"은 본 발명에 따라 사용된 폴리펩티드가 주어진 유기체의 세포의 발효에 의해 생산되었음을 의미할 것이다. 폴리펩티드는 생산되는 유기체에 고유한 것일 수 있거나, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드가 삽입된 숙주 유기체로부터 이종적으로 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 엔도펩티다아제의 하나는 트립신-유사 엔도펩티다아제이다. 용어 "트립신-유사 엔도펩티다아제"는 본원에서 아르기닌 및/또는 리신의 L-이성체의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 선택적으로 절단하는 엔도펩티다아제로서 정의된다.

바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 아르기닌 및 리신의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 선택적으로 절단한다. 이것은 엔도펩티다아제가 어떤 다른 아미노산의 뒤를 절단하는 것보다, 아르기닌 및 리신 모두의 뒤를 절단하는데 더 높은 특이성을 가지는 것을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 아르기닌 또는 리신의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 선택적으로 절단한다. 이것은 엔도펩티다아제가 어떤 다른 아미노산의 뒤를 절단하는 것보다 아르기닌 또는 리신 중 어느 하나의 뒤를 절단하는데 더 높은 특이성을 가지는 것을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 아르기닌의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 선택적으로 절단한다. 이것은 엔도펩티다아제가 어떤 다른 아미노산의 뒤를 절단하는 것보다 아르기닌의 뒤를 절단하는데 더 높은 특이성을 가지는 것을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 리신의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 선택적으로 절단한다. 이것은 엔도펩티다아제가 어떤 다른 아미노산의 뒤를 절단하는 것보다 리신의 뒤를 절단하는데 더 높은 특이성을 갖는 것을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 아르기닌 및 리신의 C-말단 쪽에서 펩티드 또는 단백질을 특이적으로 절단한다.

바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 트립신-유사 엔도펩티다아제는 100 이상의 트립신 비율을 갖고, 트립신 비율은 Arg 또는 Lys 뒤를 절단할 때의 효소의 활성(어느 것이든 더 큰 것)을 Ala, Asp, Glu, Ile, Leu, Met, Phe 또는 Val 중 어느 하나의 뒤를 절단할 때의 효소의 활성(어느 것이든 더 큰 것)으로 나눔으로서 정의된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 트립신-유사 엔도펩티다아제는 Ala, Asp, Glu, Ile, Leu, Met, Phe 또는 Val 중 어느 하나의 뒤를 절단하는 그것의 특이성(어느 것이든 더 큰 것)보다 적어도 100배 높은 Arg 또는 Lys의 뒤를 절단하는 특이성(어느 것이든 더 큰 것)을 갖는다. 트립신 비율을 결정하기 위한 이런 활성의 측정은 엔도펩티다아제의 활성이 그것의 최적 pH에서의 엔도펩티다아제의 활성의 절반인 pH-값에서 수행되어야 한다. 트립신 비율은 본 출원의 실시예 1에서 기술된 것과 같이 결정될 수 있다.

전형적으로, 이런 트립신-유사 엔도펩티다아제는 약 6.0 내지 약 11.0의 pH, 바람직하게는 약 8 내지 약 10의 pH, 및 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 65℃ 또는 약 45℃ 내지 약 60℃의 온도에서 최적의 단백질 가수분해 활성을 갖는다.

바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 진균성 엔도펩티다아제이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 푸자리움, 바람직하게는 푸자리움 옥시스포룸(F. oxysporum)의 균주로부터 유래한다. 예컨대, 본 출원의 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열(SWISSPROT No. P35049)을 가질 수 있다. 서열번호 2의 아미노산 25-248로서 보여준 아미노산 서열을 갖는 푸자리움 옥시스포룸으로부터 나온 트립신-유사 엔도펩티다아제는 이전에 기술되었다(US5,288,627; US5,693,520).

한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 푸자리움 솔라니(F. solani), 본 출원의 서열번호 4로서 보여준 아미노산 서열을 갖는 AP977S(GENESEQP: ADZ80577)로부터 유래할 수 있다. 다른 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 푸자리움 cf. 솔라니, 예컨대 본 출원의 서열번호 6으로서 보여준 아미노산 서열을 갖는 AP971로부터 유래한다.

본 발명의 목적을 위해서, 주어진 공급원(즉, 생물학적 유기체)으로부터 나온 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 유래하는 것과 관련하여 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "~로부터 유래한"은 폴리뉴클레오티드 서열이 다른 유기체로 삽입되었던지, 폴리펩티드가 다른 유기체에 의해 생산되던지 상관없이, 폴리뉴클레오티드(또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)가 그 공급원 유기체에서 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 그 서열의 변이체인 것을 의미할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 진균으로부터 생산될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 푸자리움의 균주로부터 생산될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는:

i) 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

ii) (i) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 적어도 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

iii) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및

iv) 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇몇의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선별될 수 있다.

용어 "성숙 폴리펩티드"는 본원에서 번역, 및 N-말단 과정, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등과 같은 임의의 번역 후의 변형 후 그것의 최종 형태인 엔도펩티다아제 활성을 갖는 폴리펩티드로서 정의된다.

용어 "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"은 본원에서 엔도펩티다아제 활성을 갖는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.

서열번호 2의 성숙 폴리펩티드는 아미노산 25-248일 수 있다. 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드는 아미노산 26-251일 수 있다. 서열번호 6의 성숙 폴리펩티드는 아미노산 18-250일 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 두 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277)에서 실행된 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적인 매개변수는 10의 갭 오픈 패널티, 0.5의 갭 확장 패널티 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 획득)으로 표시된 Needle의 출력은 백분율 동일성으로서 사용되고, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 잔기×100)/(배열의 길이-배열에서 갭의 총 수).

본 발명의 목적을 위하여, 두 개의 디옥시리보뉴클레오티드 사이의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기참조)에서 실행되는 바와 같이, Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, 상기참조), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적인 매개변수는 10의 갭 오픈 패널티, 0.5의 갭 확장 패널티 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 획득)으로 표시된 Needle의 출력은 백분율 동일성으로서 사용되고, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 디옥시리보뉴클레오티드×100)/(배열의 길이-배열에서 갭의 총 수).

본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 248을 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 2의 아미노산 25 내지 248로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 4의 아미노산 26 내지 251을 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 4의 아미노산 26 내지 251로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 6의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 6의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 6의 아미노산 18 내지 250을 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 6의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 6의 아미노산 18 내지 250으로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 문맥에서, 최적으로 12 내지 24시간의 표준 서던 블롯 과정 후에, 매우 낮은 내지 매우 높은 긴축 조건은 42℃에서 5× SSPE, 0.3% SDS, 200 ㎍/㎖로 전단되고 변성된 연어 정자 DNA의 예비혼성화 및 혼성화, 그리고 매우 낮은 및 낮은 긴축도에 대해 25% 포름아마이드, 중간 및 중간-높은 긴축도에 대해 35% 포름아마이드, 또는 높은 및 매우 높은 긴축도에 대해 50% 포름아마이드 중 하나로서 정의된다. 담체 물질은 최종적으로 2× SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안, 바람직하게는 45℃에서(매우 낮은 긴축도), 더욱 바람직하게는 50℃에서(낮은 긴축도), 더욱 바람직하게는 55℃에서(중간 긴축도), 더욱 바람직하게는 60℃에서(중간-높은 긴축도), 더욱 더 바람직하게는 65℃에서(높은 긴축도), 및 가장 바람직하게는 70℃에서(매우 높은 긴축도) 3회 세척된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%로 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%로 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%로 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체이다.

본 발명의 문맥에서, 이런 변이체는 대립유전자(천연) 변이체일 수 있거나, 인공 변이체일 수 있다. 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(또는 몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 부수적 특성, 즉, 단백질의 접힘 및/또는 활성에 중요하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산의 치환 또는 삽입; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 약 30개의 아미노산; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 확장, 예로써 아미노-말단 메티오닌 잔기; 약 20-25개 이하의 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 폴리-히스티딘 트랙, 항원 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 순전하 또는 다른 기능을 변형시키는 것에 의한 정제를 촉진하는 작은 확장이 있다.

트립신-유사 엔도펩티다아제의 농도는 젖-기반 단백질의 g당 바람직하게는 1,000-1,000,000 USP 트립신 유니트, 더욱 바람직하게는 5,000-500,000, 및 가장 바람직하게는 25,000-250,000이다.

