CN113930472B - 一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法及产品。所述制备方法包括以下步骤:(1)将阿胶块粉碎;(2)将步骤(1)获得的粉碎后的阿胶于非特异性酶链霉蛋白酶E共同溶解,维持酶解条件酶解3至5小时,获得糖酶解胶液;(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。本发明一方面降低了阿胶的促炎症反应能力,另一方面提供了产品的抗氧化能力,同时仍保持较强的正向免疫调节能力,从而降低了阿胶及阿胶水解产物的引起炎症的副作用,减少“上火”现象的发生,减少了阿胶使用的限制,使用更加安全。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域,更具体地,涉及一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法及产品。
背景技术
阿胶是马科动物驴皮熬制而成的胶块,其味甘,性平,入肺,肝,肾经,有滋阴补血,润燥止血,安胎等作用,为我国传统名贵的中药材。现代药理学研究证实,阿胶具有补血止血,抗衰老,抗休克,抗肿瘤,增强免疫力,促进钙吸收和贮存等广泛的临床医疗和保健功能,其有效成分和药理作用的研究越来越受到现代医学界的普遍关注。
现代科学研究证实,阿胶及其水解产物阿胶肽,具有正向免疫调节作用。一方面阿胶被用来治疗许多局部炎症,例如尿路感染、妇科炎症等等,同时,阿胶在全身性的免疫系统激发状态下,可能会进一步影响免疫系统,从而加剧全身性的炎症,表现为上火或炎症反应加重、时间延长。故在感冒发热期间不推荐食用阿胶进补,同时亦较为严格的控制阿胶的用量,并且一般情况下需要与其他药材或者食品进行复配。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法及产品,其目的在于通过酶解释放部分N-糖链,在提高阿胶的效用、降低阿胶粘腻程度以及提高阿胶生物利用度的同时,降低阿胶的促炎症反应能力,由此解决目前阿胶及阿胶水解产品——阿胶肽容易引起过度炎症反应的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)将阿胶块粉碎;
(2)将步骤(1)获得的粉碎后的阿胶于非特异性酶链霉蛋白酶E共同溶解,维持酶解条件酶解3至5小时,获得糖酶解胶液;
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其步骤(1)具体为:
将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其步骤(2)具体为:将步骤(1)获得的粉碎后的阿胶与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2000~2500:1进行混合,加入阿胶超微粉1.5至2倍质量水溶解。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其酶解条件为:38℃至42℃。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其步骤(2)酶解期间持续搅拌维持温度,并监测pH值使得pH值维持在7至8之间。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其所述蛋白酶包括胶原酶。
优选地,所述低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其所述蛋白酶包括其他蛋白酶;所述其他蛋白酶常用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、以及菠萝蛋白酶中的一种或多种的组合。
按照本发明的另一个方面,提供了一种低促炎症反应阿胶肽,其按照本发明提供的制备方法制备。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,由于采用非特异性酶链霉蛋白酶E进行初步酶解,在一定程度上降解阿胶所含有的蛋白质的同时,一定程度上的释放N-糖链,一方面降低了阿胶的促炎症反应能力,另一方面提供了产品的抗氧化能力,同时确定上述阿胶肽的仍保持较强的正向免疫调节能力,从而降低了阿胶及阿胶水解产物的引起炎症的副作用,减少“上火”现象的发生,减少了阿胶使用的限制,使用更加安全。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
阿胶作为传统中药,其药效已得到广泛而多方面的验证。现代研究发现,阿胶的对免疫力的调节作用不仅仅来自于阿胶的主要原料胶原蛋白的作用,与阿胶反复加入黄糖熬煮的炮制工艺有关。阿胶原料胶原蛋白,即马科动物驴皮与黄糖在持续高温熬煮条件下发生美拉德反应,蛋白质糖基化生成糖蛋白,而糖蛋白的免疫调节作用相较于普通胶原蛋白或胶原蛋白肽明显提升。被认为是阿胶表现出明显的正向免疫调节作用的重要原因之一。
目前,为了解决阿胶粘腻不易吸收的问题,提升阿胶的吸收率和阿胶的保健功效,有技术采用酶解的方法将阿胶糖蛋白加工成阿胶糖肽,或者螯合铁阿胶糖肽。虽然阿胶的吸收率和功效得到明显提升,然而阿胶所固有促炎症反也更为突出应,即民间所说的上火问题,降低了阿胶使用的安全性,不再适合经常使用。
本发明提供了一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉;
(2)将步骤(1)获得的阿胶超微粉与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2000~2500:1进行混合,加入阿胶超微粉1.5至2倍质量的38℃至42℃温水溶解,酶解3至5小时,获得糖酶解胶液;
非特异性酶链霉蛋白酶E(Pronase E)在水解肽键的同时,释放N-糖链并得到还原性末端的糖链,提高最终产品的抗氧化性能,降低炎症反应。
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。所述蛋白酶,包括胶原酶,以及其他蛋白酶,所述其他蛋白酶常用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、以及菠萝蛋白酶中的一种或多种的组合。可以按照各自的酶解条件一次或多次添加,并调整温度及pH值在蛋白酶酶解条件。
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
