CN108164595A - 从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白。该胶原蛋白的制备方法为：将鱿鱼皮中加入NaOH水溶液，超声波浸泡，脱脂，洗净沥干；向预处理的鱿鱼皮中加入醋酸溶液，搅拌浸提，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，上清液盐析后用醋酸溶解，透析，冷冻干燥得酸溶性胶原蛋白；向酸提取的沉淀中加入中性蛋白酶和蒸馏水，酶解，离心，将上清液盐析后用醋酸溶解，透析，冷冻干燥得酶溶性胶原蛋白。有益效果为：本发明胶原蛋白颜色较白、无鱼腥味、产品纯度高，松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，适合做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类产品深加工技术领域，尤其是涉及从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白。
背景技术
鱿鱼，虽然习惯上称它们为鱼，其实它并不是鱼，而是生活在海洋中的软体动物。鱿鱼属于软体动物门，头足纲，枪乌贼科，通称枪乌贼。体色苍白，体圆锥形，头大，有淡褐色斑，前方生有 10 条触足，常成群游弋于深约 20 米的海洋中。常活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米。肉质细嫩，风味类似于鲍鱼，但价格很低，被成为“穷人的鲍鱼”。西方人因为鱿鱼表皮暗且易变，而称鱿鱼为“魔鬼鱼”；西班牙人吃鱿鱼比较多，他们把鱿鱼加工成不同风味的罐头，鱿鱼酱油，鱿鱼圈等；美国人近几年来也开始提倡吃鱿鱼，他们把鱿鱼加工成类似鲍鱼的形态出售；鱿鱼在日本很受欢迎，已成为日本日常生活中必不可少的水产品，日本人把鱿鱼一般加工成冷冻制品、干制品、珍味制品、盐渍制品、加热杀菌制品。鱿鱼加工中产生的副产物，如皮、内脏、眼及墨囊等，都作为废弃物丢掉，不仅造成了环境污染，也不能提高鱿鱼加工的附加值。鱿鱼全身都是宝，鱿鱼皮中含有大量的胶原蛋白，可用来提取胶原蛋白；内脏中含有促进草虾摄饵的氨基酸，粗脂肪（不饱和脂肪酸的含量很高），蛋白质（可用来生产鱿鱼酱油）；墨囊中的墨汁已被证实具有抗菌功能，还有抗肿瘤和增强免疫的功能。
胶原蛋白，或称胶原，是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、腱、软骨、皮肤及其它结缔组织中，具有支撑器官、保护机体的功能，约占动物总蛋白量的30%。海洋中的水生动物种类繁多，且不同的水生动物其形态及身体结构都存在巨大差异。作为无脊椎动物头足类的鱿鱼，其具有发达的真皮组织，其体内的胶原蛋白主要分布在真皮组织中。胶原蛋白分子结构很稳定，且免疫原性低，生物相容性良好，这些性质决定了它的用途，胶原蛋白用途非常广泛，产品有各种不同形状及用途，遍及食品化工医药等多个领域，胶原蛋白正成为食品医药和化妆品行业中的新宠。要开发利用胶原产品就会涉及到胶原蛋白的分离纯化工作。只有从原料中提取到比较纯的胶原才能进行后续研究，提取工作是基础。目前为止，提取胶原蛋白通常有四种方法：即酸法、盐法、酶法、以及热水浸提法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白颜色较白、无鱼腥味，产品纯度高，松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，适合于做药物载体的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白，胶原蛋白颜色较白、无鱼腥味、产品纯度高，松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发。
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，包括预处理、酸提取、酶提取，其具体步骤为：
预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:7-9加入浓度为0.8-1.3‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.4-0.6%活性炭，在超声波功率为150-200W、温度为2-5℃下超声波浸泡2-4h，水洗至中性，最后按料液比为1:20-24向鱿鱼皮中加入浓度为8-12%的异丙醇溶液，在温度为2-5℃浸泡脱脂10-15h，用蒸馏水洗净沥干，备用，鱿鱼皮胶原蛋白在提取前，因其中含有很多杂蛋白及脂肪，所以要先进行前处理，来去除这些杂蛋白、脂肪及色素等，可减少此类物质对胶原蛋白的影响，该步骤可以去除鱼皮上的杂蛋白、脂肪及色素等，采用活性炭和超声波结合进行脱色，超声波具有强烈的分散作用和空化效应，使得活性炭能和鱼皮充分接触，能使活性炭快速吸附色素，能显著提高活性炭和鱿鱼皮的反应效果，提高活性炭的利用率；
酸提取：按料液比为1:15-18向预处理的鱿鱼皮中加入浓度为0.4-0.6M醋酸溶液，转速为130-170r/min下搅拌浸提5-7h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.1-0.3M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白，该胶原蛋白保留了胶原蛋白的三螺旋结构，为胶原蛋白作为生物医学材料的应用奠定了可靠的基础，同时可以提高胶原蛋白的提取率；
酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量4-6%的中性蛋白酶，按1:12-16的料液比加入蒸馏水，调pH为6.5-7.5，在45-55℃下酶解50-60min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.1-0.3M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，鱿鱼皮胶原蛋白主要为酶溶性的，用蛋白酶将胶原蛋白分子的非螺旋区域切断后，胶原的三螺旋主区域很容易溶于提取液中，并且蛋白酶不会对胶原蛋白的三螺旋结构产生影响，其提取量很大，且其结构和酸法提取的胶原蛋白结构一样，该胶原蛋白颜色较白、无鱼腥味，松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发。