하나의 USP 트립신 유니트는 기질로서 N-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(BAEE)를 사용하여 pH 7.6 및 25℃에서 0.003의 253 nm의 흡광도에서의 변화를 유발하는 활성이다.

특이적 활성은 다른 트립신-유사 엔도펩티다아제 사이에서 꽤 유의하게 바뀔 수 있지만, 당업자는 트립신-유사 엔도펩티다아제를 사용하는 양을, 예컨대 가수 분해의 정도에 기초하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

젖-기반 단백질에 대한 트립신-유사 엔도펩티다아제의 비율은 바람직하게는 0.01-10%, 더욱 바람직하게는 0.01-5%, 더욱 바람직하게는 0.05-2.5%, 더욱 더 바람직하게는 0.5-1%, 및 가장 바람직하게는 약 0.75% 질량/질량이다.

본 발명에 따른 방법에서, 젖-기반 단백질성 물질은 트립신-유사 엔도펩티다아제 및 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제로 처리된다.

바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 세린 엔도펩티다아제이다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 트립신-유사 엔도펩티다아제보다 덜 특이적인 활성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 포유동물 키모트립신, 예컨대 돼지 췌장 조직으로부터 추출한 키모트립신의 활성과 유사한 활성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 어떤 다른 천연 아미노산의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 또는 히스티딘 중 어느 것의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대하여 더 높은 특이성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 이소루신, 리신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린 중 어느 것의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대한 그것의 특이성보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 또는 히스티딘의 적어도 하나의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대하여 적어도 3배 더 높은, 바람직하게는 적어도 5배 더 높은 특이성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 아르기닌의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 및 히스티딘으로 구성되는 그룹으로부터의 적어도 3개의 아미노산의 각각의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대하여 더 높은 특이성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 리신의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 및 히스티딘으로 구성되는 그룹으로부터의 적어도 3개의 아미노산의 각각의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대하여 더 높은 특이성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 아르기닌 및 리신 모두의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 및 히스티딘의 각각의 카르복시-말단 쪽에서 절단하는 것에 대하여 더 높은 특이성을 갖는다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 적어도 3, 바람직하게는 적어도 5의 키모트립신 비율을 갖는다. 적어도 5의 키모트립신 비율은 Phe, Leu 또는 Met 중 하나 뒤를 절단했을 때의 활성(어느 것이든 더 큰 것)이 Ala, Arg, Asp, Glu, Ile, Lys 또는 Val 중 어느 하나 뒤를 절단했을 때의 활성(어느 것이든 더 큰 것)보다 적어도 5배 더 높다는 것을 의미한다. 즉, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 Ala, Arg, Asp, Glu, Ile, Lys 또는 Val 중 어느 하나 뒤를 절단할 때의 그것의 특이성(어느 것이든 더 큰 것)보다 적어도 3배 더 높은, 바람직하게는 적어도 5배 더 높은 Phe, Leu 또는 Met 중 하나의 뒤를 절단할 때의 특이성(어느 것이든 더 큰 것)을 갖는다. 키모트립신 비율을 결정하기 위한 이런 활성 측정은 엔도펩티다아제의 활성이 그것의 최적 pH에서의 엔도펩티다아제의 활성의 적어도 절반일 때 수행되어야 한다. 키모트립신 비율은 본 출원의 실시예 1에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 박테리아 엔도펩티다아제이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 노카르디옵시스(Nocardiopsis)로부터, 바람직하게는 노카르디옵시스 SP. NRRL 18262의 균주로부터 유래한다(예컨대, WO 88/03947에서 이전에 기술함). 예컨대, 본 출원의 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 노카르디옵시스 sp. NRRL 18262로부터 유래한 프로테아제의 DNA 및 아미노산 서열은 예컨대, DK 특허 출원 번호 1996 00013에서 이전에 등록되었다.

다른 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 메타리지움(Metarhizium), 바람직하게는 예컨대 본 출원의 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 메타리지움 아니소플리에(M. anisopliae)로부터 유래한다(TREMBL:Q9Y843). 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 브라키스포리엘라, 바람직하게는 예컨대 본 출원의 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 브라키스포리엘라 가야나(B. gayana)로부터 유래한다(CGMCC 0865). 메타리지움 아니소플리에 및 브라키스포리엘라 가야나로부터 유래한 프로테아제의 DNA 및 아미노산 서열은 예컨대, WO04072279에서 이전에 공개되었다.

다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 박테리아로부터 생산된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는:

i) 서열번호 8, 10 또는 12 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

ii) (i) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 적어도 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

iii) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및

iv) 서열번호 8, 10 또는 12 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

서열번호 10의 성숙 폴리펩티드는 아미노산 187-374일 수 있다. 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드는 아미노산 190-375일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 8의 아미노산 1 내지 188을 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 8의 아미노산 1 내지 188로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 10의 아미노산 187 내지 374를 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 10의 아미노산 187 내지 374로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 12의 아미노산 190 내지 375를 포함한다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 더욱 더 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 12의 아미노산 190 내지 375로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 (i) 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 매우 낮은 긴축 조건, 바람직하게는 낮은 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 9의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 서열번호 8, 10 또는 12 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체이다.

적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제의 농도는 바람직하게는 젖-기반 단백질의 g당 100-100,000 USP 키모트립신 유니트, 더욱 바람직하게는 500-50,000, 및 가장 바람직하게는 1,000-20,000이다.

하나의 USP 키모트립신 유니트는 기질로서 N-아세틸-L-티로신 에틸 에스테르(ATEE)를 사용하여 pH 7.0 및 25℃에서 0.0075의 237 nm의 흡광도에서의 변화를 유발하는 활성이다.

특이적 활성은 다른 엔도펩티다아제 사이에서 꽤 유의하게 다를 수 있으나, 당업자는 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제를 사용하는 양을, 예컨대 가수 분해의 정도에 기초하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

젖-기반 단백질에 대한 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제의 비율은 바람직하게는 0.001-1% 중량/중량, 더욱 바람직하게는 0.001-0.5%, 더욱 바람직하게는 0.005-0.25%, 더욱 더 바람직하게는 0.02-0.1%, 및 가장 바람직하게는 약 0.05%이다.

바람직하게는, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 엔도펩티다아제의 질량을 기준으로, 첨가된 트립신-유사 엔도펩티다아제의 농도의 2% 및 50% 사이, 더욱 바람직하게는 5% 및 20% 사이, 더욱 더 바람직하게는 5% 및 15% 사이, 및 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 첨가된다.

바람직하게는, USP 트립신 유니트로 측정된 트립신-유사 엔도펩티다아제의 활성은 USP 키모트립신 유니트로 측정된 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제의 활성보다 5배 및 500배 사이보다 더 높고, 더욱 바람직하게는 10배 및 200배 사이보다 더 높다.

가수 분해 전의 선택적 예비 단계는 예컨대, 유장 단백질 분획, 예컨대 혈청 알부민(BSA), α-락트알부민, β-락토글로불린 및 면역글로불린(특히 IgG)의 변성을 확실하게 하기 위한 젖-기반 단백질성 물질의 용액 또는 현탁액의 예비-가열이다. 이 단계는 일반적으로 면역-화학적으로 평가했을 때(아래에서 기술한 바와 같이) 감소된 잔여 항원성을 야기한다. 바람직한 구체예에서, 약 75-95℃에서 약 5-30분 동안의 단백질성 물질의 가열을 포함하는 전-처리 단계가 수행된다. 다른 바람직한 구체예에서, 135℃ 이상에서 약 1-5초간 단백질성 물질의 가열을 포함하는 전-처리 단계가 수행된다. 다른 바람직한 구체예에서, 약 130℃에서 약 30-60초 동안 단백질성 물질의 가열을 포함하는 전-처리 단계가 수행된다.

당업자는 가수 분해 반응을 바람직하게 적용할 수 있는 조건을 알 것이다. 예컨대, US5039532 또는 EP0631731A1에서 개시된 것과 같이 수행될 수 있다. 예컨대, 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 범위 내의 pH 값에서 1 내지 6시간 동안, 약 40℃ 내지 60℃의 온도로 수행할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 펩티다아제의 첫 번째 처리 후에, 단백질성 물질은 두 번째 단백질 가수분해성 가수 분해, 이후 엔도펩티다아제의 비활성화를 시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 단백질성 물질은 US5039532에서 개시된 것과 같이 첫 번째 및 두 번째 단백질 가수분해성 가수 분해 사이에 열처리를 시킨다.