本发明采用非特异性酶链霉蛋白酶E(Pronase E)进行粗酶解,使得部分糖肽的N端糖链释放,从而降低了促炎症反应,然而实验显示仍然能较为有效的调节免疫应答,同时制备的阿胶肽相对于普通水解得到的阿胶肽由于混合油还原性糖链,因此抗氧化性能更好。
然而非特异性酶链霉蛋白酶E(Pronase E)成本相对于普通蛋白酶高千倍左右,因此为了降低非特异性酶链霉蛋白酶E的用量,需要将阿胶进行超微粉碎,来提升酶解效率。
以下为实施例:
实施例1
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉;
(2)将步骤(1)获得的阿胶超微粉与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2000:1进行混合,加入阿胶超微粉1.5倍质量的40℃温水溶解,酶解4小时,期间持续搅拌维持温度,并监测pH值使得pH值维持在7至8之间,获得糖酶解胶液;
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的木瓜蛋白酶,并调整温度在40℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
实施例2
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉;
(2)将步骤(1)获得的阿胶超微粉与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2000:1进行混合,加入阿胶超微粉2倍质量的38℃温水溶解,酶解5小时,期间持续搅拌维持温度,并监测pH值使得pH值维持在7至8之间,获得糖酶解胶液;
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的菠萝蛋白酶,并调整温度在50℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
实施例3
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
(1)将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉;
(2)将步骤(1)获得的阿胶超微粉与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2500:1进行混合,加入阿胶超微粉1.5倍质量的42℃温水溶解,酶解3小时,期间持续搅拌维持温度,并监测pH值使得pH值维持在7至8之间,获得糖酶解胶液;
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的胃蛋白酶,并调整温度在40℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
对比例1
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
S1、将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉,加入温水溶解;
S2、加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的木瓜蛋白酶,并调整温度在40℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
S3、将阿胶酶解液冷冻干燥,获得阿胶肽。
对比例2
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
S1、将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉,加入温水溶解;
S2、加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的菠萝蛋白酶,并调整温度在50℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
S3、将阿胶酶解液冷冻干燥,获得阿胶肽。
对比例3
一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,包括以下步骤:
S1、将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉,加入温水溶解;
S2、加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da~3000Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液。具体步骤为:
加入阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的胃蛋白酶,并调整温度在40℃,调节pH值在7.5至8.0之间,维持温度在蛋白酶酶解条件,酶解3小时,期间每1小时搅拌一次维持体系均匀。
S3、将阿胶酶解液冷冻干燥,获得阿胶肽。
实施例4促炎症反应及免疫调节实验
实验材料:RAW264.7巨噬细胞、实施例1至3制得的阿胶肽、对比例1至3制得的阿胶肽、未经酶解的阿胶原粉、DMEM(含10%FBS+1%双抗)培养基。
实验方法
1、巨噬细胞复苏
(1)巨噬细胞冷冻管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)取出(37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率);
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后放置在冰浴上;
(3)打开冻存管盖子,用枪头吸出细胞悬液,转到10mL离心管中并加入5mL DMEM(含10%FBS+1%双抗)培养基,用移液枪轻柔的吹吸混匀;
(4)离心机800rpm离心5min,弃去上清液,加入适宜体积的DMEM(含10%FBS+1%双抗)培养基重悬细胞,调整细胞密度至3×105,接种培养瓶,37℃、5%CO2培养箱静置培养;
(5)细胞培养24h后,更换新鲜培养基,继续培养直到形成单层,便可以传代。
2、巨噬细胞传代
(1)培养巨噬细胞形成单层,取出在超净工作台里用枪头吸除培养基;
(2)加入3mL的PBS到培养瓶中,轻柔的吹吸几次,然后吸除掉PBS;
(3)加入2mL胰酶到培养瓶中,将培养瓶放入37℃培养箱,消化3-6min后取出,显微镜下观察消化情况;
