CN102690370B - 一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产动物加工副产物来源的海洋活性物质制备领域，目的在于提供一种简便、快速、提取率高的海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺。本发明包括原料处理、鱼骨粉碎、硫酸软骨素提取、滤液酶解除蛋白、高温灭酶活、硫酸软骨素沉淀、滤渣去除脂肪、胶原蛋白提取、胶原蛋白盐析、胶原蛋白收集和胶原蛋白透析和冻干等工艺步骤。本发明简便、快速、提取率高，达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的。
Description
技术领域
本发明涉及水产动物加工副产物来源的海洋活性物质制备领域，特别涉及一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺。
背景技术
硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate, CS）是一类糖胺聚糖，它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3糖苷键结合的双糖为基本单位聚合而成的大分子多糖。CS资源丰富，广泛存在于人和动物的骨骼、软骨、肌腱、韧带等组织中。CS作为一种药物，主要用来治疗关节炎和冠心病，对神经痛、偏头痛、动脉粥样硬化等也有一定疗效。硫酸软骨素传统上主要从猪、牛、羊等畜类软骨组织中提取获得，来源和工艺较为单一。
胶原蛋白是动物来源最丰富的蛋白，大概占动物总蛋白的30%。广泛存在于脊椎动物的皮、骨、软骨、韧带、肌腱、血管、牙齿、角膜及其它器官。胶原蛋白在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病（BSE）、传染性海绵状脑病（TSE） 和口蹄疫（FMD）的爆发使得人们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生恐慌。另外，由于宗教因素，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制。因此寻找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。
水产品加工副产物约有30%为鱼皮和鱼骨，其中鱼骨含有较为丰富的胶原蛋白和硫酸软骨素，利用这些副产物来提取胶原蛋白和硫酸软骨素， 不仅能提高水产品的附加值，充分有效地利用生物资源，而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。
CN1563098A的发明公开了一种制备硫酸软骨素的方法，该方法包括以下步骤：A、将卡拉胶分解为分子量为1-4万，优选2-3万的卡拉胶寡糖；B、将鱿鱼骨用15%到饱和的强碱液处理，然后用酸中和，收集胶体；C、将步骤A制得的卡拉胶寡糖、步骤B制得的胶体和氨基葡萄糖在酸性条件下反应，再纯化，获得硫酸软骨素。该方法利用海洋鱼类加工副产物鱼骨（鱿鱼骨）单一地提取硫酸软骨素，但未综合利用海洋鱼类鱼骨，并且硫酸软骨素提取效率不高，工艺较为复杂。因此，开发综合利用海洋鱼类鱼骨的工艺显得非常迫切。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，提供一种简便、快速、提取率高的海洋鱼类鱼骨综合利用工艺，达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，所述的综合利用工艺包括如下步骤：
（1）原料处理：将新鲜海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净，在40-50℃热水中清洗干净；用40-50℃热水清洗便于清洗鱼骨表面的脂肪；
（2）鱼骨粉碎：在步骤（1）处理得到的鱼骨中加入NaOH溶液，同时加入NaCl溶液，用粉碎机将鱼骨粉碎，形成粉碎液；加入NaOH溶液用于水解硫酸软骨素，加入氯化钠，以使硫酸软骨素等糖胺聚糖与蛋白分离；鱼骨粉碎能更好、更高效地提取硫酸软骨素，鱼骨粉碎标准在20-30目；
（3）硫酸软骨素提取：将步骤（2）处理得到的粉碎液，在50-58℃下搅拌浸提6-8 h，过滤，所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤，合并两次过滤的滤液得浸提滤液，同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白；搅拌浸提，这样更利于硫酸软骨素的提取，提高提取率，进行二次提取，使得鱼骨能够充分的提取利用，提高硫酸软骨素产率，增加经济效益；50-58℃下提取，温度过高会破坏硫酸软骨素和胶原蛋白的结构，温度过低提取效率太低；
