CN108060155A

CN108060155A - 从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶

Info

Publication number: CN108060155A
Application number: CN201711481380.5A
Authority: CN
Inventors: 杨艳
Original assignee: Zhoushan Fusheng Food Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Zhoushan Fusheng Food Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-05-22

Abstract

本发明公开了从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶是以鱿鱼内脏为原料得到的蛋白酶，可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品。蛋白酶的制备方法为：向鱿鱼内脏中加入NaOH水溶液超声波浸泡，水洗至中性后用异丙醇浸泡脱脂，备用；向预处理后的鱿鱼内脏中加入NaCl溶液，均质破碎，然后超声处理，取出后离心，上清液即为粗酶液；向粗酶液中加入硫酸铵，静置，离心，沉淀用Tris‑HCl缓冲溶液溶解，透析，浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶。有益效果为：本发明蛋白酶活性高、纯度高、无腥味、不含重金属镉，使用范围广。

Description

从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶

技术领域

本发明涉及鱼类产品深加工技术领域，尤其是涉及从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶。

背景技术

鱿鱼，虽然习惯上称它们为鱼，其实它并不是鱼，而是生活在海洋中的软体动物。鱿鱼属于软体动物门，头足纲，枪乌贼科，通称枪乌贼。体色苍白，体圆锥形，头大，有淡褐色斑，前方生有 10 条触足，常成群游弋于深约 20 米的海洋中。常活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米。肉质细嫩，风味类似于鲍鱼，但价格很低，被成为“穷人的鲍鱼”。西方人因为鱿鱼表皮暗且易变，而称鱿鱼为“魔鬼鱼”；西班牙人吃鱿鱼比较多，他们把鱿鱼加工成不同风味的罐头，鱿鱼酱油，鱿鱼圈等；美国人近几年来也开始提倡吃鱿鱼，他们把鱿鱼加工成类似鲍鱼的形态出售；鱿鱼在日本很受欢迎，已成为日本日常生活中必不可少的水产品，日本人把鱿鱼一般加工成冷冻制品、干制品、珍味制品、盐渍制品、加热杀菌制品。鱿鱼加工中产生的副产物，如皮、内脏、眼及墨囊等，都作为废弃物丢掉，不仅造成了环境污染，也不能提高鱿鱼加工的附加值。鱿鱼全身都是宝，鱿鱼内脏中含有促进草虾摄饵的氨基酸，粗脂肪（不饱和脂肪酸的含量很高），蛋白质（可用来生产鱿鱼酱油）；墨囊中的墨汁已被证实具有抗菌功能，还有抗肿瘤和增强免疫的功能。鱿鱼内脏是鱿鱼加工过程中产生的主要废弃物，占到鱿鱼湿重的15%，其含有丰富的脂肪、蛋白质等营养物质。脂肪约占内脏湿重的20-30%，蛋白质约占内脏湿重的20-25%，此外，鱿鱼内脏中还含有丰富的蛋白酶，可以作为提取蛋白酶的优质来源，这也加速了科研工作者对海洋动物内源性蛋白酶的研究，使得海洋动物蛋白酶的研究工作方兴未艾。

现有技术如授权公告号为CN102392010B的中国发明专利，公开了一种以鱿鱼内脏为原料提取得到的蛋白酶及其提取方法与应用。上述蛋白酶以新鲜或者冰冻的鱿鱼内脏为原料，鱿鱼内脏经破碎后，用水或食盐溶液进行提取，通过控制提取过程中食盐溶液浓度、固液比、温度、提取时间得到较高的蛋白酶回收率；然后通过等电点沉淀法和添加絮凝剂沉淀等方法去除杂蛋白，提高酶的纯度；最后经浓缩、添加稳定剂、防腐剂等成为液体鱿鱼内脏蛋白酶酶制剂；或者添加填料后经干燥、粉碎，得固体鱿鱼内脏蛋白酶制剂。本发明实现了对鱿鱼内脏的增值利用，提高渔业生产附加值，减少鱿鱼制品生产对环境的污染，而且制备得到的鱿鱼蛋白酶作为水解各种食品蛋白质的酶制剂，增加了商品蛋白酶的品种。但用该蛋白酶中含有重金属镉，极大限制了蛋白酶的使用范围，同时该蛋白酶中色素含量高，有腥味，不利于后续的蛋白酶的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白酶活性高、纯度高、无腥味、不含重金属镉、使用范围广的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶是以鱿鱼内脏为原料得到的蛋白酶，可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品。

