KR101346059B1

KR101346059B1 - 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법

Info

Publication number: KR101346059B1
Application number: KR1020120068600A
Authority: KR
Inventors: 이희삼; 조유영; 권해용; 남성희; 류강선; 강필돈; 박광영; 김미자; 최용수; 김호진; 황정욱
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2013-12-31
Also published as: KR20130031194A

Abstract

본 발명은 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법에 관한 것이다.
본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법은, 누에를 준비하는 제1단계, 상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 분리된 실샘을 물로 용해하여 제1 용해물을 제조하는 제2단계, 상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액을 취하는 제3단계, 상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조하는 제4단계, 상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조하는 제5단계, 상기 중화액을 탈염하여 가수분해물을 수득하는 제6단계 및, 상기 수득된 가수분해물을 동결건조하는 제7단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능하면서, 세포증식효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법이 제공된다.

Description

누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법{THE OBTAINING METHOD OF HYDROLYSATE FROM SILKWORM GLAND}

본 발명은 누에를 동결건조하여 수집한 실샘으로부터 가수분해물의 수득방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능한 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법에 관한 것이다.

누에로부터 수득이 가능한 실크 단백질은 물에 잘 녹지 않는 피브로인과 물에 잘 용해되는 세리신을 주요 성분으로 나눌 수 있다. 이 중 세리신은 고분자 단백질로 극성용매에 녹거나, 산이나 알칼리 용액에 분해되거나, 단백질 분해효소에 의해 분해될 때 온도, pH, 처리시간 등의 다양한 요소에 의해 최종 산물의 분자량 및 특성이 변화될 수 있다.

이러한 고분자 실크 단백질은 의학 생재료, 기능성 멤브레인, 하이드로겔, 그리고 기능성 섬유로서 대부분 사용되어 왔다.

견사에는 세리신 30%와 피브로인 70%의 2종 단백질로 구성되어 있고, 세리신은 피브로인을 코팅한 상태로 존재하고 있다.

현재 이러한 견사 등으로부터 세리신을 얻는 방법으로, 일본 특허 제3011759호(세리신 미분 및 그 제조법)에는 종래의 정련 폐액으로부터 세리신을 회수하는 방법이 공개되어 있는데 이는, 평균 분자량 50,000이하의 저분자량의 것밖에 얻을 수 없었다. 즉, 견사 중의 세리신은 결정화되어 있기 때문에, 대부분 물에 녹지않으며, 알칼리성 용매로는 용해 가능함을 알 수 있다.

또한, 일본특허 제3959452호(세리신의 추출방법)에는 세리신 추출을 위해 고온가열로 용해를 해야만 추출이 가능함을 알 수 있다.

이에, 현재까지 공지된 발명들은 누에고치로부터 복잡한 공정들을 거쳐야지만 세리신 생산이 가능하므로 공정 및 기간이 오래 걸려 비경제적인 면이 있으며, LiBr과 같은 유해한 용매를 사용하며, 90℃이상의 고온가열로 용해를 해야만 세리신 수득이 가능하였다.

본 발명의 목적은 유해한 용매를 사용하지 않고, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능하며, 세포증식효과가 우수한 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법은, 누에를 준비하는 제1단계, 상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 분리된 실샘을 물로 용해하여 제1 용해물을 제조하는 제2단계, 상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액을 취하는 제3단계, 상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조하는 제4단계, 상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조하는 제5단계, 상기 중화액을 탈염하여 가수분해물을 수득하는 제6단계 및, 상기 수득된 가수분해물을 동결건조하는 제7단계를 포함하여 구성된다.

상기 제2단계의 제1 용해물 제조시, 분리된 실샘을 미세분말로 제조한 후 물로 용해한다.

또한, 상기 제2 용해물 제조시, 알칼리로 NaOH를 사용하며, 상등액을 15~30℃에서 가수분해하는 것이 특징이다.

또한, 상기 중화액 제조시, 산으로 인산을 사용하는 것이 특징이다.

본 발명의 가수분해물은 상기와 같은 수득방법을 통해 수득되는 것이 특징이며, 특히 상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유하는 것이 특징이다.

