CN1711284A - 分离硫酸软骨素 - Google Patents

Abstract

一种从包含结缔组织的原料中分离硫酸软骨素产品的方法。

Description

分离硫酸软骨素

技术领域

本发明涉及分离方法，更具体地是获得和分离硫酸软骨素的方法。

背景

硫酸软骨素是一种十分有用的糖胺聚糖-GAG(粘多糖)，且在形成蛋白聚糖(由GAG构成的大分子)的较大分子的代谢转化中起关键作用。硫酸软骨素在结缔组织如软骨、腱、皮肤、血管壁、巩膜、角膜和椎间盘中存在并最丰富。

硫酸软骨素已被作为一种饮食补充物使用，用来预防和最近用于治疗与结缔组织有关的疾病。有人建议软骨素可以用作骨关节炎或变性关节疾病的替代性治疗，现在认为软骨素可帮助产生健康的结缔组织。

概要

本发明的特定实施方案提供了从原料中分离硫酸软骨素的方法，包括使用沉淀剂或试剂从消化的原料液体中除去杂质。将液体消化物经过膜，在滞留物中保留硫酸软骨素。

在本发明的一个方面，提供了从原料中获得硫酸软骨素的方法，包括提供含有结缔组织的原料；用蛋白酶消化原料以形成液化的消化和未消化物质；用包含碱土金属的二价氢氧化物的试剂来处理液化的消化物，将pH升到大于约10，以沉淀蛋白质杂质；从处理过的液化消化物中分离沉淀物；使用膜来加工处理过的液化消化物以形成渗透物和滞留物，其中滞留物中包含硫酸软骨素。

有利的是，本发明的示范性方法在使用中可不加入乙醇，并可处理广泛来源的原料。该方法可获得高水平的硫酸软骨素的纯度。

本发明的一个或多个实施方案的详情可见附图和下文的描述。本发明的其他特性、目的和优点可从本文描述和附图，和从权利要求中显而易见。

附图的简要说明

图1提供了描述本发明实施方案步骤的流程图。

详细描述

图1是提供包括在本发明的示范性方法中的一般步骤流程图，其中硫酸软骨素从处理的原料中分离和获得。如图中所见，硫酸软骨素可通过以下方法分离，该方法包括：将原料消化成液化消化物，从液化消化物中沉淀杂质，从液化消化物中分离沉淀物，通过膜过滤液化消化物获得滞留物，任选地对滞留物干燥以获得硫酸软骨素产物。

在该方法的消化部分中，原料是供给处理的。该原料混合入具有pH大约4到大约7的缓冲溶液中，pH大约4.5到约5.5较佳。在消化过程中，该原料/缓冲液混合物的温度可以在大约55℃到大约80℃。在本发明的一个方面，该混合物可以在大约65℃到大约75℃。可将蛋白酶加入混合物中以帮助消化原料。合适的蛋白酶包括例如，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白水解酶，和它们的组合物。在消化步骤中，混合物的pH可保持在避免对酶活性不良作用的水平上。阳离子，如乙酸钠缓冲液也可任选地加入混合物中帮助消化过程。

供给本发明方法的原料可包括来自各种椎骨的结缔组织。例如，合适的原料可获得自牛、羊、猪、马、鸟和鱼。结缔组织如软骨可以是有用的，这几乎包括可获得的量的硫酸软骨素的牛、猪、家禽种类中发现的所有软骨来源。可使用包括一些形式软骨的椎骨的各个部分，如肩胛骨、脐、气管、食管等的分。原料不一定是高等级或“清洁”的。即使在原料包括未被预先修整的(外部材料如脂肪被移去)的材料时，仍可获得足够量的硫酸软骨素。因此，含有大量部分的原料可供给本发明的方法并仍提供高纯度的硫酸软骨素产物。

消化原料产生两个部分：(未消化物质)和液化消化物。液化消化物进行处理步骤以除去和/或沉淀出不需要的杂质。这些可包括任何蛋白质或蛋白质降解产物，如包括但不限于肽、多肽、氨基酸、脂蛋白、糖等。杂质的提取可通过使用试剂提高pH从液化消化物中沉淀和除去杂质来完成。在该方法的一个方面，在液化消化物中加入一种试剂将pH提高到大于约10。大约11.0到大约11.3的pH可以从液化消化物中沉淀脂蛋白。

在使用大范围原料等级时，可存在的确定的杂质是44kda杂质。已经发现通过使用包含碱土金属的二价氢氧化物的试剂可将杂质连同其他杂质沉淀出而除去。合适的试剂包括有强沉淀特性的试剂，例如，氢氧化钙和氢氧化镁。在该方法的沉淀部分中，温度和pH的组合可提供除去蛋白质和其他杂质的有利条件。例如，液体化消化物可在大约0℃到大约80℃的温度处理。pH可维持在大于约10。在一个方面，在该方法的沉淀阶段中，pH可在大约11到大约11.5。