가수 분해의 조건에 상관없이, 가수분해물은 엔도펩티다아제의 불활성화의 추가적인 단계를 시키는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서 이 펩티다아제 불활성화는 약 70 내지 110℃, 바람직하게는 75 내지 95℃의 온도에서 약 0.1 내지 30분의 열처리를 포함한다. 대안으로, 엔도펩티다아제는 초고온에서의 멸균(예컨대, 약 30-60초 동안 약 130℃로)에 의해 불활성화 될 수 있다.

수득한 단백질 가수분해물은 더 정화될 수 있다. 액체 상태로 저장될 수 있다. 또한, 가수분해물은 한외 여과될 수 있고, 예컨대, 증발에 의해 농축될 수 있으며, 예컨대, 분무 건조 또는 동결건조에 의해 건조될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 얻어진 단백질 가수분해물은 중간 정도의 가수분해를 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 얻어진 단백질 가수분해물은 부분 가수분해물이다. 다른 바람직한 구체예에서, 얻어진 단백질 가수분해물은 5 및 30% 사이, 바람직하게는 10 및 25% 사이 그리고 더욱 바람직하게는 12 및 20% 사이의 가수분해도를 갖는다. 특히 바람직한 가수 분해도는 약 14%이다. 다른 특히 바람직한 가수분해도는 약 15%이다.

가수분해도(DH)는 방법에 의해 얻어진 단백질 가수 분해의 정도를 표현한다. 본 발명의 문맥에서, 가수분해도(DH)는 하기와 같이 정의된다:

DH=(절단된 펩티드 결합의 수/펩티드 결합의 총 수)×100 %

얻어진 단백질 가수분해물의 가수분해도(DH)는 Church, F. C. et al.(1983) Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, J. Dairy Sci. 66: 1219-1227의 방법에 따라 분광 광도법으로 측정할 수 있다.

얻어진 단백질 가수분해물에서 펩티드의 분자량 분포는 예컨대, 크기-배재 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 가수분해물은 질량-기준으로 1% 미만이 20,000 kDa보다 높은 분자량을 갖는 펩티드를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 얻어진 가수분해물은 검출가능한 원래대로의 젖 단백질이 없는 것이 바람직하다. 가수분해물에서 원래대로의 젖 단백질의 부재는 소듐 도데실설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 증명될 수 있다. 가수분해물 및 비-가수분해 단백질 시작 물질 사이의 직접적인 비교는 동일한 겔에서 수행할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 가수분해물은 중량-기준으로 1% 미만이 원래대로의 젖-기반 단백질인 펩티드를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 수득한 가수분해물의 잔여 항원성은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 결정할 수 있다. 비-가수분해 젖 단백질은 분석에서 평가된 선형 투여량 반응 범위 내에 포함되는 농도로 고체상으로 고정된다. 가수분해물 제제는 유사하게 고정된다. 그 뒤의 토끼 항-우유 단백질 및 토끼 IgG와 반응하는 효소 접합체와의 연속적인 배양이 항원적으로 검출가능한 단백질 및 펩티드의 존재를 드러낸다. 가수분해물로 얻은 결과를 비-가수분해 단백질 시작 물질로 얻은 것과 질량 기준으로 비교하였다. 가수분해물의 항원성 감소 퍼센트를 이후 계산하였다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 단백질 가수분해물은 ELISA에 의해 측정한 바, 상응하는 비-가수분해 젖-기반 단백질성 물질과 비교하여 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 가장 바람직하게는 적어도 약 98%의 항원성의 감소를 갖고, 그리고 더욱 가장 바람직하게는 항원성에서의 감소가 적어도 약 99%이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 단백질 가수분해물은 유아용 조제식 조성물을 위한 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 앞서 개시한 것과 같이 젖-기반 단백질 가수분해물을 얻는 단계를 포함하고, 유아용 조제식 조성물에 젖-기반 단백질 가수분해물을 포함시키는 단계를 더 포함하는 유아용 조제식 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

이런 유아용 조제식 조성물은 분말, 농축된 액체, 또는 즉석(ready-to-use) 액체의 형태일 수 있다.

이런 유아용 조제식 조성물은 인간 유아의 영양적인 요구를 만족하도록 설계된 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 단백질 가수분해물에 추가로, 유아용 조제식은 바람직하게는 지질 공급원, 탄수화물 공급원, 및 비타민 및 무기질과 같은 다른 영양소를 함유해야 한다. 전형적으로, 동물유, 식물유, 녹말, 수크로오스, 락토오스 및/또는 고형 옥수수 시럽이 상기 영양소의 일부 또는 전부를 제공하기 위해 조제식에 첨가될 수 있다.

본 발명의 단백질 가수분해물을 포함하는 유아용 조제식 조성물은 영양적으로 완전한 것이 바람직하다. 용어 "영양적으로 완전한"은 연장된 기간 동안 건강한 인간 생명을 유지하는데 적당한 영양소를 함유하는 조성물을 의미한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 가수분해물을 포함하는 유아용 조제식 조성물은 단백질의 중량으로 0.1 내지 2%의 양으로 유리 아르기닌을 및/또는 단백질의 질량으로 0.1 내지 3%의 양으로 유리 히스티딘을 추가로 포함한다. 유리 아르기닌 및/또는 유리 히스티딘의 첨가는 변형된 달콤한 유장 또는 유장 단백질 분리물이 본 발명의 방법에서 젖-기반 단백질성 물질로서 사용되었을 때 특히 바람직하다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 가수분해물을 포함하는 유아용 조제식 조성물은 적어도 5%의 건조 고체, 바람직하게는 약 10 내지 30%의 건조 고체의 젖-기반 단백질 가수분해물의 양을 포함하는 영양적으로 완전한 조성물의 형태이다.

실시예

실시예 1

추출한 돼지 췌장 트립신 제조에 대한 미생물 대안물

췌장 트립신 Novo 6.0S(Novozymes A/S로부터 입수가능-이하 PTN이라함)은 돼지 췌장 조직의 추출에 의해 제조된 제품이다. PTN에서의 주요 구성 요소는 적어도 12.5:1의 트립신:키모트립신의 비율을 갖는 트립신 및 키모트립신이다(활성 기준, 즉 USP 트립신 유니트:USP 키모트립신 유니트).

PTN과 같이 추출된 효소 표본에 대하여 적당한 미생물 대안물을 동정하기 위하여, Bachem에서 입수가능한 10개의 다른 Suc-AAPX-pNA 기질(X=A, R, D, E, I, L, K, M, F 및 V)에서 다른 미생물 프로테아제의 pH 9에서의 활성을 측정하였다. 이들 측정에 기초하여, 각각의 미생물 프로테아제에 대한 트립신 비율(TR) 및 키모트립신 비율(CR)을 계산하였다. 트립신 비율 및 키모트립신 비율은 하기와 같이 정의된다:

TR=Suc-AAP(R/K)-pNA에서의 최대 활성/Suc-AAPnon(R/K)-pNA에서의 최대 활성

CR=Suc-AAP(F/L/M)-pNA에서의 최대 활성/Suc-AAPnon(F/L/M)-pNA에서의 최대 활성

트립신 비율:

트립신은 아르기닌 잔기 또는 리신 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단 쪽을 절단하는 특이적 세린 엔도펩티다아제이고, 즉, 그들은 P1 위치에서 R 또는 K에 대하여 엄격한 선호성을 갖는다. 그러므로 트립신-유사 프로테아제의 논리적인 정의는 트립신 비율이 >100인 것이고, 이것은 8개의 다른 Suc-AAPnon(R/K)-pNA 기질 중 어느 것에서의 활성이 가장 좋은 Suc-AAP(R/K)-pNA 기질에서의 활성의 1% 미만인 것을 의미한다.

키모트립신 비율:

키모트립신은 방향족 아미노산(Trp, Tyr 또는 Phe) 또는 소수성 아미노산 잔기(Leu, Met 및 His) 중 어느 하나의 카르복시 말단 쪽을 절단하는데 덜 엄격한 선호성을 갖는 것으로 알려져 있다. 트립신과 비교한 것과 같이, 키모트립신은 덜 특이적인 엔도펩티다아제이고, 키모트립신-유사 프로테아제의 합리적인 정의는 키모트립신의 비율이 >5인 것이며, 이는 7개의 다른 Suc-AAPnon(F/L/M)-pNA 기질 중 어느 하나에서의 활성이 가장 좋은 Suc-AAP(F/L/M)-pNA 기질에서의 활성의 20% 미만인 것을 의미한다.

