CN111253503A - 鳐鱼硫酸软骨素及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鳐鱼硫酸软骨素及其提取方法，采用超声波辅助碱盐‑酶解法，最佳的工艺条件为：碱液浓度2.3％，提取温度43℃，酶添加量0.7％，超声提取时间180min，酶解温度45℃，酶解时间12h，最佳提取率可达43.32％，纯度达到94％。鳐鱼CS特征性成分为4‑单硫酸化二糖CS‑A、6‑单硫酸化二糖CS‑C和2,6‑二硫酸化二糖CS‑D，与鲨鱼软骨素在A/C(CS‑A/CS‑C含量比)方面具有差异，鳐鱼CS不仅具有作为良好的鲨鱼CS替代物的潜力，还因其突出的特征而表现出与鲨鱼CS不同的生理活性与功能。鳐鱼硫酸软骨素硫酸根含量达到17.18％，为高度硫酸化的软骨素多糖，抗氧化能力明显高于硫酸化程度较低的CS，具有较强的清除自由基的能力。

Description

鳐鱼硫酸软骨素及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物活性物质技术领域，具体涉及鳐鱼硫酸软骨素及其提取方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是一种普遍存在于动物软骨、结缔组织中的糖胺聚糖，糖结构与组成复杂多样，赋予其多种生物活性，如抗凝血、抗肿瘤、清除体内自由基、缓解关节炎等。硫酸软骨素还可以作为食品添加剂，用于食品的乳化、保湿和祛除异味，用于化妆品中，可调节皮肤的细胞代谢，保持皮肤水分。

CS的基本组成单位是β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-β-D-半乳糖胺通过β-1,3糖苷键连接而成的二糖单元(GlcAβ-1,3GalNAc)，基本二糖单元之间再通过β-1,4糖苷键的反复交替连接，形成聚合度为40-70，分子量一般为10-80kDa的线性生物大分子。根据硫酸基取代二糖单元糖醛酸和半乳糖胺残基中羟基的位点和数量的不同，CS分为单硫酸化的CS-A、CS-C，二硫酸化的CS-D、CS-E和三硫酸化的CS-M等多种同分异构体，因此即使CS的主链结构并不复杂，但就硫酸化的程度、硫酸基团的取代位点及分布而言，呈现出了高度的不均一性和多样性。由于物种和生长状况的不同，不同动物体内所存在的CS硫酸化二糖的含量和种类各不相同。一般来说，哺乳动物如猪、牛、兔体内的CS-A含量较多，最高可达80％，是最主要的二糖单元，CS-C和CS-D二糖含量则较少，表现出较高的A/C比值(2.0-7.0)；而海洋类动物恰好相反，CS-C含量高于CS-A为主要的二糖单元，具有较低的A/C比值(0.4-0.7)。

硫酸软骨素虽然已有化学合成、发酵工程制备CS的生产方法，但因其条件要求严苛、仪器设备昂贵，至今未能投入到大规模生产中。因此，动物软骨仍然是制备天然CS的最佳来源。CS的获取来源多为猪、牛、鸡等畜禽类动物的软骨组织，但这类动物的软骨产量很低，无法提供充足的原料以满足日益增长的CS市场需求，因此，CS的来源范围已逐渐扩大至鲨鱼、鲟鱼、鱿鱼等海洋生物。然而，由于人类的过度捕捞和水质污染，某些体内含有特殊CS成分的物种已濒临灭绝，探索并开发能够替代这些物种来源的CS成为研究者们面临的重大挑战。

CS多糖与核心蛋白通过糖肽键共价连接，若想有效地制备出纯度较高的CS，必须通过破坏糖肽键的方式除去蛋白质杂质。曹红光等研究发现，使用0.10mol/L浓度的氢氧化钠溶液处理含蛋白质的CS样品，能够去除99％以上的核心蛋白和肽段，同时CS的糖苷键不发生断裂。陈婷等的研究表明，浓盐能够沉淀CS粗提物中蛋白质。然而以上方法的使用并不能完全水解软骨中的胶原蛋白和粘蛋白，且过高的碱液浓度易引发CS的降解，并严重污染环境。王凤琴采用复合酶酶解软骨中的蛋白质，制备得到的CS产品成色好，收率高。徐丽萍等人以鸡胸软骨为原料，同样采用超声波辅助碱盐-酶解法提取CS，得到的最佳工艺参数为碱浓度4％，酶添加量1.4g/L，料液比1000:5923(g/mL)，最大得率为23.94％。王妍等采用超声波辅助-酶解-稀碱法提取罗非鱼鼻骨中的CS，平均提取率仅为0.922％，CS纯度为90.1％。周婉君等使用胰酶并辅以超声波加热水解鲟鱼软骨组织，得到的CS产率高达57.21％。这些差异的出现表明CS提取率和含量的高低不仅受到制备方法和工艺条件的影响，还与其生物来源密切相关。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供一种鳐鱼硫酸软骨素的提纯方法。

为达到上述目的，采用如下技术方案：

一种硫酸软骨素，其是从鳐鱼软骨中提取的鳐鱼硫酸软骨素。所述鳐鱼软骨素包含硫酸软骨素A，硫酸软骨素C和硫酸软骨素D。鳐鱼软骨素葡萄糖醛酸含量为28.20％，硫酸根含量为17.18％。

鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，按照如下步骤进行：

1)取鳐鱼全身软骨，用清水洗净，剔除脂肪和肌肉，剪成小块后烘干至恒重，粉碎，冷冻备用；

2)称取5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-

(1.5％-2.5％)NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀；

3)35-45℃条件下超声浸提150-210min；

4)取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，加入质量体积比为0.5％-1％的碱性蛋白酶，40-50℃振荡反应6-12h；

5)90℃灭酶10min，5000r/min离心10min，取上清液，终浓度75％的乙醇沉淀，4℃静置24h，离心收集沉淀并冻干，即得到鳐鱼硫酸软骨素，于4℃，干燥条件下储藏。

优选地，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2-2.5％；所述步骤3)中超声浸提温度为40-45℃；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.6-0.8％。

优选地，所述步骤3)中超声浸提时间为180min；所述步骤4)中碱性蛋白酶振荡反应温度为45℃；振荡反应时间为12h。

更优选地，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2.3％；所述步骤3)中超声浸提温度为43℃；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.7％。

最优地，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2.3％；所述步骤3)中超声浸提温度为43℃，超声浸提时间为180min；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.7％，反应温度为45℃，振荡反应时间为12h。

鳐鱼硫酸软骨素或包含鳐鱼硫酸软骨素的组合物在抗氧化能力中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明鳐鱼CS与鲨鱼CS具有相似的吸收谱图，两者的特征性成分均为4-单硫酸化二糖CS-A、6-单硫酸化二糖CS-C和2,6-二硫酸化二糖CS-D，但两者在A/C(CS-A/CS-C含量比)方面具有差异之处，鳐鱼CS不仅具有作为良好的鲨鱼CS替代物的潜力，还因其突出的特征而表现出与鲨鱼CS不同的生理活性与功能。

2.本发明鳐鱼CS的重均分子量、数均分子量和多分散系数分别为40752、38257和1.0652，是一种聚合度较高且分子量分布较均一的生物大分子化合物，而猪喉骨、牛气管为原料提取得到的CS的分子量约为20000-30000。

3.本发明的鳐鱼软骨素硫酸根含量达到17.18％，为高度硫酸化的软骨素多糖纯品，高度硫酸化的CS的抗氧化能力明显高于硫酸化程度较低的CS。

4.本发明的提取方法经过一系列优化可使提取率达到43.32％，CS的纯度达到94％，明显优于其他提取方法。

5.本发明的鳐鱼软骨素具有较强的抗氧化能力，具有较强的清除自由基的能力。

附图说明

图1为不同碱液浓度对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图2为不同提取温度对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图3为不同超声提取时间对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图4为不同酶添加量对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图5为不同酶解温度对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图6为不同酶解时间对硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量的影响图。

图7为碱液浓度与提取温度的交互作用响应面图和等高线图。

图8为酶添加量与提取温度的交互作用响应面图和等高线图。

图9为酶添加量与提取温度的交互作用响应面图和等高线图。

图10为鳐鱼CS的HPGC测定图

图11为鳐鱼CS和鲨鱼CS的HPGC测定图。

图12为鳐鱼CS和鲨鱼CS的红外光谱图。

图13为鳐鱼CS和鲨鱼CS的核磁共振氢谱图。

图14为鳐鱼CS和鲨鱼CS的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1不同鳐鱼硫酸软骨素提取方法的优劣比较

分别采用浓碱-浓盐法、稀碱-酶解法和超声波辅助碱盐-酶解法对鳐鱼软骨进行提取，并以硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量及外观品质为指标，比较每种提取方法的优劣。