（4）滤液酶解除蛋白：将步骤（3）所得浸提滤液用3-4 mol/L的盐酸调pH至7.0-7.5，加入浸提滤液重量0.5%-1%的中性蛋白酶，在45-55℃下保温搅拌2-3 h得酶解液；控制pH至7.0-7.5，适合酶解，提高硫酸软骨素的纯度和产率；0.5%-1%的中性蛋白酶酶解，能去除混合在硫酸软骨素中的杂蛋白，得到较高纯度的硫酸软骨素；
（5）高温灭酶活：将步骤（4）所得酶解液加热至95-100℃，保温5-10 min灭酶活；
（6）硫酸软骨素沉淀：搅拌条件下向步骤（5）处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系中乙醇体积分数为60-65%，在0-4℃静置18-24 h，离心15-20 min收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品；
（7）滤渣去除脂肪：向步骤（3）第二次过滤得到的滤渣以重量比1:20-30的比例加入质量浓度10%-15%的丁醇溶液，搅拌条件下浸泡18-24 h，浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇；搅拌条件下浸泡有利于脂肪的溶出，以去除脂肪，去除脂肪利于胶原蛋白提取，提高胶原蛋白的产率；
（8）胶原蛋白提取：向步骤（7）处理所得滤渣以重量比1:10-15的比例加入蒸馏水，调节pH至7.0-7.5，加入滤渣重量1%-2%的中性蛋白酶，在45-55℃下保温搅拌4-5 h得酶解液，然后将酶解液加热至95-100℃保温5-10min灭酶活；
（9）胶原蛋白盐析：将步骤（8）处理得到的酶解液在温度0-4℃下离心15-20 min，收集上清液，向上清液中缓慢加入NaCl盐析，在温度0-4℃下，搅拌过夜得盐析液；加入NaCl盐析NaCl要研磨粉碎后加入，这样盐析效果好，NaCl的粒度在100-200目；搅拌过夜，指搅拌时间在12小时以上；
（10）胶原蛋白收集：将步骤（9）处理得到的盐析液在0-4℃下离心15-20 min，去除上清液，所得沉淀物为胶原蛋白粗品；
（11）胶原蛋白透析和冻干：向步骤（10）所得胶原蛋白粗品中加入浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶，然后先使用浓度0.1-0.2 mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析24-36 h，再使用蒸馏水作为透析外液透析24-36 h，冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。加入浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶，浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液加入量为溶解胶原蛋白粗品的量为标准，复溶目的是为了进一步除去小分子杂蛋白，提高胶原蛋白提取的纯度。透析外液每4小时更换一次，透析效果更好。
本发明能够简便、快速、高效的从海洋鱼类鱼骨中提取活性物质，达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的，提高了鱼骨的利用效益，增加了经济效益。
作为优选，步骤（1）所述的海洋鱼类鱼骨选自A或B方案：
A、海洋软骨鱼的鱼骨：鲨科、鳐科、魟科、鲼科和银鲛科鱼类的鱼骨中的一种；
B、部分含有软骨的硬骨鱼类的鱼骨：鮟鱇鱼、鳗鱼中的一种。
本发明鱼骨的原料优选鮟鱇鱼、鲨科鱼类、魟科鱼类的鱼骨中的一种。鲨科、鳐科、魟科、鲼科和银鲛科鱼类，如姥鲨（鲨科）、华鳐（鳐科）、中国魟（魟科）、鸢鲼（鲼科）、黑线银鲛（银鲛科）。
作为优选，步骤（2）中所述的NaOH溶液加入量为步骤（1）处理得到的鱼骨重量的10%-15%，NaOH溶液的浓度为0.5-1.0 mol/L。控制NaOH溶液的加入量和浓度，以利于硫酸软骨素的提取，提高提取率。
作为优选，步骤（2）中所述的NaCl溶液加入量为步骤（1）处理得到的鱼骨重量的200%-300%，NaCl溶液的质量浓度为10%-15%。
作为优选，步骤（3）中所述的过滤采用150-200目的滤布过滤。
作为优选，步骤（9）中NaCl的加入量为至上清液中NaCl的浓度为0.8-1.2mol/L。控制NaCl的浓度为0.8-1.2mol/L，盐析效果好，利于胶原蛋白的提取。
作为优选，步骤（6）所述的离心的离心力为6000-8000×g。利于分离。
作为优选，步骤（9）所述的离心的离心力为3000-4000×g。利于分离。
