CN109722461A - 一种深海鱼胶原蛋白肽及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于胶原蛋白肽领域，公开了一种深海鱼胶原蛋白肽及其生产方法。所述深海鱼胶原蛋白肽的生产方法包括将深海鱼鱼皮碎粒依次采用NaOH溶液和HCl溶液浸泡处理，之后加水并利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液，加热处理，高效率复配酶制剂在不调节pH值且不控制温度的自然条件下酶解，无机纳滤陶瓷膜过滤去除不易溶解和易吸潮的成分，高温高压处理，浓缩以及干燥制粉。采用本发明提供的方法不需要调节酶解pH值、不需要控制酶解温度、酶解时间短、酶添加量少、酶解产物分子量低且集中，并且所制得的深海鱼胶原蛋白肽粉末水复溶性极佳并且储藏过程中不易吸潮结块。

Description

一种深海鱼胶原蛋白肽及其生产方法

技术领域

本发明属于胶原蛋白肽领域，特别涉及一种深海鱼胶原蛋白肽及其生产方法。

背景技术

胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，它是皮肤的主要组成部分，占皮肤真皮层80％的比重，它在皮肤中构成了一张细密的弹力网，牢固锁住水分，支撑着皮肤。胶原蛋白是由三条肽链拧成的螺旋纤维状蛋白质，也是人体内含量最丰富的蛋白质，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位，大约占人体总蛋白质的30％以上，它富含人体需要的脯氨酸、羟脯氨酸等胶原蛋白特征氨基酸，是人体细胞特别是肌肤细胞外基质中重要组成部分。胶原蛋白是大分子蛋白质，其分子量在300,000Da以上，不能被人体直接吸收。

胶原蛋白肽是胶原蛋白的水解产物，为介于氨基酸和大分子蛋白质之间的物质，两个以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。肽是精准的蛋白质片段，其分子只有纳米大小。现代研究表明，肽较蛋白质而言，更易于消化吸收、能迅速给机体提供能量、无蛋白质变性、低过敏性、良好的水溶性等特点，并具有多重生物活性功能。

CN102703555B公开了一种小分子鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，所述制备方法包括以鱼皮为原料，除去非胶原蛋白，经过脱脂、脱腥、磨碎等步骤，在酸性条件下对胶原蛋白加热水解处理，然后采用酶解法控制胶原蛋白的降解程度，采用膜分离法获得目标小分子胶原蛋白肽并对蛋白酶回收再利用，接着通过纳滤脱盐，活性炭结合树脂脱色脱腥后，利用喷雾干燥获得无色无味的小分子鱼皮胶原蛋白肽粉。其中，所述酶解包括依次进行的内切酶酶解和外切酶酶解，所述内切酶选自胶原蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，所述外切酶选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或中性蛋白酶。

CN108220377A公开了一种生产鱼皮胶原蛋白肽的方法，将鱼皮除杂清洗后干燥粉碎，用热水浸泡，再用柠檬酸溶液浸泡，清水洗至中性后加水加热，加入鱼皮质量8％的蛋白酶Alcalase2.4L，在温度55℃、pH值6.5～7.5下保持5小时，之后将温度升至90℃恒温10分钟，将酶解后的浆液用离心机除去固体残渣，所得清液用分子量为1000～8000Da的超滤膜去除少量大分子杂质，再用分子量为200Da的纳滤膜去除无机盐和小分子杂质并浓缩，喷雾干燥得到鱼皮胶原肽粉末。

然而，上述两件发明专利申请存在的问题和缺点为：采用的酶的酶解效率低，酶解时间长，酶添加量多，需要调节最适pH值和最适温度进行酶解，操作复杂，调节最适酶解pH值会带入大量无机离子，控制最适酶解温度能耗较大；需要采用超滤膜和纳滤膜两次膜过滤，其中，超滤膜所起的作用为截留大分子物质，纳滤膜所起的作用为脱盐浓缩，步骤繁琐，并且所用膜芯为有机材料，不耐酸碱、不耐高温高压、通量小、使用寿命短，清洗不方便；所制备的胶原蛋白肽粉末的水复溶性较差，储藏过程中容易吸潮。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不需要调节酶解pH值、不需要控制酶解温度、酶解产物分子量低且集中、膜过滤仅需一次且运行清洗方便、所制得胶原蛋白肽粉末水复溶性极佳并且储藏过程中不易吸潮结块的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法以及由该方法生产得到的深海鱼胶原蛋白肽。