1.浓碱-浓盐法提取鳐鱼硫酸软骨素工艺流程

鳐鱼软骨粉→10％NaOH、20％NaCl→40℃提取→滤液调pH至7-8→乙醇沉淀→离心取沉淀→冷冻干燥→CS；

2.稀碱-酶解法提取鳐鱼硫酸软骨素工艺流程

鳐鱼软骨粉→2％NaOH、2％NaCl→40℃碱盐浸提→调pH至9→50℃胰酶酶解→灭酶→调pH至7-8→乙醇沉淀→离心取沉淀→冻干→CS；

3.超声波辅助碱盐-酶解法提取鳐鱼硫酸软骨素工艺流程

鳐鱼软骨粉→2％NaOH、2％NaCl→超声波辅助40℃浸提→HCl调pH至11→50℃碱性蛋白酶酶解→灭酶→调pH至7-8→乙醇沉淀→离心取沉淀→冻干→CS

硫酸软骨素提取率、葡萄糖醛酸含量及外观品质结果如表1所示。

表1不同提取方法的硫酸软骨素提取率，葡萄糖醛酸含量以及产品外观

由表1可知，浓碱-浓盐法提取率最低，仅为21.50％，且得到的葡萄糖醛酸含量最低，产品外观不佳。该法中多糖-蛋白质复合物处于强碱性、高离子浓度的溶液环境中，CS分子易从断裂端发生进一步降解，导致较低的提取率，同时有大量的蛋白质、肽无法被有效水解，使得CS产品中杂质过多，严重影响了其质量。稀碱-酶解法提取的产品质量、外观较好，明显优于浓碱-浓盐法，本法的CS提取率达到了29.82％。综合使用碱提-酶解的方法，能够有效的利用蛋白酶对肽的水解高效性，从而断裂糖蛋白上的蛋白链，使CS游离并充分溶解于碱液中。但本法的生产周期较长，胰酶的成分复杂，容易引入其他杂质，不易去除，且其价格偏高，不适宜大规模的CS产品的生产。采用超声波辅助碱盐-酶解法得到的产品葡萄糖醛酸含量、外观较前两法有了明显改善，且提取率最高。原因是较低的碱性环境不会造成CS的降解，保留了其原本的多糖结构和组成；超声波辅助提取使得CS和杂质蛋白发生空化作用，分子运动速率加快，大分子蛋白发生沉降，更易被滤除，而CS的溶出速率加快，显著缩短了提取周期，也便于后续的醇沉操作；价格较为低廉的碱性蛋白酶的使用能够导致更广泛的蛋白质、肽的充分水解，且碱性蛋白酶的最适pH范围为10-12，减少了后续步骤HCl的用量。

实施例2超声波辅助碱盐-酶解法提取硫酸软骨素单因素工艺参数试验

以CS提取率及其葡萄糖醛酸含量为评价指标，分别对碱液浓度、提取温度、超声提取时间、碱性蛋白酶添加量、酶解温度及酶解时间这六个影响鳐鱼硫酸软骨素提取效果的关键工艺参数进行单因素试验，单因素试验因素水平如表2所示。

表2单因素试验因素水平表

硫酸软骨素提取率的计算公式为

式中：W—硫酸软骨素提取率，％；m—冻干硫酸软骨素产品质量，g；5—鳐鱼软骨粉质量，g。

实施例2.1碱液浓度单因素试验

每组试验称取5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，按照表2-3的设计分别加入浓度为2％NaCl-1％NaOH、2％NaCl-2％NaOH、2％NaCl-3％NaOH、2％NaCl-4％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，40℃超声浸提180min。取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，加入0.5％(质量体积比)的碱性蛋白酶，45℃振荡反应12h。取出后90℃灭酶10min，5000r/min离心10min，取上清液，终浓度75％的乙醇沉淀，4℃静置24h，离心收集沉淀并冻干，即得到CS多糖。将CS及时称重，于4℃，干燥条件下储藏，待测其含量。

不同碱液浓度(1％、2％、3％、4％)对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响结果如图1所示，碱液浓度由1％升至2％时，CS提取率从10.72％明显上升至36.88％，而随着碱液浓度的进一步增大，CS提取率出现了一定程度的下降；CS产物的葡萄糖醛酸含量也呈现出相似的趋势，同样在碱液浓度为2％时达到最大值，为23.08％。

在碱液浓度较低时，鳐鱼软骨组织中糖蛋白无法被有效分离，大部分CS未溶解于溶液中；而碱液浓度过高时，硫酸软骨素分子易被降解，造成提取率的下降，且在试验过程中发现，碱液浓度越高，CS产品的色泽越深，此外，还会加大后续工艺中HCl的用量，造成试剂的浪费以及成本的提高。故本次单因素试验的结果为，碱液浓度选择2％较为适宜。

实施例2.2提取温度单因素试验

每组试验称取5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-2％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，按照表2的设计，分别于30℃、40℃、50℃、60℃下超声浸提180min，后续步骤同实施例2.1。不同提取温度对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响，结果如图2所示，提取温度由30℃升至40℃时，CS提取率从30.76％提高至36.39％，而当提取温度大于40℃时，CS提取率随之下降，在60℃时仅为28.35％；CS产物的葡萄糖醛酸含量同样在提取温度为40℃时达到最大值，为23.08％，而提高温度后出现了明显下降，且提取温度越高，浸提液的颜色越深，60℃时呈褐色。

在一定的提取温度范围内，温度越高，CS提取率及其葡萄糖醛酸含量越高，由于较高的提取温度可使蛋白多糖发生β-消去反应的速率加快，同时能够提高硫酸软骨素分子的溶出速率，有利于CS从蛋白多糖中释放。但当温度过高时，浸提液长时间处于高温环境下，溶解于其中的CS被碱液降解，导致提取率的降低，同时某些杂质(蛋白质和无机盐等)由于溶解度的提高也溶解于浸提液中，造成了CS产品中杂质含量的增多，纯度的下降以及外观质量的降低。因此综合本次试验结果，提取温度选择40℃为宜。

实施例2.3超声提取时间单因素试验

每组试验称5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-2％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，在提取温度40℃条件下，按照表2的设计，分别超声浸提120min、180min、240min、300min，后续步骤同实施例2.1。

不同超声提取时间(120、180、240、300min)对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响，结果如图3所示，鳐鱼CS提取率随超声提取时间的增加的变化不甚明显，但也呈现出一定的升降趋势。随着超声提取时间的延长，CS提取率及其葡萄糖醛酸含量开始上升，在180min时达到最大，分别为36.59％和22.76％，但当提取时间超过180min后，CS提取率及其葡萄糖醛酸含量出现了缓慢的下降。

产生这一现象的原因是：随着超声提取时间的推移，超声波的空化作用和机械震荡波可以使得细胞被更加充分地破碎，造成CS的溶出速率加快，从而提高了提取率。但在继续延长提取时间后，蛋白多糖中发生的糖肽键断裂效应的速率也逐渐减慢，硫酸软骨素分子的溶出速率变得缓慢，并且在长时间的超声波作用下，大分子CS易发生糖链的断裂，导致部分CS的水解，在此阶段，CS的溶出速率小于水解速率，也就造成了CS提取率的下降。综合以上分析，本次单因素试验选择180min为最佳超声提取时间。

