CN109069546B

CN109069546B - 可食用燕窝提取物和提取方法

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Publication number: CN109069546B
Application number: CN201780024860.0A
Authority: CN
Inventors: 林家明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: SG11201807669VA; AU2017230150B2; SG10201601905RA; CN109069546A; TWI713708B; JP7104635B2; AU2017230150A1; CA3017336A1; KR102456015B1; KR20180128005A; US20200113947A1; MY189662A; TW201800018A; US11672833B2; US20210137996A1; NZ747051A; US10918674B2; WO2017155471A1; JP2019511571A

Abstract

本发明涉及制备燕窝提取物的方法以及由所述方法获得的各种提取物。在本发明的一个方面，提供了制备燕窝提取物的方法，该提取物包括从可食用燕窝(EBN)中获得的至少一种分子，该方法包括步骤：(a)清洗未加工的EBN；(b)过滤清洗后的EBN；(c)从EBN中提取分子；和(d)分离分子。

Description

可食用燕窝提取物和提取方法

技术领域

本发明涉及制备燕窝提取物的方法和由所述方法获得的各种提取物。

背景技术

可食用燕窝(EBN)是由东南亚地区天然存在的金丝燕的唾液制成的巢。这些被遗弃的巢从野外或从专门为金丝燕建造的房屋中收获。据报道，EBN表现出多种生物活性和营养价值，包括促有丝分裂反应潜能、表皮生长因子(EGF)样活性、抗流感病毒、血细胞凝集抑制活性、凝集素结合活性、改善骨强度和真皮厚度以及激素含量。根据应用，EBN的加工可以不同。现正进行调查以阐明可食用燕窝的生物和医疗功能。

目前，通过将EBN于水中煮沸并摄入来以汤或其他饮品的形式使用EBN。在这种情况下，EBN分子是大的生物大分子，人体难以消化和吸收。因此，以这种方式制备的EBN的有益成分的生物利用度低，且EBN的有益作用没有被最大化。

然而，摄入整个EBN可能导致免疫球蛋白E(IgE)介导的过敏反应(Goh等人，2001，J.Allergy Clin.Immun.，107(6)，1082-1088)，且EBN被认为是食物引起的过敏反应的最常见原因，这种过敏反应在儿童中可能危及生命。

粗品EBN的另一个问题是由于自然原因或加工期间有意添加而使不良化合物存在。EBN掺杂通常发生，降低了EBN的质量。所使用的掺杂物包括猪皮、琼脂、红藻和刺梧桐胶。为了掩盖掺杂物和废物，经常添加漂白剂。

特别令人担忧的是亚硝酸盐的存在，其主要源自金丝燕的粪便。亚硝酸盐也可能在加工期间被添加到白色的燕窝中，以使其变成更具有商业价值的红色燕窝。过量亚硝酸盐的摄入已经与癌症相关联(Bryan等人，Food Chem.Toxicol.2012，50(10)，3646-3654)。

病毒、细菌和真菌可能在野外或在工厂中在加工期间污染EBN。对野生鸟类禽流感的担忧可能导致整个EBN自身的进口受到限制。

因此，需要改进EBN的加工以提高整体质量和对消费者有益的性质。通过从EBN中提取并分离需要的化合物，避免或减少有害的影响，同时最大化EBN的治疗益处。

在本说明书中列举或讨论明显在先出版的文献应并不必然被认为是承认该文献是现有技术的一部分或是公知常识。

本文所提及的任何文献，其全部内容通过引用在此并入。

发明内容

在本发明的第一方面，提供了制备燕窝提取物的方法，该提取物包括从可食用燕窝(EBN)中获得的至少一种分子，该方法包括以下步骤：(a)清洗未加工的EBN；(b)过滤清洗后的EBN；(c)从EBN中提取分子；和(d)分离分子。

优选地，清洗步骤包括将EBN在环境温度下暴露于第一酶溶液中大约5分钟，并将EBN和酶溶液在水中再浸泡5分钟。更优选地，第一酶溶液包括亚硝酸还原酶。在实施方式中，水可以从反渗透工艺获得。