具体地，本发明提供了一种深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，该方法包括以下步骤：

(1)原料前处理：将深海鱼鱼皮清洗除杂后剪切成碎粒，用3～4倍原料重的0.01～0.03MNaOH溶液在室温下浸泡10～15h，再用清水漂洗至pH值为中性，之后利用3～4倍原料重的0.01～0.03M HCl溶液在室温下浸泡1～3h，再用清水漂洗至pH值为中性，加入2～6倍原料体积的水，利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液；

(2)加热处理：将所述粗胶原蛋白溶液在80～100℃下加热20～40min，之后降温至50～55℃，得到变性胶原蛋白溶液；

(3)酶解：往所述变性胶原蛋白溶液中加入用量为原料重量0.05～0.15％的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节pH值、不控制温度的自然条件下酶解0.5～2h，得到胶原蛋白肽溶液；所述高效率复配酶制剂由30～40wt％复合蛋白酶、25～30wt％胰酶、25～30wt％碱性蛋白酶、7～8wt％动物蛋白水解酶和2～3wt％酶激活剂组成，所述酶激活剂含有还原剂和二价金属离子；

(4)无机纳滤陶瓷膜过滤：将所述胶原蛋白肽溶液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度胶原蛋白肽溶液；

(5)高温高压处理：将所述高纯度胶原蛋白肽溶液进行高温高压处理，得到处理液；

(6)浓缩：将所述处理液进行减压加热浓缩，得到浓缩液；

(7)干燥制粉：将所述浓缩液进行喷雾干燥，得到深海鱼胶原蛋白肽粉末。

进一步的，所述酶激活剂中还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。

进一步的，所述还原剂为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇。

进一步的，所述二价金属离子为Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的混合物。

进一步的，Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的摩尔比为(0.9～1.1):(0.9～1.1):1。

进一步的，所述剪切成碎粒后所得深海鱼鱼皮的平均粒径为1～5cm。

进一步的，所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。

进一步的，所述高温高压处理的条件包括温度为110～130℃，压力为0.1～0.3MPa，时间为5～20min。

进一步的，所述深海鱼选自带鱼、黄花鱼、鳕鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲸鱼、三文鱼、金枪鱼、海鲈、秋刀鱼、海鳗、鲅鱼、鲳鱼、鲮鱼、凤尾鱼和马面鱼中的至少一种。

此外，本发明还提供了由上述方法生产得到的深海鱼胶原蛋白肽。

本发明的关键手段是采用特定的原料前处理、加热处理以及特定的高效率复配酶制剂酶解。其中，将深海鱼鱼皮碎粒依次采用碱溶液和酸溶液浸泡不仅能够除杂，而且还能够使得胶原蛋白溶出，以更有利于后续的加热变性以及酶解。所述加热处理能够使得鱼皮胶原蛋白变性，使其更易于被酶解，提高酶解效率。所述高效率复配酶制剂由30～40wt％复合蛋白酶、25～30wt％胰酶、25～30wt％碱性蛋白酶、7～8wt％动物蛋白水解酶和2～3wt％酶激活剂(还原剂和二价金属离子的混合物)组成，这种特定的复配酶制剂协同配合非常有利于对鱼皮胶原蛋白进行酶解，能高效专一性酶解鱼皮胶原蛋白，而酶激活剂中所含有的还原剂和二价金属离子能够激活这几种蛋白酶的酶活力，将以上几种蛋白酶在还原剂和二价金属离子的作用下按照以上配比复配形成的酶制剂具有极强的胶原蛋白酶解效率。采用以上高效复配酶制剂对变性深海鱼胶原蛋白进行酶解，在不调节pH值、不控制温度的自然条件下，在添加少量蛋白酶的前提下即可实现彻底酶解胶原蛋白的目的，酶解产物分子量小且集中，酶解产物游离氨基酸含量低，分子量为1000Da以下的胶原蛋白肽比例达到了100％，介于200～1000Da的胶原蛋白肽比例达到了95％以上。