实施例2.4酶添加量单因素试验

每组试验称5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-2％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，40℃超声浸提180min。取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，按照表2的设计，分别加入0.25％、0.5％、1％、2％的碱性蛋白酶，后续步骤同实施例2.1。不同碱性蛋白酶添加量(0.25％、0.5％、1％、2％)对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响，结果如图4所示，当酶添加量由0.25％上升至0.5％时，CS提取率及其葡萄糖醛酸含量出现了大幅度的提高并达到了最大，为36.33％和22.59％，但当进一步提高酶添加量后，CS提取率并没有发生明显的变化，而葡萄糖醛酸含量却发生了一定程度的下降。

此结果表明，在酶添加量较低时，底物无法与蛋白酶分子充分结合，蛋白质的水解程度受到限制；当继续添加蛋白酶后，酶与底物蛋白的结合达到饱和，以蛋白质-多糖复合物形式存在的硫酸软骨素分子被充分释放，从而达到最佳的提取效果；然而在此基础上过量地添加蛋白酶，并不能提高蛋白质的水解程度，反而会大量引入蛋白酶这种新的杂质，使其残留在溶液中，进而降低了CS产物的纯度，并且在试验中发现，碱性蛋白酶加入到溶液中会使反应体系呈棕褐色，过度添加不仅提高了生产成本，还会导致CS产品的外观品质的下降。综上所述，本次试验最终的酶添加量选择为1％。

实施例2.5酶解温度单因素试验

每组试验称5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-2％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，40℃超声浸提180min。取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，加入0.5％的碱性蛋白酶，按照表2的设计，分别于40℃、45℃、50℃、55℃下酶解，后续步骤同实施例2.1。不同酶解温度(40、45、50、55℃)对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响，结果如图5所示，随着酶解温度的提高，CS提取率及其葡萄糖醛酸含量呈现出先上升后下降的趋势，并在55℃时达到最低，分别为33.48％和19.67％。在45℃时，CS提取率最高，为37.15％，其葡萄糖醛酸含量为22.27％；50℃时，CS产物的葡萄糖醛酸含量略高于45℃时的，为22.35％，但其CS提取率却低于45℃时的，为34.92％。

在适宜的温度范围内，碱性蛋白酶的活力较高，对蛋白质的水解效果较好；当温度过低时，反应体系中的分子运动速率较低，蛋白酶分子和底物的碰撞几率较小，导致酶解效果的下降；当温度过高时，一方面超出了蛋白酶的适宜温度范围，酶活性易发生钝化甚至失活，另一方面也提高了部分杂质的溶解度，使得酶解液中的杂质含量增大，导致CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的下降。综上，酶解温度选择45℃为宜。

实施例2.6酶解时间单因素试验

每组试验称取5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-2％NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀，40℃超声浸提180min。取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，加入0.5％的碱性蛋白酶，45℃振荡反应，按照表2的设计，分别反应4h、8h、10h、12h，后续步骤同实施例2.1。不同酶解时间(4、8、12、16h)对鳐鱼CS提取率及其葡萄糖醛酸含量的影响，结果如图6所示，酶解时间对CS提取率的影响并不明显，在12h时，提取率达到最大值，为36.37％；葡萄糖醛酸含量随着酶解时间的延长开始上升，同样在12h时达到最值，为22.51％，但继续延长酶解时间后，开始出现明显的下降。

这说明，在充足的反应时间内，酶与底物的结合较为彻底，酶解反应较充分，使得CS提取率及其葡萄糖醛酸含量达到最高，但若继续延长酶解时间，硫酸软骨素分子长时间处于温度较高的碱性溶液环境中，易发生降解现象。因此，综合其对CS提取率和葡萄糖醛酸含量的影响，酶解时间选取12h为宜。

实施例3响应曲面法优化试验

通过单因素方差分析筛选出三个关键的试验因素：碱液浓度、提取温度、酶添加量。依照Box-Behnken的中心设计原理，进行响应曲面模型设计：选取碱液浓度(A)、提取温度(B)、酶添加量(C)三个试验因素为自变量，每个因素设置三个试验水平，并以-1，0，+1分别代表其低、中、高水平，以CS提取率(Y)为响应值，使用Design-Expert 10.0设计三因素三水平的优化试验，各因素的水平编码见表3，优化试验的设计及结果见表4。

表3 Box-Behnken响应面试验因素水平编码

表4 Box-Behnken响应面试验设计及结果

利用Design-Expert 10.0分析表4中数据，得出多元拟合回归方程为：Y＝42.28+4.20A+2.17B+1.01C-0.60AB+0.49AC-0.075BC-7.11A²-3.06B²-2.58C²。

为了检验回归方程的有效性，需对其进行方差分析和模型分析，响应面试验的方差分析见表5。

表5响应面试验方差分析

注：P<0.01表示极显著(**)；P<0.05表示显著(*)；P>0.05表示不显著(/)。

由表5可知，此回归模型的显著性检验达到极显著水平(P<0.0001)，表明该模型具有统计学意义；失拟项P值为0.0839>0.05，不显著，说明试验误差小；校正决定系数R² _Adj＝0.9779，说明该模型能解释97.79％响应值的变化；相关系数R²＝0.9904，说明该模型拟合程度很好。综上所述，可以使用此模型对超声波辅助碱盐-酶解法提取硫酸软骨素的关键工艺进行优化和预测。