또한, 상기 가수분해물은 수용성인 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출로 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득이 가능하여 기존의 누에 유래 실크 단백질을 수득하는 공정 및 기간을 단축시킬수 있다.

또한, 누에 실샘 분말에서 가수분해물을 수득함으로써 가수분해물의 회수율 및 순도를 증대할 수 있으며, 아울러, 제조과정에서 생기는 결정화 성질로 인하여 물에 완전히 녹지 않는 형태의 분말을 완전히 물에 녹는 형태의 가수분해물로 수득이 가능하다.

이러한 본 발명의 누에 유래 가수분해물은 무혈청 첨가효과가 우수하며, 세포증식효과가 우수하여 혈청대체제로 사용가능하며 피부코팅효과, 보습, 항산화능, 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로도 사용가능하다.

도 1은 본 발명의 수용성 가수분해물의 수득공정의 일예시도.
도 2는 누에로부터 분리한 실샘을 초미세분말로 가공 후 SEM(주사형 전자 현미경)을 통해 나타낸 도면.
도 3은 누에 원료별로 수득한 수용성 가수분해물의 각 단백질 분자량 분포정도를 나타낸 도면.
1: 대조군
2: 실시예 1(누에 숙잠) 3: 실시예 2(세리신 잠)
도 4는 수용성 가수분해물의 FTI-IR 분석을 나타낸 그래프.
SGH: 누에 실샘 가수분해물(silkworm gland hydrolysate)
CSH: 누에고치 세리신 가수분해물(Cocoon sericin hydrolysate)
도 5는 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 독성시험결과를 나타낸 그래프.
도 6a는 대조군인 고치(cocoon) 유래 가수분해물에 대한 무혈청 배지에서 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 그래프.
Basal media: 기본 배지
0.01mg/㎖, 0.1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 1mg/㎖ : 대조군 가수분해물 시약 농도
10% FBS(fetalbovine serum): 우(牛)태아 혈청
도 6b는 본 발명의 실시예 2의 가수분해물에 대한 무혈청 배지에서 가수분해물 첨가 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 그래프.
Basal media: 기본 배지
0.01mg/㎖, 0.1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 1mg/㎖ : 본 발명의 실시예 2의 가수분해물 농도
10% FBS(fetalbovine serum): 우(牛)태아 혈청
도 7은 세포배양 접시에 가수분해물 코팅 농도에 따른 세포 부착정도(Fold change in cell number) 및 증식효과를 나타낸 그래프.
도 8은 수용성 가수분해물의 활성산소 억제 효과를 나타낸 그래프.
SGH: 누에 실샘 가수분해물(silkworm gland hydrolysate)
CSH: 누에고치 세리신 가수분해물(Cocoon sericin hydrolysate)

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명의 누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제1단계: 누에 준비

실크원료로 누에를 사용하며, 본 발명에서 누에의 종으로 Bombix mori 종을 사용하나, 이에 국한한 것은 아니며 일반적으로 실샘을 수득할 수 있는 누에로 여겨지는 모든 종은 사용가능하다.

특히, 세포증식효과가 우수하며 사육시간 및 인건비를 감소시켜 가수분해물을 수득하기 위해 상기 누에는 숙잠을 사용하는 것이 바람직하다.

2. 제2단계: 제1 용해물 제조

상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 물로 용해하여 제1 용해물을 제조한다.

동결건조는 실샘과 혈림프의 분리를 용이하게 해주는 역할을 한다.

상기 실샘은 초미세분말 상태일 경우 성분변화를 최소화할 수 있도록 상온(15~30℃)에서 용이하게 용해가 이루어질 수 있다.

또한, 상기 실샘은 초미세분말로 제조하여 물로 용해하는 것이 바람직하다. 이는, 용해시 물분자와 접촉면적이 최대화되어 용해가 잘 이루어지며, 실온에서 용해된 실샘 단백질만을 분리할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 상기 실샘 미세분말의 입자 크기는 600~800mesh 인 것이 좋다.

상기 물은 증류된 증류수를 사용하는 것이 좋으며, 그 함량은 상기 제1 용해물이 완전 용해되도록 제1 용해물에 제1 용해물이 완전 용해가능할 정도의 물을 넣고 용해한다.