综上，本发明的有益效果如下：

(1)采用特定的原料前处理、加热处理和高效率复配酶制剂酶解的组合技术手段，显著提高了酶解胶原蛋白的酶解效率，使得在不调节最适pH值、不控制最适温度的自然条件下，添加少量蛋白酶，酶解较短时间，即可彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，酶解产物游离氨基酸含量低，分子量为1000Da以下的胶原蛋白肽比例达到100％，介于200～1000Da的胶原蛋白肽比例达到了95％以上。此外，在酶解过程中，不需要采用酸碱来调节最适酶解pH值，不带入无机离子，后续不需要再采取纳滤膜去除无机离子，简化工艺步骤；在酶解过程中，也不需要调节最适酶解温度，相比于现有技术，不仅操作简单而且节省能耗。

(2)在酶解之后采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，去除不易溶解的物质和易吸潮的糖类成分，提高最终得到的胶原蛋白肽成品的水复溶性，并且成品储藏过程中不易吸潮结块。无机纳滤陶瓷膜与有机纳滤膜相比，具有耐有机溶剂、耐高温、耐酸碱、机械强度高、通量大和寿命长的优势。本发明只需采用一次纳滤膜处理，比既需要采用超滤膜截留大分子物质、又需要采用纳滤膜脱盐浓缩的现有技术相比，显著简化了工艺步骤，并且膜处理的作用不同。

(3)在无机纳滤陶瓷膜过滤之后将所得胶原蛋白肽溶液采用高温高压处理，这样能够进一步提高最终得到的胶原蛋白肽成品的水复溶性，成品更细腻，极易溶于水。

具体实施方式

以下将详细描述本发明。

在本发明中，初始原料深海鱼可以为新鲜深海鱼，也可以为冷冻深海鱼经解冻后得到。所述深海鱼的具体实例包括但不限于：带鱼、黄花鱼、鳕鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲸鱼、三文鱼、金枪鱼、海鲈、秋刀鱼、海鳗、鲅鱼、鲳鱼、鲮鱼、凤尾鱼和马面鱼中的至少一种。

在本发明中，所述原料前处理的作用为去除杂蛋白和脂肪，并使得鱼皮肉质性状发生改变，得到粗胶原蛋白溶液。其中，所述剪切成碎粒后所得深海鱼鱼皮的平均粒径优选为1～5cm。所述胶体磨所起的作用为将漂洗处理后的鱼皮碎粒研磨成粒径更细小的粗胶原蛋白溶液。

在本发明中，所述加热处理的作用为使得胶原蛋白变性，经加热处理后更易于被酶解，能够提高酶解效率。

在本发明中，所述酶解在不调节pH值、不控制温度条件下进行。所述酶解之后，从深海鱼鱼皮中提取并酸碱处理以及加热变性后的胶原蛋白能够降解成游离氨基酸含量低、分子量为1000Da的胶原蛋白肽比例能够达到100％(介于200～1000Da的胶原蛋白肽比例能够达到95％以上)的酶解产物。其中，所述高效率复配酶制剂中所含的蛋白酶均可以通过市售获得。例如，所述复合蛋白酶可以为购自诺维信公司的复合蛋白酶。所述胰酶可以为购自广西南宁庞博生物工程有限公司的源自猪、牛胰腺天然提取所得的胰酶。所述碱性蛋白酶可以为购自广西南宁庞博生物工程有限公司的源自地衣芽孢杆菌发酵所得的碱性蛋白酶。所述动物蛋白水解酶可以为购自广西南宁庞博生物工程有限公司的源自复合酶的动物蛋白水解酶。