从模型回归方程以及表5可知：模型一次项A、B极显著，C显著；模型二次项A²、B²、C²均极显著；交互项AB、AC、BC皆不显著。由此可知，各因素对CS提取率的影响大小依次为：A>B>C，即碱液浓度>提取温度>酶添加量。

通过Design-Expert 10.0软件绘制多元回归方程的响应曲面图及其等高线图(图7，图8，图9)，以进一步研究相关变量间的交互作用，确定最佳的因素水平范围。

(1)碱液浓度与提取温度的交互作用的分析

图7表示酶添加量为0.625％时，碱液浓度(A)与提取温度(B)对CS提取率(Y)的交互影响效应。可知，在碱液浓度为2-2.5％，温度为40-45℃时，响应面坡度达到最高，即CS提取率能够达到最值。在一定的提取温度下，CS提取率随碱液浓度的增大呈现先上升后下降的趋势，当碱液浓度恒定时，提取率随提取温度的升高而上升，然后出现下降，碱液浓度的主效应大于提取温度。由方差分析表10和等高线图可以看出，碱液浓度(A)与提取温度(B)的交互作用对CS提取率(Y)的影响不显著。

(2)碱液温度与酶添加量的交互作用的分析

图8表示提取温度为40℃时，碱液浓度(A)与酶添加量(C)对CS提取率(Y)的交互影响效应。可以明显看出，碱液浓度对CS提取率的影响大于酶添加量，在碱液浓度较高时，较少的酶添加量即可得到较高的提取率。随着碱液浓度的提高，CS提取率上升较快，但当碱液浓度大于2.5％时，提取率出现明显的下降。而在碱液浓度为2-2.5％，酶添加量为0.7％时，响应面坡度达到最高，CS提取率达到最大值。由方差分析表3-10和等高线图可以看出，碱液浓度(A)与酶添加量(C)的交互作用对CS提取率(Y)的影响不显著。

(3)提取温度与酶添加量的交互作用的分析

图9表示碱液浓度为2％时，提取温度(B)与酶添加量(C)对CS提取率(Y)的交互影响效应。根据等高线图可以明显地看出，提取温度与酶添加量的交互作用对CS提取率的影响不显著，与方差分析结果一致。酶添加量为0.7％，提取温度为40-45℃时，响应曲面坡度最高，CS提取率有最大值。

通过Design-Expert 10.0分析数据，并对回归方程求解，以CS提取率(Y)为指标，根据RSM分析得出超声波辅助碱盐-酶解法提取硫酸软骨素的最佳工艺参数为：碱液浓度2.290％，提取温度43.249℃，酶添加量0.707％，在此条件下CS提取率的预测值可达43.35％。为方便实际的试验操作，将各因素修正为碱液浓度2.3％，提取温度43℃，酶添加量0.7％，并在此条件下进行三次验证试验，CS提取率的平均值为43.32％，与理论值43.35％基本吻合，说明响应面试验的优化结果可靠、准确，该模型适宜对超声波辅助碱盐-酶解法提取硫酸软骨素的提取工艺进行预测和分析。

实施例4鳐鱼硫酸软骨素理化性质测定

实施例4.1葡萄糖醛酸含量的测定

采用硫酸-咔唑法测定CS中葡萄糖醛酸含量。分别吸取50μg/mL葡萄糖醛酸标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加水补至1mL，4℃冰浴5min，各加入5mL硼砂-硫酸试剂，沸水加热15min后迅速冷却，加入0.2mL咔唑，沸水加热显色15min，在530nm处测定其吸光度，以浓度和吸光度为横、纵坐标绘制标准曲线。配制50μg/mL浓度的CS溶液按上述步骤操作，根据标准曲线计算样品中葡萄糖醛酸含量。

实施例4.2蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定CS中蛋白质含量。分别吸取0.1mg/mL的BSA标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，用生理盐水补至1mL，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，放置15min，于595nm处测定吸光度，以浓度和吸光度为横、纵坐标绘制标准曲线。配制0.1mg/mL浓度的CS溶液按上述步骤操作，根据标准曲线计算样品中蛋白质含量。

实施例4.3硫酸根含量的测定

采用硫酸钡比浊法测定CS中的硫酸根含量。分别吸取0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL的K2SO4标准溶液(6.24mmol/L)，用1mol/L HCl溶液补至0.2mL，加入3.8mL TCA和1mLBaCl2-明胶溶液，静置20min，在360nm处测定吸光度A1；以明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，按同样步骤测定吸光度A2；以浓度和吸光度(A1-A2)为横、纵坐标绘制标准曲线。

取10mg CS样品用10mL的HCl溶液(1mol/L)溶解，沸水中加热水解4h后，8000r/min离心15min，用1mol/L HCl溶液补至10mL，吸取0.2mL按上述步骤操作，根据标准曲线计算样品中硫酸根含量。