Suc - AAPX - pNA 분석:

프로테아제: PTN

돼지 트립신(UNIPROT:P00761)

푸자리움 트립신(푸자리움 옥시스포룸으로부터 나온 트립신-유사 프로테아제, 서열번호 2)

소 TLCK-처리 키모트립신(Sigma, C-3142)

알칼라아제(Novozymes A/S로부터 입수가능)

바실로펩티다아제 F(B. 리체니포르미스로부터 나온, UNIPROT : Q65JX1)

브라키스포리엘라 프로테아제(브라키스포리엘라 가야나로부터 나온, 서열번호 12)

에스퍼라아제(Novozymes A/S로부터 입수가능)

메타리지움 프로테아제(메타리지움 아니소프리에로부터 나온, 서열번호 10)

노카르디옵시스 프로테아제(노카르디옵시스 sp. NRRL 18262로부터 나온, 서열번호 8)

사비나아제(Novozymes A/S로부터 입수가능)

기질: Suc-AAPA-pNA(Bachem L-1775)

Suc-AAPR-pNA(Bachem L-1720)

Suc-AAPD-pNA(Bachem L-1835)

Suc-AAPE-pNA(Bachem L-1710)

Suc-AAPI-pNA(Bachem L-1790)

Suc-AAPL-pNA(Bachem L-1390)

Suc-AAPK-pNA(Bachem L-1725)

Suc-AAPM-pNA(Bachem L-1395)

Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)

Suc-AAPV-pNA(Bachem L-1770)

온도: 상온(25℃)

분석 버퍼: 100 mM 숙신산, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0.01% Triton X-100, pH 9.0.

분석: 20 ㎕ 펩티다아제 희석액(0.01% Triton X-100에 희석함)을 마이크로타이터 플레이트에 넣었다. 분석은 200 ㎕ pNA 기질(50 ㎎을 1.0 ㎖ DMSO에 용해하였고, 분석 버퍼로 90× 더 희석함)의 첨가에 의해 시작하였다. OD405에서의 초기 증가를 펩티다아제 활성의 측정으로서 모니터하였다. 선형(또는 선형에 가까운) 플롯이 측정 시간 4분 안에 도달하지 않으면, 펩티다아제를 더 희석하였고, 분석을 반복하였다.

데이터:

표에서 각각의 엔도펩티다아제에 대하여 보고된 활성 데이터는 가장 좋은 Suc-AAPX-pNA 기질에 대한 것이다.

결론:

>100의 트립신 비율을 갖는 프로테아제로서 트립신-유사 프로테아제의 상기 정의를 사용하면, 돼지 트립신(TR=1750) 및 푸자리움 트립신(TR>10,000)은 트립신-유사 프로테아제다. 시험된 프로테아제의 나머지는 비 트립신-유사 프로테아제다.

>5의 키모트립신 비율을 갖는 프로테아제로서 키모트립신-유사 프로테아제의 상기 정의를 사용하면, 소 키모트립신(CR=160), 알칼라아제(CR=40), 브라키스포리엘라 프로테아제(CR=22), 에스퍼라아제(CR=6.2), 메타리지움 프로테아제(CR=27), 노카르디옵시스 프로테아제(CR=7.7) 및 사비나아제(CR=9.7)는 키모트립신-유사 프로테아제다. 시험한 프로테아제의 나머지는 비 키모트립신-유사 프로테아제다.

키모트립신-유사 프로테아제의 대안적 정의는 키모트립신에 대한 상대적 활성 차이의 제곱의 합으로 계산될 것이다. 이 정의를 사용하면, 메타리지움 프로테아제는 가장 키뮤트립신-유사 세린 프로테아제로서 나타나고 다음으로 브라키스포리엘라 프로테아제, 노카르디옵시스 프로테아제, 사비나아제 및 알칼라아제이다(데이터 없음).

실시예 2

미생물 엔도펩티다아제의 조합으로 WPC의 가수 분해

다음 단계는 두 가지 효소 혼합물이 동일하게 투약되었을 때 PTN에 대하여 무엇이 얻어질 수 있는지와 같이 미생물 엔도펩티다아제의 혼합물을 사용하여 유장 단백질 농축액(WPC)의 동일한 가수분해도(DH)를 얻는 것이 가능한지 여부를 보는 것이었다.

가수 분해 실험:

본 발명자들이 수행한 가수 분해 분석은 두 단계 가수 분해 과정이었다. 8.4% WPC(80% 유장 단백질을 함유)를 pH 8.0 버퍼에 현탁시켰다. 첫 번째 가수 분해 단계를 효소 투여량의 절반을 투여하고 55℃에서 2시간 동안 교반하면서 용액을 배양함으로써 수행하였다. 이후 부분 가수 분해된 유장 단백질 기질을 짧은 열처리에 의해 변성시켰다(90℃에서 5분). 두 번째 가수 분해 단계는 효소 투여량의 절반을 투여하고 55℃에서 30분 동안 교반하면서 용액을 배양함으로써 수행하였다. 최종적으로, 효소 반응을 정지시키고 효소를 다른 짧은 열처리에 의해 불활성화시켰다(90℃에서 10분). 유장 단백질/펩티드의 최종 농도는 6.4% WP였다. 이 분석을 사용함으로써, 본 발명자들은 미생물 대안물과 PTN을 비교할 수 있을 것이다.

H⁺가 알칼리 범위에서 가수 분해 동안 생성되기 때문에, 본 발명자들은 가장 높은 효소 투여량의 일부에 대하여 pH를 체크하였다. 본 발명자들은 pH의 어떤 하락도 검출할 수 없었으며, 이는 본 발명자들의 pH 8.0 버퍼가 가수 분해 동안의 pH를 조절하기에 충분히 안정된 것을 가리킨다.

첫째로, 본 발명자들은 PTN의 4가지 다른 투여량을 시험하였다(0.625, 1.25, 2.5 및 5.0 ㎎ 트립신/g 유장 단백질). 가장 낮은 투여량에 있어서, 유장 단백질 가수분해물은 매우 점액성이었고, Eppendorf 튜브에서 거의 꺼내는 것이 불가능했으므로, 이 가수분해물에 대해서는 DH를 결정하지 않았다. PTN 가수분해물의 SDS-PAGE 분석은 적어도 5.0 ㎎ 트립신/g 유장 단백질 투여량으로, 완전한 단백질의 대부분이 분해된 것을 보여주었다. SDS-PAGE 겔에 이어서, 단백질/펩티드의 동일량을 각각의 레인에 로딩하였다. 5.0 ㎎ 트립신/g 유장 단백질 PTN 투여량에 대하여 DH=9.4%.

이후 본 발명자들은 정제한 트립신(돼지 트립신 및 푸자리움 트립신)으로 어떤 가수 분해 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 상대적으로 높은 투여량에서 조차 대략 6.5%보다 높은 DH를 얻지 못했다. 아래 데이터 섹션을 보라.

마지막으로, 본 발명자들은 5.0 ㎎ 트립신/g 유장 단백질로 일정한 푸자리움 트립신의 투여량을 유지하고 키모트립신-유사 프로테아제 투여량은 변화시킨(0.25, 0.5 및 1.0 ㎎ 프로테아제/g 유장 단백질) 세 번째 시리즈의 가수 분해 실험을 수행하였다. 여기서 본 발명자들은 동일하게 투여한 PTN과 동일한 범위에서 HD-값을 얻었다(DH=9.4%).

두 번째 키모트립신-유사 프로테아제의 증가하는 투여량의 DH에서의 효과는 두 번째 프로테아제에 따라 다른 효과를 가지는 것이 보인다. 푸자리움 트립신 및 바실러스 리체니포르미스로부터 나온 글루타밀 펩티다아제 BL(키모트립신-유사 프로테아제가 아님)의 조합은 푸자리움 트립신 단독에 대하여 보였던 것과 동등한 것으로 보였다.

SDS-PAGE 겔에서 DH-값(아래 데이터 섹션을 보라) 및 유장 단백질 가수분해물의 출현 사이에 상관관계가 있었다. 푸자리움 트립신 및 노카르디옵시스 프로테아제의 조합이 WPC 기질로부터 완전한 단백질을 제거하기 위한 가장 좋은 세린 프로테아제 조합인 것으로 보였다(SDS-PAGE 겔로부터-제시 않음).