清洗步骤可以涉及将EBN在含氧水中清洗大约10分钟，随后在70℃下干燥大约12小时的时间段。

优选地，该方法还包括在提取步骤前将清洗后的EBN在121℃下灭菌大约10分钟。可替代地，提取过程可以进行大约20分钟。

提取溶液可以包括选自包括以下的组中的任何一种：抗-N聚糖、抗-O聚糖、抗-唾液酸(特别是唾液酸结合Ig样凝集素14)、抗-锌指、抗-串珠素(anti-perlecan)、抗-螺旋-转角-螺旋(anti-helix-turn-helix)、抗-透明质酸、抗-核心蛋白聚糖(anti-decorin)、抗-皮肤素、抗-软骨素、抗-光蛋白聚糖(anti-lumican)、抗-角质素、抗-多配体聚糖(anti-syndecan)、抗-亮氨酸拉链、抗-硫酸乙酰肝素、抗-短缩素、抗-神经蛋白聚糖(anti-neurocan)、抗-多功能蛋白聚糖(anti-versican)。

“抗-”，其意思是指选择性地靶向并结合到感兴趣的靶标的任何分子，即，靶标是聚糖(N或O聚糖)、唾液酸(特别是抗-唾液酸结合Ig样凝集素14)、抗-锌指、抗-串珠素、抗-螺旋-转角-螺旋、抗-透明质酸、抗-核心蛋白聚糖、抗-皮肤素、抗-软骨素、抗-光蛋白聚糖、抗-角质素、抗-多配体聚糖、抗-亮氨酸拉链、抗-硫酸乙酰肝素、抗-短缩素、抗-神经蛋白聚糖、抗-多功能蛋白聚糖等。

正因如此，得出本发明的提取溶液将产生EBN提取物，其包括选自N聚糖、O聚糖、唾液酸(特别是唾液酸结合Ig样凝集素14)、锌指、串珠素、螺旋-转角-螺旋、透明质酸、核心蛋白聚糖、皮肤素、软骨素、光蛋白聚糖、角质素、多配体聚糖、亮氨酸拉链、硫酸乙酰肝素、短缩素、神经蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖的组的任何一种。这些可以以任何适当的量存在于提取物中。在各种实施方式中，组合物可以包括以下任何一种：

(a)EBN提取物1

20％N聚糖

30％O聚糖

50％唾液酸结合Ig样凝集素14

(b)EBN提取物2

70％锌指

15％串珠素

15％N聚糖

(c)EBN提取物3

15％N聚糖

25％螺旋-转角-螺旋

15％透明质酸

35％核心蛋白聚糖

10％皮肤素

(d)EBN提取物4

10％皮肤素

15％软骨素

55％透明质酸

20％光蛋白聚糖

(e)EBN提取物5

10％角质素

25％多配体聚糖

35％软骨素

30％透明质酸

(f)EBN提取物6

35％亮氨酸拉链

30％核心蛋白聚糖

35％光蛋白聚糖

(g)EBN提取物7

25％硫酸乙酰肝素

15％短缩素

20％神经蛋白聚糖

20％多功能蛋白聚糖

20％核心蛋白聚糖。

这些量百分比可以是整个组合物的重量百分比或其它。

优选地，在实施方式中，提取分子通过将清洗过的EBN暴露于选自包括以下的组的提取溶液中的任何一种来进行：

(a)包括抗-N聚糖和抗-O聚糖的溶液；

(b)包括抗-硫酸乙酰肝素、抗-软骨素、抗-角质素和抗-皮肤素的溶液；以及

(c)包括抗-亮氨酸拉链、抗-螺旋-转角-螺旋和抗-锌指的溶液。

上述溶液(a)至(c)每种中存在的量可以为：

(a)50％抗-N聚糖和50％抗-O聚糖；

(b)25％抗-硫酸乙酰肝素、25％抗-软骨素、25％抗-角质素和25％抗-皮肤素；以及

(c)37％抗-亮氨酸拉链、33％抗-螺旋-转角-螺旋和30％抗-锌指。

此外，在可替代的实施方式中，提取溶液的组合物可以是选自以下的任何一种：

(a)组合物1

20％抗-N聚糖(分子量在20kDa至1000kDa之间)

