CN112646856B - 一种螺旋藻活性肽的制备方法及其在护肤品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种螺旋藻活性肽的制备方法，包括以下步骤：1)取螺旋藻粉处理后，加入蛋白胨、PBS缓冲液配制发酵培养基；2)取葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨和PBS缓冲液，配制种子培养基；3)取葡萄汁有孢汉生酵母菌种接种于种子培养基中；然后挑出菌种接种于发酵培养基中，培养得到发酵液；4)将发酵液离心，过截留10KD超滤膜，获得螺旋藻活性肽。本发明还公开了上述螺旋藻活性肽在护肤品中的应用。本发明无需蛋白酶，成本低廉，且多肽水解度高、多肽收率高。

Description

一种螺旋藻活性肽的制备方法及其在护肤品中的应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种螺旋藻活性肽的制备方法及其在护肤品中的应用。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)，属于蓝藻门(Cyanophyta)段殖藻目(Oscilatoriales)颤藻科(Oscilatoriaceae)螺旋藻属的原核生物。螺旋藻的出现可追溯至35亿年前，是地球上最古老的生物之一。螺旋藻在世界范围内被广泛用作天然的食品补充剂，是一种低脂肪、低卡路里、无胆固醇的蛋白质来源，具有提高人体免疫力、抗病毒、抗氧化等作用，能够辅助治疗疾病，在人类保健食品及美容美妆方面具有重要的应用价值。
生物活性肽是由氨基酸组成的具有生物活性的肽类化合物。小分子的活性肽不仅能够提供机体生长发育所需的营养物质，而且具有增强免疫力、抑制细菌、抗氧化等功能。与游离氨基酸和蛋白质相比，肽能够更好、更快地被机体吸收。因此，越来越多的研究者开始关注生物活性肽，小肽的制备及其所具有的生物活性已经成为研究的热点。螺旋藻中蛋白含量丰富，约占干重的60％-70％，是优质生物活性肽的良好来源。螺旋藻蛋白酶解物和多肽的多种功能特性被广泛研究，包括抗氧化活性、抗菌活性、抗肿瘤、抗炎活性、降血压活性、矿物螯合作用等。
目前，活性肽的制备方法主要有生物酶解法，如CN10263384A公开了一种用活体螺旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法，将活体螺旋藻过滤清洗，pH达到8.5时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量小于90％；将处理好的藻泥装入反应罐内，每罐1000千克，加入酶活力为40万U/g碱性蛋白酶0.5千克，进行加温、搅拌，酶解温度为45℃，作用时间为70分钟；加入酶活力为1.5万U/g的风味蛋白酶0.3千克，进行加温、搅拌，酶解温度为45℃，作用时间为60分钟；添加1.5千克红曲霉，进行加温、搅拌，在45℃条件下反应180分钟使用喷雾干燥塔喷雾干燥，所得即为活体螺旋藻多肽粉。上述方法使用大量蛋白酶，价格昂贵，成本极高，且提取率较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低廉、水解度高的螺旋藻活性肽的制备方法及其在护肤品中的应用。
本发明提供的技术方案是一种螺旋藻活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)取螺旋藻粉加水混匀、冻融3-5次、均质，得到均质液；往均质液中加入其质量1-2％的蛋白胨，以及其体积10-15％的1-2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，灭菌，得到发酵培养基；
2)取葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨混合，加入1-2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液至100ml，灭菌，配制得到种子培养基；该种子培养基中葡萄糖的质量浓度为1-3％、酵母提取物的质量浓度为1-3％、蛋白胨质量浓度为1-3％；
3)取葡萄汁有孢汉逊酵母菌种接种于种子培养基中，在37-40℃下培养18-36h；挑出菌种接种于发酵培养基中，在37-40℃下培养36-48h，得到发酵液；
4)将发酵液离心，取上清液灭酶，过截留相对分子量为的10KD超滤膜，获得分子量范围小于10000的超滤液，即为螺旋藻活性肽。
步骤1)中，水的加入量为螺旋藻粉重量的10-20倍。
步骤1)中，所述冻融为先置于-20℃下冷冻8-12h，再置于37℃水浴解冻2-3h。
步骤1)中，所述均质为在5000-10000rpm下处理5-10min。
步骤1)中，往均质液中还添加了摩尔浓度为1-2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，其添加量为均质液体积的8-12％。
步骤1)和步骤2)中所述灭菌，均为对培养基灭菌，温度为121℃，灭菌时间为20-30分钟。