实施例4.4鳐鱼硫酸软骨素的主要质量指标测定

CS主要质量指标的测定方法按照《中国药典》2015版的要求进行。

实施例4.1-4.4鳐鱼CS的主要理化性质和质量指标如表6所示。

表6鳐鱼CS的主要理化性质和质量指标

鳐鱼CS样品为白色粉末状固体，无臭，不溶于乙醇、乙酸和丙酮，易溶于水且溶液无色透明，具粘稠性，加热不发生凝结。鳐鱼CS样品中蛋白质含量为1.35％，葡萄糖醛酸含量为28.20％，利用超声波辅助碱盐-酶解法提取鳐鱼软骨中的CS，能够提供一种较为温和的碱性环境，同时利用超声波产生的空化作用和振荡作用，增大碱液与蛋白多糖的接触面积和碰撞几率，使得多糖与核心蛋白连接区的O-糖苷键充分断裂，将硫酸软骨素分子以游离态释放到提取液中；稀碱盐提取后再通过碱性蛋白酶有效地切断蛋白聚糖中的肽键，将大部分的蛋白质水解成氨基酸，利用乙醇沉淀、离心的方法将CS与氨基酸有效分离，得到纯度高、产品质量好的CS纯品。鳐鱼CS样品中的硫酸根含量高达17.18％，是一种高度硫酸化的多糖。硫酸根作为硫酸软骨素结构中的重要组成成分之一，与CS的分子量、电荷密度以及生理活性密切相关。CS的硫酸化程度越高，则其分子量和电荷密度越大，与蛋白质的结合能力就越强；Bobula等人的研究表明，高度硫酸化的CS的抗氧化能力明显高于硫酸化程度较低的CS；张玉倩也证实了硫酸根是CS抗凝血活性的主要促进基团。

实施例4.5鳐鱼硫酸软骨素的分子量及纯度测定

采用HPGPC测定CS样品的分子量及纯度。使用系列分子量的葡聚糖标准品作为分子量参考，通过保留时间对相应的Mw的对数绘制标准曲线，将样品的保留时间带入校准曲线方程中，计算CS样品的分子量，通过得出的Mw和Mn计算其多分散系数PDI。

采用HPGPC测定提取得到的鳐鱼CS分的子量，以保留时间(x)为横坐标，葡聚糖标准品的分子量对数(y)为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线回归方程为：y＝8.152803-0.211132x，R²＝0.99944。将CS样品的保留时间代入回归方程中即可得出鳐鱼CS的分子量。图10表示鳐鱼CS的HPGPC的色谱图，可以看出鳐鱼CS的色谱峰为单一的对称峰，这表明硫酸软骨素多糖的纯度较高，分子量分布均一。经分析可知，鳐鱼CS的重均分子量(Mw)为40752，数均分子量(Mn)为38257，纯度为94％，多分散系数(PDI，Mw/Mn)达到1.0652。

目前以猪喉骨、牛气管为原料提取得到的CS的分子量约为20000-30000，本发明的鳐鱼CS的分子量明显要高很多，说明鳐鱼CS是一种聚合度较高且分子量分布较均一的生物大分子化合物。

实施例5鳐鱼硫酸软骨素的化学结构分析

实施例5.1紫外光谱分析

紫外光谱分析可以辅助判断其杂质的含量，但无法精确定量，也不能提供关于CS的种类及其结构特征的信息。将鲨鱼来源的CS标准品和鳐鱼CS用去离子水配制成1mg/mL的溶液，分别进行紫外光谱扫描，绘制成吸光度与波长的紫外可见吸收光谱图。

将鲨鱼来源的CS标准品和经优化后提取得到的鳐鱼CS样品分别进行紫外光谱扫描(波长范围为200-400nm)，得到的吸收光谱图如图11所示。在扫描波长范围内，两者的紫外光谱吸收基本重叠，并同样在波长210-220nm处显示出强的特征吸收峰。但鳐鱼CS在波长260nm和280nm处出现了很小的吸收峰。这些结果表明，初步判断鳐鱼CS样品为硫酸软骨素，可能含有少量与其共价结合的肽或蛋白质，以及微量的核酸类物质。

实施例5.2红外光谱分析

将鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS干燥至恒重，与KBr研磨成粉，混合均匀，制成压片，采用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描分析(4000-400cm^-1)。

CS分子中含有大量的糖醛酸、乙酰基和硫酸基，这些官能团在IR的谱图中有着十分明显的吸收峰，因此可通过这些特征吸收峰推测CS的详细结构，如糖醛酸的构型，硫酸基的存在及其取代位点。综合本试验的结果图12、表7可知，鲨鱼CS和鳐鱼CS均含有羟基、乙酰氨基、羧基、硫酸酯基、吡喃糖环等官能团，可以判定这两种CS的基本二糖单元构成均为由β-1,3糖苷键连接的β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖(GalNAc)，且两者的主要硫酸化二糖皆为CS-C。然而，在862cm^-1处还观察到了鳐鱼CS中C₄硫酸化的GalNAc上硫酸酯基的特征吸收峰，因此鳐鱼CS中可能还含有少量的硫酸化二糖CS-A，但在鲨鱼CS中未出现该吸收峰。这表明，虽然鲨鱼CS和鳐鱼CS具有相同的主要硫酸化二糖成分，但由于物种来源的不同，两者其他二糖成分的组成和含量可能存在差异。因此，仍需进一步探明其结构以揭示此差异。