30％抗-O聚糖(分子量在30kDa至3000kDa之间)

50％抗-唾液酸结合Ig样凝集素14(分子量在20kDa至700kDa之间)；或

(b)组合物2

70％抗-锌指(分子量在10kDa至200kDa之间)

15％抗-串珠素(分子量在50kDa至10000kDa之间)

15％抗-N聚糖(分子量在20kDa至700kDa之间)；或

(c)组合物3

15％抗-N聚糖(分子量在20kDa至700kDa之间)

25％抗-螺旋-转角-螺旋(分子量在10kDa至300kDa之间)

15％抗-透明质酸(分子量在100kDa至3000kDa之间)

35％抗-核心蛋白聚糖(分子量在10kDa至200kDa之间)

10％抗-皮肤素(分子量在50kDa至500kDa之间)；或

(d)组合物4

10％抗-皮肤素(分子量在50kDa至500kDa之间)

15％抗-软骨素(分子量在30kDa至700kDa之间)

55％抗-透明质酸(分子量在100kDa至3000kDa之间)

20％抗-光蛋白聚糖(分子量在20kDa至250kDa之间)；或

(e)组合物5

10％抗-角质素(分子量在25kDa至500kDa之间)

25％抗-多配体聚糖(分子量在20kDa至100kDa之间)

35％抗-软骨素(分子量在30kDa至700kDa之间)

30％抗-透明质酸(分子量在100kDa至3000kDa之间)；或

(f)组合物6

35％抗-亮氨酸拉链(分子量在10kDa至300kDa之间)

30％抗-核心蛋白聚糖(分子量在10kDa至200kDa之间)

35％抗-光蛋白聚糖(分子量在20kDa至250kDa之间)；或

(g)组合物7

25％抗-硫酸乙酰肝素(分子量在30kDa至300kDa之间)

15％抗-短缩素(分子量在10kDa至300kDa之间)

20％抗-神经蛋白聚糖(分子量在20kDa至300kDa之间)

20％抗-多功能蛋白聚糖(分子量在50kDa至500kDa之间)

20％抗-核心蛋白聚糖(分子量在10kDa至200kDa之间)。

每一种组合物可以具有不同的特异性、作用并因此有不同的用途。每种组合物的总结如下：

组合物1

这种独特的组合物提供的EBN的提取物可以在0.5g/l和1g/l的最低浓度下分别抑制H1N1和H3N2的血细胞凝集。只有唾液酸的类似提取物，仅仅在5g/l至160g/l的最低浓度下才可以分别抑制H1N1和H3N2的血细胞凝集。

其次，对于H1N1流感的体外感染，结果表明以0.03g/l至2g/l之间的浓度向哺乳动物细胞添加这种组合物，与未添加提取物组合物的培养相比时，至少将所产生的病毒滴度减少了2分之一。只具有唾液酸的类似提取物，仅在浓度高得多的情况下(在10g/l至464g/l的浓度)才可以实现这样的效果。

这表明，这种提取溶液能够提取出有效预防流感病毒的组合物(即EBN提取物)，比市场上的任何唾液酸或化合物更有效。

还表明哺乳动物细胞在感染H1N1和H3N2流感病毒1天后，在0.33g/l的最低浓度的存在下，未观察到致细胞病变效应。

其它竞争对手，即其它商业EBN溶液也在使用甲型流感的血细胞凝集抑制试验中进行了测试。发现这些EBN溶液或对细胞有细胞毒性，或没有表现出任何可检测到的抗流感病毒活性。综上所述，GeneOasis的专有EBN提取物在预防流感病毒感染方面是有效并优越的。

组合物2

这种独特的组合物提供的EBN提取物，与没有这种GO的专有EBN提取物组合物的对照相比，以浓度依赖的方式提供了增强的肾脏细胞生长。在3.3g/l的这种组合物存在下，肾脏细胞在第3天达到汇合细胞密度(～5×10⁵细胞/cm2)，比对照组(第4天)早。生长增强可能与在这种独特的EBN提取物中发现的活性分子的存在有关。