从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，具体包括以下步骤为：

步骤1：将收集到的鱿鱼内脏去除鱿鱼墨囊、鱿鱼皮、鱿鱼眼等组织，保留肝脏、胰腺、肠等组织，剪成小片，按料液比为1:7-9(g/mL)向鱿鱼内脏中加入浓度为1.2-1.6‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.6-0.8%活性炭，在超声波功率为80-100W、温度为2-5℃下超声波浸泡3-5h，水洗至中性，最后按料液比为1:20-24向鱿鱼内脏中加入浓度为8-12%的异丙醇溶液，在温度为2-5℃浸泡脱脂10-15h，用蒸馏水洗净沥干，备用，鱿鱼内脏蛋白酶在提取前，因其中含有很多杂蛋白及脂肪，所以要先进行前处理，来去除这些杂蛋白、脂肪、色素、镉和腥味物质等，减少此类物质对蛋白酶的影响，该步骤采用活性炭和超声波结合进行脱色，超声波具有强烈的分散作用和空化效应，使得活性炭能和鱿鱼内脏充分接触，能使活性炭快速吸附色素、镉和腥味物质，能显著提高活性炭和鱿鱼内脏的反应效果，提高活性炭的利用率，简化后续纯化步骤，同时扩大内脏蛋白酶的用途；

步骤2：按料液比1:2-4(g/mL)向预处理后的鱿鱼内脏中加入浓度为0.2-0.3%的NaCl溶液，均质破碎1-3min，然后在超声波功率为80-100W、温度为30-40℃下超声处理20-40min以使鱿鱼内脏蛋白酶充分浸出，取出后经转速为6000-8000r/min、温度为2-5℃的高速冷冻离心机中离心15-25min，将上清液收集起来即为粗酶液，该步骤采用超声波辅助NaCl提取内脏蛋白酶，能有效的从内脏中提取出高活性的蛋白酶粗液，提取率高，操作简单、提取速度快且不会破坏提取物的成分，该浓度范围内的NaCl溶液能够使鱿鱼内脏中的蛋白酶充分溶解到提取液中，发生“盐溶”现象，利于蛋白酶的提取，同时NaCl对蛋白酶的构象的稳定作用，有助于维持内脏蛋白酶的活性，且该超声波功率的选择使得蛋白酶的活性能够保持最佳；

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为50-60%，在2-5℃条件下静置1-3h，然后在转速为6000-8000r/min、温度为2-5℃的高速冷冻离心机中离心15-25min，沉淀用pH为7-8的Tris-HCl缓冲溶液溶解，Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.18-0.23，然后在2-5℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌器下透析20-30h，期间更换蒸馏水3-5次，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶，蛋白酶分子中的亲水基团可通过氨键与水结合在其表面形成水化膜，同时亲水基团能解离使分子表面带上同种电荷，使蛋白酶分子相互排斥隔离开来分散于溶液中，硫酸铵在水中可全部电离成离子，与蛋白酶溶液中的相反电荷粒子结合中和了蛋白酶的电性，使蛋白酶凝聚而析出沉淀，不破坏蛋白酶的结构，提高蛋白酶的纯度，该蛋白酶可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品。

作为优选，步骤1中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在70-90℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在100-120℃下干燥，按料液比为1:4-6将活性碳加入到浓度为0.02-0.05mol/L的KMnO₄溶液中，再加入KMnO₄重量0.33-0.45%的樟脑磺酸，在20-30℃搅拌5-8h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03-0.05，该樟脑磺酸的加入一方面可增强活性炭表面的极性和亲水性，使得KMnO₄与活性炭的接触面积增加，提高KMnO₄氧化改性活性炭的速率和均匀性，另一方面樟脑磺酸的短时间灼烧可使活性炭闭塞的孔径打开，改善孔径比例，进一步提高活性炭的吸附性能，能够吸附鱿鱼内脏中的色素、镉和腥味物质，使得蛋白酶纯度高，降低内脏蛋白酶中重金属镉的含量；经过KMnO₄氧化改性后的活性炭，其表面的酸性含氧官能团增加，而这些官能团能与鱿鱼内脏中的色素和镉发生络合作用，增加了对色素和镉的吸附量；同时二氧化锰也负载在活性炭表面，增强了其吸附能力，表现为良好的脱色性能与吸附性能，能够降低活性炭的用量，缩短脱色时长，同时能除去镉和腥味物质，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼内脏蛋白酶无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明蛋白酶活性高、纯度高、无腥味、不含重金属镉，使用范围广，可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品；2）该蛋白酶的制备方法简单，提取速度快，易于工业化生产，安全性更高，不会破坏提取物的成分，鱿鱼内脏蛋白酶的提取率高，能除去蛋白酶中的重金属镉，大大提高了鱿鱼内脏的附加值，市场发展潜力大；3）本发明脱色使用的活性炭具有良好的脱色性能与吸附性能，能够降低活性炭的用量，缩短脱色时长，同时能除去鱼腥味，且该活性炭能循环利用，对鱿鱼内脏蛋白酶无不良影响，无环境污染，不腐蚀设备，经济适用，具有良好的前景，从环保的观点来看，改性活性炭是一种环境友好型的材料。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶是以鱿鱼内脏为原料得到的蛋白酶，可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品。