表7红外光谱图的波数、强度和信号归属

实施例5.3核磁共振氢谱分析

核磁共振波谱分析是一种表征化合物详细结构的强有力的工具，常被用来鉴定多糖类化合物的精细结构。取50mg的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS分别用重水(D₂O)连续交换3次，以D₂O配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，进入核磁共振波谱仪进行¹H NMR分析，测定条件为：温度60℃，频率600MHz，zg30序列扫描16次。

图13为鲨鱼来源的CS标准品和鳐鱼CS的核磁共振氢谱图，可以看出鳐鱼CS和鲨鱼CS的信号峰之间具有很高的相似性，两者的GalNAc6S的H-1信号都在4.43ppm左右出现；GalNAc6S的H-6信号都在4.16ppm附近出现，这些特征峰的出现表明两种CS中均含有较多的单硫酸化的二糖单元GlcA-GalNAc6S(CS-C)。而4.10ppm处的GlcA2S的H-2信号则表明鲨鱼CS和鳐鱼CS中都含有双硫酸化的二糖单元GlcA2S-GalNAc6S(CS-D)。此外，根据该处的信号强度(鲨鱼CS>鳐鱼CS)可以判断，CS-D在鲨鱼CS中含量较多。然而，在鳐鱼CS的IR谱图中观察到了CS-A的存在，4-硫酸基取代GalNAc4S的H-4信号应出现在4.70ppm左右，但在鳐鱼CS的¹H NMR谱图中该信号未被直接观察到，这可能是由于溶剂重水的信号一般为4.70ppm，使得该信号被溶剂峰重叠而无法被辨认。而未硫酸化的GalNAc0S可能由于其含量较低，导致其信号被隐蔽，无法从谱图中辨识。

实施例5.4核磁共振碳谱分析

因分析¹H NMR谱图后，鳐鱼CS和鲨鱼CS的结构并未被详尽地阐明，所以进一步采用¹³C NMR技术对两者进行结构表征。样品配制同2.2.5.3，测定条件改为：温度20℃，频率600MHz，zg30序列扫描16次。

鲨鱼来源的CS标准品以及鳐鱼CS的核磁共振碳谱谱图如图14所示。通过检查50-70ppm以及100-110ppm范围内的信号可以得知，鳐鱼CS和鲨鱼CS均含有单硫酸化的二糖单元GlcA-GalNAc6S(CS-C)和GlcA-GalNAc4S(CS-A)，通过对比这些特征信号峰的吸收强度可以看出，在两种CS中GalNAc6S的含量要远高于GalNAc4S，即4S/6S(A/C)较小，这在鳐鱼CS中尤其明显。此外，分别在79.87ppm和79.40ppm处出现的GlcA2S的C-2信号峰表明鳐鱼和鲨鱼CS中均含有丰富的双硫酸化二糖单元GlcA2S-GalNAc6S(CS-D)。因此，通过¹³C NMR分析可知，鳐鱼CS和鲨鱼CS中主要的硫酸基取代位点为6-硫酸基取代、4-硫酸基取代以及2,6-硫酸基取代，在这其中以6-硫酸基取代GalNAc6S的含量为最多，即两种CS中最主要的硫酸化二糖为GlcA-GalNAc6S(CS-C)。然而，在两者的碳谱谱图中并未观察到未硫酸化或其他硫酸化的GlcA/GalNAc的吸收峰，这可能是由于这些成分的相对含量较低(<5％)，其信号被噪音或其他主成分的信号所屏蔽，所以无法被检测到。

通过实施例5.1-5.4获取了大量的关于鳐鱼CS和鲨鱼CS的结构相似，且在二糖成分的构成方面基本相同，但两者在A/C(CS-A/CS-C含量比)方面存在差异。鳐鱼CS不仅具有作为良好的鲨鱼CS替代物的潜力，还因其突出的特征而表现出与鲨鱼CS不同的生理活性与功能。

实施例6鳐鱼硫酸软骨素体外抗氧化能力的测定

实施例6.1DPPH自由基清除能力的测定

采用稍加改动的方法测定DPPH自由基清除能力。吸取1mL DPPH乙醇溶液(2×10^{- 4}mol/L)，分别加入2mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS溶液，混匀后避光反应30min，于517nm处测定吸光度，对照组以无水乙醇代替各样品。

浓度在0.5-2.0mg/mL的鲨鱼CS标准品、鳐鱼CS对DPPH自由基的清除能力清除DPPH·的能力相当，当样品浓度达到4.0mg/mL时，鳐鱼CS清除率48.21％高于鲨鱼CS标准品的清除率39.69％，；当浓度为8.0mg/mL时，鳐鱼CS清除率68.53％高于鲨鱼CS标准品的清除率60.8％，说明鳐鱼CS比鲨鱼CS标准品对DPPH清除能力强。

实施例6.2羟基自由基清除能力的测定

分别配制2mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼CS标准品、鳐鱼CS溶液，依次加入1mL的FeSO₄溶液(10mmol/L)，1mL的水杨酸钠-乙醇溶液(6mmol/L)，1mL的H₂O₂溶液(5mmol/L)，混匀后37℃静置反应30min，冷却至室温后在510nm处测定吸光度，空白组以蒸馏水代替各样品。