가수 분해 분석:

사용한 엔도펩티다아제 :

PTN 6.0S에서의 트립신 및 키모트립신 함유량의 계산을 위하여, 본 발명자들은 돼지 트립신에 대한 특이적 활성=7000 USP/㎎ 및 돼지 키모트립신에 대한 특이적 활성=4500 USP/㎎을 사용하였다. 다른 표본에서의 효소 농도는 A280/E280로 추정하였다. PTN은 20 mM HEPES/NaOH, 5 mM CaCl₂, pH 8에 용해시켰다. 다른 효소는 녹인 후 "그 자체로" 사용하였다.

가수 분해:

84 ㎎/㎖ WPC(전체 건조 물질의 약 80% 단백질을 포함하는 Arla로부터 나온 LactProdan80)은 1.0 M HEPES/NaOH, 50 mM CaCl₂, pH 8.0에 현탁하였고, pH는 27% NaOH로 pH 8.0으로 맞췄다. 1000 ㎕의 이 현탁액을 얼음 위에 있는 Eppendorf 튜브에 넣었다. 25 ㎕ 펩티다아제 용액을 첨가하였고, Eppendorf 튜브를 55℃로 미리 데운 Eppendorf 써모믹서(thermomixer)로 옮겼다. 튜브를 써모믹서에서 120분 동안 배양하였다(55℃, 1400 rpm). 이 후 튜브를 90℃로 미리 데운 다른 써모믹서로 옮겼고, 이 써모믹서에서 5분 동안 배양하였다(90℃, 1400 rpm). 튜브를 다시 처음 55℃ Eppendorf 써모믹서로 옮겼고, 5분 후에(가수 분해 혼합물을 55℃로 다시 가져오기 위하여), 25 ㎕ 펩티다아제 용액을 첨가하였고, 튜브를 써모믹서에서 30분 동안 배양하였다(55℃, 1400 rpm). 마지막으로, 튜브를 90℃ 써모믹서로 다시 옮겼고, 이 써모믹서에서 10분 동안 배양하였다(90℃, 1400 rpm).

가수분해물(64 ㎎/㎖ 유장 단백질과 함께)을 SDS-PAGE로 분석하였고(데이터 없음) DH를 OPA 방법을 사용하여 측정하였다.

SDS-PAGE:

가수분해물을 0.1% SDS에서 5×로 희석시켰다. 20 ㎕의 이 희석물을 환원제가 있는 20 ㎕ 2× SDS-PAGE 샘플 버퍼와 혼합하였다. 이 혼합물을 가열하였고, 10 ㎕을 4-20% 트리스-글리신 겔에 적용시켰다.

DH를 측정하기 위한 OPA 방법:

가수분해물을 0.01% Triton X-100에서 80×로 희석시켰다. 30 ㎕의 이 희석물을 MicroTiterPlate(MTP)에 옮겼고, 225 ㎕의 새롭게 제조한 OPA 시약을 첨가하였고, 2분 후에 340 nm에서의 흡광도를 MTP 리더에서 읽었다. 알려지지 않은 샘플의 반응을 세린 표준 희석 시리즈와 비교하였고, ㎎/㎖ 세린로서 표현하였다. "OPA 반응"은 "㎎/㎖ 기질"에 대한 "가수분해물에서의 ㎎/㎖ 세린"으로서 계산하였다. 효소 블랭크의 "OPA 반응"은 DH의 계산에서 뺐다.

OPA 시약:

3.81 g 사붕산 이나트륨(Merck 6308) 및 1.00 g SDS(BIO-RAD 161-0301)을 80 ㎖ 탈이온수에 용해시켰다. 사용하기 바로 전에, 2.0 ㎖ 에탄올에 용해된 80 ㎎ o-프탈디알데하이드(Merck 821027) 및 1.0 ㎖ 10%(w/v) DTE(Merck 24511)를 첨가하였다. 마지막으로, 부피를 탈이온수로 100 ㎖까지 맞췄다.

데이터:

결론:

미생물 PTN-대체물을 사용하여 WPC의 동일한 가수분해도(DH)를 얻는 것이 가능할 것으로 보인다(PTN으로서 투여함). 또한, 트립신-유사 프로테아제 단독으로는 PTN과 같은 동일한 DH를 얻을 수 없을 것임이 결과로부터 명백하다.

실시예 3

푸자리움 트립신 및 브라키스포리엘라 엔도펩티다아제의 절단 특이성 분석

배양:

미생물 트립신-유사 엔도펩티다아제, 푸자리움 트립신의 단백질 가수 분해 절단 특이성을 돼지 트립신과 비교하였다. 그리고 브라키스포리엘라로부터 나온 미생물 키모트립신-유사 엔도펩티다아제의 단백질 가수 분해 절단 특이성을 TLCK 처리 돼지 키모트립신의 단백질 가수 분해 특이성과 비교하였다.(TLCK는 키모트립신에 영향을 주지 않고 트립신 활성을 불활성화시킨다).

절단 특이성 분석을 변성된 모델 기질 소 베타-락토글로불린 A의 배양에 의해 수행하였다. 결과적인 단백질 가수 분해 펩티드의 서열을 단백질 동정에 사용된 이중 질량분석기 데이터 분석 프로그램(SEQUEST) 및 오직 소 베타-락토글로불린 A만을 함유하는 데이터베이스와 결합된 온라인 RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS에 의해 결정하였다.

샘플:

프로테아제: 돼지 트립신(UniProt 기탁: P00761)

소 TLCK 처리 키모트립신(Sigma, C-3142)

기질: 우유로부터 나온 베타-락토글로불린 A(Sigma L7880 097K7010)

단백질 가수분해:

베타-락토글로불린 A의 변성:

일정량의 약 11 ㎎의 우유로부터 나온 베타-락토글로불린(Sigma L7880 097K7010)을 1 ㎖ 버퍼(100 mM 암모늄 아세테이트, 1 mM CaCl₂, pH 8)에 용해시켰다. 베타-락토글로불린의 이황화 결합을 디티오트레이톨(DTT, CAS number 3483-12-3)를 20 mM의 최종 농도로 첨가하여 환원시켰다. 혼합물을 상온(25℃)에서 30분 동안 배양하였다. 그 후에 2-요오드아세트아미드(CAS 번호 144-48-9)를 55 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 후자의 혼합물을 암실에서 상온으로 30분 동안 배양하였다.

변성된 베타-락토글로불린은 프로테아제로 배양하기 전에 100 mM 암모늄 아세테이트, 1 mM CaCl₂, pH 8로 버퍼를 교체하였다. 버퍼 교체는 GE-healthcare에서 나온 PD-10 탈염 컬럼(Sephadex G-25 컬럼 물질)에서 수행하였다. 첫 번째 컬럼은 25 ㎖ 100 mM 암모늄 아세테이트, 1 mM CaCl₂, pH 8로 평형시켰다. 베타-락토글로불린 샘플 부피는 평형 버퍼로 2.5 ㎖의 최종 부피로 맞추었고, 컬럼에 로드하였다. 베타-락토글로불린 A는 3.5 ㎖ 100 mM 암모늄 아세테이트, 1 mM CaCl₂, pH 8로 용출하였다. 버퍼교체된 베타-락토글로불린의 최종 단백질 농도는 280 nm에서의 분광광도법 분석에 의해 2 ㎎/㎖로 결정하였고, 1의 흡광 계수(A280)로 추측하였다.

단백질 가수 분해 배양:

190 ㎕ 용액에 상응하는 일정량의 400 ㎍의 베타-락토글로불린을 프로테아제의 하기의 양과 함께 40℃에서 배양하였다.

돼지 트립신 8 ㎍

푸자리움 트립신 16 ㎍

소 TLCK 처리 키모트립신 4 ㎍

브라키스포리엘라 프로테아제 4 ㎍

단백질 가수분해 과정은 샘플에서 1% TFA의 최종 농도로 10% 트리플루오로아세트산(TFA, CAS 번호 76-05-1)의 수성 용액을 첨가하여 18시간 후에 정지시켰다. 모든 샘플은 LC-MS/MS에 의해 분석하기 전에 -20℃에 저장하였다.