作为优选，预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在70-90℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在100-120℃下干燥，按料液比为1:4-6将活性碳加入到浓度为0.02-0.05mol/L的KMnO4溶液中，再加入KMnO4重量0.33-0.45%的樟脑磺酸，在20-30℃搅拌5-8h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03-0.05，该樟脑磺酸的加入一方面可增强活性炭表面的极性和亲水性，使得KMnO4与活性炭的接触面积增加，提高KMnO4氧化改性活性炭的速率和均匀性，另一方面樟脑磺酸的短时间灼烧可使活性炭闭塞的孔径打开，改善孔径比例，进一步提高活性炭的吸附性能，使得胶原蛋白较白，且能去除鱼腥味；经过KMnO4氧化改性后的活性炭，其表面的酸性含氧官能团增加，而这些官能团能与鱿鱼皮中的色素发生络合作用，增加了对色素的吸附量；同时二氧化锰也负载在活性炭表面，增强了其吸附能力，表现为良好的脱色性能与吸附性能，能够降低活性炭的用量，缩短脱色时长，同时能除去鱼腥味，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼皮胶原蛋白无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明胶原蛋白颜色较白、无鱼腥味、产品纯度高，松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发；2）该胶原蛋白制备方法简单，易于工业化生产，安全性更高，胶原蛋白的提取率高，大大提高了鱿鱼皮的附加值，市场发展潜力大；3）本发明脱色使用的活性炭具有良好的脱色性能与吸附性能，能够降低活性炭的用量，缩短脱色时长，同时能除去鱼腥味，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼皮胶原蛋白无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白。
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，包括预处理、酸提取、酶提取，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:9加入浓度为0.8‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.6%活性炭，在超声波功率为150W、温度为5℃下超声波浸泡2h，水洗至中性，最后按料液比为1:24向鱿鱼皮中加入浓度为8%的异丙醇溶液，在温度为5℃浸泡脱脂10h，用蒸馏水洗净沥干，备用；
2）酸提取：按料液比为1:18向预处理的鱿鱼皮中加入浓度为0.4M醋酸溶液，转速为170r/min下搅拌浸提5h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.3M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白；
3）酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量4%的中性蛋白酶，按1:16的料液比加入蒸馏水，调pH为6.5，在55℃下酶解50min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.3M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白。
上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在70℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在120℃下干燥，按料液比为1:4将活性碳加入到浓度为0.05mol/L的KMnO4溶液中，再加入KMnO4重量0.33%的樟脑磺酸，在30℃搅拌5h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.05。
实施例2：
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白。
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，包括预处理、酸提取、酶提取，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:7加入浓度为1.3‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.4%活性炭，在超声波功率为200W、温度为2℃下超声波浸泡4h，水洗至中性，最后按料液比为1:20向鱿鱼皮中加入浓度为12%的异丙醇溶液，在温度为2℃浸泡脱脂15h，用蒸馏水洗净沥干，备用；
2）酸提取：按料液比为1:15向预处理的鱿鱼皮中加入浓度为0.6M醋酸溶液，转速为130r/min下搅拌浸提7h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.1M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白；
3）酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量6%的中性蛋白酶，按1:12的料液比加入蒸馏水，调pH为7.5，在45℃下酶解60min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.1M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白。
上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在90℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在100℃下干燥，按料液比为1:6将活性碳加入到浓度为0.02mol/L的KMnO4溶液中，再加入KMnO4重量0.45%的樟脑磺酸，在20℃搅拌8h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03。
实施例3：
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白。
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，包括预处理、酸提取、酶提取，其具体步骤为：1）预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:8加入浓度为1.0‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.5%活性炭，在超声波功率为180W、温度为4℃下超声波浸泡3h，水洗至中性，最后按料液比为1:22向鱿鱼皮中加入浓度为10%的异丙醇溶液，在温度为4℃浸泡脱脂12h，用蒸馏水洗净沥干，备用；
2）酸提取：按料液比为1:16向预处理的鱿鱼皮中加入浓度为0.5M醋酸溶液，转速为150r/min下搅拌浸提6h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.2M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白；
3）酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量5%的中性蛋白酶，按1:14的料液比加入蒸馏水，调pH为7.0，在50℃下酶解55min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.2M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白。
