JP2013006799A - 水溶性エラスチンペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エラスチン含有物をアルカリ性プロテアーゼを用いて夾雑物を除去、洗浄した後、さらにアルカリ性プロテアーゼを用いて前記エラスチン含有物中のエラスチンを水溶性エラスチンペプチドに分解する。
【選択図】図1
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洗浄工程は、エラスチン含有物に付着・残存している血液や脂質及びコラーゲンなどの夾雑物を除去する工程である。本発明では、この洗浄工程において、水洗後に、アルカリ性プロテアーゼ(エンドペプチターゼ)を用いて洗浄するものであり、これにより、熱水のみの洗浄に比べて、最終製品の水溶性エラスチンペプチドの無臭化を向上させることができる。また、アルカリ性プロテアーゼを用いた場合は、アルカリ性の薬品や有機溶剤を使用して洗浄する場合に比べて、製造設備の腐食や作業員への安全性の問題も少なく、さらに酸による中和作業や脱塩作業、大掛かりな限外濾過装置も必要がなく、加えて、アルカリ性の薬品や有機溶剤を水洗する際の洗浄不足によって、最終製品の水溶性エラスチンペプチドにおける異臭の発生や味覚の低下などの問題を懸念することもなくなるものである。また、アルカリ性プロテアーゼを用いた場合は、酸性プロテアーゼや中性プロテアーゼを使用する場合に比べて、夾雑物の除去率が低下しにくく、エラスチン本体の分解も殆ど起こらないようにすることができる。
アルカリ性プロテアーゼとしては、酵素の至適pHが6以上であるものが好ましく、例えば、糸状菌(Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus saitoi、Aspergillus sojae、Monascus pilosus、Mucor circinelloides、Mucor javanicus、Mucor miehei、 Mucor rouxii、Penicillium citrinum、Rhizomucor miehei、Rhizopus chinensis、 Rhizopus delemar 、Rhizopus niveus)、担子菌(Pycnopporrus coccineus)、放射菌(Streptomyces)、細菌(Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coaglans、j4、Bacillus lentus 、Bacilluslicheniformis、Bacillus polymixa 、Bacillus stearothermophilus 、Bacillussubtilis 、Bacillus thermoproteolyticus 、Pseudomonas paucimobilis)もしくは酵母(Saccharomyces)等の培養液より得られたものなどを用いることができる。また、洗浄は、エラスチン含有物を水に浸漬させた後、アルカリ性プロテアーゼを添加することによって行うことができる。この場合、エラスチン含有物100重量部に対して、水を200〜800重量部、アルカリ性プロテアーゼを0.1〜0.5重量部の配合割合にするのが好ましい。この範囲であると、エラスチン含有物に対して水やアルカリ性プロテアーゼが多すぎたり少なすぎたりすることがなく、洗浄を十分に行えると共にアルカリ性プロテアーゼが無駄に消費されにくくすることができる。また、洗浄の際のアルカリ性プロテアーゼ水溶液はpHが6.0〜7.5とするのが好ましい。この範囲であるとアルカリ性プロテアーゼの活性が損なわれにくく、洗浄を十分に行うことができる。また、洗浄の際のアルカリ性プロテアーゼ水溶液の温度は50〜70℃であることが好ましい。この範囲であるとアルカリ性プロテアーゼの活性が損なわれにくく、洗浄を十分に行うことができる。また、エラスチン含有物の洗浄時間(浸漬時間)は5〜10分間とするのが好ましい。この範囲であるとアルカリ性プロテアーゼをエラスチン含有物に十分に作用させることができ、洗浄を十分に行うことができると共に洗浄工程の長時間化を防止することができる。
可溶化工程は、洗浄工程後のエラスチン含有物中のエラスチンの一部または全部をペプチドやアミノ酸に加水分解し、本来、不溶性タンパク質であるエラスチンを可溶化(水溶性化)し、市販される製品として加工しやすくするものである。
固液分離工程は、可溶化工程後のエラスチン由来のペプチドやアミノ酸を含有する水溶液を活性炭処理して不純物を吸着により除去し、この後、液体と固体とに分離する工程である。液体にはエラスチン由来のペプチドが含有されており、場合によってはエラスチン由来のアミノ酸も含まれている。固体は可溶化工程で分解されなかった成分(残渣)である。固液分離工程は、有孔壁遠心分離機、無孔壁遠心分離機、加圧濾過機、濾布、濾紙などによって行うことができる。
図1に示す工程により、水溶性エラスチンペプチド粉末を製造した。
マグロ(ミナミマグロ)の動脈球を200g用意し、これを動脈球の重量の5倍の水1000gに浸漬し、0.5時間保持した。これにより、水での洗浄を行い、動脈球に付着、残存している血液や脂質などを粗洗浄した。この後、洗浄液(洗浄に用いた水)と動脈球とを濾過により分離する。この洗浄液のビウレット反応は陰性であった(365nm青色蛍光なし)。
