CN108728509B - 一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及日本黄姑鱼的多肽制备技术领域，具体涉及一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，将鱼皮经脂肪酶与异丙醇联合脱脂，消除了免疫调节肽的苦味，然后经酒石酸、脉冲电场和还原胺化试剂作用后削弱鱼皮分子蛋白间的交联程度，强化鱼皮蛋白的溶胀，再经50～60℃温度下由木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、曲霉菌丝氨酸蛋白酶或/和碱性蛋白酶等对鱼皮蛋白分解作用较弱的蛋白提取酶的作用使鱼皮中的鱼皮蛋白尽可能的溶出，然后经中性蛋白酶和中性金属蛋白酶共同作用分解鱼皮蛋白得到鱼皮免疫调节肽，鱼皮蛋白的利用率高，断链分解均匀性高，得到的免疫调节肽的分子量为2000～3500Da。
Description
技术领域
本发明涉及日本黄姑鱼的多肽制备技术领域，具体涉及一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法。
背景技术
日本黄姑鱼是石首鱼科中黄姑鱼属的一种鱼类，分布在朝鲜、日本南部以及中国沿海等地区，目前在浙江省舟山渔场已经进行引进养殖，具有幼苗发育迅速、抗病能力强、生长周期短、营养价值高、经济效益等优点。日本黄姑鱼在加工过程中会产生如鱼皮、鱼骨、鱼内脏等下脚料，为进一步提高日本黄姑鱼的经济价值，合理利用资源，有必要开发利用日本黄姑鱼下脚料的途径。
免疫调节肽为从生物体或食物蛋白中获取的具有免疫调节活性的肽，可通过影响免疫器官生长发育、免疫细胞活性与功能以及免疫分子表达、合成和释放而参与机体特异性和非特异性免疫功能的调节，对维持机体免疫功能正常和健康具有重要作用。目前免疫调节肽的获得途径主要有：从生物机体组织器官中直接提取、酶解食物蛋白获得、在已知一些免疫调节肽结构序列的基础上通过化学法合成、应用DNA重组技术表达已有的免疫调节肽，其中第一种途径来源广，获取方便。目前研究表明，日本黄姑鱼的鱼皮中含有丰富的免疫调节肽，因此通过合适的途径提取日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽一方面提高了日本黄姑鱼的经济价值和利用率，另一方面也拓宽了免疫调节肽的来源，无疑具有较好的效益。目前多采用酶解鱼皮制备免疫调节肽，但该方法还存在处理调节苛刻导致鱼皮蛋白利用率低、免疫调节肽活性不够等问题。
中国专利2006100701172，专利名称一种利用鳕鱼皮制取鱼蛋白活性肽粉的方法，申请日期2016年8月31日，公开了一种将鳕鱼皮蒸煮后加复合蛋白酶分解，然后脱色喷雾制成鱼蛋白活性肽，但是该方法存在鱼皮蛋白高温蒸煮变性失活、鱼皮蛋白利用率低、直接酶解鱼皮浆液使所得活性肽粉中可能含有变性鱼皮蛋白、活性肽活性一般等不足。
发明内容
针对目前酶解法从鱼皮中获取多肽还还存在鱼皮蛋白利用率低等问题，本申请的目的在于提供一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，以日本黄姑鱼的鱼皮下脚料为原料制备鱼皮免疫调节肽，制备过程温和，鱼皮中的鱼皮蛋白得到充分利用且活性得到保证，得到的免疫调节肽的制备效率高、活性好。
本发明提供如下的技术方案：
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）用水将鱼皮清洗干净后剪片、脱脂待用；
（2）将脱脂后的鱼皮置于低浓度碱液中浸泡，然后用水洗至中性后冷冻备用；
（3）将步骤（2）处理后鱼皮置于水中，加酸液调节pH值2.0～4.6得浸泡液，向浸泡液中加鱼皮质量1%～5%的还原胺化试剂搅拌处理3～5小时，过滤鱼皮并冲洗至中性后冷冻备用；
（4）向步骤（3）处理后的鱼皮加入30～50倍质量的水后匀浆，加热至水温50～60℃后加入蛋白提取酶处理，然后加热灭酶活性后离心分离，所得上清液为鱼皮蛋白原液；
（5）向鱼皮蛋白原液中加入蛋白分解酶处理，然后加热灭酶活后离心分离得到酶解液；
（6）真空冷冻干燥酶解液得到鱼皮免疫调节肽干粉。
