CN104140472A - 精品硫酸软骨素a和c和制备精品硫酸软骨素a和c的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法。其中制备精品硫酸软骨素A和C的方法包括：向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。

Description

精品硫酸软骨素A和C和制备精品硫酸软骨素A和C的方法

发明领域

本文涉及精品硫酸软骨素A和C，以及制备精品硫酸软骨素A和C的方法。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,以下简称为“CS”)广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。由于不同生物或者相同生物的不同组织所含CS的种类和量均不同，CS通常是一种混合物，主要由硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A，以下简称为“CS-A”)、硫酸软骨素C(chondroitinsulfate C，以下简称为“CS-C”)、软骨素(chondroitin)和硫酸皮肤素(chondroitinsulfate B，dermatan sulfate，以下简称为“DS”)构成，上述这些均为二糖单元构成的线性高分子，平均分子量均为25000道尔顿左右，其各自的二糖结构单元如图1所示。

如上所述，硫酸软骨素(CS)是多种多糖组成的混合物，因此其结构与活性是复杂多样的。作为一类重要的生物大分子，CS具有广泛的生物活性，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛和偏头痛等(参见：张天民，凌沛学，糖胺聚糖研究新进展[J].食品与药品,2008,10(9):1-5；Volpi N.Quality of differentchondroitin sulfate preparations in relation to their therapeutic activity[J].JPharm Pharmacol,2009,61:1271-1280；Uebelhart D,Knols R,de Bruin E D等人，Treatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate[J].AdvPharmacol,2006,53:475–488；Kahan A,Uebelhart D,De Vathaire F等人，Long-term effects of chondroitins4and6sulfate on knee osteoarthritis:the studyon osteoarthritis progression prevention,a two-year,randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Arthritis Rheum,2009,60:524-533(正确)；ChristinaMalavaki，Shuji Mizumoto等人，Recent Advances in the Structural Study ofFunctional Chondroitin Sulfate and Dermatan Sulfate in Health and Disease.Connective Tissue Research,49:133–139,2008)。

4种硫酸软骨素多糖的二糖结构单元

随着CS全球市场需求量的增大，其产量逐年增加，如2008年我国出口CS达3121吨，出口额为1.86亿美元(参见：吴慧芳，2009硫酸软骨素360°产业论坛(青岛)2009：20-27)。中国是全球硫酸软骨素产量最大的国家，占全球产量80％以上，2006-2009年的年平均产量为3300吨，年复合平均增长率为24％(参见：乔海利，2010硫酸软骨素360°产业论坛(青岛)，2010)。

目前广泛应用的硫酸软骨素是其中的硫酸软骨素A和C(CS-A和CS-C)组分，而对于其中的硫酸皮肤素组分的应用很少，其实际应用价值还处于实验室研究阶段(参见：Christina Malavaki，Shuji Mizumoto等人，RecentAdvances in the Structural Study of Functional Chondroitin Sulfate andDermatan Sulfate in Health and Disease.Connective Tissue Research,49:133–139,2008)。

硫酸皮肤素可以代替肝素或者硫酸乙酰肝素与基质蛋白质相互作用，基质蛋白质比如有纤连蛋白(参见：Walker,A.和Gallagher,J-T(1996)Structuraldomains of heparan sulphate for specific recognition of the C-terminalheparin-binding domain of human plasma fibronectin(HEP II).Biochem.J.,317,817–871)、细胞膜接受器和血小板因子4(参见：Cella,G.,Boerri,G.,Saggiorato,G.,Paolini,R.,Luzzato,G.和Terribile,V.I.(1992)Interaction betweenhistidine-rich glycoprotein and platelet factor4with dermatan sulphate andlow-molecular-weight dermatan sulphate.Angiology,43,59–62.)，硫酸皮肤素在呼吸道合胞病毒(RSV)感染中起到重要作用(参见：Hallak,L.K.,Collins,P.L,Knudson,W.和Peeples,M.E.(2000)Iduronic acid-containingglycosaminoglycans on target cells are required for efficient respiratory syncytialvirus infection.Virology,271,264–275)。DS通过提供一个催化模板(提供抑制因子以及蛋白酶结合的位点)而使通过肝素辅因子2(HCII)抑制凝血酶的速率提高大约1000倍(参见：Liaw,P.C.Y.,Becker,D.L.,Stafford,A.R.,Fredenburgh,J.C和Weitz,J.I.(2001)Molecular basis for the susceptibility of fibrin-boundthrombin to inactivation by heparin cofactor II in the presence of dermatansulphate but not heparin.J.Biol.Chem.,276,20959–20965)。