所述酶激活剂含有还原剂和二价金属离子。其中，所述还原剂优选为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇。所述二价金属离子优选选自Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺中的至少一种，更优选为Mg^{2 +}、Zn²⁺和Ca²⁺的混合物，最优选为Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺按照摩尔比(0.9～1.1):(0.9～1.1):1复配得到的混合物。所述二价金属离子可以以含有以上金属离子的盐的形式存在。特别优选地，所述酶激活剂由还原剂和二价金属离子以及能够与所述二价金属离子形成盐的阴离子组成。此外，所述酶激活剂中还原剂和二价金属离子的摩尔比特别优选为1:(0.5～2)。

在本发明中，所述陶瓷膜过滤的作用为去除不易溶解的成分和易吸潮的糖类成分，提高最终得到的胶原蛋白肽成品的水复溶性，并且成品储藏过程中不易吸潮结块。无机纳滤陶瓷膜与有机纳滤膜相比，具有耐有机溶剂、耐高温、耐酸碱、机械强度高、通量大和寿命长的优势。所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯优选采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。所述无机纳滤陶瓷膜的截留分子量为800Da，当截留分子量超过800Da时，去除不易溶解的成分和易吸潮的糖类成分不彻底，当截留分子量小于800Da时，胶原蛋白肽损失率高。

在本发明中，所述高温高压处理的作用为进一步提高最终得到的胶原蛋白肽成品的水复溶性，使得成品更细腻，极易溶解，并且高纯度胶原蛋白肽溶液经过高温高压处理后，也可以起到彻底灭菌和消除过敏性的作用。优选地，所述高温高压处理在温度不低于110℃、压力不低于0.1MPa的条件下进行；更优选地，所述高温高压处理的条件包括温度为110～130℃，压力为0.1～0.3MPa，时间为5～20min。在本发明中，所述压力均指表压。

在本发明中，所述减压加热浓缩的作用为将高温高压处理后的高纯度胶原蛋白肽中的水分部分或者全部去除。

在本发明中，所述干燥制粉的作用为将浓缩液加工成粉末。其中，所述喷雾干燥的温度可以为110～140℃。

此外，待喷雾干燥形成深海鱼胶原蛋白肽粉末之后，还可以将其进行包装，以便外售。

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例和对比例中，所述复合蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、动物蛋白水解酶的来源及生产企业如下表1所示：

表1

酶的名称	来源	生产企业
			复合蛋白酶	复合酶	诺维信公司
胰酶	猪、牛胰腺天然提取	广西南宁庞博生物工程有限公司
			碱性蛋白酶	地衣芽孢杆菌发酵	广西南宁庞博生物工程有限公司
动物蛋白水解酶	复合酶	广西南宁庞博生物工程有限公司

实施例1

(1)原料前处理：将深海鱼(带鱼)鱼皮除杂清洗后剪切成平均粒径为1μm的碎粒，用3倍原料重的0.02M NaOH溶液在室温下浸泡12h，再用清水漂洗至pH值为中性，之后利用3倍原料重的0.02M HCl溶液在室温下浸泡2h，再用清水漂洗至pH值为中性，加入4倍量体积的水，利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液。

(2)加热处理：将粗胶原蛋白溶液在90℃热水下加热30min，之后降温至50～55℃，得到变性胶原蛋白溶液。

(3)酶解：往所述变性胶原蛋白溶液中加入0.1％(w/w)原料重量的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节pH值、不控制温度的自然条件下酶解1h，制得胶原蛋白肽溶液。所述高效率复配酶制剂由如下质量百分含量的组分组成：复合蛋白酶30％、胰酶30％、碱性蛋白酶30％、动物蛋白水解酶7％和酶激活剂3％。所述酶激活剂由还原剂二硫苏糖醇和二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺复配组成，所述还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:0.5，所述二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的摩尔比为1:1:1。