组合物3

这种提取组合物提供的EBN提取物可以在体外细胞扩增期间引发人类干细胞增殖的增加。

最重要地，将本提取物与竞争对手A EBN通过蛋白量进行比较，显示4.39％的GeneOasis EBN可以诱导的细胞生长曲线从培养的第2天开始至第5天在统计学上显著不同于10％竞争对手A EBN，(所有天数^***p<0.001，p值在图中示出)。类似地，将GeneOasis EBN(GOA)与竞争对手A EBN通过体积进行比较，显示10％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线从培养的第2天开始至第5天在统计学上显著不同于10％竞争对手A EBN(p值在图中示出)。这是显著的且新颖的，因为它表明本EBN提取物在(i)促进细胞生长而不像竞争对手A那样导致细胞死亡，和(ii)其代替EGF的能力方面比竞争对手A EBN更有效。

最重要地，将本EBN提取物(GOB)与竞争对手B EBN通过蛋白量进行比较，显示3.35％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线在统计学上从培养的第4天开始至第5天显著不同于10％竞争对手B EBN(第4天^**p<0.01且第5天^***p<0.001；p值在图中示出)。类似地，将本EBN提取物(GOB)与竞争对手B EBN通过体积进行比较，显示10％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线在统计学上从培养的第2天开始至第5天显著不同于10％竞争对手A EBN(第4天^**p<0.01，且第2天和第5天^***p<0.001；p值在图中示出)。这是显著的且新颖的，因为它表明本EBN提取物在(i)促进细胞生长，和(ii)其代替EGF的能力——特别是在细胞生长的后期(培养的第4天和第5天)——方面比竞争对手B EBN更有效。

组合物4

这种组合物提供的EBN提取物可以在体外成软骨分化的过程期间引发人类干细胞增殖在统计学上显著的增加。这是新颖的，因为这是第一个不仅显示DNA增加(细胞增殖)，而且是在统计学上显著增加的研究。

组合物5

这种组合物提供的EBN提取物引发体外根据蛋白聚糖含量的人类干细胞成软骨分化增加。

添加本EBN提取物导致每团块糖胺聚糖(GAG)含量和GAG/DNA比增加，主要从分化的第14天至第28天。每团块GAG含量的增加从使用2.5％至5％的分化的第14天至第28天是最显著且最一致的。GAG/DNA比的增加从使用5％的EBN的分化的第14天至第28天是最显著且最一致的。GAG是软骨组织中常见的蛋白多糖的主要类型。

组合物6

这种组合物提供的EBN提取物导致每团块II型胶原含量和II型胶原/DNA比增加，主要从分化的第21天至第28天。每团块II型胶原含量的增加对于1.25％EBN从分化的第7天至第14天，以及对于2.5％EBN从分化的第21天至第28天是最显著且最一致的。II型胶原/DNA比的增加从使用1.25％EBN的分化的第7天至第28天是最显著且最一致的。II型胶原是关节软骨组织中常见的胶原分子或原纤维的主要类型。每团块II型胶原含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。II型胶原/DNA比反映了每细胞II型胶原产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。虚线是指未添加EBN提取物时的每团块II型胶原和II型胶原/DNA比。

组合物7

这种提取溶液组合物提供的EBN提取物包含EGF样成分，其可以有利于hNPC的长期培养。

优选地，提取的步骤在酸的存在下进行。

优选地，提取在25℃至37℃之间进行大约20至120分钟。

优选地，分离分子在第二酶溶液的存在下进行。更优选地，第二酶溶液包括蔬菜或水果蛋白酶。第二酶溶液的浓度可以在10ug/ml至100ng/ml之间。另外，分离分子的步骤在pH值为6.5至9.0在45℃下进行60分钟。

优选地，分离步骤还包括在70℃下加热混合物5分钟以使第二酶溶液中的酶失活。

优选地，本方法还包括使所提取的混合物脱水的步骤。更优选地，脱水步骤是冷冻干燥。

在本发明的第二方面，提供了从根据本发明的第一方面的方法中获得的燕窝提取物。

在本发明的第三方面，提供了包括根据本发明的第二方面的提取物的组合物。优选地，组合物还包括麦芽糖糊精。在实施方式中，组合物中存在的麦芽糖糊精的量可以在30wt％至75wt％之间。