结合HCII的DS片段包括六糖和八糖，而且IdoA的C-2和GalNAc的C-4硫酸化会得到最高的亲和能力(参见：Maimone,M.M.和Tollefsen,D.M.(1990).Structure of dermatan sulphate hexasaccharides that binds to heparincofactor II with high affinity.J.Biol.Chem.,265,18263–18271)。除此之外，DS在纤维组织母细胞生长因子2(FGF-2)的信号转导中起到潜在的作用。Penc等人证明在伤口修复中从PGs释放出来的DS同样可以激活FGF-2的信号转导(参见：Penc,S.F.,Pomahac,B.,Winkler,T.,Dorschner,R.A.,Eriksson,E.,Herndon,M.和Gallo,R.L.(1998)Dermatan sulphate released after injury is apotent promoter of fibroblast growth factor-2function.J.Biol.Chem.,273,28116–28121.)。DS还可以结合并激活肝(实质)细胞生长因子(HGF/SF)(参见：Lyon,M.,Deakin,J.A.,Rahmoune,H.,Fernig,D.G.,Nakamura,T.和Gallagher,J.T.(1998)Hepatocyte growth factor/scatter factor binds with high affinity todermatan sulfate.J.Biol.Chem.,273,271–278)。

根据上述内容可以看出，如果硫酸软骨素A和C中混入硫酸皮肤素，则由于硫酸皮肤素复杂的作用可能会引起很多副反应，因此有必要对作为原料的硫酸软骨素混合物进行精制，以从硫酸软骨素组合物中除去硫酸皮肤素，得到含硫酸软骨素A和C的精制产品。此外，由于硫酸软骨素中的软骨素的含量非常少，因此通常认为需要从原料硫酸软骨素混合物中除去的主要的杂质为硫酸皮肤素。

发明内容

目前已有的硫酸软骨素的纯化方法有酶法、有机溶剂沉淀法、盐沉淀、超滤、和离子色谱法等多种方法。Martin B.Mathews使用蛋白水解酶去除牛来源的硫酸软骨素钠中的痕量杂质，得到分子量为5000道尔顿的硫酸软骨素钠(Martin B.Mathews.The molecular weight of sodium chondroitin sulfate bylight scattering[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1956,61:367-377)。Nicola Volpi使用乙醇沉淀的纯化方法，向硫酸软骨素溶液中加入少量乙醇，在低温下静置后离心，取上清液重复以上步骤，最后得到高纯度的硫酸软骨素(Nicola Volpi.Purification of heparin,dermatan sulfate and chondroitin sulfatefrom mixtures by sequential precipitation with various organic solvents[J].Jornalof Chromatography B,1996,685:27-34)。Kazuaki Kakehi等人使用5mg/mL的氯化十六烷基吡啶纯化硫酸软骨素，当溶液中硫酸钠的浓度增加到0.1mol/L时，硫酸软骨素的沉淀量达到最大(Kazuaki Kakehi，Yu-ko Maeya，YasuyoshiMiki，Yasuo Oda，Shozo Hayase.Use of a binary mixture of quanternaryammonium salts in fluorometric determiniation of glycosaminoglycans[J].Analytical biochemistry,1997,252:56-61)。B.Lignot等人采用管形的三氧化铝膜纯化硫酸软骨素，滤膜的孔径分别为100、50、20nm，溶液的透过速率分别为每平方米90、60、43L/h，硫酸软骨素的截留率均为100％，肽类的截留率分别为20％、45％、45％，盐类的截留率分别为50％、65％、70％(B.Lignot,V.Lahogue,P.Bourseau.Enzymatic extraction of chondroitinsulfate from skate cartilage and concentration desalting by ultrafitration[J].Journal of Biotechnology,2003,103:281-284)。熊双丽等人使用DEAE-52和DEAE-sepharose FF离子交换层析纯化硫酸软骨素粗品，实验结果表明DEAE-sepharose FF更适合于分离纯化此类多糖，因为后者不仅带有离子交换功能还具有分子筛效应(熊双丽，金征宇，不同分子量硫酸软骨素的制备和抗氧化活性探讨[J].中成药，2006，28(9)：1343-1346)。

上述硫酸软骨素的精制方法都很粗放，纯化效果不佳，并且上述方法的操作较为麻烦，成本较高，比较费时，需要昂贵的仪器，而且回收的硫酸软骨素是多种成分的混合物，收率和纯度低。

此外，由于硫酸皮肤素(DS)和硫酸软骨素A和C的结构很类似，通过蛋白水解酶法、有机溶剂沉淀法、盐沉淀、超滤、和离子色谱法等方法得到的硫酸软骨素A和C的收率和纯度一般较低，产品中含有的多糖种类较多，不够单一。目前尚没有方法可以有效和有针对性地除去硫酸软骨素混合物中与硫酸软骨素A和C结构类似的硫酸皮肤素等杂质。

因此，鉴于上述问题，本申请的发明人进行了深入地研究，提出了如下的方案解决了上述问题。

本文的一个方面提供一种精品硫酸软骨素A和C。具体来说：

(1).一种精制的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为5质量％以下、优选为3质量％以下、进一步优选为1质量％以下、优选为0.8质量％以下、优选为0.5质量％以下、优选为0.3质量％以下、优选为0.1质量％以下、优选为0.05质量％以下。

