CN111234048A - 鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鳐鱼硫酸软骨素降解产物及降解方法，由鳐鱼硫酸软骨素降解得来。所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物的分子量为5000‑8400。所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物硫酸根含量为17.26％。本发明采用硫酸软骨素酶进行酶解，LMWCS得率高达72％、外观质量好、分子量低至5009，多分散系数最低，纯度达到99％，且仍保持了与降解前相同的硫酸根含量；硫酸软骨素酶选择性裂解GalNAc4S残基，使CS‑A二糖含量的提高；LMWCS较降解前的鳐鱼CS具有更强的抗氧化能力。

Description

鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法
技术领域
本发明涉及生物活性物质技术领域，具体涉及鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)普遍存在于动物的软骨及结缔组织的胞外基质中和细胞表面，同时也是哺乳动物血液和血管中的重要组成部分。CS具有蛋白链接域，其通过四糖连接域(GlcAβ1→3GalNAcβ1→3GalNAcβ1→4Xylβ1-O-Ser)共价连接到甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸序列中的丝氨酸残基上，从而与核心蛋白相连接，以聚集的蛋白聚糖糖链的形式存在。目前工业生产的CS大多来源于猪、牛、鸡这类陆生动物和一些水生动物如鲨鱼、鲟鱼、鱿鱼的软骨组织，CS可占其干重的20％-50％。CS种类与含量随着动物来源的种类、部位、年龄等因素而表现出明显的差异，如牛气管中含36％左右，在猪软骨中一般为40％，而鱼类软骨中的CS含量较高，可达50％以上，成为提取CS的重要来源。
作为生物体组织内自身合成和天然存在的成分，参与着众多的生理活动，如生长因子的信号传导、神经细胞的生长、肿瘤细胞的迁移等。虽然CS的主链结构较为简单，但其二糖的组成和排列顺序、分子量的大小以及硫酸基取代的位点和程度造成了其具有高度的不均一性。正是由于CS极为复杂的精细结构，赋予了其丰富多样的理化性质和生物活性，能够在调节关节机能、清除自由基、抗凝血、抗肿瘤等方面发挥重要的生理功效，可作为生物药物对关节炎、动脉粥样硬化、冠心病、肿瘤起到辅助治疗的作用。
我处制备的鳐鱼硫酸软骨素鳐鱼的特征性成分为4-单硫酸化二糖CS-A、6-单硫酸化二糖CS-C和2,6-二硫酸化二糖CS-D，与鲨鱼软骨素结构类似，但在A/C(CS-A/CS-C含量比)方面具有差异，鳐鱼CS不仅具有作为良好的鲨鱼CS替代物的潜力，还因其突出的特征而表现出与鲨鱼CS不同的生理活性与功能。多糖的相对分子质量是其重要的化学性质之一，对其生物功能和生理活性的发挥起到关键性的影响。天然CS的相对分子质量范围一般在40000-100000之间，采用不同降解方法得到的CS的分子量一般在500-30000之间，低于10000时，则可称为低分子量硫酸软骨素(LMWCS)。由于LMWCS具有易吸收，生物利用度高，且多数生物活性得到增强的特点，近些年来受到了越来越多的关注。与此相对应的，关于采用不同降解方法制备LMWCS的研究也陆续出现，其降解方法一般可分为物理降解法、化学降解法和生物降解法，但采用不同降解方法得到的LMWCS的分子量差异较大，降解产物的得率、质量也参差不齐，为LMWCS的研究带来了一定的难度和不确定性。但不同来源的CS降解酶的降解机理可能并不相同，张莲等人通过动物来源的透明质酸酶对CS进行降解，得到的LMWCS为饱和寡糖，而Yin等人从细菌中分离得到的硫酸软骨素AC裂解酶对CS进行降解后，得到的为不饱和寡糖，这说明采用生物酶对CS进行降解，得到的LMWCS的结构可能会发生未知的变化，其生物活性也可能随之改变。CS的来源不同，降解方式的差异，都会对制备出的LMWCS的理化性质和结构造成不同的影响。
发明内容
本发明旨在解决上述问题，提供鳐鱼硫酸软骨素的降解产物及其降解方法。
为达到上述目的，采用如下技术方案：