作为本发明方法的优选，步骤（1）脱脂过程如下：向鱼皮中加水，加入鱼皮质量0.2～0.6wt%的番茄红素与维生素C混合物，维生素C与番茄红素质量比为1:0.1～0.2，然后加脂肪酶30～40℃一次脱脂2～4h，脂肪酶活力为30000～50000U/g，冲洗鱼皮至无番茄红素色后置于20～30wt%异丙醇溶液二次脱脂2～4h，冲洗鱼皮至无异丙醇味。
作为本发明方法的优选，步骤（2）中所述低浓度碱液为质量浓度2～5wt%的氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液，浸泡温度25～30℃，浸泡时间12～24h。
作为本发明方法的优选，步骤（3）中所用酸溶液为酒石酸与醋酸、柠檬酸或苹果酸的混合溶液，其中酒石酸的质量百分比为50wt%～70wt%。
作为本发明方法的优选，浸泡液的温度≤38℃，调节的浸泡液的pH值为2.8～4.0。
作为本发明方法的优选，步骤（3）中所用还原胺化试剂为硼氢化锌、硼氢化钠、醋酸硼氢化钠或氰代硼氢化钠中的一种。
作为本发明方法的优选，步骤（3）还包括在搅拌的过程中向浸泡液施加低压脉冲电场，低压脉冲电场的电压为60～100V，频率为20～25Hz。
作为本发明方法的优选，步骤（4）中的蛋白提取酶为木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、曲霉菌丝氨酸蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种，所述蛋白提取酶的酶活力为7000～10000U/g，处理时间10～16h。
作为本发明方法的优选，步骤（5）中的蛋白分解酶为中性蛋白酶和金属蛋白酶的混合物，两者的质量比为1:0.2～0.5，分解温度为40～50℃，分解时间3～5h。
作为本发明方法的优选，所述金属蛋白酶为多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶。
本发明的日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备过程中，首先将鱼皮经脂肪酶和异丙醇脱脂。现鱼皮及鱼加工下胶料制备多肽的加工过程中多用纯的异丙醇或者脂肪酶脱脂，但异丙醇消耗量比较大，脱脂时间一般不低于24小时；脂肪酶脱脂生成的脂肪酸容易氧化导致生成的多肽具有苦臭味，并且脱脂时间也较长。因此发明人将脂肪酶分解和异丙醇脱脂联合使用：脂肪酶在番茄红素和维生素C存在下脱脂，番茄红素具有较强的抗氧化性，可增强脂肪酸的抗氧化能力，但番茄红素用量较多则影响多肽的颜色，因此将番茄红素与维生素C混合使用，经脂肪酶脱脂后由异丙醇进行物理的更加较为彻底的脱脂，此时所需的异丙醇的量减少，本申请中只需20～30wt%异丙醇溶液即可，同时整体的脱脂时间缩短。然后将脱脂后的鱼皮置于2～5wt%的氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液中浸泡脱除杂质蛋白，碱浓度过高或者碱性过强则容易破坏鱼皮蛋白的结构，影响制备的多肽的性能。发明人发现直接使用蛋白酶处理鱼皮的效率比较低，这可能是因为鱼皮蛋白分子之间经离子键的静电作用和席夫碱交联连接导致鱼皮蛋白分解不充分所致。因此发明人将鱼皮首先置于加酸调节pH值为2.0～4.6的浸泡液中浸泡，使鱼皮蛋白分子间的离子键断开，增加鱼皮蛋白的溶胀；所用酸为酒石酸与醋酸、柠檬酸或苹果酸的混合，酒石酸有较强的抗氧化性，在溶胀鱼皮蛋白的同时避免蛋白被氧化破坏。更优选的同时向浸泡液中施加低压脉冲电场，强化酸的鱼皮蛋白溶胀，但是电场的强度不易过高，否则容易导致鱼皮蛋白的变性。向浸泡液中加入1%～5%的还原胺化试剂进一步去除鱼蛋白分子间的席夫碱，从而与酸、电场协同削弱鱼皮蛋白分子间的交联程度，加强鱼皮蛋白的溶胀，提高鱼皮蛋白的利用效率。将鱼皮匀浆后加热至50～60℃，并加入蛋白提取酶，通过温度与蛋白提取酶协同作用使鱼皮中的鱼皮蛋白充分溶出。本申请所用的蛋白提取酶如木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、曲霉菌丝氨酸蛋白酶和碱性蛋白酶对鱼皮蛋白的作用比较弱，避免了蛋白分子的断裂，保持了鱼皮蛋白的完整性，但能够破坏鱼皮蛋白尾端的肽链，强化温度对鱼皮蛋白的提取效果。然后加入中性蛋白和多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶分解提取的鱼皮蛋白，对鱼皮蛋白的分解专一性较好，鱼皮免疫调节肽的制备效率高，而且分子量较为均匀，所得免疫调节肽的分子范围为2000～3500Da。
