JPH05505524A

JPH05505524A - タンパク質加水分解物

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Publication number: JPH05505524A
Application number: JP91506279A
Authority: JP
Inventors: ダンブマン，クラウス; モルテンセン，ステーン　ベンニケ; ブッツ，ペテル; エリクセン，スベント
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2016-04-03
Also published as: EP0518999A1; EP0518999B1; DE69112611D1; JP3153237B2; WO1991013554A1; DE69112611T2; US5866357A; ATE126970T1; ES2077220T3; DK0518999T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ンパク　” 発明の分野本発明はタンパク質の限定された特異的な加水分解を得る方法、この方法によって得られるタンパク質加水分解物、及びこのタンパク質加水分解物を含む食品に関する。

発明の背景プロテアーゼによるタンパク質の酵素的加水分解はもとのタンパク質の栄養価を保持するタンパク質加水分解物を調製する、良好に確立された方法であり、従ってこの方法は通常の食品に存在する十分な量の全長タンパク質を摂取もしくは消化できない一定の患者の常食において有利に利用されうるか、又は幼児のためのミルク代替品の栄養価を向上せしめるために利用されうる。更に、タンパク質加水分解物ヒトの栄養食品のために伝統的に利用されていない起源から調製されることができ、そして例えばそれ自体の食品として又は他の食品への添加剤のいずれかとして利用されうる。

今日迄このタイプのタンパク質加水分解物の調製のために利用されているプロテアーゼは、広い特異性を有するプロテアーゼ、例えばバチルス　リシェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒＩｌｉｓ）アルカリ性プロテアーゼである。広い特異性を有するプロテアーゼを用いたときに出くわす主たる問題は、しばしば生成されるタンパク質加水分解物の強い苦味にある。この苦味は、暴露された疎水性アミノ酸残基を有するペプチドの形成をもたらす、疎水性側鎖を存するアミノ酸でのタンパク質の切断の結果である。全長タンパク質又は長めのペプチドにおいて、この疎水性側鎖は、折りたたまれているタンパク質内にこの側鎖がかくれてしまうタンパク質分子の三次構造に基づいて接近しづらい。小さめのペプチドがタンパク質分子のタンパク質分解的切断によって形成されたなら、この疎水性側鎖は暴露され、従って近づ（味蕾上の疎水性及び親水性レセプターに受けられやすくなる。この現象が苦味を生じせしめることが分っている（Ｈ，Ｗｉｅｓｅｒ　ａｎｄ　Ｈ，−Ｄ、Ｂｅ１ｉｔｚ、Ｚ、　Ｌｅｂｅｎｓ＋ｗ、Ｕｎｔｅｒ、−Ｆｏｒｓｃｈ、　１５９　。

１９７５、　頁６５−７２　；及びＨ，Ｗｉｅｓｅｒ　ａｎｄ　Ｈ，−Ｄ、Ｂｅ１ｉｔｚ、Ｚ、　Ｌｅｂｅｎｓｍ、Ｕｎｔｅｒ、−Ｆｏｒｓｃｈ、１６０．　１９７６、１３８３　３９２、を参照のこと）。

このタンパク質加水分解物の苦味の問題を、出発タンノクク賞の加水分解の程度を限定すること、即ち、プロテアーゼによって切断されるペプチド結合の数を限定すること、例えば加水分解の程度をモニターし、そして適切な加水分解の程度が得られたならこのタンノくり譬分解反応を止めること（例えば、Ｊ、Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ　Ｅｎｚ　ｍｉｃ　Ｈｄｒｏｌ　ｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９８６を参照のこと）によって解決することが提案されて“いる。

このような加水分解物は、少なくともそれらが含まれている食品の他の構成成分と一緒になって、弱められた苦味を示すことが見い出されている。

加水分解の程度をコントロールするその他の方法は、タンパク質分子を一定のアミノ酸残基でのみ切断する特異的なプロテアーゼを利用することにある。これはＪ、−Ｍ、ＣｈｏｂｅｒｔらのＪ、Ａ　ｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ。

１１．１９８８．頁２２０−２２４に提案され、これにはタンノ〈り質をグルタミン酸及びアスパラギン酸残基にて特異的に加水分解せしめるス　フィロコ・カス　アウレウス（１工ｌＬ笠、ａｕｒｅｕｌ）ｖ８プロテアーゼの利用が報告されている。

発明の概要驚くべきことに、バチルス　リシェニホルミスブロテアーゼはグルタミン酸及びアスパラギン酸残基に特異的であり、従ってタンパク質加水分解物であってそれ自体は苦味を有さないものをもたらす、タンパク質の限定された十分なる加水分解を提供することができる。

従って、本発明はＧｌｕ及び／又はＡｓｐ結合でのタンパク質の限定された特異的な加水分解を得るための方法であって、以下の特徴を有する酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（本明細書にて定義する）の比活性を有する；（ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｄ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１０．０のｐＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；を含んでなり、その他のタンパク質分解活性を実質的に有さない酵素調製品をタンパク質性物質に加え、次いで所望の加水分解の程度が得られるまで中性又は弱いアルカリ性のｐＨにてインキュベーションし、その復液酵素を適切に不活性化せしめることによってこのインキュベーションを終了し、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を存するペプチドの形成をもたらしめる方法に関連する。

上記に定義したタンパク質分解酵素は、バチルス　ユ之工王主水マ＾によって生産されるスブチリシンＡ　（Ｓｕｂｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓ　１ｎＡ）の夾雑物として、米国特許第４，２６６．０３１号において既に特徴付けされている。しかしながら、この米国特許においてこの酵素の特異的なタンパク質分解活性の記載はなく、従って本発明のタンパク質加水分解方法におけるその有用性はこの特許におけるこの酵素の開示自体によっては予測できない。本発明に従い、驚くべきことにこのタンパク質分解酵素はＧｌｕ及びＡｓｐ残基に対して特異的な酵素であることがわかった。この性質は本目的に関して重要であり、なぜならこれはタンパク質のＧｌｕ及び／又はＡｓｐ残基での限定された、且つ特異的な加水分解を提供するからである。このようなアミノ酸残基は親水性であり、生成される弱い苦味のタンパク質加水分解物をもたらし、従ってこれが組込まれている食品の味に何ら悪い影響を及ぼさない０本発明によって生成される苦みのないタンパク質加水分解物は、それ自体の食品として利用されることも可能とし、そしてそれが組込まれうる食品の範囲を、例えば幼児のためのミルク代替品のような温和な味のもの含むまで広げることも可能とする。