(4)无机纳滤陶瓷膜过滤：将所述胶原蛋白肽溶液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜(滤芯采用硅质材料制作而成)进行过滤，所得透过液为高纯度胶原蛋白肽溶液。

(5)高温高压处理：将所述高纯度胶原蛋白肽溶液在温度为130℃、压力为0.1MPa的条件下处理10min，得到处理液。

(6)浓缩：将处理液进行减压加热浓缩，得到浓缩液。

(7)干燥制粉及包装：将浓缩液进行喷雾干燥制粉，包装后得深海鱼胶原蛋白肽成品。

实施例2

(1)原料前处理：将深海鱼(三文鱼)鱼皮除杂清洗后剪切成平均粒径为3μm的碎粒，用3.5倍原料重的0.02M NaOH溶液在室温下浸泡12h，再用清水漂洗至pH值为中性，之后利用3.5倍原料重的0.02M HCl溶液在室温下浸泡2h，再用清水漂洗至pH值为中性，加入4倍量体积的水，利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液。

(2)加热处理：将粗胶原蛋白溶液在90℃热水下加热30min，之后降温至50～55℃，得到变性胶原蛋白溶液。

(3)酶解：往所述变性胶原蛋白溶液中加入0.1％(w/w)原料重量的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节pH值、不控制温度的自然条件下酶解1h，制得胶原蛋白肽溶液。所述高效率复配酶制剂由如下质量百分含量的组分组成：复合蛋白酶35％、胰酶27.5％、碱性蛋白酶27.5％、动物蛋白水解酶7.5％和酶激活剂2.5％。所述酶激活剂由还原剂二硫苏糖醇、β-巯基乙醇以及二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺组成，所述还原剂中二硫苏糖醇和β-巯基乙醇的摩尔比为1:1，所述还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:1，所述二价金属离子Mg^{2 +}、Zn²⁺和Ca²⁺的摩尔比为1:1:1。

(4)无机纳滤陶瓷膜过滤：将所述胶原蛋白肽溶液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜(滤芯采用铝质材料制作而成)进行过滤，所得透过液为高纯度胶原蛋白肽溶液。

(5)高温高压处理：将所述高纯度胶原蛋白肽溶液在温度为120℃、压力为0.2MPa的条件下处理10min，得到处理液。

(6)浓缩：将处理液进行减压加热浓缩，得到浓缩液。

(7)干燥制粉及包装：将浓缩液进行喷雾干燥制粉，包装后得深海鱼胶原蛋白肽成品。

实施例3

(1)原料前处理：将深海鱼(鳕鱼)鱼皮除杂清洗后剪切成平均粒径为5μm的碎粒，用4倍原料重的0.02M NaOH溶液在室温下浸泡12h，再用清水漂洗至pH值为中性，之后利用4倍原料重的0.02M HCl溶液在室温下浸泡2h，再用清水漂洗至pH值为中性，加入4倍量体积的水，利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液。

(2)加热处理：将粗胶原蛋白溶液在90℃热水下加热30min，之后降温至50～55℃，得到变性胶原蛋白溶液。

(3)酶解：往所述变性胶原蛋白溶液中加入0.1％(w/w)原料重量的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节pH值、不控制温度的自然条件下酶解1h，制得胶原蛋白肽溶液。所述高效率复配酶制剂由如下质量百分含量的组分组成：复合蛋白酶40％、碱性蛋白酶25％、胰酶25％、动物蛋白水解酶8％和酶激活剂2％。所述酶激活剂由还原剂β-巯基乙醇和二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺组成，所述还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:2，所述二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的摩尔比为1:1:1。

(4)无机纳滤陶瓷膜过滤：将所述胶原蛋白肽溶液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜(滤芯采用镁质材料制作而成)进行过滤，所得透过液为高纯度胶原蛋白肽溶液。

(5)高温高压处理：将所述高纯度胶原蛋白肽溶液在温度为130℃、压力为0.3MPa的条件下处理5min，得到处理液。

(6)浓缩：将处理液进行减压加热浓缩，得到浓缩液。

(7)干燥制粉及包装：将浓缩液进行喷雾干燥制粉，包装后得深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例1