本申请的日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽制备过程中将鱼皮经脂肪酶与异丙醇联合脱脂，消除了免疫调节肽的苦味，然后经酒石酸、脉冲电场和还原胺化试剂作用后削弱鱼皮分子蛋白间的交联程度，强化鱼皮蛋白的溶胀，再经50～60℃温度下由木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、曲霉菌丝氨酸蛋白酶或/和碱性蛋白酶等对鱼皮蛋白分解作用较弱的蛋白提取酶的作用使鱼皮中的鱼皮蛋白尽可能的溶出，然后经中性蛋白酶和中性金属蛋白酶共同作用分解鱼皮蛋白得到鱼皮免疫调节肽，鱼皮蛋白的利用率高，断链分解均匀性高，得到的免疫调节肽的分子量为2000～3500Da。
本发明的有益效果如下：
本发明方法采用脱脂-鱼皮蛋白溶胀-鱼皮蛋白溶出-鱼皮蛋白断链的分阶段过程处理鱼皮制备鱼皮免疫调节肽，鱼皮蛋白的利用率高，所得鱼皮免疫调节肽的肽链均匀，肽链分子量范围为2000～3500Da，产品纯度高，而且过程易操作，异丙醇用量降低，脱脂时间短，脱腥脱苦比较彻底。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：；
（1）用水将鱼皮清洗干净后剪片，然后向鱼皮中加水，再加入鱼皮质量0.2wt%的番茄红素与维生素C混合物，维生素C与番茄红素质量比为1:0.1，然后加酶活力为30000U/g的脂肪酶30℃一次脱脂4h，冲洗鱼皮至无番茄红素色后置于20wt%异丙醇溶液二次脱脂4h，冲洗鱼皮至无异丙醇味脱脂待用；
（2）将脱脂后的鱼皮置于质量浓度2wt%的氢氧化钠低浓度碱液中浸泡24h，浸泡温度25～30℃，然后用水洗至中性后冷冻备用；
（3）将步骤（2）处理后鱼皮置于水中，加酸液调节pH值2.0～4.6/2.8～4.0得浸泡液，浸泡液的温度≤38℃，所用酸溶液为酒石酸与醋酸的混合溶液，酒石酸的质量百分比为50wt%，向浸泡液中加鱼皮质量1%的还原胺化试剂硼氢化锌搅拌处理3小时，搅拌过程中向浸泡液施加电压为60V的低压脉冲电场，频率为20Hz，过滤鱼皮并冲洗至中性后冷冻备用；
（4）向步骤（3）处理后的鱼皮加入30倍质量的水后匀浆，加热至水温50℃后加入酶活力为7000U/g的蛋白提取酶处理，所用蛋白提取酶为木瓜蛋白酶，处理时间10h，然后加热灭酶活性后离心分离，所得上清液为鱼皮蛋白原液，将鱼皮蛋白原液真空冷冻干燥后制得的鱼皮蛋白的提取率为97%±1%；
（5）向鱼皮蛋白原液中加入蛋白分解酶处理，蛋白分解酶为中性蛋白酶和金属蛋白酶的混合物，所用金属蛋白酶为多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶，两者的质量比为1:0.2，分解温度为40℃，分解时间3h，然后加热灭酶活后离心分离得到酶解液；
（6）真空冷冻干燥酶解液得到鱼皮免疫调节肽干粉，测得鱼皮免疫调节肽的质量为2000～3500Da，平均值为3200±100Da。
实施例2
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，与实施例1的不同之处在于：
步骤（2）中所用低浓度碱液为质量浓度2wt%的碳酸钠溶液；
步骤（3）中加酸液调节所得浸泡液的pH值为2.8，所用还原胺化试剂为硼氢化钠；
步骤（4）中所用蛋白提取酶为胰凝乳蛋白酶。
测得鱼皮免疫调节肽的质量为2000～3500Da，平均值为3400±100Da。
实施例3
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：；