步骤2)中所述的酵母提取物，又称酵母味素，英文名称为Yeast extract，简称YE。YE(酵母提取物)是根据中华药典之规定采用以蛋白质含量丰富的食用酵母为原料,采用自溶、酶解、分离、浓缩等现代生物高新技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解后精制而成的一种棕黄色可溶性膏状或浅黄色粉状纯天然制品。
步骤3)中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母菌种在种子培养基中的接种重量比为1：40-50；所述葡萄汁有孢汉逊酵母菌种在发酵培养基中的接种重量比为1：10-20。
步骤3)中，所述培养为摇床振荡培养，其振荡频率为200-300rpm。
步骤4)中，所述灭酶是将上清液置于沸水浴中灭活10-15分钟。
本发明还提供了一种螺旋藻活性肽的制备方法所制得的螺旋藻活性肽在护肤品中的应用。
所述螺旋藻活性肽在护肤品中的添加量为0.01％-5％。
本申请的螺旋藻活性肽在护肤品原料目录名称为：酵母发酵产物提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明利用葡萄汁有孢汉逊酵母”在发酵的过程中分泌的蛋白酶直接酶解螺旋藻的蛋白质成分，无需蛋白酶制备、螺旋藻粗蛋白提取等工艺步骤，工艺简单，节约时间。
(2)生产过程消耗仅为螺旋藻原料、培养基成分，无需蛋白酶等昂贵原料，成本极低。
(3)本方法的螺旋藻蛋白水解度高，多肽收率高。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)取螺旋藻粉50g(广西农垦绿仙生物保健食品有限公司)加入500ml水混匀，先置于-20℃下冷冻8h，再置于37℃水浴解冻2h，反复冻融操作3次，在5000rpm下均质处理5min，得到均质液；往均质液中加入其质量1％的蛋白胨(英国Oxoid公司)，并加入均质液体积10％的1mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，在121℃灭菌20分钟，得到发酵培养基；
2)取葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)、酵母提取物(英国Oxoid公司)和蛋白胨(英国Oxoid公司)混合，加入1mol/L、pH7.0的PBS缓冲液至100ml，在121℃灭菌20分钟，配制得到种子培养基；该种子培养基中葡萄糖的质量浓度为1％、酵母提取物的质量浓度为1％、蛋白胨质量浓度为1％；
3)取葡萄汁有孢汉逊酵母菌种(H.uvarum)解冻后，接种于种子培养基中，接种重量比为1：40，在37℃下摇床振荡培养18h，振荡频率为200rpm；挑出菌种接种于发酵培养基中，接种重量比为1：10，在37℃下摇床振荡培养36h，振荡频率为200rpm，得到发酵液；
4)将发酵液5000rpm离心10min，取上清液，置于沸水浴中灭活10分钟，自然冷却，过截留相对分子量为的10KD超滤膜，获得分子量范围小于10000的超滤液，经0.22μm无菌过滤后，滤液即为螺旋藻活性肽。
实施例2
1)取螺旋藻粉50g(广西农垦绿仙生物保健食品有限公司)加入1000ml水混匀，先置于-20℃下冷冻12h，再置于37℃水浴解冻3h，反复冻融操作5次，在10000rpm下均质处理10min，得到均质液；往均质液中加入均质液质量2％的蛋白胨(英国Oxoid公司)，并加入均质液体积15％的2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，在121℃灭菌30分钟，得到发酵培养基；
2)取葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)、酵母提取物(英国Oxoid公司)和蛋白胨(英国Oxoid公司)混合，加入2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液至100ml，在121℃灭菌30分钟，配制得到种子培养基；该种子培养基中葡萄糖的质量浓度为3％、酵母提取物的质量浓度为3％、蛋白胨质量浓度为3％；
3)取葡萄汁有孢汉逊酵母菌种(H.uvarum)解冻后，接种于种子培养基中，接种重量比为1：50，在40℃下摇床振荡培养36h，振荡频率为300rpm；挑出菌种接种于发酵培养基中，接种重量比为1：20，在40℃下摇床振荡培养48h，振荡频率为300rpm，得到发酵液；
4)将发酵液5000rpm离心10min，取上清液置于沸水浴中灭活15分钟，自然冷却，过截留相对分子量为的10KD超滤膜，获得分子量范围小于10000的超滤液，经0.22μm无菌过滤后，滤液即为螺旋藻活性肽。
实施例3
1)取螺旋藻粉50g(广西农垦绿仙生物保健食品有限公司)加入750ml水混匀，先置于-20℃下冷冻10h，再置于37℃水浴解冻2.5h，反复冻融操作4次，在8000rpm下均质处理7min，得到均质液；往均质液中加入其质量1.5％的蛋白胨，以及其体积12％的1.5mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，在121℃灭菌25分钟，得到发酵培养基；
2)取葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)、酵母提取物(英国Oxoid公司)和蛋白胨(英国Oxoid公司)混合，加入1.5mol/L、pH7.0的PBS缓冲液至100ml，在121℃灭菌25分钟，配制得到种子培养基；该种子培养基中葡萄糖的质量浓度为2％、酵母提取物的质量浓度为2％、蛋白胨质量浓度为2％；