一种硫酸软骨素降解产物，其是鳐鱼硫酸软骨素降解得来。所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物的分子量为5000-8400。所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物硫酸根含量为17.26％。
一种鳐鱼硫酸软骨素的降解方法，按照如下步骤进行：
1)称取鳐鱼硫酸软骨素样品1g溶解于50mL Tris-乙酸缓冲溶液中；
2)加入硫酸软骨素酶8-12U，于37℃培养箱中反应6h；
3)取出后85℃灭酶5min，冷却至室温后，调pH至7.0；
4)使用MWCO 3500Da透析袋透析，48h后，真空冷冻干燥得到产物，于4℃干燥条件下储藏。
优选地，所述步骤1)中Tris-乙酸缓冲溶液为50mmol/L Tris与60mmol/L乙酸钠、pH值为8.0的缓冲溶液。
优选地，所述步骤2)加入硫酸软骨素酶10U。
鳐鱼硫酸软骨素降解产物或包含鳐鱼硫酸软骨素降解产物的组合物具有抗氧化中的作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.LMWCS得率高达72％、外观质量最好、分子量低至5009，多分散系数最低，纯度达到99％，且仍保持了与降解前相同的硫酸根含量；2.硫酸软骨素酶选择性裂解GalNAc4S残基，使CS-A二糖含量的提高；3.LMWCS较降解前的鳐鱼CS具有更强的抗氧化能力。
附图说明
图1为LMWCS的硫酸根含量图。
图2为LMWCS的红外光谱图。
图3为LMWCS的核磁共振氢谱图。
图4为不同浓度的CS和LMWCS样品的DPPH·清除能力图。
图5为不同浓度的CS和LMWCS样品的·OH清除能力图。
图6为不同浓度的CS和LMWCS样品的O2 -·清除能力图。
图7为CS和LMWCS样品的ORAC值图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例1鳐鱼硫酸软骨素酶降解
分别采用氧化降解法、酸降解法、酶降解法对鳐鱼硫酸软骨素进行降解，制备低分子量硫酸软骨素。
1.氧化降解法制备低分子量硫酸软骨素
称取CS样品1g溶于50mL的6％乙酸钠溶液中，加入乙酸铜·一水合物64mg，使其充分溶解并混匀后，预热至35℃，随后加入12mL 10％H2O2溶液(v/v)，在50℃下反应4h，反应过程中用1mol/L NaOH溶液使反应体系的pH保持在7.0-7.5范围内。待反应结束后向溶液中加入0.2g EDTA，冷却至室温后用乙酸调整pH至7.0，使用MWCO 3500Da透析袋进行透析，36h后，真空冷冻干燥得到产物，命名为LMWCS-H，并于4℃干燥条件下储藏。
2.酸降解法制备低分子量硫酸软骨素
称取CS样品1g溶于50mL的0.4mol/L HCl溶液中，待溶解为无色透明溶液后，65℃振荡反应4h。待反应结束后冷却至室温，调pH至7.0，使用MWCO3500Da透析袋进行透析，48h后，真空冷冻干燥得到产物，命名为LMWCS-A，并于4℃干燥条件下储藏。
3.酶降解法制备低分子量硫酸软骨素
称取CS样品1g溶解于50mL Tris-乙酸缓冲溶液(50mmol/L Tris+60mmol/L乙酸钠，pH＝8.0)中，加入硫酸软骨素酶(CSase ABC)10U，于37℃培养箱中反应6h，取出后85℃灭酶5min，冷却至室温后，调pH至7.0，使用MWCO 3500Da透析袋进行透析，48h后，真空冷冻干燥得到产物，命名为LMWCS-E，于4℃干燥条件下储藏。
实施例2降解产物的得率、外观质量比较
比较降解产物的得率、外观质量。降解产物得率的计算W＝m/1*100％，式中：W—降解产物得率，％；m—冻干后降解产物质量，g；1—鳐鱼硫酸软骨素质量，g。降解产物的得率、外观质量的结果如表1所示。
表1 LMWCS的外观质量、得率
Figure BDA0002403936920000051
由表1可知，经酸降解法制备的得到的LMWCS-A与降解前的CS相比颜色较深，外观质量较差，且产物得率较低，仅为44.20％。采用酸法降解CS的反应比较剧烈，不易控制，反应过程的pH会出现较大幅度的波动，且在温度较高时反应体系的颜色呈棕色，在高温环境和较长的持续时间内，强酸破坏了葡萄糖醛酸的结构，使得产物的得率较低、外观质量不佳。采用氧化法制备得到的LMWCS-H的产品外观与CS相似，得率为65.78％。酶降解法经过专用酶CSase ABC的处理后，得到的LMWCS-E产品质量好，且得率最高，为72.11％。综合以上分析可以得出，通过氧化降解法和酶降解法制备得到的LMWCS产物的外观质量是最接近降解前的鳐鱼CS的，其中酶解法的得率最高，而酸降解制备出的LMWCS-A的外观质量和得率都较差。