本明細書において、「加水分解の程度」なる語は、このタンパク質分解酵素によって切断されるペプチド結合の数を示すものと理解される。加水分解の最大の程度とは、むろんタンパク質分子における実質的に全てのＧｌｕ及びＡｓｐ残基での切断である。加水分解の程度は、Ｊ、Ａｄｌｅｒ−ＮｉｓｓｅｒのＪ、Ａ　ｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ、　２工、１９７９゜頁１２５６に詳細のトリニトロベンゼンスルホン酸アッセイを用いる、下記の例２において詳細の通りに測定した。

従って、本方法において用いるタンパク質分解酵素は、前記のＪ。

−Ｍ、Ｃｈｏｂｅｒｔらによるタンパク質の限定された加水分解のために提案されたΣ↓ｍ、アウレウス■８プロテアーゼと類似の特異性を有する。しかしながら、Ｖ８プロテアーゼは本方法において利用するタンパク質分解酵素よりも活性が弱い、即ち、これはその基質に対して弱い親和性を有するといういくつかの徴候を存する。カゼインの加水分解による彼らの報告において、この著者は４８時間のインキュベーションの後に６．７％程度の加水分解しか得られなかったことも示している。

発明の詳細な説明本方法において利用されるタンパク質分解酵素は微生物、特に細菌によって生産されうるちのでよい。このような細菌はバチルスリシェニホルミスの株、例えばスプチリシンＡ及び前記に定義したタンパク質分解酵素に相当する他のプロテアーゼを生産することで知られる株でありうる。この場合において、このタンパク質分解酵素は、後に８Ｍすべきアルカリ性プロテアーゼの生産を助長せしめる条件のもとでこの細菌株を培養し、その後このプロテアーゼ活性物質を周知の方法、例えば前記した米国特許第４，２６６．０３１号に詳細のプロセスによって選別することによって調製されうる。

バチルス　１シヱニホルミスの株は、突然変異株、例えばスブチリシンＡをコードする遺伝子が、例えば実質的に前記の米国特許第４．２６６．０３１号（注目のタンパク質分解酵素をコードする遺伝子の不活性化が開示されている）に開示の方法による突然変異誘発物質、例えばニトソグアニジンの利用を含む常用の突然変異誘発方法によって不活性化されている突然変異体でもよい、他方、スブチリシンＡ遺伝子の不活性化は、組換えＤＮＡ操作、例えばこのスブチリシンＡ遺伝子の中に１もしくは複数のヌクレオチドを挿入せしめてこの配列を崩壊せしめることによって行うこともできる。このことは、例えば相同性組換え、例えばＦ、Ａ、Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　４　（３）、１９８３．頁１５１３−１５１５に詳細の通りによって行われうる。このタンパク質分解酵素は、この酵素を生産する微生物、例えばバチルス　１シエニホルミスのＣＤＮＡ又はゲノムライブラリーからＤＮＡ配列を単離し、このＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに挿入せしめ、このベクターによって適当な宿主微生物を形質転換せしめ、この酵素の生産を助長せしめる条件のもとてこの宿主を増殖せしめ、そしてこの培養物からこの酵素を回収せしめることによっても提供されうる。これらの工程は標準の方法によって行なわれうる。Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　１９８２を参照のこと。

本プロセスの特定の態様において、このタンパク質分解酵素は添付した図４において示すアミノ酸配列又はその誘導体を有するものである。

本明細書において、「誘導体」なる語は、天然タンパク質のＣ−及びＮ−末端のいづれかもしくは両方に１もしくは複数個のアミノ酸を付加することにより、天然アミノ酸配列におけるｌもしくは複数の異なる部位での１もしくは複数のアミノ酸の置換により、天然タンパク質のいづれかの、もしくは両方の末端での又はアミノ酸配列における１もしくは複数の部位での１もしくは複数のアミノ酸の欠失により、あるいは天然アミノ酸配列における１もしくは複数の部位での１もしくは複数のアミノ酸の挿入により、この酵素のタンパク質分解活性がこれによって損傷を受けていないことを条件として、天然酵素から誘導されたタンパク質分解酵素を意味するものと理解される。

加水分解反応の際、このインキュベーション混合物のｐＨは中性又は若干アルカリ性であるときに、ペプチド結合の切断に基づいて下がる傾面にある。加水分解の程度をモニターするため、ある特定の態様において、このタンパク質性材料とこの酵素調製品とのインキュベーション中にｐＨを一定に保つことが好ましい、これはこのインキュベーション混合物を塩基、例えばＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｃａ（ＯＨ）Ｚ又はＮＨ，によって滴定することによって行われうる。

ＰＨのモニター及び滴定はｐＨ−スタットにおいて自動的に行うのが好都合でありうる。

他の特定の態様において、非ｐＨスタット法、即ち、このタンパク質性材料とこの酵素調製品のインキュベーションの際にｐＨを一定に保たせない加水分解を行うことが好ましい。この態様において、加水分解の程度は加水分解の際の浸透圧の上昇を測定することによって容易に追跡することができる。

本方法によって有利に加水分解されうるタンパク質性物質は従来の文献における加水分解のために挙げられている任意のタンパク質又はタンパク質性物質でありうる。適切なタンパク質性物質は動物性タンパク質、たとえば乳漿タンパク質、カゼイン、肉類タンパク質、魚類タンパク質、赤血球、卵白もしくはゼラチン、又は植物性タンパク質、例えばダイズタンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテンもしくはゼイン、なたねタンパク質、むらさきうまごやしタンパク質、えんどうタンパク質、マメ科タンパク質、綿の実タンパク質又はごまの実タンパク質である。

十分な加水分解の程度を得るため、このタンパク質加水分解酵素をこのタンパク質性物質に、０．　０５−１５ｃｐｕ　／タンパク質１゜Ｏｇ、特に０−１５ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの量において加えることが適当でありうる。確立されている手法に従い、このタンパク質分解酵素を、このインキュベーション混合物の温度を約７０″Ｃ以上に高めることにより、又はこのインキュベーション混合物のｐＨを約５．０以下に下げることにより不活性化せしめることが適切でありうる。