(4)消化好后加入2mL DMEM(含10%FBS+1%双抗)培养基终止消化,用枪头轻柔的吹吸,使所有细胞从培养皿底部脱落下来;
(5)将细胞悬液转到10mL离心管中,离心机800rpm离心5min;
(6)枪头吸除上清,加入适宜体积的DMEM(含10%FBS+1%双抗)培养基重悬细胞,调整细胞密度至3×105,接种至培养瓶,37℃、5%CO2培养箱静置培养;
3、阿胶肽或阿胶处理巨噬细胞
阿胶肽或阿胶浓度:50mg/mL
巨噬细胞以1×105密度接种至48孔板板中培养24小时后:
实验组:去除培养基,加入分别含有实施例1至3、对比例1至3、以及阿胶的DEME培养基200μL,1h后加入4μL的LPS(100μg/mL)处理24小时收集上清;
阳性对照组:去除培养基,更换新的DEME培养基,1h后加入4μL的LPS(100μg/mL)处理24小时收集上清;
阴性对照组:去除培养基,DEME培养基培养25小时收集上清;
4、样品收集
分别收集每组处理的培养细胞上清液,离心机10000rpm 4℃低温离心10min,收集上清,弃除细胞碎片及悬浮颗粒,-80℃保存。
5、炎性因子检测
使用ELISA试剂盒检测培养细胞上清液中的IL-1β、IL-6、TNF-α浓度。
在众多炎症细胞因子中,起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6等。
TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放;TNF-α的浓度代表了促炎症反应的强度。
IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答,是炎性反应的促发剂同时是免疫调节剂,需要维持在正常范围之内。
IL-1β的主要生物学功能:(1)局部低浓度--免疫调节:协同刺激APC和T细胞活化,促进B细胞增殖和分泌抗体;(2)大量产生--内分泌效应:诱导肝脏急性期蛋白合成;引起发热和恶病质。在一定范围之内,IL-1β浓度越高代表免疫力越强。
其中,对比例1至3的阿胶肽相对于阿胶,能更加明显地刺激RAW264.7巨噬细胞表达TNF-α,TNF-α的含量相对于阿胶有所提高,而阿胶本身S对RAW264.7巨噬细胞的促炎症反应能力数倍于阳性对照的LP。显示阿胶和阿胶肽促炎症反应能力极强。而实施例1至3提供的阿胶肽,刺激RAW264.7巨噬细胞表达TNF-α的能力相对于对比例1至3以及阿胶而言较弱,其中实施例1的促炎症反应能力甚至低于阳性对照LPS,证明本发明提供的阿胶太促炎症反应能力较低。而实施例1至3的IL-1和IL-6的浓度与对比例1至3以及阿胶相当,甚至略高于对比例1至3以及阿胶,证明其调节免疫的作用于阿胶相当,甚至更加明显。
实施例5
体外抗氧化测试:·OH抑制率测试
在样品管中一次加入0.4ml 50mmol/L pH7.5的磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲液,分别加入实施例1至3、以及对比例1至3的产品100ug/mL,0.1mL1.04mmol/L EDTA溶液,0.1mL10mmol/L双氧水,0.1mL 60mmol/L DR(对照不加),0.1mL 2mmol/L维生素C、以及0.1mL1mmol/L氯化铁溶液,样品管测试体系体积1.0mL。37℃保温1小时后取出,加入1mL 25%稀盐酸终止反应,再加入1.0ml 1%TBA溶液,将样品管中反应体系混匀,沸水浴15min,冷却离心(3000rpm)。在532nm波长处测试吸光度,并计算抑制率:
其中A0、A1、A2分别代表对照、样品及样品空白的吸光度。
测试结果如下:
超氧阴离子自由基的清除作用测试:
反应体系3mL:pH值为7.5的磷酸缓冲液,含核黄素3×10-6mol/L,甲硫氨酸浓度1×10-2mol/L,25摄氏度光照20min,产生超氧阴离子自由基O2 ·-;光照强度4000lx。
在上述体系中加入氯化硝基四氮唑兰(NBT),浓度1×10-4mol/L,光照核黄素产生的O2 ·-能将NBT还原为蓝色,以无光照体系做校正,在560nm处侧其吸光度A,表征O2 ·-含量,加入实施例1至3、对比例1至3的产品100ug/mL,测定反应体系吸光度并计算抑制率如下;
其中A1为加入产品后吸光读,A为反应体系以无光照体系校正的吸光度。
结果如下:
·OH抑制率、超氧阴离子自由基抑制率的体外抗氧化测试结果显示,不同工艺生产的阿胶肽粉抗氧化有一定关系,经过N-糖链释放,阿胶肽的抗氧化能力有了一定程度的提高,同时用于酶解的酶种类也对阿胶肽的抗氧化能力有一定影响。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将阿胶块粉碎;
(2)将步骤(1)获得的粉碎后的阿胶于非特异性酶链霉蛋白酶E共同溶解,维持酶解条件酶解3至5小时,获得糖酶解胶液;具体为:
将步骤(1)获得的粉碎后的阿胶与非特异性酶链霉蛋白酶E按照质量比例2000~2500:1进行混合,加入阿胶超微粉1.5至2倍质量水溶解;
(3)向步骤(2)获得的糖酶解胶液加入蛋白酶进行酶解,使得酶解产物分子量在1000Da ~3000 Da之间,高温灭酶,获得所述阿胶酶解液;
所述蛋白酶包括阿胶块质量0.5%的胶原酶、以及阿胶块质量0.5%的其他蛋白酶;所述其他蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠萝蛋白酶中的一种或多种的组合;
(4)将步骤(3)阿胶酶解液冷冻干燥,获得所述阿胶肽。
2.如权利要求1所述的低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其特征在于,步骤(1)具体为:
将阿胶块进行超微粉碎过500目筛,得到阿胶超微粉。
3.如权利要求2所述的低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其特征在于,酶解条件为:38℃至42℃。
4.如权利要求3所述的低促炎症反应阿胶肽的制备方法,其特征在于,步骤(2)酶解期间持续搅拌维持温度,并监测pH值使得pH值维持在7至8之间。
5.一种低促炎症反应阿胶肽,其特征在于,按照如权利要求1至4任意一项所述的制备方法制备。
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2021
- 2021-11-26 CN CN202111417049.3A patent/CN113930472B/zh active Active
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