（1）用水将鱼皮清洗干净后剪片，然后向鱼皮中加水，加入鱼皮质量0.4wt%的番茄红素与维生素C混合物，维生素C与番茄红素质量比为1:0.15，然后加酶活力为40000U/g的脂肪酶35℃一次脱脂3h，冲洗鱼皮至无番茄红素色后置于25wt%异丙醇溶液二次脱脂3h，冲洗鱼皮至无异丙醇味脱脂待用；
（2）将脱脂后的鱼皮置于质量浓度4wt%的氢氧化钠低浓度碱液中浸泡16h，浸泡温度27℃，然后用水洗至中性后冷冻备用；
（3）将步骤（2）处理后鱼皮置于水中，加酸液调节pH值3.7得浸泡液，浸泡液的温度≤38℃，所用酸溶液为酒石酸与柠檬酸的混合溶液，酒石酸的质量百分比为60wt%，向浸泡液中加鱼皮质量3%的还原胺化试剂醋酸硼氢化钠搅拌处理3～5小时，搅拌过程中向浸泡液施加电压为80V的低压脉冲电场，频率为20～25Hz，过滤鱼皮并冲洗至中性后冷冻备用；
（4）向步骤（3）处理后的鱼皮加入40倍质量的水后匀浆，加热至水温550℃后加入酶活力为8000U/g的蛋白提取酶处理，蛋白提取酶为胰蛋白酶，处理时间14h，然后加热灭酶活性后离心分离，所得上清液为鱼皮蛋白原液，将鱼皮蛋白原液真空冷冻干燥后制得的鱼皮蛋白的提取率为97%±1%；
（5）向鱼皮蛋白原液中加入蛋白分解酶处理，蛋白分解酶为中性蛋白酶和金属蛋白酶的混合物，所用金属蛋白酶为多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶，两者的质量比为1:0.4，分解温度为45℃，分解时间4h，然后加热灭酶活后离心分离得到酶解液；
（6）真空冷冻干燥酶解液得到鱼皮免疫调节肽干粉，测得鱼皮免疫调节肽的质量为2000～3500Da，平均值为2800±100Da。
实施例4
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：；
（1）用水将鱼皮清洗干净后剪片，然后向鱼皮中加水，加入鱼皮质量0.6wt%的番茄红素与维生素C混合物，维生素C与番茄红素质量比为1: 0.2，然后加酶活力为50000U/g的脂肪酶40℃一次脱脂2h，冲洗鱼皮至无番茄红素色后置于30wt%异丙醇溶液二次脱脂2h，冲洗鱼皮至无异丙醇味脱脂待用；
（2）将脱脂后的鱼皮置于质量浓度5wt%的碳酸钠低浓度碱液中浸泡12h，浸泡温度25℃，然后用水洗至中性后冷冻备用；
（3）将步骤（2）处理后鱼皮置于水中，加酸液调节pH值4.0得浸泡液，浸泡液的温度≤38℃，所用酸溶液为酒石酸与苹果酸的混合溶液，其中酒石酸的质量百分比为70wt%，向浸泡液中加鱼皮质量5%的还原胺化试剂氰代硼氢化钠搅拌处理5小时，搅拌过程中向浸泡液施加电压为100V的低压脉冲电场，频率为25Hz，过滤鱼皮并冲洗至中性后冷冻备用；
（4）向步骤（3）处理后的鱼皮加入50倍质量的水后匀浆，加热至水温60℃后加入酶活力为10000U/g的蛋白提取酶处理，所用蛋白提取酶为曲霉菌丝氨酸蛋白酶，处理时间10h，然后加热灭酶活性后离心分离，所得上清液为鱼皮蛋白原液，将鱼皮蛋白原液真空冷冻干燥后制得的鱼皮蛋白的提取率为97%±1%；
（5）向鱼皮蛋白原液中加入蛋白分解酶处理，蛋白分解酶为中性蛋白酶和金属蛋白酶的混合物，所用金属蛋白酶为多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶，两者的质量比为1: 0.5，分解温度为50℃，分解时间3h，然后加热灭酶活后离心分离得到酶解液；
（6）真空冷冻干燥酶解液得到鱼皮免疫调节肽干粉，测得鱼皮免疫调节肽的质量为2000～3500Da，平均值为3000±100Da。
实施例5
一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，与实施例4的不同之处在于：
步骤（3）中加酸液调节所得浸泡液的pH值为4.6；
步骤（4）中所用蛋白提取酶为碱性蛋白酶；
测得鱼皮免疫调节肽的质量为2000～3500Da，平均值为3100±100Da。
Claims (8)
1.一种日本黄姑鱼的鱼皮免疫调节肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用水将鱼皮清洗干净后剪片、脱脂待用；
(2)将脱脂后的鱼皮置于低浓度碱液中浸泡，然后用水洗至中性后冷冻备用；