实施例3分子量及纯度比较
采用HPGPC测定CS样品的分子量及纯度。使用系列分子量的葡聚糖标准品作为分子量参考，通过保留时间对相应的Mw的对数绘制标准曲线，将样品的保留时间带入校准曲线方程中，计算CS样品的分子量，通过得出的Mw和Mn计算其多分散系数PDI。
分子量及纯度测定结果如表2所示。
表2 LMWCS的纯度和分子量
Figure BDA0002403936920000061
由表2可知，经过三种降解方法处理后，CS样品的分子量皆发生了明显的下降，制备得到的LMWCS的分子量(Mw)范围在8364-5009之间，皆低于10000，其中酶降解法降解得到的LMWCS-E的Mw最低，仅为5009，而LMWCS-A和LMWCS-H的分子量较高，分别为7822和8364。在经过降解处理后，得到的三种LMWCS的纯度较CS样品都有了相同的提升，皆为99％，说明这三种方法不仅能够有效降低CS的分子量，还可以提高其纯度。但三种LMWCS的多分散系数较降解前的CS样品都有了一定程度的升高，其中氧化法降解得到的LMWCS-H最高，由原本的1.065升高至1.443，呈现出较宽的分子量分布，而LMWCS-E的多分散系数只有1.122，仍表现出较均一的分子量分布，与CS样品的相差很小。
实施例4低分子量硫酸软骨素的硫酸根含量比较
采用硫酸钡比浊法测定CS中的硫酸根含量。
分别吸取0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL的K2SO4标准溶液(6.24mmol/L)，用1mol/LHCl溶液补至0.2mL，加入3.8mL TCA和1mL BaCl2-明胶溶液，静置20min，在360nm处测定吸光度A1；以明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，按同样步骤测定吸光度A2；以浓度和吸光度(A1-A2)为横、纵坐标绘制标准曲线。
取10mg CS样品用10mL的HCl溶液(1mol/L)溶解，沸水中加热水解4h后，8000r/min离心15min，用1mol/L HCl溶液补至10mL，吸取0.2mL按上述步骤操作，根据标准曲线计算样品中硫酸根含量。
对三种经降解得到的LMWCS进行硫酸根含量的测定，并以CS作为对照，比较三种降解方式对CS中的硫酸根含量的影响，结果如图1所示。可以看出，LMWCS-E的硫酸根含量与降解前的CS相比没有发生显著变化(P>0.05)，这说明采用酶降解制备LMWCS的方法较为温和，不会造成CS中硫酸基团的损失，对其主要活性基团的保留较好；在LMWCS-H的测定结果中，硫酸根含量出现了一定程度的下降(P<0.05)；而在经酸降解得到的LMWCS-A中，硫酸根的含量发生了显著的降低(P<0.01)，在三种LMWCS中最低，仅有14.84％，酸降解反应剧烈，导致硫酸基团的损失和二糖结构的破坏，从而影响到其生物活性。
实施例5化学结构分析
1.红外光谱分析
将样品干燥至恒重，与KBr研磨成粉，混合均匀，制成压片，采用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描分析(4000-400cm-1)。
鳐鱼CS及其经不同方法降解得到的LMWCS-A、LMWCS-H和LMWCS-E的红外光谱图如图2所示，它们都有相似的特征吸收峰，表明官能团基本一致：(1)在4000-1800cm-1的信号范围内，3435cm-1处有宽且强的O—H伸缩振动峰，此为CS上羟基的特征吸收峰；2920cm-1处有明显的甲基的吸收峰。(2)1800-400cm-1的信号范围则属于糖胺聚糖类的特征吸收峰区域，可以看出：1635cm-1和1560cm-1处分别有乙酰氨基上的C＝O不对称伸缩振动峰和N—H变角振动峰，表明乙酰氨基的存在；出现在1424cm-1和1384cm-1处的伸缩振动峰分别为羧基和—COO—的特征吸收峰，表明非离子化和离子化葡萄糖醛酸的存在。(3)硫酸取代基的特征峰信号分别归属于1262cm-1(S＝O)和821cm-1(C—O—S)处，说明含有较多的6-硫酸软骨素，即CS-C。(4)多糖糖环的的C—O特征吸收峰在1140-1045cm-1范围内被发现，927cm-1处的吡喃糖环的吸收峰表明葡萄糖醛酸的构型为β-D-吡喃葡萄糖醛酸。