(2).根据(1)所述的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量％以上、优选为93质量％以上、优选为95质量％以上、优选为97质量％以上、优选为98质量％以上、优选为99质量％以上、进一步优选为99.5质量％以上、优选为99.7质量％以上、优选为99.9质量％以上。

本文的另一个方面涉及一种硫酸软骨素A和C的精制方法(制备精品硫酸软骨素A和C的方法)，具体来说：

(3).一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括：

向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。

(4).根据(3)所述的方法，其还包括：

通过分离方法分离除去混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素。

(5).根据(4)所述的方法，其中所述低分子量的硫酸皮肤素为分子量在2000道尔顿以下的经降解的硫酸皮肤素。

(6).根据(3)所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBP-ChonB(SEQ ID NO:1)。

(7).根据(3)所述的方法，其中包括进一步除去硫酸软骨素酶B，其中，通过将加入了硫酸软骨素酶B的溶液加热至70℃以上，优选加热至80℃以上以停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。

(8).根据(4)所述的方法，其中，所述分离方法为醇沉淀分离。

(9).根据(4)所述的方法，其中，所述分离方法为超滤膜分离。

(10).根据(8)所述的方法，其中，所述醇沉淀分离是一级乙醇沉淀分离。

(11).根据(3)所述的方法，其中，硫酸软骨素酶B与硫酸皮肤素的反应在20～40℃的条件下，优选在25～35℃的条件下进行，以及在pH为6.5-9的条件下，优选pH为7～8.5的条件下进行。

(12).根据(3)所述的方法，所述硫酸软骨素酶B和所述硫酸软骨素混合物的比例为：100IU～10000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，优选为500IU～5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU-5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物。

(13).根据(3)所述的方法，其中，所述含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨；以及来自贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜的基本含硫酸软骨素A和C的混合物，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨。

(14).根据(3)所述的方法，其中，所述硫酸软骨素混合物溶液的浓度为1g/L～500g/L，优选为1g/L～100g/L。

本文利用硫酸软骨素酶B，通过使硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素反应，将硫酸皮肤素降解为小分子(硫酸皮肤素的二糖形式)，并利用分子量小的组分在乙醇中溶解度高、高分子硫酸软骨素溶解度低的特点，通过随后乙醇沉淀(通常可以是一级沉淀，即一次乙醇沉淀)而得到基本上不含硫酸皮肤素的硫酸软骨素A和C的混合物，或者采用超滤膜分离过滤除去硫酸皮肤素二糖而截留大分子的硫酸软骨素A及硫酸软骨素C。由此使得到的产品中硫酸软骨素的种类更为单一，纯度更高。此外由于后续获得精品硫酸软骨素A和C的步骤较为简单，降低了成本并同时达到硫酸软骨素收率提高的双重效果。

附图说明

图1为利用Thermo公司的Hypersil-SAX色谱柱(3.0×250mm，34105-253030)分析硫酸软骨素原料中DS含量的色谱图。方法如下：在1mL、50mg/mL的待分析样品中加入0.5IU硫酸软骨素酶B，在30℃下反应24h，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在原料中存在DS。

图2为利用Thermo公司的Hypersil-SAX色谱柱(3.0×250mm，34105-253030)分析对比例1中得到的硫酸软骨素产品中DS含量的色谱图。方法如下：在1mL、50mg/mL的待分析样品中加入0.5IU硫酸软骨素酶B，在30℃下反应24h，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在对比例1的产品中存在DS。

图3为利用Thermo公司的Hypersil-SAX色谱柱(3.0×250mm，34105-253030)分析实施例1中得到的精品硫酸软骨素中DS含量的色谱图，方法如下：在1mL、50mg/mL的待分析样品中加入0.5IU硫酸软骨素酶B，在30℃下反应24h，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的弱峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在实施例1的产品中存在很少的DS。

图4为利用Thermo公司的Hypersil-SAX色谱柱(3.0×250mm，34105-253030)分析实施例2中得到的精品硫酸软骨素中DS含量的色谱图，方法如下：在1mL、50mg/mL的待分析样品中加入0.5IU硫酸软骨素酶B，在30℃下反应24h，然后进行色谱分析。色谱图在20分钟左右出现的弱峰表示DS降解后得到的二糖的峰，表明在实施例2的产品中存在很少的DS。

具体实施方式

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。本文中，所涉及的数值一般指重量或重量百分比，除非特殊说明。

在本说明书的上下文中，本文所提到的全部出版物、专利申请、专利和其它文献，若非另有说明，通过引用将其整体明确地并入本文，用于仿佛完全阐明的全部目的。

除非另有定义，本文所使用的全部技术和科技术语具有本文所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。若有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。