上記に定義したタンパク質分解酵素単独で得られるものよりも高い加水分解の程度、即ち、酸素ｐＨ値で可溶性であるより高い収量のペプチドを必要とする目的に関して、驚くべきことにこのタンパク質性物質に他のタンパク質分解酵素を加えることが有利であることが見い出せた。この更なるタンパク質分解酵素は、上記に定義したタンパク質分解酵素と同様に、親水性アミノ酸、特にＣ，ｌｕ又はＡｓｐ以外の親水性アミノ酸に特異的なものであることが好ましい。

適切な更なるタンパク質分解酵素の例はトリプシン及びその他のトリプシン一様プロテアーゼである。トリプシンはＬｙｓ及びＡｒｇ残基でのペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼである。

「トリプシン一様プロテアーゼ」なる語は、トリプシンに似た特異性を有するプロテアーゼを意味することを意図している。適当なトリプシン一様プロテアーゼはヱ土ユ立互（Ｆｕ　ｓ　ａ　ｒ　ｉ　ｕｍ）　（例えばＷＯ３９１０６２７０に開示されている）種から得ることができるプロテアーゼである。

このタンパク質性物質を第１のタンパク質分解酵素及び更なるタンパク質分解酵素の両方によって加水分解せしめるとき、このタンパク質性物質に加える酵素の対応の量は、第１のタンパク質分解酵素に関しては０．　０５−５ｃｐｕ　／タンパク質１００ｇであり、そして更なるタンパク質分解酵素に関しては０．１− １０ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの範囲であることが適切である。

他の観点において本発明は、以下の特徴を有するタンパク質分解酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（本明細書にて定義する）の比活性を有する；（Ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｄ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１Ｏ６０のｐＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；を含んで成り、その他のタンパク質分解活性を実質的に有さない酵素調製品によるタンパク質のＧｌｕ及び／又はＡｓｐ結合の特異的な加水分解の結果としての、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドより本質的に成るタンパク質加水分解物に関連する。

適切なタンパク質の起源は、タンパク質の加水分解に通常用いられる任意のタンパク質性物質、例えば前記したもの又はその組合せでありうる。

本発明に従い、相対的に高い比率の高分子量ペプチド及び相対的に低い比率の低分子量ペプチドを有するタンパク質加水分解物は、高い比率で低分子量ペプチドを含む加水分解物よりも有意に弱い苦味を有することが見い出せた。上記に定義した特定のタンパク質分解酵素を用いることにより得られる限定された特異的な加水分解は、この好ましい重量範囲におけるペプチドを提供するのに特によく適する。従って、本発明のタンパク質加水分解物は、高い比率の１０００−２０，０００の範囲、好ましくは１０００−１０，０００の範囲における分子量を有するペプチドと、低い比率の約１０００未満の分子量を有するペプチドを含んで成ることが好ましい。

特定の態様において本発明は、タンパク質のＧｌｕ及び／又はＡｓｐの結合での特異的な加水分解の結果としてのＣ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基ををするペプチドとは別に、タンパク質のＬｙｓ及び／又はＡｒｇの結合での特異的な加水分解の結果としてのＣ−末端にＬｙｓ及び／又はＡｒｇ残基を有するペプチドを含んで成るタンパク譬加水分解物に関する。このタンパク質加水分解物は、加水分解物の高い程度の加水分解を必要とする目的、例えばタンパク！濃縮物としての飲料に加水分解物を含ませることを目的とするときに特によく適する。前記した通り、加水分解の程度の上昇はタンパク質性物質を他の特異的なプロテアーゼ、例えばトリプシンによって加水分解せしめることによって適切に得られうる。

この場合において、この加水分解物は、高い比率の１０００−１０゜ＯＯＯの範囲における分子量を有するペプチドと低い比率の約１０００以下の分子量を有するペプチドを適切に含んで成りうる。

更なる観点において本発明は、本発明のタンパク質加水分解物を含んで成る食品に関する。このタンパク質加水分解物はＧｌｕ／Ａｓｐ特異的プロテアーゼ単独により調製されたものであっても、又は前記した通りＬ　ｙ　ｓ　／　Ａ　ｒ　ｇ特異的プロテアーゼによる更なる加水分解によって調製されたものであってもよい、タンパク質加水分解物を含む食品は先行の文献から周知であり、これらの中にはこの加水分解物の存在によって生ずる苦味の問題も記載されている。

本発明の重要な食品は、虚弱な患者であって通常の食物を介しては彼らの必須栄養をほとんど又は全く摂取できない者のための食餌栄養素である。このような食品において、本発明のタンパク譬加水分解物はしばしば唯一のタンパク質性成分となることがあり、なぜなら本発明のタンパク質加水分解物の苦味のなさは、このタイプの食品における含有物として特に注目されるからである。食餌栄養素製品はしばしば液体又は半液体であるため、それに含まれるタンパク質加水分解物は高濃度の可溶性ペプチドを含むことが好ましい。

従って、高い収量の可溶性ペプチドを得るため、タンパク質性出発物質をＧｌｕ／ＡｓＰ特異的プロテアーゼ及び前記したＬｙｓ／Ａｒｇ特異的プロテアーゼの両方によって加水分解せしめることによって調製したタンパク質加水分解物を含むことが好ましい。

食品に含まれるタンパク質加水分解物の量は典型的には１〜３０重量％の範囲であろう。他方、本発明の食餌用食品は米国特許第４゜１００．０２４号又はヨーロッパ特許明細書第２４６，７４７号に詳細の通りに実質的に作られうる。従って、この製品は更に脂肪及び／又は炭水化物の適当な起源を含みうる。脂肪の適当な起源は例えば植物油（例えばトウモロコシ又はヒマワリ油等）でありうる。

炭水化物の適当な起源は例えばＩ！類、例えばスクロース又はラクトース、加水分解デンプン、マルトデキストン等でありうる０食餌製品は通常の添加剤、例えば風味料、甘味料、ビタミン、ミネラル及び微量元素を更に含んで成りうる。