상기 실샘 분말은 하기와 같은 방법들 중 어느 하나의 방법으로 분리된다.

1) 수작업으로 가로×세로 0.5mm 씩 그물코를 갖는 체 또는 망을 이용하여 분리한다.

2) 볼밀을 이용하여 실샘을 분리한다(볼밀 직경 1~5cm, 회전수 80~120분)

3) 물리적으로 파쇄 후 바람을 이용하여 분리한다.

3. 제3단계: 상등액 획득

상기 제1 용해물을 원심분리한 후, 가라앉은 침전물을 제외한 나머지 상등액만을 회수한다.

4. 제4단계: 제2 용해물 제조

상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조한다.

상기 알칼리로는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는 것이 좋다. 이는, 수산화나트륨(NaOH)으로 인해 상기 상등액이 분자량이 작은 펩타이드(peptide)로 분해가 이루어지도록 해주기 때문이다.

바람직하게는 NaOH를 사용하되 최종 농도가 0.2~1M이 되도록, 더욱 바람직하게는 1M 이 되도록 첨가한 후, 상온(15~30℃)에서 0.5~1시간 정도, 더더욱 바람직하게는 30분간 가열하여 가수분해한다.

즉, 상기 상온에서도 모두 분해가 가능하므로, 기존에 고온 처리시 수득된 가수분해물의 특성이 일부 변형되는 것을 방지할 수 있으면서, LiBr과 같은 유해한 용매를 사용하지 않아도 가수분해물의 분리가 가능하다.

5. 제5단계: 중화액 제조

상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조한다.

이때, 산으로는 인산을 사용하는 것이 바람직하며, 이때 다른 종류의 산을 사용할 수는 있으나, 다른 종류의 산을 사용하는 경우에는 하기의 탈염과정이 어려운 문제점이 있다.

이에 상기 인산으로 2N 인산을 사용하는 것이 좋으며, 이는 중화점인 종말점을 맞추기 쉽고, 또한 작업시 취급이 용이하고 안전하기 때문이다.

상기 인산은 pH가 7.0~7.5 정도가 될 때까지 첨가하여 중화액을 제조한다.

6. 제6단계: 탈염

탈염은 시료에 포함되어 있는 염류를 제외하는 조작으로 순수(純水) 가수분해물을 얻을 목적으로의 시행되는 것이다.

이에 탈염 방법으로는 통상적인 탈염 방법으로 모두 사용가능하나, 물질이 분자량 수천 이상인 고분자의 경우는 염류와의 분자크기 차이를 이용하는 여러 가지 방법, 즉 겔여과, 한외여과, 투석 등으로 사용하는 투석용 막의 분자량은 5K 이하의 것, 바람직하게는 3.5K 이하의 것을 사용하도록 한다.

7. 제7단계: 가수분해물 수득

상기 탈염 후 이를 동결건조하여 가수분해물을 수득한다.

다시말해, 상기 수득된 물질은 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)이 혼합된 상태의 실샘이 상온에서 용해가 되는 실크 단백질을 가수 분해하여 얻은 것이므로 피브로인과 세리신 모두 혼합된 상태이다. 이에 상기 수득된 물질을 본 발명에서는 "가수분해물"이라고 명명한다.

특히 상기 가수분해물은 물에 용이하게 용해되기 위해 수용성인 것이 특징이다.

상기 가수분해물은 동결건조 후 분말형태로 분쇄하여 하기와 같이 사용하기도 한다.

이와 같이 상기의 과정을 통해 유해한 용매를 사용하지 않으면서, 상온추출만으로 가수분해물 수득이 가능하여 기존 누에고치에서 가수분해물을 수득하는 공정 및 기간을 단축시킬 수 있다.

또한, 실샘분말에서 가수분해물을 추출하여 물 분자와의 접촉하는 표면적 증대로 회수율 및 순도를 증대할 수 있으며, 또한, 제조과정에서 생기는 가수분해물의 결정화 성질로 인하여 물에 완전히 녹지 않는 형태의 분말을 완전히 물에 녹는 형태로 수득 가능하다.