<精品硫酸软骨素A和C>

本文的一个方面提供一种精制的硫酸软骨素A和C。精品硫酸软骨素A和C通常以粉末状态存在。

该硫酸软骨素A和C中的硫酸皮肤素(DS)成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为5质量％以下，优选为3质量％以下，进一步优选为1质量％以下，优选为0.8质量％以下，优选为0.5质量％以下，最优选为0.3质量％以下，优选为0.1质量％以下，优选为0.05质量％以下。在本文中，对于硫酸皮肤素成分含量的下限没有具体限定，可以是所采用的检测方法的极限值，例如可以是0.001质量％或以上。

此外，就本文的精品硫酸软骨素A和C而言，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量％以上，优选为93质量％以上，优选为95质量％以上，优选为97质量％以上，优选为98质量％以上，优选为99质量％以上，进一步优选为99.5质量％以上，优选为99.7质量％以上，优选为99.9质量％以上。

在本文中通过色谱方法来检测硫酸软骨素混合物中硫酸皮肤素的含量。在本文的检测方法中，利用硫酸软骨素酶B与待测样品中的硫酸皮肤素反应并将其降解为二糖形式，并通过色谱方法来检测降解形成的二糖从而判断待测样品中是否含有硫酸皮肤素。所述色谱方法是能够用于检测二糖含量的色谱方法，通过其检测样品中含有的硫酸皮肤素经降解后得到的二糖的量，并通过该量来表征样品中硫酸皮肤素的量。具体的检测方法的实例可以参见实施例部分描述的色谱测定方法。

利用色谱方法测定可以获得在色谱谱图中代表二糖的特征峰的峰面积的数值，通过该数值的大小来反应硫酸皮肤素的相对量，并通过与硫酸皮肤素含量已知的标准样品的二糖特征峰的峰面积来比对、计算出待分析样品中硫酸皮肤素的量。具体的计算方法可以参见实施例部分描述的计算方法。

在本文中，涉及对硫酸软骨素A和C的含量进行检测的方法。可以直接检测硫酸软骨素A和C的含量：利用硫酸软骨素酶ABC在一定条件下，将硫酸软骨素酶解成硫酸软骨素A和C对应的二糖，然后通过离子交换色谱分析二糖的含量，换算成硫酸软骨素的含量。具体方法见中国药典2010版第二部984-985页。

或者测定硫酸软骨素A、C和DS的总含量，参见欧洲药典7.0版：采用滴定法测定，通过与标准品比对确定硫酸软骨素含量。具体方法见European Pharmacopoeia7.01681-1683。

在本文中针对经过通常的纯化步骤，除去了其它杂质的硫酸软骨素的粗产品，由于通常仅含有硫酸软骨素A和C，以及难以除去的杂质硫酸皮肤素，因此硫酸软骨素A和C的含量也可以通过从100质量％中减去检测到的样品中硫酸皮肤素的量的方法来确定。

<制备精品硫酸软骨素A和C的方法>

本文的另一个方面涉及一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括：

向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。

(含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物)

本文的含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物是指含有硫酸软骨素A和C的原料，因此只要是主要含硫酸软骨素A和C的原料即可，通常硫酸软骨素A和C的含量占原料的比例在20质量％以上，在30质量％以上，在40质量％以上，在50质量％以上，在60质量％以上，在70质量％以上，在80质量％以上，在90质量％以上或者更高。在本文中的含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物是指未经本文所述的方法进行处理的含有硫酸皮肤素等杂质的混合物。当然该硫酸软骨素混合物也可以是经过了通常的纯化步骤除去了其它多种杂质但尚未除去硫酸皮肤素等杂质的含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物。例如可以从安徽科宝生物工程有限公司、四川广元申达实业有限公司购买含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物。

或者本文所涉及的硫酸软骨素混合物也可以是从动物中直接提取得到，并通过本文中引用的文献记载的方法进行初步纯化。目前提取硫酸软骨素混合物的原料种类也逐渐增多。所用原料不仅有猪、牛、羊、驴、鸡等软骨，也有鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼软骨，还有贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜等。

硫酸软骨素混合物的来源有陆地动物和海洋动物两大类。陆地动物主要是牛、猪、和禽；海洋动物包括软骨鱼的软骨、海参和贝类等。陆地动物的硫酸软骨素混合物中，硫酸软骨素A是主要组成组分，而海洋动物则以硫酸软骨素C为主。USP-NF2003年第一增补版颁布的CS(硫酸软骨素)标准中对其来源作了认定：健康的、适合人类食用的牛、猪和禽的软骨，而对海洋动物来源未予认定。

来自动物的硫酸软骨素混合物可以是来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨的提取物；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨的提取物；以及来自贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨(参考文献：张雷，刘新.硫酸软骨素不同提取工艺的探讨.黑龙江科技信息，2009(29):253-253)。

(硫酸软骨素酶B)