作为优选，步骤（10）所述的离心的离心力为5000-6000×g。利于分离。
本发明的有益效果是： 能够简便、快速、高效的从海洋鱼类鱼骨中提取活性物质，达到硫酸软骨素和胶原蛋白联产目的，提高了鱼骨的利用效益，增加了经济效益。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
（1）原料处理：将新鲜鮟鱇鱼鱼骨上的残肉剔净，在40℃热水中清洗干净；
（2）鱼骨粉碎：在步骤（1）处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量15%的NaOH溶液，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，同时加入鱼骨重量200%的NaCl溶液，NaCl溶液的质量浓度为15%；用粉碎机将鱼骨粉碎，形成粉碎液；
（3）硫酸软骨素提取：将步骤（2）处理得到的粉碎液，在50℃下搅拌浸提8 h，150目的滤布过滤，所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤，合并两次过滤的滤液得浸提滤液，同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白；
（4）滤液酶解除蛋白：将步骤（3）所得浸提滤液用3mol/L的盐酸调pH至7.0，加入浸提滤液重量1%的中性蛋白酶，在45℃下保温搅拌3 h得酶解液；
（5）高温灭酶活：将步骤（4）所得酶解液加热至95℃，保温10 min灭酶活；
（6）硫酸软骨素沉淀：搅拌条件下向步骤（5）处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系中乙醇体积分数为60%，在0℃静置18h，在离心力为6000×g下，离心20 min收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品；
（7）滤渣去除脂肪：向步骤（3）第二次过滤得到的滤渣以重量比1:20的比例加入质量浓度15%的丁醇溶液，搅拌条件下浸泡18h，浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇；
（8）胶原蛋白提取：向步骤（7）处理所得滤渣以重量比1:10的比例加入蒸馏水，调节pH至7.0，加入滤渣重量2%的中性蛋白酶，在45℃下保温搅拌5 h得酶解液，然后将酶解液加热至95℃保温10min灭酶活；
（9）胶原蛋白盐析：将步骤（8）处理得到的酶解液在温度0℃下，离心力为4000×g下离心15 min，收集上清液，向上清液中缓慢加入NaCl盐析，NaCl的加入量为至上清液中NaCl的浓度为0.8mol/L，在温度4℃下，搅拌过夜得盐析液；
（10）胶原蛋白收集：将步骤（9）处理得到的盐析液在0℃下，离心力为6000×g下离心15 min，去除上清液，所得沉淀物为胶原蛋白粗品；
（11）胶原蛋白透析和冻干：向步骤（10）所得胶原蛋白粗品中加入浓度0.3 mol/L 的醋酸溶液复溶，然后先使用浓度0.1mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析36 h，再使用蒸馏水作为透析外液透析24h，冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。
实施例2
（1）原料处理：将新鲜鳐鱼鱼骨上的残肉剔净，在50℃热水中清洗干净；
（2）鱼骨粉碎：在步骤（1）处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量10%的NaOH溶液，NaOH溶液的浓度为1.0 mol/L，同时加入鱼骨重量300%的NaCl溶液，NaCl溶液的质量浓度为10%；用粉碎机将鱼骨粉碎，形成粉碎液；
（3）硫酸软骨素提取：将步骤（2）处理得到的粉碎液，在58℃下搅拌浸提6h，200目的滤布过滤，所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤，合并两次过滤的滤液得浸提滤液，同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白；
（4）滤液酶解除蛋白：将步骤（3）所得浸提滤液用4 mol/L的盐酸调pH至7.5，加入浸提滤液重量0.5%的中性蛋白酶，在55℃下保温搅拌2h得酶解液；
（5）高温灭酶活：将步骤（4）所得酶解液加热至100℃，保温5min灭酶活；
（6）硫酸软骨素沉淀：搅拌条件下向步骤（5）处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系中乙醇体积分数为65%，在4℃静置24 h，在离心力为8000×g下，离心15 min收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品；