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，将高效率复配酶制剂中的复合蛋白酶采用相同重量百分含量的动物蛋白水解酶替代，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例2

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，将高效率复配酶制剂中的胰酶采用相同重量百分含量的动物蛋白水解酶替代，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例3

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，将高效率复配酶制剂中的碱性蛋白酶采用相同重量百分含量的动物蛋白水解酶替代，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例4

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，将高效率复配酶制剂中的动物蛋白水解酶采用相同重量百分含量的碱性蛋白酶替代，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例5

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，高效率复配酶制剂中所含的酶激活剂完全由二价金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺按照摩尔比为1:1:1复配组成，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例6

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，高效率复配酶制剂中所含的酶激活剂完全由二硫苏糖醇组成，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

对比例7

按照实施例1的方法生产深海鱼胶原蛋白肽，不同的是，在酶解过程中，将高效率复配酶制剂中所含的酶激活剂采用相同重量百分含量的动物蛋白水解酶替代，其余与实施例1相同，得到参比深海鱼胶原蛋白肽成品。

测试例

(1)高效率复配酶制剂酶解效果检测：

实施例1～3以及对比例1～7中，深海鱼鱼皮经过原料前处理、加热处理后，利用高效率复配酶制剂在不调节pH值、不控制温度条件下进行酶解，为了评估酶解效果，酶解结束后，采用《中华人民共和国国家标准GB/T 22729-2008》附录A中的方法进行酶解产物检测，结果如下表2所示：

表2

由表2的结果可知，实施例1～3的酶解产物分子量小且集中，酶解产物游离氨基酸含量低(小于200Da的比例小于5％)，分子量小于1000Da的胶原蛋白肽比例达到了100％，介于200～1000Da的胶原蛋白肽比例达到了95％以上，酶解产物分子量明显优于对比例1～7。由此可以说明，采用本发明提供的特定原料前处理、加热处理和高效率复配酶制剂酶解的组合技术手段，能够显著提高酶解胶原蛋白的酶解效率，使得在不调节最适pH值、不控制最适温度的自然条件下，添加少量蛋白酶，酶解较短时间，即可彻底酶解胶原蛋白。

(2)深海鱼胶原蛋白肽成品理化指标检测：

对实施例1～3获得的深海鱼胶原蛋白肽成品粉末进行理化指标检测，其中，羟脯氨酸检测方法参照GB/T 9695.23进行，总氮检测方法参照GB 5009.5进行，灰分检测方法参照GB 5009.4进行，结果如下表3所示：

表3

由表3的结果可知，实施例1～3获得的深海鱼胶原蛋白肽成品的羟脯氨酸、总氮、灰分指标均显著优于《食品安全国家标准胶原蛋白肽GB 31645-2018》的要求，说明采用本发明提供的方法所得深海鱼胶原蛋白肽纯度高，品质好，尤其是灰分含量只有0.6～0.9g/100g。由此可以说明，利用本发明这种特定的高效率复配酶制剂在不调节pH值条件下进行酶解，不需要用酸碱调节pH值，从而在生产过程不会引入无机离子，可大幅度减少成品灰分含量。

(3)深海鱼胶原蛋白肽成品的水复溶性和深海鱼胶原蛋白肽溶液的透光率检测：

分别将实施例1～3获得的深海鱼胶原蛋白肽成品粉末8g倒入不同杯中，用300mL60℃左右温开水冲调，1s时间内即全部溶解，得到深海鱼胶原蛋白肽溶解液，肉眼观察溶解液澄清透明、无任何沉淀。使用紫外分光光度计在620nm下检测以上几种深海鱼胶原蛋白肽溶解液的透光率，结果如下表4所示：