在该方法中，硫酸软骨素酶B可以是通过任何方法获得的硫酸软骨素酶B。该硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，也可以利用能够生产硫酸软骨素酶B的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、也可以是细胞提取物经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶B的细菌例如有肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus或Flavobacterium heparinum)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和嗜水气单孢菌(Aeromonas liquefaciens)。

例如，硫酸软骨素酶B来自肝素黄杆菌。

硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品，例如购买自Sigma、IBEX等公司的硫酸软骨素酶B。

其中，来自肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶B可以通过直接使用肝素黄杆菌菌体、菌体的细胞提取物、或细胞提取物经初步纯化后得到的含酶溶液。也可以利用该硫酸软骨素酶B分别在大肠杆菌中重组表达后得到的经基因工程操作的酶。

在本文中，硫酸软骨素酶B可以是与MBP融合的硫酸软骨素酶，即MBP-ChonB。该MBP-ChonB的氨基酸残基序列如SEQ ID No:1所示，其DNA序列如SEQ ID No:2所示，关于MBP-ChonB的详细描述可以参考申请号为201110358134.7的中国专利申请。

MBP-ChonB可以是以具有该酶基因的细菌的粗培养液、该粗培养液的细胞提取物、或者是根据简单的纯化方法得到的酶粗产品、或者进一步纯化得到的酶产品形式被利用。

在上述方法中，硫酸软骨素酶B与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物进行反应，反应过程中硫酸软骨素酶B降解硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素。本文对于该反应条件没有特别地限定，只要是硫酸软骨素酶B能够发挥活性，有效地降解硫酸皮肤素的反应条件即可，本领域技术人员可以根据所使用的酶和原料进行适当地选择。在一个具体的实施方式中，反应在20～40℃的条件下，优选在25～35℃的条件下进行，以及在pH为7～8.5，优选在30℃，PH7.5的条件下进行。

对于上述反应进行的时间也没有具体限定，只要是能够将作为原料的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素充分降解皆可。所述充分降解是指在反应进行的过程中通过紫外可见光分光光度计检测反应体系在232-235nm处的吸光度，当吸光度不再变化时，认为其中的硫酸皮肤素已经被充分降解。因此仅需要根据不同的酶量、不同的操作条件，选择适当的反应时间即可，本领域技术人员可以适当地调节。在一个具体的实施方式中，反应进行的时间根据加入的酶量和DS的含量适当调整。

在上述方法中，本领域技术人员可以根据原料中含有的DS的量，以及计划进行的反应时间来适当地确定硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素混合物的比例，所述比例在100IU～100000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，优选为500IU～5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU-5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物。

其中硫酸软骨素酶B的1IU定义为：在30℃，pH值为7.5的条件下能产生1μmol4,5-不饱和糖醛酸的酶量。

此外，硫酸软骨素混合物的浓度为1g/L～500g/L，优选为1g/L～100g/L。在进行本文所述的方法之前，可以称量一定量的待精制的硫酸软骨素混合物，将其加入到去离子水中，配制成1g/L～500g/L，优选为1g/L～100g/L的浓度。

在本文所述的方法中，由于硫酸软骨素A和C的分子量在25000道尔顿左右，而经硫酸软骨素酶B反应而降解的硫酸皮肤素是基本上以二糖形式存在的低分子经降解的硫酸皮肤素，其分子量一般在2000道尔顿以下，例如1000道尔顿以下，或约为400～500道尔顿，由于分子量明显不同于硫酸软骨素A和C，因此可以容易地在后续步骤中利用分子量的差异从混合物中分离出目标产品硫酸软骨素A和C。

在本文涉及的方法中，还包括：可以添加反应终止剂使酶失活然后除去该酶。所述反应终止剂例如酸、碱等。考虑到不再向反应体系中增加其它的杂质，可以通过加热的方法使酶失活从而停止反应。加热的温度只要是使硫酸软骨素酶B失活并产生絮状沉淀的温度即可，例如可以加热至70℃以上，优选加热至80℃以上，加热的时间可以根据加热的温度选定，例如可以列举在80℃加热20分钟，从而停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。

进一步，在通过上述加热过程使硫酸软骨素酶B失活并产生絮状沉淀后，通过离心分离除去加热后沉淀的硫酸软骨素酶B，对于离心分离的转速和时间没有具体限定，只要可以除去沉淀的硫酸软骨素酶B即可。在本文一个具体的实施方案中，例如可以在10000rpm的转速下离心10分钟。此外，通过上述的离心步骤可以除去硫酸软骨素混合物中的其它的杂质，例如蛋白质等。

本文所述的方法还包括：通过分离方法分离除去所述含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素(硫酸皮肤素的二糖)，从而得到精品硫酸软骨素A和C。

例如，通过如上所述离心除去硫酸软骨素酶B后，得到了含有硫酸软骨素A和C的中间产品。然后通过分离方法除去所述含有硫酸软骨素A和C的中间产品中的、经酶分解后得到的低分子硫酸皮肤素。