本発明の他の重要な食品は幼児のためのミルク代替品である。このミルク代替品はこのタイプの製品に関する先行文献（例えばＥＰ３２２．５８９号）において示されているのと実質的に同じ方法であるが、但し既知の製品に含まれているタンパク質加水分解物を本発明のタンパク質分解物に代えて作られうる。このタイプの製品において、本タンパク質加水分解物の苦味のなさは明らかに好都合であり、なぜなら幼児は苦味を有するミルクを非常に嫌うからである。

この場合においても、Ｇｌｕ／Ａｓｐ特異的プロテアーゼ及びＬｙｓ／Ａｒｇ特異的プロテアーゼの両方による出発タンパク質の加水分解によって作られる加水分解物を含むことが好ましいことがある。

本発明の加水分解物は低アレルゲン性ミルク代替品の有利に含まれることができ、この加水分解物は全長ミルクタンパク質よりも有意に低いアレルゲン性を有する。

本発明の食品は、食品補足物として、又はこの食品に他の性質が提供されるために本発明のタンパク質加水分解物を含むこともある。

従って、この食品に含まれるタンパク質加水分解物は例えば、圧搾せしめた骨を本発明の方法によってＧｌｕ／Ａｓｐ特異的プロテアーゼによって処理せしめることにより、骨から得られるスクラップ肉（例えば、機械的に回収せしめた肉、即ち、屠殺場において屠殺した動物から切り取った通常の肉片の後に残っている骨上の肉；一般的な方法のより詳しい説明については、本出願人の同時係属特許出願ＰＣＴ／ＤＫ８９１０　ＯＯ２７２を参照のこと）に基づいてよい。次いで、得られたタンパク質加水分解物を適切にミンチミート製品、例えばソーセージ又はパテに加えてよい。

本発明の食品は、タンパク質内容物の一部又は全てが植物及び／又は肉類タンパク質に基づ（タンパク質加水分解物より成るベビーフード製品であることもできる。

図面の簡単な説明本発明を添付した図面を参照しながら以下の例において更に説明し、ここで：図１は、５Ｐ４４６プロテアーゼのｐＨ活性を示し；図２は、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の存在下（白四角）及び非存在下（黒四角）における５Ｐ４４６プロテアーゼの温度活性を示す図であり；図３は、５Ｐ４４６プロテアーゼによるインスリンの切断を示し；図４は、５Ｐ４４６プロテアーゼのアミノ酸配列を示しくここでアミノ酸は確立された一文字コードで示している）；そして図５は、乳漿タンパク譬濃縮物の５Ｐ４４６加水分解に由来する、粘度、浸透圧及び塩基消費データーを示す（＋−ｍｌ　Ｎ　ａ　ＯＨＨ中＝ｍＰａ’　ｓ　；−１ｊ−＝δｍｏｓｍ／ｋｇ）。

本発明を、本発明の範囲を何ら限定することを意図しない以下の例において更に説明する。

例１バチルス　Ｉシェニホルミス５Ｐ４４６ブロテアーゼの特徴付け５Ｐ４４６プロテアーゼのアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ：商標）ＰＰＡＬ６１Ｂを米国特許第４，２６６．０３１号に詳細の通りに精製した。精製した５Ｐ４４６プロテアーゼの収率は、基質としてＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ｐＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、出発及び精製５Ｐ４４６ブロテアーゼの酵素活性を測定することによって決定した。この酵素調製品において存在するスプチリシンＡを不活性化せしめるためにフェニルメタンスルホニルフルオリド（１：１０容量）を加えることが必要であり、なぜならスプチリシンＡは明らかにＰｈｅｒ又はＬｅｕの後３を切断せしめることによってこの基質を分解することができるからである。出発物質（４０ｍ＋１）の酵素活性はパーキン−エルマーラムダ −（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩｍｅｒ　Ｌａｍｄａ）リーダーにおいて４０５　ｎｍ／　５ｈｉｎ、　／　ｍｌでの吸光度として測定され、そして１６６．９２０であると測定された。

精製物質（３１ｍｌ）の酵素活性を同様に測定し、そして１５８，７２０と決定された。従って、５Ｐ４４６プロテアーゼの収率は９５％であった。

ンパク　゛ＳＦ３４６プロテアーゼのタンパク質分解活性を、基質としてカゼインを用いて測定し、２７ｃｐｃ／ｇを得た。１力ゼインプロテアーゼ単位（ｃｐｕ　）は、以下に記載する如く、標準条件下、毎分第１７ミノ基の１ミリモルを放出する酵素の量（セリン標準との比較により決定）として定義される：カゼイン（ハマルステン（登録商標）、メルク社、デルムスタント、ＦＲＧ）の２％（Ｗ／Ｖ）溶液を、プリトンおよびロビンソン（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９３１．Ｐ１４５１）によって記載されるユニバーサル緩衝液を用いて調製し、ｐＨ９，５に調節した。

２ｍｌの基質溶液を２５°Ｃで１０分間水浴中で予じめインキュベートした。ユニバーサル緩衝液（ｐＨ９，５）１＋＋１当り、約０．２〜０゜３　ｃｐｕに相当する、酵素１ｍｌ当りｂｇを含有する１＋＊１の酵素溶液を添加する。２５° Ｃで３０分間インキュベーシゴン後、急冷剤（１７゜９ｇの三塩化酢酸、２９．９ｇの酢酸ナトリウムおよび１９．８ｇの酢酸を含有し、脱イオン水で５００ｍ１とした溶液５ｍ１）を添加して反応を停止する。ブランクは、試験溶液と同様に調製するが、急冷剤は酵素溶液の前に添加する。反応混合物を２０分間水浴中で保持し、しかる後ワトマン４２の濾紙で濾過する。この分析方法を記載するパンフレンドは、要求によりノボノルディスク社（デンマーク国）から人手できる。