在本发明的实施方式中，提取物可以用于医药。更特别地，提取物可以用于制备用于治疗和/或预防病症和/或疾病的药物。

甚至更特别地，提取物可以用于改善皮肤和治疗各种皮肤病、脱水和炎症性皮肤、推动免疫系统、延缓衰老、促进代谢、保护人的视力、改善血液循环、调节血液胆固醇水平、保护心血管健康、活跃和更新细胞、缓解关节炎不适、平衡激素水平、减少炎症的发病率、控制糖尿病、治疗退行性关节、退行性皮肤、退行性神经系统和大脑，并保护免受肾衰竭。

在本发明的第四方面，提供了包括根据发明的第二方面的提取物、药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

优选地，该组合物或制剂是含有有效成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当分数的单位剂量。本发明的组合物通常可以口服或通过任何肠道外途径，以包括燕窝提取物的药物组合物的形式，任选地以无毒的有机、或无机、酸、或碱、加成盐的形式，以药学上可接受的剂型的形式。根据需要治疗的病症、疾患和病人，以及给药的途径，组合物可以以不同的剂量给药。

在人类治疗中，本发明的燕窝提取物或组合物可以单独给药，但通常将与根据预期的给药途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物的形式给药。它们可以口服(通过片剂和胶囊)或肠胃外，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内(intrastemally)、颅内、肌肉内或皮下给药，或者它们可以通过输注技术给药。它们最好以无菌水溶液的形式使用，溶液可以包含其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如有必要，水溶液应适当地缓冲(优选地至pH为从3至9)。无菌条件下制备合适的肠胃外制剂是很容易通过本领域技术人员熟知的标准药学技术实现的。

适合于肠胃外给药的组合物或制剂包括可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质的水性和非水性无菌注射液，其使制剂与预期接受者的血液等渗；以及可以包括混悬剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬液。制剂可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中提供，也可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用前立即添加无菌液体载体(例如注射用水)。即时性注射液和混悬液可以从上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

对于向人类患者口服和肠胃外给药，本发明的化合物的日剂量水平将通常为从1mg/kg至30mg/kg。因此，例如，本发明的化合物的片剂或胶囊可以包含活性化合物的用于适当地一次给药一个或两个或更多个的剂量。在任何情况下，医师将针对任何个体患者确定将最为适合的实际剂量，且剂量将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以有个别情况使用更高或更低的剂量范围，且这些都在本发明的范围内。

可替代地，本发明的组合物可以以栓剂或子宫托的形式给药，或者它们可以以洗剂、溶液、乳霜、软膏或扑粉的形式局部应用。本发明的组合物，特别是燕窝提取物，也可以透皮给药，例如通过使用皮肤贴片的方式。它们也可以通过眼的途径给药，特别是用于治疗眼疾。对于向皮肤的局部敷用，本发明的化合物可以配制成包含活性化合物的合适的软膏，其悬浮或溶解在例如具有以下一种或多种的混合物：矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，它们可以配制成合适的洗剂或乳霜，其悬浮或溶解在例如以下一种或多种的混合物：矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

通常，在人类中，口服或局部给药本发明的组合物是优选的途径，是最方便的。在接受者有吞咽疾患或有口服给药后药物吸收障碍的情况下，可以肠胃外给药药物，例如舌下、口含、透粘膜或透皮方式。

目前，广泛用于补充关节软骨健康的生物活性分子，如硫酸软骨素(CS)、硫酸角质素(KS)和透明质酸(HA)，主要是从动物部位或生物反应器中克隆的基因修饰微生物中提取的。在所提取的产品的纯度、产量和安全性方面缺乏一致性标准。

当从可食用燕窝(EBN)的天然来源中提取这些化合物时，就解决了安全性和可持续性的问题，因为EBN对于这样的生物活性因子是非常丰富和充裕的来源。

硫酸软骨素以乳霜、胶囊和健康补充药物的形式用于关节炎治疗。透明质酸广泛用于全球化妆品和制药行业。

由于通过皮肤或肠内的疏水膜或结构的渗透性较差，所以通过皮肤和关节、囊或通过口服给药途径来吸收这种水溶性因子(CS)、(KS)和(HA)一直是个问题。因此，对于全球数百万关节炎症和疼痛患者，要使这些化合物的最大并即刻的作用达到身体所必需的部位是困难的。这对于可持续且长期的解决方案来说是巨大的挑战。