步骤1：将收集到的鱿鱼内脏去除鱿鱼墨囊、鱿鱼皮、鱿鱼眼等组织，保留肝脏、胰腺、肠等组织，剪成小片，按料液比为1:9(g/mL)向鱿鱼内脏中加入浓度为1.2‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.8%活性炭，在超声波功率为80W、温度为5℃下超声波浸泡3h，水洗至中性，最后按料液比为1:24向鱿鱼内脏中加入浓度为8%的异丙醇溶液，在温度为5℃浸泡脱脂10h，用蒸馏水洗净沥干，备用，上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在70℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在120℃下干燥，按料液比为1:4将活性碳加入到浓度为0.05mol/L的KMnO₄溶液中，再加入KMnO₄重量0.33%的樟脑磺酸，在30℃搅拌5h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.05；

步骤2：按料液比1:4(g/mL)向预处理后的鱿鱼内脏中加入浓度为0.2%的NaCl溶液，均质破碎3min，然后在超声波功率为80W、温度为40℃下超声处理20min以使鱿鱼内脏蛋白酶充分浸出，取出后经转速为8000r/min、温度为2℃的高速冷冻离心机中离心25min，将上清液收集起来即为粗酶液；

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为60%，在2℃条件下静置3h，然后在转速为8000r/min、温度为2℃的高速冷冻离心机中离心25min，沉淀用pH为7的Tris-HCl缓冲溶液溶解，Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.23，然后在2℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌器下透析30h，期间更换蒸馏水3次，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶。

实施例2：

步骤1：将收集到的鱿鱼内脏去除鱿鱼墨囊、鱿鱼皮、鱿鱼眼等组织，保留肝脏、胰腺、肠等组织，剪成小片，按料液比为1:7(g/mL)向鱿鱼内脏中加入浓度为1.6‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.6%活性炭，在超声波功率为100W、温度为2℃下超声波浸泡5h，水洗至中性，最后按料液比为1:20向鱿鱼内脏中加入浓度为8%的异丙醇溶液，在温度为5℃浸泡脱脂10h，用蒸馏水洗净沥干，备用，上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在90℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在100℃下干燥，按料液比为1:6将活性碳加入到浓度为0.02mol/L的KMnO₄溶液中，再加入KMnO₄重量0.45%的樟脑磺酸，在20℃搅拌8h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03；

步骤2：按料液比1:2(g/mL)向预处理后的鱿鱼内脏中加入浓度为0.3%的NaCl溶液，均质破碎1min，然后在超声波功率为100W、温度为30℃下超声处理40min以使鱿鱼内脏蛋白酶充分浸出，取出后经转速为6000-r/min、温度为5℃的高速冷冻离心机中离心15min，将上清液收集起来即为粗酶液；

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为50%，在5℃条件下静置1h，然后在转速为6000r/min、温度为5℃的高速冷冻离心机中离心15min，沉淀用pH为8的Tris-HCl缓冲溶液溶解，Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.18，然后在5℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌器下透析20h，期间更换蒸馏水5次，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶。

实施例3：

步骤1：将收集到的鱿鱼内脏去除鱿鱼墨囊、鱿鱼皮、鱿鱼眼等组织，保留肝脏、胰腺、肠等组织，剪成小片，按料液比为1:8(g/mL)向鱿鱼内脏中加入浓度为1.4‰的NaOH水溶液中，NaOH水溶液中含有0.7%活性炭，在超声波功率为90W、温度为4℃下超声波浸泡4h，水洗至中性，最后按料液比为1:22向鱿鱼内脏中加入浓度为10%的异丙醇溶液，在温度为4℃浸泡脱脂12h，用蒸馏水洗净沥干，备用，上述预处理步骤中活性炭为高锰酸钾改性活性炭，其制备方法为：在80℃下用去离子水清洗活性炭，除去细粉和污染物，然后在110℃下干燥，按料液比为1:5将活性碳加入到浓度为0.04mol/L的KMnO₄溶液中，再加入KMnO₄重量0.4%的樟脑磺酸，在25℃搅拌6h，然后水洗至滤液pH值恒定，干燥，即得活性炭。上述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.04；