第一アミノ基を、次の如くＯ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたそれらの発色によって測定するニア、６２ｇの四ホウ酸二ナトリウム１０水和物および２．０ｇのドデシル硫酸ナトリウムを１５０ｍ１の水中に溶解する０次いで４ｍｌのメタノールに溶解した１６０ｓ＋ｇのＯＰＡを、４００μｌのβ−メルカプトエタノールと共に添加し、次いで溶液を水で２００ｍ１にする。３１のＯＰＡ試剤に、混合しながら、上記で得られた濾液４００μＩを添加する。３４０ｎ−での光学濃度（ＯＤ）を約５分後に測定する。また、ＯＰＡテストを、１００ｍ１のユニバーサル緩衝液（ｐＨ９，５）中に１０−ｇのセリンを有するセリン標準液を用いて行う、プロテアーゼ活性は次式を用い０Ｄｆｓ定価から計算する：ｃｐｕ　／酵素製剤（ｇ　）　＝ｃｐｕ　／ｍｌ　：　ｂここで、ＯＤｔ、ＯＤ、、ＯＤ、、、オヨヒＯＤｌ　ハ＋ｈソｈ試１ｉｆｔ溶液、ブランク、セリン標準液および緩衝液の光学濃度であり、Ｏ３，１は標準液（この場合０　、　１　ｍｇ／ｍｌ　）中のセリン（−ｇ／謳ｌ）の濃度であり、ＭＷ、、、はセリン（１０５，０９）の分子量である。

Ｑは酵素溶液に対する希釈因子（この場合８）であり、ｔ、はインキュベーション体内（５）（この場合３０分）である。

Ｌ且孟性５Ｐ４４６ブロテアーゼの活性のｐＨ依存性を、上記のＯＰＡカゼイン法で測定するか、但し、ユニバーサル緩衝液を種々のｐＨ値、すなわちｐＨ６，７，８，９，１０および１１に調節した。結果を図１に示す、この図から明らかなように、５Ｐ４４６ブロテアーゼは最適ｐＨをｐＨ８〜１０の範囲に有する。

１皮孟血５Ｐ４４６ブロテアーゼ活性の温度依存性を、上記のＯＰＡカゼイン法で測定した。

但し、酵素反応は、種々の温度、すなわち、１５℃、３０″Ｃ，４０℃、５０° Ｃ１６０℃および７０℃で行い、酵素反応は、多くの商業上の洗剤中、通常の洗剤である０、１％トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の存在および非存在下で行った。結果を図２に示す。

この図から５Ｐ４４６ブロテアーゼは、５ＴＰＰの存在如何にががわらず、約５０℃の最適温度を有する。

旦上且豊異立５Ｐ４４６ブロテアーゼのＧｌｕ特異性を次の如く測定した：ユニバーサル緩衝液（ｐＨ９，５、同上）中１＋ｓｇ／ｍｌヒトインシュリン０．５ｍｌおよび同緩衝液中７５μｌの５Ｐ４４６ブロテアーゼ（０，６ｃｐｕ　／　ｌ　）を、３７℃で１２０分間インキュベートした。

５０μｌのｌＮＨＣｌを添加して反応を停止した。

インシュリン分子を、多数のプペチド断片に分解した。これらを分離し、適当なＣ−１８カラム（ハイバーリフ１２ソーブＲＰ−１８、メルク社製の５μｍ粒子）を用い、逆相ＨＰＬＣにより単離した。断片を次の溶剤で５０分間こう配溶離した。

Ａ、０．２Ｍの硫酸ナトリウムおよび０．１Ｍのリン酸；ｐＨ２，５；Ｂ、アセトニトリル／水、５０％；線状グラジェントは９０％Ａ／１０％Ｂから８０％Ａ／２０％Ｂであった。

分離した断片を、アプライドバイオシステム（フォスター社、ＣＡ、ＵＳＡ）モデル４７０Ａ気相シーケンサ−を用い、自動エドマン分解によりアミノ酸配列決定装置に委ね、次いでフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ−）アミノ酸を、Ｌ、チム等ｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ　１ｎｓｕｌｉｎ　ｂｙ　ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｙｅａｓｔ　ｃｅｌｌ”、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１２（２）、　１９８７．　ｐ、３０７」により記載される如（、ＨＰＬＣにより分析した。インシュリン分子の分解部位は、図３に示される如く固定される。

Ｎ−「アミノ　１精製５Ｐ４４６ブロテアーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、次節で記載の如（決定した。Ｎ−末端配列は、次の如く決定した：完全なアミノ酸配列をＤＮＡ配列から決定した。ＤＮＡ配列は、「発明の詳細な説明」の節で記載の如く標準の方法で決定した。完全なアミノ酸配列を図４に示す。

このアミノ酸配列に基づいて、ＳＦ３４６プロテーアゼの分子量は、２３．６００であった。

ＤＦＰによる５Ｐ４４６プローアーゼの　２ＰＭＳＦ　（イソプロパツール中１％）と共に酵素を１対１０（容量比）の割合でインキュベーションすると、ＳＦ３４６プロテアーゼの不活性化は何ら生起しなかった。しかし８０μＩの１０ｍＭＭ０ＰＳ　（ｐＨ７，２）およびｌＯμｌの０．１Ｍジイソプロビルホスホフルロリデート（ＤＦＰ）と共に１０　ｍｌ　（１ｍｇ／ｍｌ）の酵素を６０分間インキュベーションすると、基質ＣＢＺ−ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ｐＮＡに関するその活性によって測定される如く、酵素の完全な不活性化がもたらされた。

実施例２乳漿タンパク質の加水分解８００ｍ１の脱イオン水に溶解した７５ｇのスプレー乾燥乳漿タンパク質（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−８０，デンマークプロテイン＾／Ｓ、　Ｎｒ、　Ｖｉｕｓ＋、６９２０ビデバツク、デンマークより入手可能）に、５Ｐ４４６ブロテアーゼおよび商業上のブトリプシン（Ｐａｎｃｒｅａｓ　ＴｒｙｐｓｉｎＮｏｖｏ　６．　Ｏ３，ノボノルディスク社より入手可能、対照として用いる）の１００ｇのタンパク質当り１４．７ｃｐｕをそれぞれ添加した。プロテアーゼを、インフォメーシッンシートＮｏ、Ｂ　１６３　ｆ。

１９８４年１１月、ｒｕｓｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｇｒａｄｅ　Ａｌｃａｌａｓｅ ”　ｏｒ　Ｎｅｕｔｒａｓｅ”ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｊと標章されたシート（ノボノルディスク社より要求により入手可能）に記載の如きいわゆるｐＨ− ５ｔａｔ法により、乳漿タンパク質と共に、４時間６５℃でかつｐＨｓ、０でインキュベーションした。乳漿タンパク質に対して測定された加水分解の程度は、５Ｐ４４６では１２゜１％であり、トリプシンでは１０．４％であって（％はタンパク質中のペプチド結合の全数から計算する）ＳＰ４４６に対する実験結果は、表１および図５に示される。