3)取葡萄汁有孢汉逊酵母菌种(H.uvarum)解冻后，接种于种子培养基中，接种重量比为1：45，在38℃下摇床振荡培养24h，振荡频率为270rpm；挑出菌种接种于发酵培养基中，接种重量比为1：15，在38℃下摇床振荡培养42h，振荡频率为280rpm，得到发酵液；
4)将发酵液5000rpm离心10min，取上清液置于沸水浴中灭活12分钟，自然冷却，过截留相对分子量为的10KD超滤膜，获得分子量范围小于10000的超滤液，经0.22μm无菌过滤后，滤液即为螺旋藻活性肽。
实验例1(螺旋藻活性肽的水解度和多肽收率测定)
水解度的测定方法：用样品中α-氨基态氮的量占总含氮量的百分比表示水解度(degree of hydrolysis，DH)的大小。以实施例1-3制得的螺旋藻活性肽作为样品，样品α-氨基态氮的量采用茚三酮法测定，样品总含氮量则采用凯氏定氮法测定，水解度按照下式计算。
水解度＝(样品的α-氨基态氮的量/样品的总含氮量)×100％
多肽收率的测定方法：高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物(酸溶蛋白质)可溶于酸性溶液。分别将实施例1-3的步骤4)制得的上清液酸化后，滤去沉淀，采用凯氏定氮法测定多肽含量；采用凯氏定氮法(GB/T 6432-2018)测定螺旋藻粉蛋白质含量，计算多肽收率：
多肽收率＝螺旋藻活性肽中多肽的总量/螺旋藻粉蛋白质总量×100％
测定结果如下表：
组别 水解度 多肽收率
实施例1 46.2％ 74.7％
实施例2 48.3％ 73.2％
实施例3 47.9％ 78.5％
实验例2(螺旋藻活性肽抗氧化活性研究)
1.清除DPPH自由基能力：将2mL的实施例1-3制得的螺旋藻活性肽分别与2mL0.2mmol/L DPPH的95％乙醇溶液充分混匀后，室温放置30min，于517nm处测定吸光值。DPPH·清除能力按下式计算。
DPPH·清除率＝(1-(A1-A2)/A3)×100％
式中：A1为DPPH溶液与螺旋藻活性肽测得的吸光值；A2为95％乙醇代替DPPH溶液与螺旋藻活性肽测得的吸光值；A3为蒸馏水代替螺旋藻活性肽与DPPH溶液测得的吸光值。
2.清除羟基自由基能力：以实施例1-3的螺旋藻活性肽为样品，向1mL样品中加入8.8mmol/LH2O2、9mmol/LFeSO4溶液、9mmol/L水杨酸-70％乙醇溶液各1ml，最后加H2O2启动反应，37℃反应0.5h，用蒸馏水为参比，在510nm下测定样品的吸光度记为AX；同时用蒸馏水代替样品进行空白对照试验，测得的吸光度记为A0。考虑到样品本身的吸光度，以1ml 9mmol/LFeSO4溶液、1ml 9mmol/L水杨酸-70％乙醇溶液、1ml样品和1ml蒸馏水作为样品溶液的本底吸光度，记为AX0。·OH清除能力按下式计算。
·OH清除率＝(A0-AX+AX0)/A0×100％
式中：A0为空白对照液的吸光度；AX为加入样品后的吸光度；AX0为样品本底的吸光度
螺旋藻活性肽抗氧化活性检测结果为：
组别 DPPH·清除率(％) ·OH清除率(％)
实施例1 70.2 88.6
实施例2 69.7 86.4
实施例3 71.3 87.9
实验例3(螺旋藻活性肽促细胞生长活性研究)
螺旋藻活性肽促细胞生长活性研究采用“细胞增殖法/MTT比色法”。
试剂：
(1)RPMI 1640培养液：取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)维持培养液：量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。
(3)完全培养液：量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。
(4)PBS：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
标准品溶液：取重组人表皮生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液：实施例1-3制得的螺旋藻活性肽用维持培养液稀释成每1ml约含1μg肽。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。
测定法：小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3细胞)用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1mL含1.0×105-5.0×105个细胞，传代后24-36小时弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含5.0×104-8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养64-72小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养5小时。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570mn处测定吸光度。按下式计算螺旋藻活性肽促细胞生长活性：