步骤2：按料液比1:3(g/mL)向预处理后的鱿鱼内脏中加入浓度为0.25%的NaCl溶液，均质破碎2min，然后在超声波功率为90W、温度为35℃下超声处理30min以使鱿鱼内脏蛋白酶充分浸出，取出后经转速为7000r/min、温度为4℃的高速冷冻离心机中离心20min，将上清液收集起来即为粗酶液；

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为55%，在4℃条件下静置2h，然后在转速为7000r/min、温度为4℃的高速冷冻离心机中离心20min，沉淀用pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解，Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.2，然后在4℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌器下透析24h，期间更换蒸馏水4次，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶。

实施例4：

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为40%，再加入硫酸铵重量0.72-8.82‰的乙酰螺旋霉素，在4℃条件下静置2h，然后在转速为7000r/min、温度为4℃的高速冷冻离心机中离心20min，沉淀用pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解，Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.2，然后在4℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌器下透析24h，期间更换蒸馏水4次，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶，乙酰螺旋霉素会催化硫酸铵在水中快速电离成离子，进而会快速使得蛋白酶沉淀快速析出，减少已经絮凝的蛋白质对硫酸铵离子运动路线的阻碍作用，提高纯化的速率和纯度，同时可破坏蛋白质表面的水化膜，使蛋白质相互结合形成沉淀析出，从而使得蛋白酶在溶液中的溶解度降低而析出，可以降低硫酸铵的用量，最终提高蛋白酶的纯度。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶以鱿鱼内脏为原料提取得到的蛋白酶，所述蛋白酶可用于水解各种食品蛋白，获得风味鲜美水解蛋白类调味品。

2.要求1所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的制备方法具体包括以下步骤：

步骤1：将收集到的鱿鱼内脏去除鱿鱼墨囊、鱿鱼皮、鱿鱼眼等组织，保留肝脏、胰腺、肠等组织，剪成小片，向鱿鱼内脏中加入NaOH水溶液中，超声波浸泡，水洗至中性，最后加入异丙醇溶液浸泡脱脂，用蒸馏水洗净沥干，备用；

步骤2：向预处理后的鱿鱼内脏中加入NaCl溶液，均质破碎，然后超声处理，取出后离心，将上清液收集起来即为粗酶液；

步骤3：向粗酶液中加入硫酸铵，静置，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲溶液溶解，然后透析，最后将透析袋中的液体浓缩、低温干燥、粉碎，即得鱿鱼内脏蛋白酶。

3.权利要求2所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述步骤1中NaOH水溶液的浓度为1.2-1.6‰，鱿鱼内脏和NaOH水溶液的料液比为1:7-9(g/mL)，浸泡的超声波功率为80-100W、温度为2-5℃、时间为3-5h，所述NaOH水溶液中含有0.4-0.6%活性炭。

4.权利要求3所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述活性炭为高锰酸钾改性活性炭。

5.权利要求3所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述活性炭的制备方法为：在70-90℃下用去离子水清洗活性炭，干燥，按料液比为1:4-6将活性碳加入到浓度为0.02-0.05mol/L的KMnO₄溶液中，再加入樟脑磺酸，在20-30℃搅拌5-8h，水洗，干燥，即得活性炭。

6.权利要求5所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述樟脑磺酸的添加量为KMnO₄重量的0.33-0.45%，所述樟脑磺酸中L-樟脑磺酸和D-樟脑磺酸的重量比为1:0.03-0.05。

7.权利要求2所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述步骤2中NaCl溶液的浓度为0.2-0.3%，预处理后的鱿鱼内脏和NaCl溶液的料液比1:2-4(g/mL)，均质破碎1-3min，超声波处理功率为80-100W、温度为30-40℃、时间为20-40min。

8.权利要求1所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3中硫酸铵加至饱和度为50-60%，静置温度为2-5℃、时间为1-3h。

9.权利要求1所述的从鱿鱼内脏中提取的蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3中Tris-HCl缓冲溶液的pH为7-8，所述Tris-HCl缓冲溶液和原粗酶液的体积比为1:0.18-0.23，透析温度为2-5℃、时间为20-30h。