表１時間　粒度　Δ浸透圧重量モル濃度　塩基消費分　ｓｐａ’ｓ　ｍｏｓｓ／ｋｇ　ｓ＋１４Ｎ　Ｎａ０ｈ加水分解度は次式によって計算で出る：タンパク質中のペプチド結合の全数は、そのアミノ酸組成から計算できる。分解したペプチド結合の数は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いた次の方法により氷解物中の０−アミノ基の分析から決定できる。

０．２５Ｘ１０−’〜２．５Ｘ１０弓アミノ当量／ｌを含有するサンプル０．２５ｍ１を、ＰＨ８，２のホスフェート緩衝液２．００ｍ１と試験管内で交合する２ｍｌの０．１％ＴＮＢＳ溶液を添加し、次いで試験管を振とうし、５０±１℃ の水浴中３０分間保持する。

インキュベーション中、試験管および水浴をアルミニウム箔でカバーする。と言うのは、ブランク反応が露光により促進されるからである。６０分後、４．００ｍ１のＨＣＩを添加して反応を終了させ、次いで３４０ｎｍでの水に対する分光度を吸光学的に読みとる前に試験管を室温で３０分間放置する。詳細は、アドラーニッセン（Ｊ。

Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ、　Ｃｈｅｗ、　２７．１９７９．　ｐ、１２５６−１２６２）を参照のこと。

驚くべきことに以下の内容が見出された。５Ｐ４４６による乳漿タンパク質の加水分解は、反応混合物の粘度増加をもたらした。このことは、親水性であるグルタミン酸およびアスパラギン酸を含むペプチド結合に対する５Ｐ４４６ブロテアーゼの特異性に帰因するか、又は氷解物中のプラスティン反応に帰因するであろう、塩基消費（すなわち、加水分解が生起している）の一定増加にかかわらず、浸透圧重量モル濃度は加水分解中一定には増加しないことは注目されるが、このことは酵素的加水分解中には通常起こるであろう。粘度は、最初の３０分中に増加し、次いで浸透圧重量モル濃度の増加が比較的ゆるやかになる同じ点でその鰻大に達する。

実施例３ＳＦ３４６ブロテアーゼを用いた大豆タンパク質の加水分解４０００ｍ１の大豆タンパク質濃縮物の懸濁液（この懸濁液は約８％タンパク質（ＮＸ６．２５）を含有する）を、５Ｐ４４６ブロテアーゼ（２７ｃｐｕ／ｇ酵素の０．１％）および商業上のトリプシン（パンクレアストリブシンＮ０ＶＯ３，０５，ノボノルディスク社より入手可能）（２％、３．　３ｃｐｕ　／ｇ）の混合物を用い、ｐＨ８，０および５０°Ｃの温度で加水分解に委ねた。ｐＨ−スタット（ｓｔａｔ）（ラジオメーター、コペンハーゲン、デンマーク国）を用いて監視した加水分解中、ＰＨを４Ｎ　ＮａＯＨを添加して一定に保持した。２時間加水分解後、加水分鮮度（先に定義）を測定し、１４％を得た。次いで６Ｎ　ＨＣＩを添加して、ｐＨ４，２にし酵素を失活させた。次いで、加水分解混合物を、助剤として珪藻土を用い濾紙を通して上澄みをデカントする前に３０分間放置した。

風味を改善するため、上澄みを２〜４秒間Ｌ　４０　”Ｃに加熱し、引続き真空室内にフラッシュした。更に、生成物をＨ，Ｓ、オルセルおよびＪ、アルダー− −ラセンｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｕｌｔｒａ−ａｎｄ　Ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａ−Ｌｉｏｎ　２５　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　」ＡＳＣＳｙｍｐ、　Ｓｅｒ、　１５４．　ｐｐ、１３３−１６９）に記載される如く脱塩した。

対照の氷解物を、上記の如く調整したが、但し、１．０％のアルカラーゼ（Ａｌｃａｒａｓｅ登録商標）　２．　４　Ｌ　（２４ＡＵ、／Ｋｇタンパク質分解活性に対応するタンパク譬の重量に関して計算）をタンパク質の加水分解に用いた。

かくして得られたタンパク質氷解物（３，５％溶液）を、苦味に対する通常の三角試験において比較した。主張者は、二種の生成物の苦味における差異は著しいものであると判断し、更に５Ｐ４４６およびトリプシンで調整した氷解物を好ましいものとした。

５Ｐ４４６および商業上のトリプシンの混合物を用いた大豆タンパク質濃縮物の加水分解は、反応混合物の粘度増加をもたらした。

このことは、親水性であるグルタミン酸およびアスパラギン酸を含むペプチド結合に対する５Ｐ４４６ブロテアーゼの特異性に帰因するか、又は氷解物中のプラスティン反応に帰因するであろう。

ｐＨ−活性ＩＯ− 曜Ｆｉｇ、　１温度活性Ｆｉｇ、　２０　３０　６０　９０　１２０　１５０　１８０　２Ｌ０　２１４０時間（分）一一？−ｍｌ　ＮａＯＨ −一←−ｍＰａ’ｓ −噌−ム加Ｓｍ／に９要約書本発明は、タンパク質の限定された特異的な加水分解を得るための方法、該方法によって得られる氷解物およびタンパク質水解物を含有する食品に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１　特許出願の表示ＰＣＴ／ＤＫ９１１０００６９２　発明の名称タンパク質加水分解物３　特許出願人住所　デンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし）名　称　ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカプ４代理人５　補正書の提出年月日１９９２年２月２、特許請求の範囲１、Ｇｌｕ及び／又はＡｓｐ結合でのタンパク質の限定された特異的な加水分解を得るための方法であって、以下の特徴を有する酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（カゼインプロテアーゼ単位）の比活性を有する；（ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｂ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１０．０のＰＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；Ｉｕｓ　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の株によって産生され得るものである；を含んでなり、その他のタンパク質分解活性と実質的に有さない酵素調製品をタンパク質性物質に加え、次いで所望の加水分解の程度が得られるまで中性又は弱いアルカリ性のｐＨにてインキュベーションし、その復液酵素を適切に不活性化せしめることによってこのインキュベーションを終了させ、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドの形成をもたらす、前記方法。