LC-MS/MS 방법:

모든 단백질 가수 분해 샘플을 Waters C18 컬럼(ACQUITY UPLC？BEH C18, 1.7 , 2.1×100 mm), Thermo Scientific에서 나온 Accela 액체 크로마토그래피 시스템 및 Thermo Scientific에서 나온 LTQ Orbitrap XL ETD 하이브리드 질량 분광계로 구성되는 RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS 시스템에서 분석하였다. 20 ㎕의 부피를 컬럼으로 주입하였다. 펩티드를 하기 기울기에 의해 분리하였다:

용매 A: UHQ 물 중의 0.1% 포름산(CAS 번호 64-18-6) 및 용매 B: 아세토니트릴(CAS 번호 75-05-8) 중의 0.1% 포름산

펩티드를 용출하는 것은 214 nm에서 UV-검출기에 의해 온라인으로, 그 후에 MS/MS 모드에서 질량 분광계에 의해 온라인으로 모니터하였다. 결과적인 UV-크로마토그램은 도 1 및 도 2에서 보여준다. 질량 분광계에서의 전구체 이온은 30,000의 해상도(FWHM)에서, 그리고 단편 이온은 15,000의 해상도(FWHM)에서 검출되었다. 결과적인 MS 및 MS/MS 스펙트럼은 베타-락토글로불린과 대조적으로 Proteome Discoverer(버전 1.0, Thermo Fisher Scientific)를 통해 SEQUEST 소프트웨어(U.S. 특허 6,017,693 및 5,538,897의 주제인 알고리즘)로 분석하였다. 효소의 절단은 "효소가 없을 때"의 "비특이적" 절단 특이성으로서 정의하였다. 일부 높은 세기의 UV-피크의 단백질 가수 분해 단편을 도 1 및 도 2에서 가리키는 것과 같이 동정하였다.

결과:

비교를 위해, 푸자리움 트립신 분석의 UV-크로마토그램(하부 자취)을 도 1에서 돼지 트립신 분석(상부 자취)과 함께 나타내었고, 일부 주된 펩티드의 서열 동일성을 나타내었다. 유사하게, 도 2에서, 브라키스포리엘라 프로테아제 분석의 UV-크로마토그램(하부 자취)을 소 키모트립신(상부 자취)과 함께 나타내었다. 모든 경우에서, 동정된 펩티드는 상부 및 하부 자취 모두에서 검출되었다.

결론:

도 1에서, 소 베타-락토글로불린 A의 일반적 단백질 가수분해 펩티드는 푸자리움 트리신 및 돼지 트립신에 의해 검출되었고, 따라서 두 가지 엔도 프로테아제 모두는 트립신 유사 특이성을 갖는다. 도 2에서, 소 베타-락토글로불린 A의 동일한 일반적 단백질 가수분해 펩티드는 브라키스포리엘라 프로테아제 및 소 키모트립신에 의해 검출되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Process for making a milk-based protein hydrolysate <130> DK11P0849 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 744 <212> DNA <213> Fusarium oxysporum <400> 1 atggtcaagt tcgcttccgt cgttgcactt gttgctcccc tggctgctgc cgctcctcag 60 gagatcccca acattgttgg tggcacttct gccagcgctg gcgactttcc cttcatcgtg 120 agcattagcc gcaacggtgg cccctggtgt ggaggttctc tcctcaacgc caacaccgtc 180 ttgactgctg cccactgcgt ttccggatac gctcagagcg gtttccagat tcgtgctggc 240 agtctgtctc gcacttctgg tggtattacc tcctcgcttt cctccgtcag agttcaccct 300 agctacagcg gaaacaacaa cgatcttgct attctgaagc tctctacttc catcccctcc 360 ggcggaaaca tcggctatgc tcgcctggct gcttccggct ctgaccctgt cgctggatct 420 tctgccactg ttgctggctg gggcgctacc tctgagggcg gcagctctac tcccgtcaac 480 cttctgaagg ttactgtccc tatcgtctct cgtgctacct gccgagctca gtacggcacc 540 tccgccatca ccaaccagat gttctgtgct ggtgtttctt ccggtggcaa ggactcttgc 600 cagggtgaca gcggcggccc catcgtcgac agctccaaca ctcttatcgg tgctgtctct 660 tggggtaacg gatgtgcccg acccaactac tctggtgtct atgccagcgt tggtgctctc 720 cgctctttca ttgacaccta tgct 744 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 2 Met Val Lys Phe Ala Ser Val Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Pro Gln Glu Ile Pro Asn Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser 20 25 30 Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly 65 70 75 80 Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val 85 90 95 Arg Val His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu 100 105 110 Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg 115 120 125 Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val 130 135 140 Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn 145 150 155 160 Leu Leu Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala 165 170 175 Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val 180 185 190 Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile 195 200 205 Val Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly 210 215 220 Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu 225 230 235 240 Arg Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ala 245 <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 3 atggtcaagt ttgctgccat cctcgcactt gttgcgcctc ttgtcgccgc tcggcctcag 60 gactcatcac ccatgatcgt tggtggaact gctgccagcg ctggtgactt ccccttcatc 120 gtcagcatcg cctacaatgg tggcccttgg tgcggaggta ccctcctcaa cgccaacacc 180 gtcatgactg ctgcccactg cacccaaggt cgctctgcta gcgccttcca ggtccgcgcc 240 ggaagtctga accgcaactc gggtggtgtt acctcttccg tttcttccat caggatccat 300 cctagcttca gtagctcgac cctgaacaac gatgtttcca tcctgaagct gtccaccccc 360 atctcgacta gctccactat ttcttatggt cgcctggctg cgtcgggctc tgaccctgtt 420 gccggctctg atgccacagt tgctggctgg ggtgtcactt ctcagggctc ttccagctct 480 cccgtggctt tgaggaaggt taccattccc atcgtctccc gcaccacttg ccgatcccag 540 tatggcactt ctgccatcac caccaacatg ttctgcgctg gtcttgctga gggtggtaag 600 gactcttgcc agggcgacag cggcggtccc attgtcgata cctccaacac tgtcattggc 660 attgtttctt ggggtgaggg ttgtgctcag cccaacttat ctggtgtcta tgcccgagtt 720 ggatctctcc gcacttacat cgacggccag ctg 753 <210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> Fusarium solani <400> 4 Met Val Lys Phe Ala Ala Ile Leu Ala Leu Val Ala Pro Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Arg Pro Gln Asp Ser Ser Pro Met Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala 20 25 30 Ser Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ala Tyr Asn Gly Gly 35 40 45 Pro Trp Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Met Thr Ala 50 55 60 Ala His Cys Thr Gln Gly Arg Ser Ala Ser Ala Phe Gln Val Arg Ala 65 70 75 80 Gly Ser Leu Asn Arg Asn Ser Gly Gly Val Thr Ser Ser Val Ser Ser 85 90 95 Ile Arg Ile His Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Leu Asn Asn Asp Val 100 105 110 Ser Ile Leu Lys Leu Ser Thr Pro Ile Ser Thr Ser Ser Thr Ile Ser 115 120 125 Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Asp 130 135 140 Ala Thr Val Ala Gly Trp Gly Val Thr Ser Gln Gly Ser Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Val Ala Leu Arg Lys Val Thr Ile Pro Ile Val Ser Arg Thr Thr 165 170 175 Cys Arg Ser Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Asn Met Phe Cys 180 185 190 Ala Gly Leu Ala Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 195 200 205 Gly Pro Ile Val Asp Thr Ser Asn Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Trp 210 215 220 Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Leu Ser Gly Val Tyr Ala Arg Val 225 230 235 240 Gly Ser Leu Arg Thr Tyr Ile Asp Gly Gln Leu 245 250 <210> 5 <211> 750 <212> DNA <213> Fusarium cf. solani <400> 5 atggtcaagt ttgctgccat cctcgcactt gttgcgcctc ttgtcgccgc tcggcctcag 60 gaccgaccca tgattgtcgg cggaactgct gccagcgcag gtgacttccc cttcatcgtc 120 agcatcgcct acaatggtgg cccttggtgc ggaggtaccc tcctcaacgc cagcaccgtc 180 ttgactgctg cccactgcac ccaaggtcgc tctgctagcg ccttccaggt ccgcgctgga 240 agcttgaacc gcaactcggg tggtgttacc tctgccgttt cttccatccg gatccatcct 300 agcttcagtg gctcgaccct gaacaacgat gtttctatcc tgaagctgtc cacccccatc 360 tcgactagct ccaccatctc ttatggtcgc ttggctgcgt cgggctccga ccctgctgcc 420 ggctctgatg ccacagttgc tggctggggt gtcacttctc agggctcttc cagctccccc 480 gtcgctttga ggaaggttac cattcccatt gtctctcgca ccacttgccg atcccagtat 540 ggcacttctg ccatcaccac caacatgttc tgcgctggcc ttgctgaggg tggaaaggac 600 tcttgccagg gcgacagcgg tggtcccatt gtcgacacct ccaacactgt cattggcatt 660 gtttcttggg gtgagggttg tgctcagccc aacttctctg gtgtctatgc ccgcgttggc 720 agcctccgct cttacattga cggccagctg 750 <210> 6 <211> 250 <212> PRT <213> Fusarium cf. solani <400> 6 Met Val Lys Phe Ala Ala Ile Leu Ala Leu Val Ala Pro Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Arg Pro Gln Asp Arg Pro Met Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala Ser 20 25 30 Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ala Tyr Asn Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ala Ser Thr Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Thr Gln Gly Arg Ser Ala Ser Ala Phe Gln Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Ser Leu Asn Arg Asn Ser Gly Gly Val Thr Ser Ala Val Ser Ser Ile 85 90 95 Arg Ile His Pro Ser Phe Ser Gly Ser Thr Leu Asn Asn Asp Val Ser 100 105 110 Ile Leu Lys Leu Ser Thr Pro Ile Ser Thr Ser Ser Thr Ile Ser Tyr 115 120 125 Gly Arg Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Ala Ala Gly Ser Asp Ala 130 135 140 Thr Val Ala Gly Trp Gly Val Thr Ser Gln Gly Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Val Ala Leu Arg Lys Val Thr Ile Pro Ile Val Ser Arg Thr Thr Cys 165 170 175 Arg Ser Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Asn Met Phe Cys Ala 180 185 190 Gly Leu Ala Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 195 200 205 Pro Ile Val Asp Thr Ser Asn Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly 210 215 220 Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Phe Ser Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly 225 230 235 240 Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Asp Gly Gln Leu 245 250 <210> 7 <211> 1596 <212> DNA <213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262 <400> 7 acgtttggta cgggtaccgg tgtccgcatg tggccagaat gcccccttgc gacagggaac 60 ggattcggtc ggtagcgcat cgactccgac aaccgcgagg tggccgttcg cgtcgccacg 120 ttctgcgacc gtcatgcgac ccatcatcgg gtgaccccac cgagctctga atggtccacc 180 gttctgacgg tctttccctc accaaaacgt gcacctatgg ttaggacgtt gtttaccgaa 240 tgtctcggtg aacgacaggg gccggacggt attcggcccc gatcccccgt tgatcccccc 300 aggagagtag ggaccccatg cgaccctccc ccgttgtctc cgccatcggt acgggagcgc 360 tggccttcgg tctggcgctg tccggtaccc cgggtgccct cgcggccacc ggagcgctcc 420 cccagtcacc caccccggag gccgacgcgg tctccatgca ggaggcgctc cagcgcgacc 480 tcgacctgac ctccgccgag gccgaggagc tgctggccgc ccaggacacc gccttcgagg 540 tcgacgaggc cgcggccgag gccgccgggg acgcctacgg cggctccgtc ttcgacaccg 600 agagcctgga actgaccgtc ctggtcaccg atgccgccgc ggtcgaggcc gtggaggcca 660 ccggcgccgg gaccgagctg gtctcctacg gcatcgacgg tctcgacgag atcgtccagg 720 agctcaacgc cgccgacgcc gttcccggtg tggtcggctg gtacccggac gtggcgggtg 780 acaccgtcgt cctggaggtc ctggagggtt ccggagccga cgtcagcggc ctgctcgcgg 840 acgccggcgt ggacgcctcg gccgtcgagg tgaccacgag cgaccagccc gagctctacg 900 ccgacatcat cggtggtctg gcctacacca tgggcggccg ctgttcggtc ggcttcgcgg 960 ccaccaacgc cgccggtcag cccgggttcg tcaccgccgg tcactgcggc cgcgtgggca 1020 cccaggtgac catcggcaac ggcaggggcg tcttcgagca gtccgtcttc cccggcaacg 1080 acgcggcctt cgtccgcggt acgtccaact tcacgctgac caacctggtc agccgctaca 1140 acaccggcgg gtacgccacg gtcgccggtc acaaccaggc ccccatcggc tcctccgtct 1200 gccgctccgg ctccaccacc ggttggcact gcggcaccat ccaggcccgc ggccagtcgg 1260 tgagctaccc cgagggcacc gtcaccaaca tgacccggac caccgtgtgc gccgagcccg 1320 gcgactccgg cggctcctac atctccggca cccaggccca gggcgtgacc tccggcggct 1380 ccggcaactg ccgcaccggc gggaccacct tctaccagga ggtcaccccc atggtgaact 1440 cctggggcgt ccgtctccgg acctgatccc cgcggttcca ggcggaccga cggtcgtgac 1500 ctgagtacca ggcgtccccg ccgcttccag cggcgtccgc accggggtgg gaccgggcgt 1560 ggccacggcc ccacccgtga ccggaccgcc cggcta 1596 <210> 8 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262 <400> 8 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 85 90 95 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 115 120 125 Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr 180 185 <210> 9 <211> 1125 <212> DNA <213> Metarhizium anisopliae <400> 9 atggagctta ccaaatttct tgccttactg gcagttatcc tgcccgtcgc ctacggtgca 60 ccaacgcagg cggcaagcct gcacccccag attttggagg ccatgaagcg cgacttgggg 120 ctgaacgccg agcaggccac tgttcgtgtg gcgcgggaga tccatgccac cgatgttatt 180 gagcagctgc gcagctcagt agcgttcgct ggtgcttgga ttgacgcgga cgtgctatac 240 atcggcatta ctgaccaagc cttggccgat gaggtcactg ctgccggcgc cacgccgatt 300 gtcatgacca acagcctgtc caagctggaa aaggccaagg aggatctcga taagatattc 360 atcggccgag ccaacaccct ggaaacatct tcggacacta gctctggcat tgcatcgtat 420 ttcgttgatg tcgccgccaa caagctcgtt atagaggctc tcgccgacag tcacggccat 480 gctgagcaac tagccgcgca ggttgggctt acatccgaat tcgaggtgcg gactgttgag 540 acgatgccga ctaccatggc cacggttcag ggtggtgatg tctattatat taatagaagc 600 tcccgctgct ctatcggttt cgcagtaacc acaggtttcg tgtccgctgg acactgtgga 660 ggatcaggag cttcagctac aacaagtagt ggtgaggccc taggaacctt ttcgggctcc 720 gtcttccctg gcagtgccga catggcctac gtccgcactg taagtggaac agtccttaga 780 ggctacatca acggctacgg ccaagggagc tttcccgtct caggaagctc cgaggctgcc 840 gttggagcta gcatctgccg ctccggctca accactcaag tccactgcgg cacgattggt 900 gccaagggcg ccacggttaa ctaccctcaa ggagctgttt cgggcctcac tcggactagc 960 gtctgcgccg agcccggcga ctcaggcggt tctttctact ccggctccca ggcgcagggt 1020 gtcacctcgg gaggcagcgg cgactgcagc cgtggaggca cgacctattt ccagcctgtt 1080 aataggatcc tccagacata tggccttacc ttggtcacgg cgtag 1125 <210> 10 <211> 374 <212> PRT <213> Metarhizium anisopliae <400> 10 Met Glu Leu Thr Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ile Leu Pro Val 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Ala Pro Thr Gln Ala Ala Ser Leu His Pro Gln Ile Leu 20 25 30 Glu Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asn Ala Glu Gln Ala Thr Val 35 40 45 Arg Val Ala Arg Glu Ile His Ala Thr Asp Val Ile Glu Gln Leu Arg 50 55 60 Ser Ser Val Ala Phe Ala Gly Ala Trp Ile Asp Ala Asp Val Leu Tyr 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Asp Gln Ala Leu Ala Asp Glu Val Thr Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Thr Pro Ile Val Met Thr Asn Ser Leu Ser Lys Leu Glu Lys Ala 100 105 110 Lys Glu Asp Leu Asp Lys Ile Phe Ile Gly Arg Ala Asn Thr Leu Glu 115 120 125 Thr Ser Ser Asp Thr Ser Ser Gly Ile Ala Ser Tyr Phe Val Asp Val 130 135 140 Ala Ala Asn Lys Leu Val Ile Glu Ala Leu Ala Asp Ser His Gly His 145 150 155 160 Ala Glu Gln Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu Thr Ser Glu Phe Glu Val 165 170 175 Arg Thr Val Glu Thr Met Pro Thr Thr Met Ala Thr Val Gln Gly Gly 180 185 190 Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala 195 200 205 Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu Gly Thr Phe Ser Gly Ser 225 230 235 240 Val Phe Pro Gly Ser Ala Asp Met Ala Tyr Val Arg Thr Val Ser Gly 245 250 255 Thr Val Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Phe Pro 260 265 270 Val Ser Gly Ser Ser Glu Ala Ala Val Gly Ala Ser Ile Cys Arg Ser 275 280 285 Gly Ser Thr Thr Gln Val His Cys Gly Thr Ile Gly Ala Lys Gly Ala 290 295 300 Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Ala Val Ser Gly Leu Thr Arg Thr Ser 305 310 315 320 Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Tyr Ser Gly Ser 325 330 335 Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asp Cys Ser Arg Gly 340 345 350 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Arg Ile Leu Gln Thr Tyr Gly 355 360 365 Leu Thr Leu Val Thr Ala 370 <210> 11 <211> 1400 <212> DNA <213> Brachysporiella gayana <400> 11 gtaggagctg tagaatcagc acatgaggca agtataaaag aaccagcatg ggatgatcaa 60 agtctgccaa ttcaaaggag caccatcaag ccgtcttgtc tagaactcct tgaacaccct 120 gtctactcca gtactcttgt cacagaacac atctagatat ggagctcaca agcctcatcg 180 ccgcactcgc agttattctg cctattgcct acggtgttcc catggatgcc accaccaacc 240 tttctcccaa ggtcctggcc gctatgaagc gcgacctggg acttgacgcc agggaggcca 300 ctgcccgtgt caccttcgaa cgtcgtgctg gcgatgtcat cgaggagctg cgcagctccc 360 tgggagattc gttcgccggt gcttgggtta cggatggcaa ggtcatcaac attggtgtca 420 ctgatcaagc tttggtctcc aaggttaagg aagctggcgc tgaaccgatg gttatgaaga 480 acagcctcgg gaagcttcaa gaggcaaaga agaagcttga tcagatcatc aaggagaagc 540 cgaagaccct cagcacctca ggcaagcccg gcattgcaac atactacgtt gacattgaga 600 ccaacaagct catcatcacg gcactctcca ccagtatcac tcaagctgaa gatctggcta 660 aggaggttgg cctttctgag tctgagttcg aggtgcgcaa gactgagaag atgccatccc 720 ctttcatcct cggcggagac ccctttgtca tcaacaacag tgccgtgtgc tctgtcggct 780 tcgccgtctc tggcgggttt gtctcagctg gccactgtgg cggtcaaggc agccctgtca 840 cctatatcga cggtggcgca cttggaacga tcgaaggatc tgtcttcccc ggtgatgcag 900 atatgtcctt catccgtgcc gttgacggca ctgacctccc tggcatcgtt ggtacctatg 960 gcaacggtga tcagcccatc tttggcagca atgtcgcacc catcggctct ggtgtctgcc 1020 gctcaggaac aactaccggc tatcactgcg gccagcttga tgcctacgac gtcactgtca 1080 actacgacgt gggacctgtg ttcggtctta ccatgacctc tgcttgcgct gagcctggag 1140 actctggcgg ctccttcttt gccggtgacc aggctcaggg cgtcacctcg ggaggttctg 1200 gtgattgcac cagcggtggt cagaccttct tccagcccgt gaacgagatt ctggagacct 1260 atggtctctc gctcaccacg gcctaattgg atgaggcttt ggacagccaa gagcctcaac 1320 ttttcatctg tatatagcaa ttattttcgt atctcaagta cttagatcgt cacgatcaat 1380 acatatggac ttcgcttggc 1400 <210> 12 <211> 375 <212> PRT <213> Brachysporiella gayana <400> 12 Met Glu Leu Thr Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Pro Ile 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Val Pro Met Asp Ala Thr Thr Asn Leu Ser Pro Lys Val 20 25 30 Leu Ala Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Arg Glu Ala Thr 35 40 45 Ala Arg Val Thr Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Val Ile Glu Glu Leu 50 55 60 Arg Ser Ser Leu Gly Asp Ser Phe Ala Gly Ala Trp Val Thr Asp Gly 65 70 75 80 Lys Val Ile Asn Ile Gly Val Thr Asp Gln Ala Leu Val Ser Lys Val 85 90 95 Lys Glu Ala Gly Ala Glu Pro Met Val Met Lys Asn Ser Leu Gly Lys 100 105 110 Leu Gln Glu Ala Lys Lys Lys Leu Asp Gln Ile Ile Lys Glu Lys Pro 115 120 125 Lys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Lys Pro Gly Ile Ala Thr Tyr Tyr Val 130 135 140 Asp Ile Glu Thr Asn Lys Leu Ile Ile Thr Ala Leu Ser Thr Ser Ile 145 150 155 160 Thr Gln Ala Glu Asp Leu Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Glu Ser Glu 165 170 175 Phe Glu Val Arg Lys Thr Glu Lys Met Pro Ser Pro Phe Ile Leu Gly 180 185 190 Gly Asp Pro Phe Val Ile Asn Asn Ser Ala Val Cys Ser Val Gly Phe 195 200 205 Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ser Ala Gly His Cys Gly Gly Gln Gly 210 215 220 Ser Pro Val Thr Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Leu Gly Thr Ile Glu Gly 225 230 235 240 Ser Val Phe Pro Gly Asp Ala Asp Met Ser Phe Ile Arg Ala Val Asp 245 250 255 Gly Thr Asp Leu Pro Gly Ile Val Gly Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Gln 260 265 270 Pro Ile Phe Gly Ser Asn Val Ala Pro Ile Gly Ser Gly Val Cys Arg 275 280 285 Ser Gly Thr Thr Thr Gly Tyr His Cys Gly Gln Leu Asp Ala Tyr Asp 290 295 300 Val Thr Val Asn Tyr Asp Val Gly Pro Val Phe Gly Leu Thr Met Thr 305 310 315 320 Ser Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Phe Ala Gly 325 330 335 Asp Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asp Cys Thr Ser 340 345 350 Gly Gly Gln Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Glu Ile Leu Glu Thr Tyr 355 360 365 Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ala 370 375