（7）滤渣去除脂肪：向步骤（3）第二次过滤得到的滤渣以重量比1:30的比例加入质量浓度10%的丁醇溶液，搅拌条件下浸泡24 h，浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇；
（8）胶原蛋白提取：向步骤（7）处理所得滤渣以重量比1:15的比例加入蒸馏水，调节pH至7.5，加入滤渣重量1%的中性蛋白酶，在55℃下保温搅拌4h得酶解液，然后将酶解液加热至100℃保温5min灭酶活；
（9）胶原蛋白盐析：将步骤（8）处理得到的酶解液在温度4℃下，离心力为3000×g下离心20 min，收集上清液，向上清液中缓慢加入NaCl盐析，NaCl的加入量为至上清液中NaCl的浓度为1.2mol/L，在温度0℃下，搅拌过夜得盐析液；
（10）胶原蛋白收集：将步骤（9）处理得到的盐析液在4℃下，离心力为5000×g下离心20 min，去除上清液，所得沉淀物为胶原蛋白粗品；
（11）胶原蛋白透析和冻干：向步骤（10）所得胶原蛋白粗品中加入浓度0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶，然后先使用浓度0.2 mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析24h，再使用蒸馏水作为透析外液透析36 h，冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。
实施例3
（1）原料处理：将新鲜中国魟鱼骨上的残肉剔净，在45℃热水中清洗干净；
（2）鱼骨粉碎：在步骤（1）处理得到的鱼骨中加入占鱼骨重量12%的NaOH溶液，NaOH溶液的浓度为0.8 mol/L，同时加入鱼骨重量250%的NaCl溶液，NaCl溶液的质量浓度为12%；用粉碎机将鱼骨粉碎，形成粉碎液；
（3）硫酸软骨素提取：将步骤（2）处理得到的粉碎液，在55℃下搅拌浸提7 h，180目的滤布过滤，所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤，合并两次过滤的滤液得浸提滤液，同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白；
（4）滤液酶解除蛋白：将步骤（3）所得浸提滤液用3.5 mol/L的盐酸调pH至7.2，加入浸提滤液重量0.8%的中性蛋白酶，在50℃下保温搅拌2.5 h得酶解液；
（5）高温灭酶活：将步骤（4）所得酶解液加热至100℃，保温8 min灭酶活；
（6）硫酸软骨素沉淀：搅拌条件下向步骤（5）处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系中乙醇体积分数为62%，在2℃静置20 h，在离心力为7000×g下，离心18 min收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品；
（7）滤渣去除脂肪：向步骤（3）第二次过滤得到的滤渣以重量比1:25的比例加入质量浓度12%的丁醇溶液，搅拌条件下浸泡20 h，浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇；
（8）胶原蛋白提取：向步骤（7）处理所得滤渣以重量比1:12的比例加入蒸馏水，调节pH至7.2，加入滤渣重量1.5%的中性蛋白酶，在50℃下保温搅拌4.5 h得酶解液，然后将酶解液加热至100℃保温8min灭酶活；
（9）胶原蛋白盐析：将步骤（8）处理得到的酶解液在温度4℃下，离心力为3500×g下离心18 min，收集上清液，向上清液中缓慢加入NaCl盐析，NaCl的加入量为至上清液中NaCl的浓度为1.0mol/L，在温度2℃下，搅拌过夜得盐析液；
（10）胶原蛋白收集：将步骤（9）处理得到的盐析液在2℃下，离心力为5500×g下离心18 min，去除上清液，所得沉淀物为胶原蛋白粗品；
（11）胶原蛋白透析和冻干：向步骤（10）所得胶原蛋白粗品中加入浓度0.4 mol/L 的醋酸溶液复溶，然后先使用浓度0.15 mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析30 h，再使用蒸馏水作为透析外液透析30 h，冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。
本发明提取的硫酸软骨素产品为白色粉末，得率为4.5%-6.7%（鱼骨干品重量计），纯度为92.0%-97.4%。对提取的硫酸软骨素的理化性质研究表明，其水分含量为8.5%-10.5%，氮含量为2.7%-3.2%，氨基己糖含量为30.1%-32.6%，葡萄糖醛酸含量为30.8%-34.5%。提取出的硫酸软骨素产品电泳实验显示为单点，表明其为单一糖胺聚糖。