이렇게 수득된 가수분해물은 상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유한다. 이는 현재 타 회사에서 판매중인 가수분해물보다 더 많이 함유되어 있는 것이다.

또한, 상기 수득된 가수분해물은 세포독성이 없어 무혈청 배지에 첨가하여 사용이 가능하며, 10% FBS가 첨가된 배양액에서 배양한 세포증식 효과보다 더 우수하여 혈청대체제로 상품화도 가능함을 알 수 있다.

이에, 고가수입의 대체효과를 누릴 수 있으며, 이로 인해 양잠농가의 부가소득원으로 사용가능하며, 항산화능, ROS 억제능, 세포사멸억제능이 높아 피부친화력 등의 물성이 우수한 소재로 개발 가능하며 배양첨가물, 코팅제, 화장품 첨가제의 원료소재로도 사용가능하다.

하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 수용성 가수분해물1 수득

도 1에 도시되어 있듯이, 먼저 실크 원료로 누에 숙잠을 준비하고 이를 동결건조하였다.

상기 동결 건조물을 통해 실샘을 분리하고 이 분리된 실샘을 초저온 분쇄기 (cryogenic mill)에 투여하여 초미세분말로 가공하였으며, 이를 SEM(주사형 전자 현미경)을 통해 확인한 바 도 2와 같이 나타났다.

이렇게 가공된 누에실샘 초미세분말을 상온(15~30℃)에서 30분간 교반하면서 용해하여 제1 용해물을 제조하였다.

상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액만을 취하고 여기에 NaOH를 첨가하되, 최종 1M이 되도록 상기 상등액에 첨가하여 24℃에서 30분간 교반하여 제2 용해물을 제조하였다.

상기 제2 용해물을 인산을 이용하여 pH가 7이 되도록 중화하여 중화액을 제조하였다.

상기 중화액을 한외여과(ultrafiltration) 방법으로 탈염하였다.

그 후 다시 동결건조하여 최종 물질인 수용성 가수분해물1을 수득하였다.

<실시예 2> 본 발명의 수용성 가수분해물2 수득

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 숙잠 대신 세리신 잠을 사용하여 최종 물질인 수용성 가수분해물2를 수득하였다.

<실험예 1> 실크 원료에 따른 가수분해물의 함량 비교

상기 실시예 1과 2에 제시된 본 발명의 특징적인 가수분해물을 수득해 내되, 실크원료별로 제조된 가수분해물에 대해 최종적으로 회수된 가수분해 분말의 함량을 확인하였다.

그 결과, 아래의 표 1과 같이 나타났다.

	초기 사용량(g)	최종 회수 분말(g)
일반누에 실샘 미세분말 '실시예1'	1.0	0.2
세리신잠(Sericinjam) 실샘 미세분말 '실시예2'	1.0	0.89

상기 표 1에 나타나 있듯이, 실시예2의 세리신잠의 실샘에는 피브로인이 없고 거의 100%가 세리신만으로 구성되어 있는 것으로 일반 누에(실시예1)보다 높은 가수분해물의 회수율을 얻음을 알 수 있었다.

<실험예 2> 수용성 가수분해물 단백질의 분자량 측정

실시예1과 실시예2에서 수득된 분말형태의 가수분해물들의 각 단백질 분자량 패턴을 확인하기 위하여, 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다.

이때, 대조군으로는 고치(cocoon) 유래 가수분해물을 사용하였다.

상기 실험결과, 도 3에 나타나 있듯이, 본 발명의 제조공정으로 제조된 가수분해 분말들(실시예1, 실시예2)의 경우 대조군보다 분자량이 작아, 대다수의 단백질이 50kDa 이하에서 넓게 분포됨을 확인하였다.

즉, 본 발명의 제조공정으로 제조된 가수분해 분말들(실시예1, 실시예2)은 분자량이 작고 수용성임을 알 수 있었다.

<실험예 3> 가수분해물의 아미노산 분석

일반누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 아미노산 분석을 실시하였다.