(3)将步骤(2)处理后鱼皮置于水中，加酸液调节pH值2.0～4.6得浸泡液，向浸泡液中加鱼皮质量1％～5％的还原胺化试剂搅拌处理3～5小时，过滤鱼皮并冲洗至中性后冷冻备用；
(4)向步骤(3)处理后的鱼皮加入30～50倍质量的水后匀浆，加热至水温50～60℃后加入蛋白提取酶处理，然后加热灭酶活性后离心分离，所得上清液为鱼皮蛋白原液；
(5)向鱼皮蛋白原液中加入蛋白分解酶处理，然后加热灭酶活后离心分离得到酶解液；
(6)真空冷冻干燥酶解液得到鱼皮免疫调节肽干粉；
所述步骤(2)中所述低浓度碱液为质量浓度2～5wt％的氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液，浸泡温度25～30℃，浸泡时间12～24h；
所述步骤(3)中所用酸溶液为酒石酸与醋酸、柠檬酸或苹果酸的混合溶液；
步骤(3)中浸泡液的温度≤38℃；
所述步骤(3)还包括在搅拌的过程中向浸泡液施加低压脉冲电场，低压脉冲电场的电压为60～100V，频率为20～25Hz；
所述蛋白提取酶的酶活力为7000～10000U/g，处理时间10～16h；
步骤(5)中蛋白分解酶为中性蛋白酶和金属蛋白酶的混合物，两者质量比为1:0.2～0.5，分解温度为40～50℃。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)脱脂过程如下：向鱼皮中加水，加入鱼皮质量0.2～0.6wt％的番茄红素与维生素C混合物，维生素C与番茄红素质量比为1:0.1～0.2，然后加脂肪酶30～40℃一次脱脂2～4h，脂肪酶活力为30000～50000U/g，冲洗鱼皮至无番茄红素色后置于20～30wt％异丙醇溶液二次脱脂2～4h，冲洗鱼皮至无异丙醇味。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中酸溶液中，酒石酸的质量百分比为50wt％～70wt％。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中调节的浸泡液的pH值为2.8～4.0。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所用还原胺化试剂为硼氢化锌、硼氢化钠、醋酸硼氢化钠或氰代硼氢化钠中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的蛋白提取酶为木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、曲霉菌丝氨酸蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中分解时间3～5h。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述金属蛋白酶为多粘芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101538602A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-09-23 | 湖北瑞邦生物科技有限公司 | 一种鱼皮胶原蛋白的提取方法 |
| CN101892278A (zh) * | 2009-05-18 | 2010-11-24 | 湛江中南岛生化有限公司 | 从鱼中提取小分子胶原蛋白寡肽的方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN101892278A (zh) * | 2009-05-18 | 2010-11-24 | 湛江中南岛生化有限公司 | 从鱼中提取小分子胶原蛋白寡肽的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 张寒俊 等.罗非鱼皮胶原蛋白肽酶解液的制备及其抗氧化特性研究.《中国酿造》.2008,第27卷(第13期),全文. * |
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