在沉淀步骤作为处理步骤执行时，将杂质从处理的液化消化物中分离的沉淀时间可以变化。例如，取决于系统处理的体积，杂质可在大约20分钟到大约15小时中沉淀出。通过在混合物中任选地加入絮凝剂可以减少沉淀时间。现在认为氢氧化钙的功能不仅是作为沉淀剂，而且可作为絮凝剂。

其中有沉淀物的经过处理的液化消化物随后进行分离步骤从液化消化物中除去沉淀的杂质。这可以通过常规技术如离心和过滤来完成。从经过处理的液化消化物中分离沉淀物有助于确保随后的步骤，膜过滤可有效地进行。因此，优选可以除去大部分的沉淀物从而减至最低程度和避免物质对膜的阻塞。

在膜过滤步骤中，经过处理的液化消化物穿过膜来分离物质。这可以使用按照物质的分子量分离物质的技术进行。结合具有特定的分子量截断的膜，可使用如渗滤或超滤的技术。为了在滞留物(即，被膜保留的液体)中保留硫酸软骨素产物和允许较高分子量物质作为渗透物的分离和通过，膜可具有的分子量截断约5,000到约15,000。根据本发明方法的一个方面，膜可具有的分子量截断在约8,000到约10,000。

在渗滤中，通过加入水可维持所需的固体百分比水平(如，约1-5％)。在渗滤中，滞留物和加料压力可有很大的变化。现在认为这部分是由于在渗滤前的物质中发现的固体百分比范围和材料的杂质分布。例如，液化消化物的加料温度维持在大约3℃到大约50℃；然而，渗滤可以在加料温度大约15℃到大约40℃进行。加料压力可以在大约10到大约35psi，而滞留物的压力可以在大约0到大约25psi。

任选的是，为了浓缩和获得需要的纯度水平，可重复膜过滤步骤。例如，如果滞留物通过膜处理至少两次，可获得较高水平的纯度。

在膜过滤以后，如果需要，滞留物可以随后进行干燥步骤，通过例如蒸发来除去水分，以获得充分干燥的硫酸软骨素。可使用任何常规的干燥技术，包括例如，盘式干燥或鼓式干燥。如果需要，干燥可在升高的温度和压力下进行。

根据本发明的示范性方法，干燥步骤后生成的干燥物质可产生＞90％的硫酸软骨素。在另一方面，干燥物质可有＞约95％的硫酸软骨素。

可在本发明方法中进行的另外的任选步骤是硅胶处理。使用硅胶可增加硫酸软骨素产物的纯度。

实施例

实施例1

软骨质原料在消化缓冲液(pH 4.8-5.0)中消化，该消化缓冲液由1000g蒸馏水、和8.86g 50％氢氧化钠水溶液，和10.91g冰醋酸组成。脐软骨(601.07g)加入缓冲液中，该混合物温度随搅拌而升到65℃。当温度达到60℃时加入木瓜蛋白酶(5g)。随后4小时出现消化。消化后从混合物的顶部虹吸产生的脂肪层，用#1Whatman^TM过滤器进行真空过滤除去bora/未消化物质。余下的消化后液体(1302.73g)进行脂蛋白沉淀。

在沉淀步骤中，分类为脂蛋白的杂质按照下列方法获得。消化后物质被冷却到49℃。通过在水中加入50％氢氧化钠，物质的pH被升高到11.3。脂蛋白层在约3℃沉淀处理。顶部清晰层通过蠕动泵被移到第二个容器中，而底部脂蛋白层包含的液体用#5Whatman^TM过滤器进行真空过滤。沉淀脂蛋白后的溶液(1258.98g)被确定含有23.17克的硫酸软骨素，基于原料重量等于3.85％产量。

使用渗滤进一步浓缩和纯化溶液。该脂蛋白除去后的样品被加热到40℃和使用蠕动泵通过包含8,000分子量截断膜的Millipore Pellicon II超滤单元进行循环。加料和滞留物压力通过滞留阀控制，在加料压力达到25psi时滞留物压力保持在10psi。渗滤出现大约4小时，整个运转消耗1409.66g补充水。最终的浓缩样品(150.68g)被确定含有21.70克硫酸软骨素。渗透物样品(2032.2g)被确定没有可检测水平的硫酸软骨素。

浓缩物(150.68g)随后被倒入平底Pyrex^TM蒸发皿，并在减压下和在约70℃用氮吹洗干燥。产生的饼状物(22.7g)被确定为92.48％纯，相当于21.07克硫酸软骨素。计算该方法产量为90.94％。