以鳐鱼CS的红外光谱图作为对照，分别比较三种LMWCS的特征吸收峰的波数与强度可以发现，三种降解方法得到的LMWCS，较降解前的CS，其羟基基团、糖醛酸基团和N-乙酰氨基基团未发生降解；硫酸软骨素分子仍保留了完整的多糖糖环结构，且β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-β-D-半乳糖胺的结构亦未发生破坏，表明这三种降解作用的发挥主要是通过断裂CS中二糖间相互连接的β-1，4糖苷键，而对连接单糖(糖醛酸与氨基半乳糖)之间的β-1，3.糖苷键不产生影响。
然而，经降解得到的LMWCS的某些官能团的吸收峰与鳐鱼CS的相比也存在着一定的差异：(1)LMWCS-A、LMWCS-H和LMWCS-E在1424cm-1处的羧基的吸收峰较鳐鱼CS的明显增强，而在1384cm-1处的—COO-的吸收峰则明显降低，说明LMWCS中羧基的含量上升，游离的—COO-的含量下降，表明经降解处理后，CS中离子化的葡萄糖醛酸大量转化为非离子化的葡萄糖醛酸。(2)由1262cm-1处硫酸基团的特征吸收峰发现，LMWCS-A和LMWCS-E在此处的吸收峰强度皆出现了一定的下降，而LMWCS-E的强度与降解前的CS相比并没有变化，说明在经过酸降解和氧化降解处理后，LMWCS的硫酸基团发生了脱落，而酶解处理并未对硫酸基团造成影响，这与硫酸根含量的测定结果相一致。(3)在LMWCS-E的谱图中还看出与CS和其他LMWCS不同的吸收峰，其在705cm-1处出现的较小的吸收峰为吡喃糖醛酸上形成的不饱和双键的信号峰，这表明经酶解获得的LMWCS-E的非还原端有Δ4,5-不饱和糖醛酸的形成。(4)此外，LMWCS-E在862cm-1处出现C4—O—S的伸缩振动峰，表明4-硫酸软骨素(CS-A)的存在，这与未降解的CS相似，而在LMWCS-A和LMWCS-H中并未观察到CS-A的特征吸收峰，是由于CS经过酶裂解而成的小片段LMWCS-E中，二糖单元GlcA-GalNAc4S的相对含量较高，造成此处谱峰强度的增强。
2.核磁共振氢谱分析
取50mg样品分别用重水(D2O)连续交换3次，以D2O配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，进入核磁共振波谱仪进行1H NMR分析，测定条件为：温度60℃，频率600MHz，zg30序列扫描16次。
鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H和LMWCS-E的核磁共振氢谱图如图3所示，三种LMWCS的质子信号与未降解的CS的大致相似，主要的信号有：(1)1.95ppm处重叠的GalNAc上的甲基氢信号表明三种LMWCS都是两种以上的硫酸化二糖的混合物。(2)4.43ppm和4.16ppm处分别为6-硫酸基取代的GalNAc6S的H-1信号和H-6信号，且其信号峰的强度较高，说明三种LMWCS中的主要二糖单元为GlcA-GalNAc6S，即CS-C。(3)4.10ppm处的2-硫酸基取代的GlcA2S的H-2信号表明双硫酸化的二糖单元GlcA2S-GalNAc6S(CS-D)也存在于三种LMWCS中。这些共同于CS和LMWCS谱图中发现的信号表明，经三种降解方法制备的LMWCS中，主要的硫酸化二糖仍然为CS-C，且其含量未发生明显下降，而降解前的CS中的二糖单元CS-D也被保留下来，这证明三种降解处理未对LMWCS的主要结构产生影响。
在观察LMWCS谱图的其他信号后发现，有部分信号峰发生了强度或化学位移值的变化：(1)在LMWCS-A与LMWCS-E的谱图中，3.68ppm处GlcA的H-4/5的吸收峰发生了剧烈的增强，表明两者的GlcA上有Δ4,5-不饱和双键的生成，同时在5.18ppm处出现GlcUA(不饱和的GlcA)的H-1信号，进一步证实这两种LMWCS的非还原端有Δ4,5-不饱和糖醛酸的形成，LMWCS-E中的GlcUA含量要明显高于LMWCS-A的，即LMWCS-E的不饱和度更高。(2)仅在LMWCS-E的谱图中发现了5.82ppm处的6-硫酸基取代的GlcUA的H-4信号峰，根据其较高的吸收强度，进一步证实LMWCS-E中不饱和葡萄糖醛酸的含量较高。(3)LMWCS-E在4.67ppm处的吸收峰为GalNAc4S的H-4信号，证明了CS-A的存在，而该信号在CS和其他LMWCS的谱图中并未出现。通过以上的差异信号得出结论：分别经过酸降解和酶降解得到的LMWCS-A和LMWCS-E，它们的非还原端形成了Δ4,5-不饱和糖醛酸，其中LMWCS-E的不饱和度较高，这说明酸降解法和酶降解法会对LMWCS的非还原端的结构产生影响，而氧化降解法的影响不大，得到的LMWCS-H的还原端结构与未降解的CS一致；在LMWCS-E中，CS-A的含量得到了提高，表明CS裂解酶选择性地裂解GalNAc4S残基。鳐鱼CS在经过三种不同的降解处理后，制备出的LMWCS的结构发生了不同程度变化，导致其具有不同的生物活性。