由于经过硫酸软骨素酶B降解后，硫酸皮肤素降解为二糖形式，因此其分子量与硫酸软骨素A和C不同，利用分子量不同，可以利用本领域技术人员已知的不同的分离方法来实现分离，从含有硫酸软骨素A和C的中间产品分离除去经酶分解后得到的低分子硫酸皮肤素。所述分离方法例如有利用醇溶液进行的醇沉淀分离、梯度离心、膜过滤方法等。

所述醇沉淀是本领域普通技术人员所熟知的醇沉淀方法，由于分子量小的物质的醇溶性更好，在同样的乙醇浓度下更容易溶解而除去，因此在本文所述的方法中，可以利用醇沉淀分离方法来除去降解后的低分子的硫酸皮肤素。通常可以采用30～70％的乙醇溶液进行分级分离，静置一段时间后，收集沉淀。在本文实施例中通过乙醇进行醇沉淀，利用的乙醇是80重量％的乙醇溶液。在本文所述的方法中，醇沉淀可以进行1～3次。在本文的一实施方式中，醇沉淀是利用乙醇溶液进行的一次乙醇沉淀，即进行一次乙醇沉淀。具体操作的方式例如添加80重量％的乙醇溶液，在10000rpm的转速下离心10分钟，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥离心得到的沉淀物质12小时，得到经精制的硫酸软骨素A和C的产品。

由于降解后的硫酸皮肤素的分子量低于硫酸软骨素A和C，因此在本文的方法中可以利用超滤膜截留不同分子量的物质，从而可以实现将低分子量的硫酸皮肤素二糖与硫酸软骨素A和C的分离。对于超滤膜的种类没有具体的限制，可以根据操作选择合适截留分子量的超滤膜，例如根据购买的厂商的使用说明书中标注的截留分子量来进行选择，通常可以选择截留分子量为1000道尔顿、3000道尔顿、5000道尔顿、8000道尔顿以及10000道尔顿的市售超滤膜。本文实施例中使用了超滤膜的截留分子量为1000道尔顿。利用超滤膜分离的方法例如可以是使待分离的混合物溶液切向通过超滤膜，其中分子量小于截留分子量的物质透过膜，大分子等回流到初始的待分离的混合物溶液中进入下一次膜分离，如此循环，直至效率截留分子量的小分子基本透过超滤膜，从而实现将大分子与小分子分离的目的。可以使用例如美国通用GE、美国3M、日本东丽、旭化成、海德能、新加坡凯发等公司提供的超滤膜。

在本文的一个具体的实施方式中，使用Minipore公司的超滤膜PLAC1K。该超滤膜的使用条件可以参考其说明书，在该实施方式中，控制进口压力0.18-0.2Mpa，回流压力0.06-0.08MPa，操作60分钟，切向流速大约1L/min，过滤体积100ml，循环次数为600次。

通过上述本文的制备精品硫酸软骨素A和C的方法得到的质量收率可以通过：(精品硫酸软骨素A和C产品/原料硫酸软骨素混合物)×100％来计算。

利用本文所述的方法可以获得本文的精品硫酸软骨素A和C，即硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总含量中所占的比例为5质量％以下，优选为3质量％以下，进一步优选为1质量％以下，优选为0.8质量％以下，优选为0.5质量％以下，优选为0.3质量％以下，优选为0.1质量％以下，优选为0.05质量％以下。

硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总含量中所占的比例为90质量％以上，优选为93质量％以上，优选为95质量％以上，优选为97质量％以上，优选为98质量％以上，优选为99质量％以上，进一步优选为99.5质量％以上，优选为99.7质量％以上，优选为99.7质量％以上、优选为99.9质量％以上。

实施例

下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。此外，在实施例中使用的是MBP-ChonB作为硫酸软骨素酶B的代表，本领域技术人员应当理解，任何形式的硫酸软骨素酶B均可以用于实现本发明的目的。除非另有说明，实施例中涉及的百分比为质量百分比，份数为质量份数。

检测降解后的低分子硫酸皮肤素量的色谱测定方法

流动相A的配制：称取0.308g的NaH₂PO₄置于1000ml容量瓶中，加入950ml的水溶解，使用磷酸调节溶液pH至2.9，最后用水定容至刻度线，使用前过滤并超声脱气。

流动相B的配制：称取80g的高氯酸钠置于1000ml容量瓶中，加入950ml的流动相A溶解，使用磷酸调节溶液pH至3.0，最后用流动相A定容至刻度线，使用前过滤并超声脱气。

酶解溶液：在50mg/mL的待分析样品1mL中加入0.5IU硫酸软骨素酶B，在30℃下反应24h使得待分析样品中的硫酸皮肤素降解成硫酸皮肤素的二糖，然后利用下述分析条件了分析降解后的硫酸皮肤素的量。