实施例2

从牛软骨无溶剂纯化硫酸软骨素利用了产物与杂质的分子量的差异。通过渗滤除去蛋白质杂质是可能的，其中杂质经过膜而保留产物。产物与杂质分子量之间的差异越大，越容易获得纯度。但是，杂质与产物的分子量大致相同，则产物不能除去。

在液化消化物中发现的杂质鉴定为44kda杂质。通过比较不同的原料，修整过的(外部材料除去如脂肪)和未修整过的原料来确定杂质的来源。观察到该杂质的影响取决于原料来源，和原料的清洁。

44kda杂质被确定大部分包含在特定原料中的外部材料内，而不来自软骨本身(见表1)。

表1

原料	44kda杂质％
		修整过的胛骨A	0.01
修整过的胛骨B	0.006
		来自样品A的外部修整物	0.03
来自样品B的外部修整物	0.05

如数据中所见，当具有外部材料如脂肪的原料被修整掉时，发现44kda杂质的量较低。外部修整物本身，在用作原料时产生较高水平的44kda杂质。

实施例3

如用HPLC方法“Percent2M”测定那样，已确定获得大于90％纯度的终产品，44kda杂质应少于0.03％。由于适当地清除所有的原料来源达到该水平在经济上通常是不可行的，寻找了获得高纯度产品的替代方法。只有在使用胛骨和修整过的脐软骨时才可达到大于过90％的纯度(见表2)。

表2

原料	44kda杂质％
		修整过的脐	0.006
胛骨	0.03
		气管	0.07
食管	0.09

为了除去44kda杂质，发现第二处理步骤是有利的。在消化后，混合物的pH被升高到11-11.3(通过氢氧化钠)以沉淀出脂蛋白杂质。使用氢氧化钙代替氢氧化钠用来升高pH，观察到44kda蛋白质水平明显下降(见表3)。用所有可用的原料来源可以获得大于90％的纯度。

表3

原料	消化后44kda	用NaOH处理后44kda	用Ca(OH)2处理后44kda
				食管	0.08	0.06	0.01
气管	0.07	0.06	0.01
				胛骨	0.03	0.01	0.01

已描述了本发明的许多实施方案。然而，应当理解在不背离本发明的精神和范围可进行各种改变。因此，其他实施方案是在以下的权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种获得硫酸软骨素的方法，所述方法包括：

a)提供包含结缔组织的原料；

b)用蛋白酶消化原料以形成液化的消化和未消化物质；

c)用包含碱土金属的二价氢氧化物的试剂在pH大于约10时处理液化的消化物，以形成包含蛋白质杂质和处理过的液化消化物的沉淀物；

d)从处理过的液化消化物中分离至少一部分沉淀物；和

e)使用膜来加工处理过的液化消化物以形成渗透物和滞留物，其中所述滞留物包含硫酸软骨素。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包含干燥滞留物以产生包含硫酸软骨素的充分干燥的产物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于结缔组织包含软骨。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于结缔组织是选自牛、羊、猪、马、鸟和鱼的至少一种脊椎动物中获得的组织。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于蛋白酶是选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白水解酶、链霉蛋白酶、和它们的组合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)是在大约55℃到大约80℃的温度下进行的。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于缓冲液是在步骤b)中加入的。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)是在大约0℃到大约80℃的温度下进行的。

9.如权利要求1所述的方法，进一步包含在步骤c)中加入絮凝剂。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中的试剂是氢氧化钙。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)是在大约10℃到大约60℃的温度下进行的。

12.如权利要求2所述的方法，其特征在于充分干燥的产物包含至少约90％的硫酸软骨素。

13.如权利要求2所述的方法，其特征在于充分干燥的产物包含至少约95％的硫酸软骨素。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于膜的分子量截断约5,000到约15,000。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于膜的分子量截断约8,000到约10,000。

16.按照权利要求2的方法制备包含硫酸软骨素的粉末。

17.一种获得硫酸软骨素的系统，包括：

用来提供包含结缔组织的原料和一定量的蛋白酶的供给设备；

与供给设备连接的消化容器，消化容器用来将原料分解成液化消化物和未消化物质；

与消化容器连接的反应器，反应器用来以包含碱土金属的二价氢氧化物的试剂处理液化消化物，和

反应器后的过滤设备，该设备包含膜，其中该设备被用来使渗透物通过膜并保留包含硫酸软骨素的滞留物。

18.如权利要求17所述的系统，其特征在于膜的分子量截断约5,000到约15,000。

19.如权利要求17所述的系统，其特征在于膜的分子量截断约8,000到约10,000。