实施例6体外抗氧化能力的比较
1.DPPH自由基清除能力的测定
采用稍加改动的方法测定DPPH自由基清除能力。吸取1mL DPPH乙醇溶液(2×10- 4mol/L)，分别加入2mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS或LMWCS溶液，混匀后避光反应30min，于517nm处测定吸光度，对照组以无水乙醇代替各样品。
不同浓度(0.5-8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H以及LMWCS-E对DPPH自由基的清除能力如图4所示。由图4可知，在试验浓度范围内，随着样品浓度的增加，两种CS和三种LMWCS的DPPH·清除率皆逐渐增大，呈现出了剂量-效应关系。在同一浓度下，三种降解后的LMWCS的DPPH·清除率皆明显高于两种CS(P<0.05)。在同等浓度下，LMWCS-H的清除率略低于LMWCS-E，但比LMWCS-A要高(P<0.05)。在浓度为8mg/mL时，LMWCS-E的清除率在五种样品中最高，达到了90.88％，显示出很强的DPPH·清除能力。以上结果表明，经过降解处理后，CS对DPPH·的清除能力获得了较大的提高，清除率由降解前的68％提升至90％以上，LMWCS-E对DPPH·的清除能力最强。
2.羟基自由基清除能力的测定
分别配制2mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS或LMWCS溶液，依次加入1mL的FeSO4溶液(10mmol/L)，1mL的水杨酸钠-乙醇溶液(6mmol/L)，1mL的H2O2溶液(5mmol/L)，混匀后37℃静置反应30min，冷却至室温后在510nm处测定吸光度，空白组以蒸馏水代替各样品。
不同浓度(0.5-8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H以及LMWCS-E对羟基自由基的清除能力如图5所示。由图5可知，所有的CS和LMWCS样品均具有一定的·OH清除能力，并且同样呈现出了剂量-效应关系，即清除能力随着样品浓度的升高而增大。从图中可以看出LMWCS-H和LMWCS-E在同一浓度下也表现出了相同的清除能力。在浓度不超过2mg/mL时，鳐鱼CS和鲨鱼CS的·OH清除率均小于30％，明显低于降解后的LMWCS(P<0.05)，表现出较低的·OH清除能力；然而，当样品浓度达到4.0mg/mL时，两种CS的清除率出现了十分明显的升高，并与LMWCS-A的相当；而当浓度为8.0mg/mL时，所有的CS和LMWCS样品的清除率均超过80％，呈现出相等的·OH清除能力(P>0.05)。以上结果表明，样品浓度较低时，LMWCS比未降解的鳐鱼CS清除·OH的能力强，LMWCS-E最强。
3.超氧阴离子自由基清除能力的测定
将4.5mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.2)于25℃预热15min，分别加入1mL不同浓度(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS或LMWCS溶液和0.5mL的邻苯三酚溶液(3mmol/L)，于25℃反应15min，加入0.1mL的3％抗坏血酸溶液，在波长420nm处测定吸光度，空白组以蒸馏水代替各样品。
不同浓度(0.5-8.0mg/mL)的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H以及LMWCS-E对超氧阴离子自由基的清除能力如图6所示。从图6可以看出，降解后的LMWCS的清除率均明显高于CS(P<0.05)，LMWCS之间清除率的大小顺序依次为LMWCS-E>LMWCS-H>LMWCS-A。