Claims

젖-기반 단백질성 물질의 용액을
a) 미생물로부터 생산된 트립신-유사 엔도펩티다아제, 및
b) 미생물로부터 생산된 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하는 젖-기반 단백질 가수분해물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는 푸자리움(Fusarium)의 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 트립신-유사 엔도펩티다아제는:
i) 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii) (i) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 적어도 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;
iii) 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
iv) 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 젖-기반 단백질에 대한 트립신-유사 엔도펩티다아제의 비율은 0.01-10% 중량/중량, 바람직하게는 0.01-5%, 더욱 바람직하게는 0.05-2.5%, 더욱 더 바람직하게는 0.5-1%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 아르기닌 및 리신의 카르복시-말단 쪽을 절단하는 것보다 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 루신, 메티오닌 및 히스티딘의 카르복시-말단 쪽을 절단하는 것에 대하여 더 높은 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 적어도 3의 키모트립신 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 노카르디옵시스(Nocardiopsis), 메타리지움(Metarhizium) 또는 브라키스포리엘라(Brachysporiella)의 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는:
i) 서열번호 8, 10 또는 12 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii) (i) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함하는 게놈 DNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전장 상보 가닥과 적어도 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;
iii) 서열번호 7, 9 또는 11 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
iv) 서열번호 8, 10 또는 12 중 어느 것의 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의(몇개의) 아미노산의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 젖-기반 단백질에 대한 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제의 비율은 0.001-1% 중량/중량, 바람직하게는 0.001-0.5%, 더욱 바람직하게는 0.005-0.25%, 더욱 더 바람직하게는 0.02-0.1%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 엔도펩티다아제는 엔도펩티다아제의 중량을 기준으로, 첨가된 트립신-유사 엔도펩티다아제의 농도의 2% 및 50% 사이의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 가수 분해는 6.5 내지 8.5의 범위 내의 pH 값에서, 1 내지 6시간 동안, 약 40℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 단백질 가수분해물은 5 및 30% 사이, 바람직하게는 10 및 25% 사이, 더욱 바람직하게는 12 및 20% 사이의 가수 분해의 정도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 단백질 가수분해물은 중량-기준 1% 미만이 20,000 kDa보다 높은 분자량을 가지는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 단백질 가수분해물은 ELISA에 의해 측정한 바, 상응하는 비-가수분해 젖-기반 단백질성 물질과 비교하여, 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 가장 바람직하게는 적어도 약 98%, 및 한층 더 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 항원성의 감소를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 젖-기반 단백질 가수분해물을 유아용 조제식 조성물에 포함시키는 단계를 추가로 포함하는, 유아용 조제식 조성물의 제조 방법.