아미노산 분석을 위한 가수분해 분말을 6N 염산(Hydrochloric acid)을 이용하여 120℃, 24시간 동안 진공상태에서 반응하였다.

반응이 완료된 샘플은 아미노산 자동 분석기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 표 2와 같이 나타났다.

단위: %
아미노산의 종류	SGH(본 발명)	CSH(대조군)
아스파라긴(Asx)	12.4	33.6
글루타민(Glx)	5.4	4.8
세린(Ser)	9.9	25.0
글리신(Gly)	29.5	8.6
히스티딘(His)	1.7	1.8
알르기닌(Arg)	2.2	3.9
트레오닌(Thr)	2.4	7.3
알라닌(Ala)	15.3	2.8
프롤린(Pro)	1.9	0.4
타이로신(Tyr)	7.2	4.4
발린(Val)	4.3	3.5
메티오닌(Met)	0.3	0.2
시스테인(Cys2)	0.6	0.2
이소류신(Ile)	1.8	0.7
류신(Leu)	1.8	0.9
페닐알라닌(Phe)	2.1	0.4
라이신(Lys)	1.3	1.6

상기 표 2에 나타나 있듯이 대조군인 고치 유래 가수분해물에 비해 주요 아미노산인 알라닌(ala)과 글라신(gly)의 함량이 더 높게 나타난 것을 확인하였다.

상기 알라닌과 글리신의 성분은 세포의 당대사에 중요한 역할을 하는 것으로써 궁극적으로는 세포의 에너지원으로 사용되어 세포의 증식을 증가시키는 역할을 한다.

<실험예 4> 가수분해물의 FT-IR 분석

일반누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 적외선 분광 광도계를 이용하여 구조적 특성을 확인하였다.

적외선 분광 광도계를 이용하여 4000~300cm^-1의 스펙트럼 범위에서 ATR-FTIR을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타나 있듯이, 수용성 가수분해물의 IR-스펙트럼 패턴은 1625~1655cm^-1와 3420~3440cm^-1 부근에서 최고점(peak)을 나타냈으며, 대조군인 고치 유래 가수분해물에 비해 낮은 β-구조(sheet)와 랜덤코일(random coil)의 흡열 최고점(peak)를 나타내었다.

상기 β-구조는 실샘에 존재하는 실크 단백질이 체외에 나오면서 비가역적인 반응으로 수소결합에 의한 크리스탈화(crystalizaion)가 일어나면서 생성되며 이로 인해 용해도를 떨어뜨리게 되는 것이다. 이에 β-구조가 적게 존재한다는 것은 높은 용해도를 갖는다는 것이므로 본 발명의 수용성 가수분해물은 상기 대조군보다 수용성 성질이 더 우수하다는 것을 알 수 있다.

<실험예 5> 가수분해물의 세포 독성확인

일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 세포 독성시험을 하였다.

일단 DPBS(Welgene. cat. LB 001-02)에 20 mg/㎖의 농도로 용해한 후, 배양중인 세포에 최종 0~5 mg/㎖의 농도로 가수분해물을 처리하였을 때 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 CCK-8 분석(assay)을 수행하였다.

이때, 상기 가수분해물을 세포에 처리하고 2일간 배양한 후 CCK-8 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타나 있듯이, 농도가 증가됨에 따라 세포증식 억제가 일어나지 않는 것으로 보아 독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실험예 6> 무혈청 배지를 통한 세포증식 효과 확인

일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 무혈청 배지를 통한 세포증식 효과를 측정하였다.

이때, 대조군로는 누에고치 유래 가수분해물을 사용하였다.

즉, 실시예 1의 가수분해물을 DPBS(WelGENE, cat. LB 001-02)에 20㎎/㎖ 의 농도로 용해한 후 혈청이 제거된 배지에 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1㎎/㎖의 농도로 각각 처리하였다.

10% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 배양한 세포와 비교하기 위하여 WST-1 분석을 하루 간격으로 총 4일간 측정하였다.