通过分离化合物和它们的水解产物诸如硫酸软骨素、透明质酸和硫酸角质素的过程，提供了以高纯度、可变剂量供应该化合物的经济的方法以适合目的。在这种过程中分离的产品适合以各种方式和方法递送给使用者，以允许将化合物有效且快速地递送到作用部位。特别是使用合适的制剂，可以将硫酸软骨素、透明质酸和硫酸角质素以有效且有用的剂量递送到疼痛和炎症部位。

以脂质形式配制的从EBN回收碎屑的天然而丰富的供应中提取的本提取物，可以用于生产市场上第一经济产品，其透皮给药且由安全并可持续的生物活性分子组成。

为了充分理解本发明并使其易于付诸实践，现在将仅通过非限制性实例的方式描述本发明的优选的实施方式，描述参照所附说明性附图。

附图说明

图1示出了根据本发明的实施方式制备燕窝提取物的方法的流程图。

图2SF-EBN对Vero细胞生长的作用。培养基中SF-EBN的存在显示出细胞生长有显著的改善(在第3天测量)。

图3来自GeneOasis的SF-EBN可以预防流感病毒(H1N1)介导的血细胞凝集。基于WHO推荐的8HAU/50μl的病毒浓度，在SF-EBN为0.5g/l(2⁶)时获得血细胞凝集的预防。

图4来自GeneOasis的SF-EBN对流感病毒(H3N2)介导的血细胞凝集的抑制效果的作用。基于WHO推荐的8HAU/50μl的病毒浓度，在SF-EBN浓度为1.0g/l(2⁵)时获得血细胞凝集的预防。

图5用于在SF-EBN的存在下感染Vero细胞后测定培养上清中的流感病毒滴度的血细胞凝集试验。该试验在感染H1N1后24h在0.001MOI下进行。虚线将一行中的孔在可以观察到血细胞凝集处分开。

图6来自竞争对手B的SF-EBN在流感病毒(H1N1)介导的血细胞凝集中的评估。使用16HAU/50μl的H1N1病毒浓度。稀释本发明的SF-EBN以匹配来自竞争对手B的SF-EBN的可溶性蛋白浓度。

图7示出了从所述使用抗-N-聚糖和/或抗-螺旋-转角-螺旋的工艺中获得的EBN提取物产品对细胞扩增期间人类干细胞增殖的作用。图7中的数据显示，10％EBN提取物和3生长因子的组合对人类干细胞增殖的积极作用与使用4生长因子相似。10％EBN只能代替表皮生长因子(EGF)，并作为EGF的替代品。EGF不能作为食品补充剂获得且Pan等人(Environ.Health Perspect.，DOI:10.1289/ehpl409200)已经表明人类EGF和对羟基苯甲酸酯(parabens)可能导致乳腺癌细胞株的增殖增加。因此，EBN提取物会是可行的替代品，用于那些不产生人间充质干细胞(hMSC)激活和分化为软骨细胞所需的内源性EGF的个体。

图8和图9示出了在人类干细胞增殖方面，从所述使用抗-N-聚糖和/或抗-螺旋-转角-螺旋的工艺中获得的EBN提取物产品与来自竞争对手A和B的EBN提取物之间的比较。EBN提取物与竞争对手A和B两者产品相比，EBN提取物代替EGF的作用要显著得多。

图10EBN提取物对hNPCs的增殖和分化的作用。培养1周后测定细胞生长(A)、增殖的细胞标志物(ki67)和神经元分化的细胞标志物(β-微管蛋白)(B)。

图11EBN提取物对hNPCs的增殖和分化的长期作用。在任一生长因子和EBN提取物的存在下，连续培养hNPCs三周。之后，将hNPCs收获并接种到新的孔板中，以20000细胞/孔用于细胞生长研究。培养1周后测定细胞生长(A)、增殖的细胞标志物(ki67)和神经元分化的细胞标志物(β-微管蛋白)(B)。