２、タンパク分解酵素が、確立された一文字コードで示される次のアミノ酸配列：５−ｖ−ｉ　−ｇ−ｓ−ｄ−ｄ−ｒ−ｔ−ｒ−ｖ−ｔ−ｎ−ｔ、−ｔ、　−ａ− ｙ−ｐ−ｙ−ｒ−ａ−ｉ　−ｖ−ｈ−４−ｓ−ｓ−ｓ−ｉ−ｇ　−ｓ−ｃ−ｔ− ｇ−ｗ−ｍ−ｉ　−ｇ−ｐ−に−ｔ−ｖ−ａ−ｔ、−ａ　−ｇ−ｈ−ｃ−ｉ　− ｙ−ｄ−ｔ−ｓ−ｓ−ｇ−ｓ−ｆ−ａ−ｇ−ｔ　−ａ　−４−ｖ−ｓ　−ｐ−ｇ −ｒ−ｎ−ｇ−ｔ−５−’Ｊ　Ｐ　＞’　ｇ−ｓ−ｖ−に−５−ｔ−ｒ−ｙ−ｆ −４−ｐ−ｓ−ｇ−ｗ−ｒ−ｓ　−ｇ−ｎ−ｔ−ｎ−ｙ−ｄ−ｙ−ｇ−ａ−ｉ− ｅ−１−Ｓ−ｅ−ｐ　−４−ｇ−ｎ−ｔ−ｖ−ｇ−ｙ−ｆ−ｇ−ｙ−ｓ−ｙ−ｔ −ｔ−ｓ　−５−１−ｖ−ｇ−ｔ−ｔ−ｖ−ｔ−ｉ−ｓ−ｇ−ｙ−ｐ−ｇ−ｄ　 −に−ｔ−ａ−ｇ−ｔ−ｑ−ｗ−ｑ−ｈ−ｓ−ｇ−ｐ−ｉ−ａ−ｉ　−５−ｅ− ｔ−ｙ−に−１−ｑ−ｙ−ａ　−ｍ−ｄ−ｔ−ｙ　ｇ−ｇ　−ｑ−ｓ−ｇ−ｓ　 −ｐ−ｖ−ｆ−ｅ−ｑ−ｓ−ｓ−ｓ−ｒ−ｔ−ｎ　−ｃ−ｓ−ｇ−ｐ−ｃ−ｓ− １−ａ−ｖ−ｈ−ｔ−ｎ−ｇ−ｖ−ｙ　−ｇ　ｇ−ｓ−ｓ−ｙ−ｎ−ｒ−ｇ−ｔ −ｒ−ｉ−ｔ−に−ｅ−ｖ　−ｆ−ｄ−ｎ−１−ｔ−ｎ−ｗ−に−ｎ−ｓ−ａ− ｑを存する請求の範囲第１項記載の方法。

３、ＰＨを、タンパク質性物質と酵素調製品とのインキュベーション中、一定に保持する、請求の範囲第１項記載の方法。

４、タンパク質性物質と酵素調製品とのインキュベーションを、非ｐＨ−５ｔａｔ法によって行う、請求の範囲第１項記載の方法。

５、タンパク質性物質が、動物性タンパク質、例えば乳漿タンパク質、カゼイン、肉類タンパク質、魚類タンパク質、赤血球、卵白もしくはゼラチン、又は植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテンもしくはゼイン、なたねタンパク質、むらさきうまごやしタンパク質、えんどうタンパク質、マメ科タンパク質、綿の実タンパク質又はごまの実タンパク質から成る群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の方法。

６、タンパク質性物質に加えられるべき酵素の量が、０．０５〜１５ｃｐｕ／タンパク質１００ｇ、特に０．　１〜５ｃｐｕ　／タンパク質１００ｇの範囲内にある、請求の範囲第１項記載の方法。

７、酵素を、インキュベーション混合物の温度を約７０°Ｃ超に高めることにより、又はインキュベーション混合物のｐＨを約５．０未満に下げることにより不活性化する、請求の範囲第１項記載の方法。

８、第一のタンパク質分解酵素に加え、他のタンパク質分解酵素をタンパク質性物質に加える、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。

９、他のタンパク質分解酵素が、トリプシンおよびトリプシン一様プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求の範囲８項記載の方法。

１０、第一のタンパク分解酵素が、０．０５〜５ｃｐｕ／タンパクｔ　１００　ｇの範囲内の量で加えられ、さらに第二のタンパク分解酵素が０．１〜１０ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの範囲内の量で加えられる、請求の範囲第８項記載の方法。

１１、タンパク質加水分解物であって、以下の特徴も有するタンパク質分解酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（カゼインプロテアーゼ単位）の比活性を有する；（Ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｄ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１０．０のｐＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；（ｆ）これは、Ｂ　１シエニホルミス　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ土１）の変異株を含む、バシラス　リシェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の株によって産生され得るものである；を含んで成り、その他のタンパク質分解活性を実質的に有さない酵素調製品によるタンパク質のＣ１ｕ及び／又はＡｓｐ結合の特異的な加水分解の結果としての、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドより本質的に成る、前記タンパク質加水分解物。

１２、タンパク質性物質が、動物性タンパク質、例えば乳漿タンパク質、カゼイン、肉類タンパク質、魚類タンパク質、赤血球、卵白もしくはゼラチン、又は植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテンもしくはゼイン、なたねタンパク質、むらさきうまごやしタンパク質、えんどうタンパク質、マメ科タンパク質、綿の実タンパク質又はごまの実タンパク質から成る群から選ばれる、請求の範囲第１１項記載のタンパク質加水分解物。

１３、高い比率の１０００−２０，０００の範囲、好ましくは１０００−１０，０００の範囲における分子量を有するペプチドと、低い比率の約１０００未満の分子量を有するペプチドを含んで成る、請求の範囲第１１項記載のタンパク質加水分解物。

１４、タンパク質Ｇｌｕおよび／又はＡｓｐ結合の特異的加水分解の結果としてのＣ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドとは別に、タンパク質のＬｙｓおよび／又はＡｒｇ結合の特異的加水分解の結果としてのＣ −末端にＬｙｓおよび／又はＡｒｇ残基を有するペプチドを含んでなる、請求の範囲第１１項記載のタンパク譬加水分解物。