活性(IU/ml)＝Pr×Ds×Es/(Dr×Er)
式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml
Ds为供试品预稀释倍数
Dr为标准品预稀释倍数
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数
Er为标准品半效量的稀释倍数
螺旋藻活性肽促细胞生长活性结果
组别 活性(IU/ml)
实施例1 <![CDATA[2.45×10<sup>6</sup>]]>
实施例2 <![CDATA[2.68×10<sup>6</sup>]]>
实施例3 <![CDATA[2.65×10<sup>6</sup>]]>
实验例4(螺旋藻活性肽加入到护肤品中的安全性研究)
将实施例1-3所得螺旋藻活性肽分别制成面膜液或精华液样品，用于研究螺旋藻活性肽相关产品的皮肤刺激性与过敏性。
面膜液配方：透明质酸钠0.3％，丁二醇5％，羟苯乙酯0.1％，螺旋藻活性肽5％，水89.6％。
精华液配方：甘油2％，透明质酸钠0.1％，甜菜碱2％，海藻糖0.5％，甲基丙二醇5％，聚丙烯酸0.15％，精氨酸0.15％，EDTA二钠0.05％，对羟基苯乙酮0.4％，1,2-戊二醇0.8％，螺旋藻活性肽0.01％，水88.84％。
螺旋藻活性肽相关产品安全性研究遵守《化妆品安全技术规范》2015年版相关规定。
皮肤刺激性试验使用日本大耳白兔背部皮肤，研究受试样品对完好皮肤和损伤皮肤的刺激性。单次给药研究(Single dose，简称SD)动物皮肤涂抹供试品一次，24hr后洗去供试品，于1h、24h、48h及72h观察。多次给药研究(Multiple dosing，简称MD)动物皮肤每天涂抹供试品一次，连续涂抹14天，每天涂抹24h后洗去供试品1h后进行观察；最后一次涂抹供试品24h后洗去供试品，于1h、24h、48h及72h观察。
皮肤过敏性试验使用豚鼠皮肤涂抹供试品，共给药4次。第1天、第7天和第14天致敏，在动物左侧皮肤涂抹供试品；第28天激发，在动物右侧右侧皮肤涂抹供试品。激发后6h观察过敏症状，24h、48h和72h再次观察皮肤过敏症状。
结果：
皮肤刺激性研究：实施例1-3的螺旋藻活性肽制成的面膜液与精华液对白兔完整皮肤和破损皮肤均无刺激性。
皮肤过敏性研究：实施例1-3的螺旋藻活性肽面膜液与精华液对豚鼠皮肤均无致敏性。

Claims (9)

1.一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取螺旋藻粉加水混匀、冻融3-5次、均质，得到均质液；往均质液中加入其质量1-2％的蛋白胨，以及其体积10-15％的1-2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液，灭菌，得到发酵培养基；
2)取葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨混合，加入1-2mol/L、pH7.0的PBS缓冲液至100ml，灭菌，配制得到种子培养基；该种子培养基中葡萄糖的质量浓度为1-3％、酵母提取物的质量浓度为1-3％、蛋白胨质量浓度为1-3％；
3)取葡萄汁有孢汉逊酵母菌种接种于种子培养基中，接种重量比为1：40-50，在37-40℃下培养18-36h；挑出菌种接种于发酵培养基中，接种重量比为1：10-20，在37-40℃下培养36-48h，得到发酵液；
4)将发酵液离心，取上清液灭酶，过截留相对分子量为的10KD超滤膜，获得分子量范围小于10000的超滤液，即为螺旋藻活性肽。
2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤1)中，水的加入量为螺旋藻粉重量的10-20倍。
3.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述冻融为先置于-20℃下冷冻8-12h，再置于37℃水浴解冻2-3h。
4.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述均质为在5000-10000rpm下处理5-10min。
5.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)中所述灭菌温度为121℃，灭菌时间为20-30分钟。
6.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述培养为摇床振荡培养，其振荡频率为200-300rpm。
7.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法，其特征在于：步骤4)中，所述灭酶是将上清液置于沸水浴中灭活10-15分钟。
8.权利要求1-7中任一项所述的一种螺旋藻活性肽的制备方法所制得的螺旋藻活性肽在护肤品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述螺旋藻活性肽在护肤品中的添加量为0.01％-5％。
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