4.氧化自由基吸收能力的测定
采用稍加改动的方法测定氧化自由基吸收能力。吸取50μL不同浓度的水溶性维生素E(Trolox)溶液(12.5、25、50、100、200μmol/L)置于酶标板的微孔中，与50μL荧光素钠(FL)溶液(126nmol/L)混合均匀，37℃预热10min后，加入100μL AAPH溶液(221mM)，以激发波长485nm，发射波长535nm，每隔2min检测各待测孔的荧光强度值，持续60min。用相同体积的磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂作为阴性空白；用相同体积的磷酸盐缓冲液代替抗氧化剂和AAPH溶液作为阳性空白。以时间为横坐标，荧光强度值为纵坐标，分别绘制出样品、阴性空白、阳性空白的荧光衰变曲线，利用近似积分法，计算阴性空白与样品所围成的曲线下面积(ATU)值，并以ATU值为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，绘制Trolox抗氧化标准溶液的ORAC标准曲线。分别配制浓度为4mg/mL的鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS和LMWCS样品的溶液，它们的ORAC值即可通过计算其ATU值得到，并以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g(μmolTE/g)表示,ORAC值越高，抗氧化剂的抗氧化能力越强。
鲨鱼来源的CS标准品、鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H以及LMWCS-E的ORAC值如图7所示，三种LMWCS的ORAC值明显高于两种CS，表现出更强的自由基吸收能力。通过分析可知，各个样品的ORAC的强弱顺序为LMWCS-E>LMWCS-H>LMWCS-A>鳐鱼CS>鲨鱼CS，其中LMWCS-E的ORAC值最高，可达188.1μmol TE/g。
5.抗氧化能力的比较
鳐鱼CS、LMWCS-A、LMWCS-H和LMWCS-E对三种自由基的半数抑制浓度和ORAC值见表3。
表3 CS和LMWCS之间抗氧化能力的比较
Figure BDA0002403936920000131
由表3可以看出，三种LMWCS均具有较强的自由基清除能力和较高的ORAC值，表现出比CS更强的抗氧化能力。此外，综合表中数据，能够得出所有样品总的抗氧化能力的强弱顺序，依次为：LMWCS-E>LMWCS-H>LMWCS-A>鳐鱼CS。这些结果表明，通过降低CS的分子量，能够在很大程度上增强其抗氧化活性，其中酶降解得到的LMWCS-E的抗氧化能力最强。

Claims (7)

1.一种硫酸软骨素降解产物，其是鳐鱼硫酸软骨素降解得来。
2.根据权利要求1所述的鳐鱼硫酸软骨素降解产物，其特征在于，所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物的分子量为5000-8400。
3.根据权利要求1所述的鳐鱼硫酸软骨素降解产物，其特征在于，所述鳐鱼硫酸软骨素降解产物硫酸根含量为17.26％。
4.一种鳐鱼硫酸软骨素的降解方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
1)称取鳐鱼硫酸软骨素样品1g溶解于50mL Tris-乙酸缓冲溶液中；
2)加入硫酸软骨素酶8-12U，于37℃培养箱中反应6h；
3)取出后85℃灭酶5min，冷却至室温后，调pH至7.0；
4)使用MWCO 3500Da透析袋透析，48h后，真空冷冻干燥得到产物，于4℃干燥条件下储藏。
5.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的降解方法，其特征在于，所述步骤1)中Tris-乙酸缓冲溶液为50mmol/L Tris与60mmol/L乙酸钠、pH值为8.0的缓冲溶液。
6.根据权利要求4所述的鳐鱼硫酸软骨素的降解方法，其特征在于，所述步骤2)加入硫酸软骨素酶10U。
7.权利要求1-6任一项所述的鳐鱼硫酸软骨素降解产物或包含鳐鱼硫酸软骨素降解产物的组合物在抗氧化中的应用。
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