洗浄工程後の動脈球を粉砕(ミンチに)した後、これに水400g加え、さらにアルカリ性プロテアーゼ(オリエンターゼ 22BF(HBI Enzymes inc.))を0.5%配合することによって、アルカリ性プロテアーゼ水溶液による酵素処理(加水分解処理)を行った。このときのアルカリ性プロテアーゼ水溶液の温度は60℃、反応時間は60分間、pHは6.2とした。次に、アルカリ性プロテアーゼ水溶液の温度を90℃で10分間保持することによって、アルカリ性プロテアーゼを失活させた。失活後のアルカリ性プロテアーゼ水溶液のブリックス(Brix)は3.2%、pHは6.2であった。失活後のアルカリ性プロテアーゼ水溶液は、エラスチン由来のペプチドやアミノ酸を含有するエラスチンペプチド含有水溶液である。
可溶化工程で得られたエラスチンペプチドを含有する水溶液を活性炭に接触させて活性炭処理を行った。活性炭処理を行ったエラスチンペプチドを含有する水溶液のブリックス(Brix)は3.0%、pHは5.9であった。
図2に示す工程により、水溶性エラスチンペプチド粉末を製造した。
実施例と同様のマグロの動脈球を200g用意し、これを動脈球の重量の5倍の水1000gに浸漬し、0.5時間保持した。これにより、水での洗浄を行い、動脈球に付着、残存している血液や脂質などを粗洗浄した。この後、洗浄液(洗浄に用いた水)と動脈球とを濾過により分離した。この洗浄液のビウレット反応は陰性であった(365nm青色蛍光なし)。
洗浄工程後の動脈球を粉砕(ミンチに)した後、これに水400g加え、さらに中性プロテアーゼ(オリエンターゼ 90N(HBI Enzymes inc.))を0.5%添加することによって、中性プロテアーゼによる酵素処理(加水分解処理)を行った。このときの中性プロテアーゼ水溶液の温度は60℃、浸漬時間は60分間、pHは6.2とした。次に、中性プロテアーゼ水溶液の温度を90℃で10分間保持することによって、中性プロテアーゼを失活させた。失活後の中性プロテアーゼ水溶液は、エラスチン由来のペプチドやアミノ酸を含有する水溶液である。
可溶化工程で得られた水溶性エラスチンペプチド含有水溶液を活性炭に接触させて活性炭処理を行った。次に、活性炭処理後の水溶性エラスチンペプチド含有水溶液を濾過し、残渣と濾液とに分離した。次に、濾液を濃縮し、液量が60.0g、ブリックス(Brix)は26%であった。次に、濃縮液を噴霧乾燥して粉末状の水溶性エラスチンペプチドを得た。この粉末は15.5g得られ、200gの動脈球から収率7.8%で水溶性エラスチンペプチド粉末が得られた。また、この粉末はビウレット反応が陽性であった(365nm青色蛍光あり)。
比較例1において、[洗浄工程]の熱水の代わりに、アルカリ水溶液を用いた。アルカリとしては水酸化ナトリウムを用い、濃度は0.1%とした。その他の構成は比較例1と同様にした。この場合、アルカリ除去による動脈球の水洗に3〜4日を要し、洗浄液もビウレット反応が陽性を示した為、実用的では無いと判断し、その後の処理を中止した。
アミノ酸標準溶液(アミノ酸混合標準液、H型)及びエラスチン、デスモシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリンを0.01Mの塩酸で一定量に定容し、標準溶液とした。
実施例により得られたエラスチンペプチド粉末を適量とり、6M塩酸を加えて110℃で、24時間加水分解を行い、中和後、0.01Mの塩酸で定容し、試料溶液とした。シスチンについてはあらかじめ過ギ酸による酸化処理を行った後、加水分解を行った。また、トリプトファンの測定についてはアルカリを用いて加水分解を行った試料を用いた。
標準溶液及び試料溶液を液体クロマトグラフ法等により各アミノ酸類及び、デスモシン、イソデスモシンの含量を測定した。トリプトファンについては逆相HPLCにて含量を測定した。
分子量マーカーとして、(1)Cytochrome C(M.W=12500)、(2)Aprotinin(M.W=6512)、(3)Bacitracin(M.W=1450)、(4)Angiotensin II(M.W=1046)、(5)Gly−Gly−Tyr−Arg(M.W=451)、(6)Gly−Gly−Gly(M.W=189)の適量をとり、溶出時間及び分子量をもとに検量線を作成した。
実施例により得られた水溶性エラスチンペプチド粉末を適量とり、移動相を加えて溶かし、試料溶液とした。
各標準溶液を用いて作成した検量線をもとに、下記の条件にて試料溶液中の各ピークにおける分子量を調べた。
[HPLCの条件]
カラム;TSKgel G2500PW 7.8mm×300mm
カラム温度;40℃
移動相;水/アセトニトリル/T.F.A.混液(55/45/0.1)
測定波長;220nm
Claims (2)
- エラスチン含有物をアルカリ性プロテアーゼを用いて夾雑物を除去、洗浄した後、さらにアルカリ性プロテアーゼを用いて前記エラスチン含有物中のエラスチンを水溶性エラスチンペプチドに分解することを特徴とする水溶性エラスチンペプチドの製造方法。
- 前記エラスチン含有物は魚類の動脈球であることを特徴とする請求項1に記載の水溶性エラスチンペプチドの製造方法。
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