本发明提取的胶原蛋白产品为白色粉末，无腥味，得率为14.3%-17.8%（鱼骨干品重量计），纯度为94.2-98.3%。对提取的胶原蛋白的理化性质研究表明，其水分含量为7.3%-9.7%，热变性温度35.7-42.7℃，甘氨酸含量占所有氨基酸总数的36.4%-42.7%， 亚氨酸含量为18.9% -23.4%，电泳显示提取的胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (6)
1.一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：所述的综合利用工艺包括如下步骤：
（1）原料处理：将新鲜海洋鱼类鱼骨上的残肉剔净，在40-50℃热水中清洗干净；
（2）鱼骨粉碎：在步骤（1）处理得到的鱼骨中加入NaOH溶液，同时加入NaCl溶液，用粉碎机将鱼骨粉碎，形成粉碎液；所述的NaOH溶液加入量为步骤（1）处理得到的鱼骨重量的10%-15%，NaOH溶液的浓度为0.5-1.0 mol/L；所述的NaCl溶液加入量为步骤（1）处理得到的鱼骨重量的200%-300%，NaCl溶液的质量浓度为10%-15%；
（3）硫酸软骨素提取：将步骤（2）处理得到的粉碎液，在50-58℃下搅拌浸提6-8 h，过滤，所得滤渣在相同条件下再提取一次并过滤，合并两次过滤的滤液得浸提滤液，同时收集第二次过滤得到的滤渣用于进一步提取胶原蛋白；
（4）滤液酶解除蛋白：将步骤（3）所得浸提滤液用3-4 mol/L的盐酸调pH至7.0-7.5，加入浸提滤液重量0.5%-1%的中性蛋白酶，在45-55℃下保温搅拌2-3 h得酶解液；
（5）高温灭酶活：将步骤（4）所得酶解液加热至95-100℃，保温5-10 min灭酶活；
（6）硫酸软骨素沉淀：搅拌条件下向步骤（5）处理得到的酶解液中加无水乙醇至体系中乙醇体积分数为60-65%，在0-4℃静置18-24 h，离心15-20 min收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品；
（7）滤渣去除脂肪：向步骤（3）第二次过滤得到的滤渣以重量比1:20-30的比例加入质量浓度10%-15%的丁醇溶液，搅拌条件下浸泡18-24 h，浸泡结束后用蒸馏水冲洗除尽丁醇；
（8）胶原蛋白提取：向步骤（7）处理所得滤渣以重量比1:10-15的比例加入蒸馏水，调节pH至7.0-7.5，加入滤渣重量1%-2%的中性蛋白酶，在45-55℃下保温搅拌4-5 h得酶解液，然后将酶解液加热至95-100℃保温5-10min灭酶活；
（9）胶原蛋白盐析：将步骤（8）处理得到的酶解液在温度0-4℃下离心15-20 min，收集上清液，向上清液中缓慢加入NaCl盐析，在温度0-4℃下，搅拌过夜得盐析液；NaCl的加入量为至上清液中NaCl的浓度为0.8-1.2mol/L；
（10）胶原蛋白收集：将步骤（9）处理得到的盐析液在0-4℃下离心15-20 min，去除上清液，所得沉淀物为胶原蛋白粗品；
（11）胶原蛋白透析和冻干：向步骤（10）所得胶原蛋白粗品中加入浓度0.3-0.5 mol/L 的醋酸溶液复溶，然后先使用浓度0.1-0.2 mol/L的醋酸溶液作为透析外液进行透析24-36 h，再使用蒸馏水作为透析外液透析24-36 h，冷冻干燥后即得胶原蛋白成品。
2.根据权利要求1所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：步骤（1）所述的海洋鱼类鱼骨选自A或B方案：
A、海洋软骨鱼的鱼骨：鲨科、鳐科、魟科、鲼科和银鲛科鱼类的鱼骨中的一种；
B、部分含有软骨的硬骨鱼类的鱼骨：鮟鱇鱼、鳗鱼中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：步骤（3）中所述的过滤采用150-200目的滤布过滤。
4.根据权利要求1或2所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：步骤（6）所述的离心的离心力为6000-8000×g。
5.根据权利要求1或2所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：步骤（9）所述的离心的离心力为3000-4000×g。
6.根据权利要求1或2所述的一种海洋鱼类鱼骨的综合利用工艺，其特征在于：步骤（10）所述的离心的离心力为5000-6000×g。
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