上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在80℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在110℃下干燥，按料液比为1:5将活性碳加入到浓度为0.04mol/L的KMnO4溶液中，再加入KMnO4重量0.4%的樟脑磺酸，在25℃搅拌6h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.04。
实施例4：
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，该胶原蛋白为I型胶原蛋白。
从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，包括预处理、酸提取、酶提取，其具体步骤为：
1）预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，按料液比为1:8加入浓度为1.0‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.5%活性炭，在超声波功率为180W、温度为4℃下超声波浸泡3h，水洗至中性，最后按料液比为1:22向鱿鱼皮中加入浓度为10%的异丙醇溶液，在温度为4℃浸泡脱脂12h，用蒸馏水洗净沥干，备用；
2）酸提取：按料液比为1:16向预处理的鱿鱼皮中加入浓度为0.5M醋酸溶液，转速为150r/min下搅拌浸提6h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.2M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白；
3）酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量5%的中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量0.27%的聚六亚甲基胍，按1:14的料液比加入蒸馏水，调pH为7.0，在50℃下酶解55min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.2M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白，聚六亚甲基胍的加入可以促使中性蛋白酶能快速地找到胶原蛋白两端的端肽，进而切除，提高胶原蛋白的提取速率，且聚六亚甲基胍的加入可以适当提高胶原蛋白的热稳定性，具有意想不到的效果。
上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在80℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在110℃下干燥，按料液比为1:5将活性碳加入到浓度为0.04mol/L的KMnO4溶液中，再加入KMnO4重量0.4%的樟脑磺酸，在25℃搅拌6h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.04。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白，其特征在于：所述的胶原蛋白包括酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白，所述的胶原蛋白为I型胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的从鱿鱼皮中提取胶原蛋白，其特征在于：所述的胶原蛋白的制备方法包括以下步骤：
1）预处理：将鱿鱼皮经解冻，清水洗净，沥干，切碎后再组织捣碎，加入NaOH水溶液中超声波浸泡，水洗至中性，最后用异丙醇溶液浸泡脱脂，洗净沥干，备用；
2）酸提取：向预处理的鱿鱼皮中加入醋酸溶液，搅拌浸提，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心后沉淀水洗至中性，烘干备用，合并上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酸溶性胶原蛋白；
3）酶提取：向酸提取的沉淀中加入其重量4-6%的中性蛋白酶，按1:12-16的料液比加入蒸馏水，调pH为6.5-7.5，在45-55℃下酶解50-60min，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠盐析取沉淀，上清液继续用氯化钠进行二次盐析，两次沉淀合并后用0.1-0.3M醋酸溶解，透析，冷冻干燥即得酶溶性胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中NaOH水溶液的浓度为0.8-1.3‰，鱿鱼皮和NaOH水溶液的料液比为1:7-9，浸泡的超声波功率为150-200W、温度为2-5℃、时间为2-4h。
4.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中NaOH水溶液中含有0.4-0.6%活性炭，所述的活性炭为高锰酸钾改性活性炭。
5.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的活性炭的制备方法为：在70-90℃下用去离子水清洗活性炭，干燥，按料液比为1:4-6将活性碳加入到浓度为0.02-0.05mol/L的KMnO4溶液中，再加入樟脑磺酸，在20-30℃搅拌5-8h，水洗，干燥，即得活性炭。
6.根据权利要求5所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的樟脑磺酸的添加量为KMnO4重量的0.33-0.45%，所述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03-0.05。
7.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中异丙醇溶液的浓度为8-12%，鱿鱼皮和异丙醇溶液的料液比为1:20-24，浸泡脱脂温度为2-5℃、时间为10-15h。
8.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中鱿鱼皮和醋酸溶液的料液比为1:15-18，醋酸溶液的浓度为0.4-0.6M，搅拌浸提转速为130-170r/min、时间为5-7h。
9.根据权利要求2所述的从鱿鱼皮中提取的胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中中性蛋白酶的添加量为沉淀重量的4-6%，沉淀和蒸馏水的料液比为1:12-16，酶解pH为6.5-7.5、温度为45-55℃、时间为50-60min。
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