分析条件：

检测波长：234nm。

色谱柱：3×250mm，填料粒径5μm，填料类型L14A

(Thermo,Hypersil-SAX，5μm，3.0×250mm，34105-253030)

保护柱：填料粒径5μm，填料类型L14A。

(100x2.1mm5um Hypersil GOLD SAX，26305-102130)

流速：0.45ml/min。

柱温：50℃。

进样量：10μl。

采集时间：0-80min

流动相梯度：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	97	3
40	40	60
			60	20	80
61	0	100
			70	0	100
71	97	3
			80	97	3

对比例1

向从安徽科宝生物工程有限公司购买的含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中添加去离子水。配制成50g/L的浓度，并使总体积为100ml，调节其PH为7.5，30℃保温2h到溶液。然后在80℃的温度下加热20min，加热结束后利用离心机，在10000rpm离心10min。向离心后的上清液中加入无水乙醇使其含量为80％(酒精度计测定)，然后利用离心机，在10000rpm离心10min，并在冷冻干燥机(日本东京理化，FDU-1100)中冷冻干燥在上述一次离心过程中收集到的沉淀物质12h，得4.88g硫酸软骨素产品，收率为97.6％。

DS含量变化如下计算：

利用上述色谱方法检测硫酸软骨素混合物原料(已知原料中的DS含量为5％)中的DS二糖的峰面积为8709444(保留时间19.347分钟)，色谱图如图1所示。

利用上述色谱方法检测对比例1得到的硫酸软骨素产品的DS二糖的峰面积为7026852(保留时间19.434分钟)，色谱图如图2所示。

对比例1得到的产品中的DS含量为(7026852/8709444)*5％＝4.03％。

由于在本实施例中使用的原料是直接购买主要含硫酸软骨素A和C，以及硫酸皮肤素的混合物，因此本发明得到的硫酸软骨素A和C的含量为100％-4.03％＝95.97％。

实施例1(利用MBP-ChonB+醇沉)

向从安徽科宝生物工程有限公司购买的含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中添加去离子水。配制成50g/L的浓度，并使总体积为100ml，调节其PH为7.5。向其中加入50IU的MBP-ChonB，30℃反应2h到溶液在232nm下的吸光度不再变化为止。然后在80℃的温度下加热20min，加热结束后利用离心机，在10000rpm离心10min。向离心后的上清液中加入无水乙醇使其含量为80％(酒精度计测定)，然后利用离心机，在10000rpm离心10min，并在冷冻干燥机(日本东京理化，FDU-1100)中冷冻干燥在上述一次离心过程中收集到的沉淀物质12h，得4.70g精品硫酸软骨素A和C，收率为94％。

DS含量变化如下计算：

利用上述色谱方法检测硫酸软骨素混合物原料(已知原料中的DS含量为5％)中的DS二糖的峰面积峰面积为8709444(保留时间19.347分钟)，色谱图如图1所示。

利用上述色谱方法检测实施例1得到的精品硫酸软骨素A和C的DS二糖的峰面积为30324(保留时间19.533分钟)，色谱图如图3所示。

实施例1的产品中DS含量为(30324/8709444)*5％＝0.017％。

由于在本实施例中使用的原料是直接购买主要含硫酸软骨素A和C，以及硫酸皮肤素的混合物，因此本发明得到的硫酸软骨素A和C的含量为100％-0.017％＝99.983％。

实施例2(利用MBP-ChonB+超滤膜过滤)

向从安徽科宝生物工程有限公司购买的含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中添加去离子水。配制成50g/L的浓度，并使总体积为100ml，调节其PH为7.5。向其中加入50IU的MBP-ChonB，30℃反应2h到溶液在232nm下的吸光度不再变化为止。然后在80℃的温度下加热20min，加热结束后利用离心机，在10000rpm离心10min。上清液进行膜分离(Minipore,PLAC1K)进口压力0.18-0.2MPa，回流压力0.06-0.08MPa，操作60min，切向流速大约1L/min，过滤体积100ml，循环次数为600。收集过滤后的回流液在冷冻干燥机(日本东京理化，FDU-1100)中冷冻干燥12h，得4.71g精品硫酸软骨素，收率为94.2％。

DS含量变化如下计算：

利用上述色谱方法检测硫酸软骨素混合物原料(已知原料中的DS含量为5％)中的DS二糖的峰面积峰面积为8709444(保留时间19.347分钟)，色谱图如图1所示。

利用上述色谱方法检测实施例2得到的精品硫酸软骨素A和C的DS二糖的峰面积为43360(保留时间19.776分钟)，色谱图如图4所示。

实施例2的产品中DS含量为(43360/8709444)*5％＝0.025％。

硫酸软骨素A和C的含量为100％-0.025％＝99.975％。

表1实施例1、2和对比例1的比较

根据表1所列举的数据可以知道利用硫酸软骨素酶B可以有效地除去目前市售的硫酸软骨素粗产品中极其难以除去的硫酸皮肤素杂质，得到精品硫酸软骨素A和C。利用本发明的方法仅需要通过简单的一次(一级)乙醇沉淀或膜分离之后，就可以除去基本上全部的硫酸皮肤素杂质。硫酸皮肤素杂质由对比例1中的4.03％，降低到0.017％和0.025％，去除率高达99％以上。本文涉及的制备精品硫酸软骨素A和C的方法工艺简单，易于操作，可以获得良好的精品硫酸软骨素A和C。简化了目前生产硫酸软骨素A和C时使用的繁杂的方法。