表4

项目	透光率(％)
		实施例1	96
实施例2	95
		实施例3	95

由表4的结果可知，采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，去除不易溶解的物质，再采用肽溶液的高温高压处理的技术手段，进一步提高了成品的溶解性能，使得获得的深海鱼胶原蛋白肽成品极易溶于水、水复溶性极佳，溶于水后的溶解液澄清透明、无任何沉淀、透光率高，消费者冲泡此产品时，不需搅拌，食用方便、食用体验佳，是现有技术达不到的技术效果。

(4)深海鱼胶原蛋白肽成品的货架期试验：

分别将实施例1～3获得的深海鱼胶原蛋白肽成品粉末8g倒入包装袋中，室温敞口放置于室内展架上，肉眼观察成品出现结块的时间，结果如下表5所示：

表5

项目	出现结块的时间(天)
		实施例1	56
实施例2	52
		实施例3	57

现有技术生产的胶原蛋白肽在贮藏过程中，容易吸潮结块，影响产品的销售。由表5的结果可知，本发明采用无机纳滤陶瓷膜过滤的技术手段，可以去除易吸潮的糖类成分，使得成品储藏过程中不易吸潮结块，易于储藏，是现有技术达不到的技术效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)原料前处理：将深海鱼鱼皮清洗除杂后剪切成碎粒，用3～4倍原料重的0.01～0.03M NaOH溶液在室温下浸泡10～15h，再用清水漂洗至pH值为中性，之后利用3～4倍原料重的0.01～0.03M HCl溶液在室温下浸泡1～3h，再用清水漂洗至pH值为中性，加入2～6倍原料体积的水，利用胶体磨制备成粗胶原蛋白溶液；

(2)加热处理：将所述粗胶原蛋白溶液在80～100℃下加热20～40min，之后降温至50～55℃，得到变性胶原蛋白溶液；

(3)酶解：往所述变性胶原蛋白溶液中加入用量为原料重量0.05～0.15％的高效率复配酶制剂，混合均匀后在不调节pH值、不控制温度的自然条件下酶解0.5～2h，得到胶原蛋白肽溶液；所述高效率复配酶制剂由30～40wt％复合蛋白酶、25～30wt％胰酶、25～30wt％碱性蛋白酶、7～8wt％动物蛋白水解酶和2～3wt％酶激活剂组成，所述酶激活剂含有还原剂和二价金属离子；

(4)无机纳滤陶瓷膜过滤：将所述胶原蛋白肽溶液采用截留分子量为800Da的无机纳滤陶瓷膜进行过滤，所得透过液为高纯度胶原蛋白肽溶液；

(5)高温高压处理：将所述高纯度胶原蛋白肽溶液进行高温高压处理，得到处理液；

(6)浓缩：将所述处理液进行减压加热浓缩，得到浓缩液；

(7)干燥制粉：将所述浓缩液进行喷雾干燥，得到深海鱼胶原蛋白肽粉末。

2.根据权利要求1所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述酶激活剂中还原剂和二价金属离子的摩尔比为1:(0.5～2)。

3.根据权利要求1所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇和/或β-巯基乙醇。

4.根据权利要求1所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述二价金属离子为Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的混合物。

5.根据权利要求4所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺的摩尔比为(0.9～1.1):(0.9～1.1):1。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述剪切成碎粒后所得深海鱼鱼皮的平均粒径为1～5cm。

7.根据权利要求1～5中任意一项所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述无机纳滤陶瓷膜的滤芯采用硅质、铝质、镁质、硅铝质和硅镁质中的任意一种材料制作而成。

8.根据权利要求1～5中任意一项所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述高温高压处理的条件包括温度为110～130℃，压力为0.1～0.3MPa，时间为5～20min。

9.根据权利要求1～5任一项所述的深海鱼胶原蛋白肽的生产方法，其特征在于，所述深海鱼选自带鱼、黄花鱼、鳕鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲸鱼、三文鱼、金枪鱼、海鲈、秋刀鱼、海鳗、鲅鱼、鲳鱼、鲮鱼、凤尾鱼和马面鱼中的至少一种。

10.由权利要求1～9中任意一项所述的方法生产得到的深海鱼胶原蛋白肽。