１５、高い比率の分子量１０００〜１０，０００を有するペプチドおよび低い比率の分子量約１０００未満を有するペプチドを含んでなる、請求の範囲第１４項記載のタンパク質加水分解′＃。

１６、請求の範囲第１１〜１３項のいずれかに記載のタンパク質加水分解物を含んでなる食品。

１７、請求の範囲第１４又は１５須に記載のタンパク質加水分解物を含んでなる食品。

１８．１種以上の脂肪源および／又は１種以上の炭水化物源を、更に含んでなる、請求の範囲第１６又は１７項記載の食品。

国際調査報告１０１．ｌ、Ｉｌｌ、１１．ＩＡ、ユ１．５．。、。ＰＣＴ／ＤＫ　９１１０００６９国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｇｌｕ及び／又はＡｓｐ結合でのタンパク質の限定された特異的な加水分解を得るための方法であって、以下の特徴を有する酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（本明細書にて定義する）の比活性を有する；（ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｄ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１０．０のｐＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；を含んで成り、その他のタンパク質分解活性も実質的に有さない酵素調整品をタンパク質性物質に加え、次いで所望の加水分解の程度（本発明にて定義される）が得られるまで中性又は弱いアルカリ性のｐＨにてインキュベーションし、その後該酵素を適切に不活性化せしめることによってこのインキュベーションを終了させ、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドの形成をもたらす、前記方法。２．タンパク質分解酵素が、微生物、特に細菌によって産生されるものである請求の範囲第１項記載の方法。３細菌がＢ．リシェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の変異株を含む、バシラスリシェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の株である請求の範囲第２項記載の方法。４．タンパク質分解酵素が、図４に示されるアミノ酸配列、又はその誘導体を有する請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。５．ｐＨを、タンパク質性物質と酵素調整品とのインキュベーション中、一定に保持する、請求の範囲第１項記載の方法。６．タンパク質性物質と酵素調整品とのインキュベーションを、非ｐＨ−ｓｔａｔ法によって行う、請求の範囲第１項記載の方法。７．タンパク質性物質が、動物性タンパク質、例えば乳漿タンバク質、カゼイン、肉類タンパク質、魚類タンパク質、赤血球、卵白もしくはゼラチン、又は植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテンもしくはゼイン、なたねタンバク質、むらさきうまごやしタンパク質、えんどうタンパク質、マメ科タンパク質、綿の実タンパク質又はごまの実タンパク質から成る群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の方法。８．タンパク質性物質に加えられるべき酵素の量が、０．０５〜１５ｃｐｕ／タンパク質１００ｇ、特に０．１〜５ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの範囲内にある、請求の範囲第１項記載の方法。９．酵素を、インキュベーション混合物の温度を約７０℃超に高めることにより、又はインキュベーション混合物のｐＨを約５．０未満に下げることにより不活性化する、請求の範囲第１項記載の方法。１０．第一のタンパク質分解酵素に加え、他のタンパク質分解酵素をタンパク質性物質に加える、請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。１１．他のタンパク質分解酵素が、トリプシンおよびトリプシンー様プロテアーゼから成る群から選ばれる、請求の範囲第１０項記載の方法。１２．第一のタンパク分解酸素が、０．０５〜５ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの範囲内の量で加えられ、さらに第二のタンパク分解酵素が０．１〜１０ｃｐｕ／タンパク質１００ｇの範囲内の量で加えられる、請求の範囲第１０項記載の方法。１３．タンパク質加水分解物であって、以下の特徴を有するタンバク質分解酵素：（ａ）これはグルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基に対して特異的なセリンプロテアーゼである；（ｂ）これは１ｇの酵素タンパク質当り少なくとも２５ｃｐｕ（本明細書にて定義する）の比活性を有する；（ｃ）これは約２３，６００の見かけ上の分子量を有する；（ｄ）これはジイソプロピルホスホフルオリデートによって阻害されるが、フェニルメタンスルホニルフルオリドによっては阻害されない；（ｅ）これは６．５〜１０．０のｐＨの範囲においてその最大活性の７５％以上を示す；を含んで成り、その他のタンパク質分解活性を実質的に有さない酵素調整品によるタンパク質のＧｌｕ及び／又はＡｓｐ結合の特異的な加水分解の結果としての、Ｃ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドより本質的に成る、前記タンパク質加水分解物。１４．タンパク質性物質が、動物性タンパク質、例えば乳漿タンバク質、カゼイン、肉類タンパク質、魚類タンパク質、赤血球、卵白もしくはゼラチン、又は植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば小麦グルテンもしくはゼイン、なたねタンパク質、むらさきうまごやしタンパク質、えんどうタンパク質、マメ科タンパク質、綿の実タンパク質又はごまの実タンパク質から成る群から選ばれる、請求の範囲第１３項記載のタンパク質加水分解物。１５．高い比率の１０００−２０，０００の範囲、好ましくは１０００−１０，０００の範囲における分子量を有するペプチドと、低い比率の約１０００未満の分子量を有するペプチドを含んで成る、請求の範囲第１３項記載のタンパク質加水分解物。１６．タンパク質のＧｌｕおよび／又はＡｓｐ結合の特異的加水分解の結果としてのＣ−末端にグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するペプチドとは別に、タンパク質のＬｙｓおよび／又はＡｓｐ結合の特異的加水分解の結果としてのＣ−末端にＬｙｓおよび／又はＡｒｇ残基を有するペプチドを含んでなる、請求の範囲第１３項記載のタンパク質加水分解物。１７．高い比率の分子量１０００−１０，０００を有するペプチドおよび低い比率の分子量約１０００未満を有するペプチドを含んでなる、請求の範囲第１６項記載のタンパク質加水分解物。１８．請求の範囲第１３〜１５項のいずれかに記載のタンパク質加水分解物を含んでなる食品。１９．請求の範囲第１６又は１７項記載のタンパク質加水分解物を含んでなる食品。２０．１種以上の脂肪源および／又は１種以上の炭水化物源を、更に含んでなる、請求の範囲第１８又は１９項記載の食品。