虽然，本发明以多种不同形式详细地描述概括于本发明的优选的实施方式中。但是，本公开的内容仅是本发明精神的举例说明并且本发明并不限于所举例的实施方式。所提及的所有专利、专利申请、科技论文、以及任何其它的参考资料均通过参考的方式将其全部内容结合引入。另外，本发明包括某些或全部所描述的和所结合的各种实施方式的任何可能的组合。

上述公开的内容意在举例说明并且是非穷举的。对于本领域技术人员来说，本说明书具有多种变形和替换方式。全部的这些变形和替换方式包括在权利要求的范围之内，其中所述“包括”意思是“包括，但不限于”。那些熟悉本领域的人员能够认识到本发明所描述的实施方式的其它等价形式，这些等价形式同样包括在权利要求的范围之内。

所公开的全部范围和参数理解为含概任意和全部其所包括的子范围，以及端点之间的每个数值。例如，所述的“1～10”应理解为含概最小值1和最大值10之间(并且包括端点)的任意和全部子范围；也就是说，以最小值1或更高值开始的全部子范围(例如，1～6.1)，并且以最大值10或更小值结束(例如，2.3～9.4、3～8、4～7)，并且最终每个数值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10均包括在该范围。

至此，完成了对本发明优选的和可替换的实施方式的描述。本领域技术人员能够认识到所描述的实施方式的其它等价形式，这些等价形式包括在附加的权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种精制的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸皮肤素成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为5质量％以下、优选为3质量％以下、进一步优选为1质量％以下、优选为0.8质量％以下、优选为0.5质量％以下、优选为0.3质量％以下、优选为0.1质量％以下、优选为0.05质量％以下。

2.根据权利要求1所述的精品硫酸软骨素A和C，其中，硫酸软骨素A和C成分在所述精品硫酸软骨素A和C的总量中所占的比例为90质量％以上、优选为93质量％以上、优选为95质量％以上、优选为97质量％以上、优选为98质量％以上、优选为99质量％以上、进一步优选为99.5质量％以上、优选为99.7质量％以上、优选为99.9质量％以上。

3.一种制备精品硫酸软骨素A和C的方法，其包括：

向含硫酸软骨素A和C成分的硫酸软骨素混合物的溶液中加入硫酸软骨素酶B，使其与含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物中的硫酸皮肤素成分反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其还包括：

通过分离方法分离除去混合物中的经酶分解后得到的低分子量的硫酸皮肤素。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述低分子量的硫酸皮肤素为分子量在2000道尔顿以下的经降解的硫酸皮肤素。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶B，即MBP-ChonB(SEQ ID NO:1)。

7.根据权利要求3所述的方法，其中包括进一步除去硫酸软骨素酶B，其中，通过将加入了硫酸软骨素酶B的溶液加热至70℃以上，优选加热至80℃以上以停止硫酸软骨素酶B与所述硫酸皮肤素成分的反应，然后通过离心分离从所述溶液中除去加热后的硫酸软骨素酶B。

8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离方法为醇沉淀分离。

9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离方法为超滤膜分离。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述醇沉淀分离是一级乙醇沉淀分离。

11.根据权利要求3所述的方法，其中，硫酸软骨素酶B与硫酸皮肤素的反应在20～40℃的条件下，优选在25～35℃的条件下进行，以及在pH为6.5-9的条件下，优选pH为7～8.5的条件下进行。

12.根据权利要求3所述的方法，所述硫酸软骨素酶B和所述硫酸软骨素混合物的比例为：100IU～10000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，优选为500IU～5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物，更优选为1000IU-5000IU硫酸软骨素酶B/kg硫酸软骨素混合物。

13.根据权利要求3所述的方法，其中，所述含硫酸软骨素A和C的硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊、驴、鸡等的软骨；来自鲟鱼、鲨鱼、鱿鱼、魟、鳐、鳗、鳝鱼等的软骨；以及来自贝类、海参、蚯蚓、鹿茸和蛋壳膜的基本含硫酸软骨素A和C的混合物，优选所述硫酸软骨素混合物来自猪、牛、羊等的软骨。

14.根据权利要求3所述的方法，其中，所述硫酸软骨素混合物溶液的浓度为1g/L～500g/L，优选为1g/L～100g/L。