不同浓度(0.5-8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS呈现出了剂量-效应关系，即清除能力随着样品浓度的升高而增大，在同等浓度下，鳐鱼CS和鲨鱼CS的·OH清除率相等，两者表现出了相似的清除·OH的能力，在浓度不超过2mg/mL时，鳐鱼CS和鲨鱼CS的·OH清除率均小于30％，当样品浓度达到4.0mg/mL时，两种CS的清除率出现了十分明显的升高，·OH清除率达到72％；而当浓度为8.0mg/mL时，清除率均超过80％，呈现出相等的·OH清除能力。

实施例6.3超氧阴离子自由基清除能力的测定

将4.5mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.2)于25℃预热15min，分别加入1mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS溶液和0.5mL的邻苯三酚溶液(3mmol/L)，于25℃反应15min，加入0.1mL的3％抗坏血酸溶液，在波长420nm处测定吸光度，空白组以蒸馏水代替各样品。

不同浓度(0.5-8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS对O₂ ^-·的清除能力均呈现出了较好的剂量-效应关系。在0.5、1.0、4.0mg/mL样品中，鳐鱼CS比鲨鱼CS对O₂ ^-·清除率表现出强的，其余浓度具有同等的O₂ ^-·清除能力，说明鳐鱼CS对O₂ ^-·的清除能力要强于鲨鱼来源的CS标准品。

实施例6.4氧化自由基吸收能力的测定

采用稍加改动的方法测定氧化自由基吸收能力。吸取50μL不同浓度的水溶性维生素E(Trolox)溶液(12.5、25、50、100、200μmol/L)置于酶标板的微孔中，与50μL荧光素钠(FL)溶液(126nmol/L)混合均匀，37℃预热10min后，加入100μL AAPH溶液(221mM)，以激发波长485nm，发射波长535nm，每隔2min检测各待测孔的荧光强度值，持续60min。用相同体积的磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂作为阴性空白；用相同体积的磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂和AAPH溶液作为阳性空白。以时间为横坐标，荧光强度值为纵坐标，分别绘制出样品、阴性空白、阳性空白的荧光衰变曲线，利用近似积分法，计算阴性空白与样品所围成的曲线下面积(ATU)值，并以ATU值为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，绘制Trolox抗氧化标准溶液的ORAC标准曲线。分别配制浓度为4mg/mL的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS样品的溶液，它们的ORAC值即可通过计算其ATU值得到，并以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g(μmol TE/g)表示。

该分析方法中的自由基来源于AAPH热分解产生的过氧化氢自由基，其与作为荧光探针的荧光素钠(FL)相互作用后，探针的荧光强度出现衰退，而当体系中有抗氧化剂存在时，自由基引起的荧光强度的衰退受到抑制，抑制的程度则表示为抗氧化剂的ORAC值，ORAC值越高，抗氧化剂的抗氧化能力越强。

鲨鱼来源的CS标准品的ORAC值为60.1μmol TE/g，鳐鱼CS的ORAC值为72.5μmolTE/g，鳐鱼CS表现出更强的自由基吸收能力。

实施例6.5抗氧化能力的比较

鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS对三种自由基的半数抑制浓度和ORAC值见表8。由表8可以看出，鳐鱼CS表现出了较好的体外抗氧化能力。

表8鲨鱼CS和鳐鱼CS抗氧化能力的比较

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种硫酸软骨素，其是从鳐鱼软骨中提取的鳐鱼硫酸软骨素。

2.根据权利要求1所述的鳐鱼硫酸软骨素，其特征在于，所述鳐鱼软骨素包含硫酸软骨素A，硫酸软骨素C和硫酸软骨素D。

3.根据权利要求1所述的鳐鱼硫酸软骨素，其特征在于，所述鳐鱼软骨素葡萄糖醛酸含量为28.20％，硫酸根含量为17.18％。

4.一种鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

1)取鳐鱼全身软骨，用清水洗净，剔除脂肪和肌肉，剪成小块后烘干至恒重，粉碎，冷冻备用；

2)称取5g鳐鱼软骨粉于烧杯中，以1:6g/mL的料液比，加入浓度为2％NaCl-(1.5％-2.5％)NaOH水溶液，边加入边搅拌使其充分混匀；

3)35-45℃条件下超声浸提150-210min；

4)取出后用双层纱布过滤，收集滤液，冷却后调节pH至11，加入质量体积比为0.5％-1％的碱性蛋白酶，40-50℃振荡反应6-12h；

5)90℃灭酶10min，5000r/min离心10min，取上清液，终浓度75％的乙醇沉淀，4℃静置24h，离心收集沉淀并冻干，即得到鳐鱼硫酸软骨素，于4℃，干燥条件下储藏。

5.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2-2.5％；所述步骤3)中超声浸提温度为40-45℃；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.6-0.8％。

6.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中超声浸提时间为180min；所述步骤4)中碱性蛋白酶振荡反应温度为45℃；振荡反应时间为12h。

7.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2.3％；所述步骤3)中超声浸提温度为43℃；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.7％。

8.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中NaCl-NaOH水溶液NaOH的浓度为2.3％；所述步骤3)中超声浸提温度为43℃，超声浸提时间为180min；所述步骤4)中碱性蛋白酶的质量体积比为0.7％，反应温度为45℃，振荡反应时间为12h。

9.权利要求1-8任一项所述的鳐鱼硫酸软骨素或包含鳐鱼硫酸软骨素的组合物在抗氧化中的应用。

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