WST-1 분석시약을 배지의 10%가 되게 첨가하고 배양 조건과 동일하게 약 3시간 정도 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타나 있듯이, 무혈청 배지에 1% 가수분해물을 첨가한 경우(도 6b) 10% FBS를 첨가한 배지와 동등 이상의 세포증식 효과를 확인할 수 있었으며 대조군인 누에고치 유래 가수분해물(도 6a)보다 세포증식 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

<실험예 7> 증식된 세포수 측정

일반누에 숙잠의 미세분말을 이용하여 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 세포 부착 정도를 측정하여 증식된 세포수를 확인하였다.

즉, 실시예 1에서 제조된 가수분해 분말을 DPBS (WelGENE, cat. LB 001-02)에 20 ㎎/㎖ 의 농도로 용해한 후 배양 접시 표면에 처리하고 1시간 동안 37℃ 배양기에 정치해 두었다.

그 다음, 가수분해 단백질 용액을 제거한 후 포스페이트 완충용액으로 2회 세척하고 상온에서 완전히 건조시켰다

세포 부착성 시험은 가수분해물의 코팅 농도별로 세포 접종 후 2일간 배양하여 증식한 세포 수를 직접 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타나 있듯이, 가수분해물 0.5 mg/㎖의 코팅 농도에서 대조군 (sericin 0 ㎍/㎖)에 비해 약 4배의 세포 증식 증대효과를 확인하였다.

<실험예 8> 가수분해물의 ROS 억제 효과

일반 누에 숙잠의 미세분말을 이용해서 제조된 실샘 가수분해물을 대상으로 활성산소 억제 효과를 측정하였다.

배양 중인 섬유아 세포에 H₂O₂ 1 mM과 실샘 가수분해물 1 mg/ml을 30분간 처리하였다.

세포를 트립신/EDTA(trypsin 0.25%/EDTA 1 mM)을 사용해 배양접시에서 떼어낸 뒤 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)로 현탁시킨후 270 x g에서 3분 동안 원심분리 하였다.

세포 현탁액에 5M의 CM-H₂DCFDA 염료(Invitrogen)를 가하고 차광하여, 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 30분 동안 반응시켰으며 발생되는 형광을 유세포 분석기(Becton Dickinson)의 FL-1 채널을 통해 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타났듯이 고치 유래 가수분해물 보다 실샘 유래 가수분해물의 활성산소 억제 효과가 약 2배 정도 더 높게 나타났다.

이와 같이 상기 수득된 가수분해물은 세포독성이 없어 무혈청 배지에 첨가하여 사용이 가능하며, 10% FBS가 첨가된 배양액에서 배양한 세포증식 효과보다 더 우수하여 혈청대체제로 상품화도 가능하며, 항산화능, ROS억제능, 세포사멸억제능이 높아 배양첨가물, 코팅제, 화장품 첨가제의 원료소재로 사용가능하다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

누에를 준비하는 제1단계;
상기 준비된 누에를 동결건조하여 실샘을 분리하고, 분리된 실샘을 물로 용해하여 제1 용해물을 제조하는 제2단계;
상기 제1 용해물을 원심분리한 후 상등액을 취하는 제3단계;
상기 상등액에 알칼리를 첨가한 후 가수분해하여 제2 용해물을 제조하는 제4단계;
상기 제2 용해물에 산을 넣고 중화하여 중화액을 제조하는 제5단계;
상기 중화액을 탈염하여 가수분해물을 수득하는 제6단계 및,
상기 수득된 가수분해물을 동결건조하는 제7단계;를 포함하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 제2단계의 제1 용해물 제조시, 분리된 실샘을 초미세분말로 제조한 후 물로 용해하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 용해물 제조시, 알칼리로 수산화나트륨(NaOH)을 사용하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 용해물 제조시, 상등액을 15~30℃에서 가수분해하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 중화액 제조시, 산으로 인산을 사용하는,
누에 실샘 유래 가수분해물의 수득방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 수득방법에 의해 수득된,
누에 실샘 유래 가수분해물.
제6항에 있어서,
상기 가수분해물의 전체 아미노산을 기준으로 25~35%의 글리신과 10~25%의 알라닌을 함유하는,
누에 실샘 유래 가수분해물.
제6항에 있어서,
상기 가수분해물은 수용성인,
누에 실샘 유래 가수분해물.