图12EBN提取物对形态学NPC培养的作用

图13 10％的本EBN提取物可以代替EGF以获得相似的体外hMSC扩增的生长曲线。使用双向ANOVA的统计分析显示，3生长因子+10％EBN的细胞生长显著不同于只有3生长因子的细胞生长，表明10％EBN通过从细胞培养的第2天至第4天增加细胞生长而引发积极作用。相比之下，使用双向ANOVA的统计分析显示，3生长因子+10％EBN的细胞生长并没有显著不同于4生长因子的细胞生长，表明10％EBN可以代替EGF以实现从细胞培养的第0天至第4天相似的hMSC生长，p值，^**p<0.01，^***p<0.001并且^****p<0.0001。

图14添加本EBN提取物导致每团块DNA含量增加，主要从分化的第7天至第14天，在第7天具有2.5％至5％EBN时有最显著且一致的结果。DNA含量的增加通常用于衡量细胞的增殖。虚线是指未添加EBN提取物时的每团块DNA含量。数字是指相对于0％EBN时的引起的倍数变化。方框突出了那些倍数超过1.0的情况。

图15对于总共n＝3个团块的第一次独立实验，从分化的第7天至第28天，加入本EBN提取物没有导致每团块DNA含量在统计学上显著增加。这可能是由于在每个指定的时间点，在相同条件下的团块之间观察到的DNA含量的变化造成的。DNA含量的增加通常用于衡量细胞的增殖。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况。

图16对于总共n＝4个团块的第二次独立实验，当与没有任何EBN提取物(0％)的对照条件相比时，2.5％和10％的本EBN提取物导致在分化的第7天每团块DNA含量在统计学上显著的增加。这表明本EBN提取物可以在体外成软骨分化的过程期间引发人类干细胞增殖在统计学上显著的增加。这是新颖的，因为这是第一个不仅显示DNA增加(细胞增殖)，而且是在统计学上显著增加的研究。DNA含量的增加通常用于衡量细胞的增殖。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况，p值，^*p<0.05。

图17对于总共n＝7个团块的合并结果，当与没有任何EBN提取物(0％)的对照条件相比时，2.5％的本EBN提取物导致在分化的第7天每团块DNA含量在统计学上显著的增加。这表明本EBN提取物可以在体外成软骨分化的过程期间引发人类干细胞增殖在统计学上显著的增加。这是新颖的，因为这是第一个不仅显示DNA增加(细胞增殖)，而且是在统计学上显著增加的研究。DNA含量的增加通常用于衡量细胞的增殖。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况，p值，^*p<0.05。

图18添加本EBN提取物导致每团块糖胺聚糖(GAG)含量和GAG/DNA比增加，主要从分化的第14天至第28天。每团块GAG含量的增加从使用2.5％至5％的分化的第14天至第28天是最显著且最一致的。GAG/DNA比的增加从使用5％的EBN的分化的第14天至第28天是最显著且最一致的。GAG是软骨组织中常见的蛋白多糖的主要类型。每团块GAG含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。GAG/DNA比反映了每细胞GAG产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。虚线是指未添加EBN提取物时的每团块GAG和GAG/DNA比。数字是指相对于0％EBN的所引起的倍数变化。方框突出了那些倍数超过1.0的情况。

图19对于总共n＝3个团块的第一次独立实验，从分化的第7天至第28天，加入本EBN提取物没有导致每团块GAG含量和GAG/DNA比在统计学上显著的增加。这可能是由于在每个指定的时间点，在相同条件下的团块之间观察到的GAG和DNA含量(参考图15)的变化造成的。GAG是软骨组织中常见的蛋白多糖的主要类型。每团块GAG含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。GAG/DNA比反映了每细胞GAG产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况。

图20对于总共n＝4个团块的第二次独立实验，从分化的第7天至第28天，加入本EBN提取物没有导致每团块GAG含量和GAG/DNA比在统计学上显著的增加。这可能是由于在每个指定的时间点，在相同条件下的团块之间观察到的GAG和DNA含量(参考图15)的变化造成的。然而，当与没有任何EBN提取物(0％)的对照条件相比时，2.5％和10％的本EBN提取物可能潜在地导致在分化的第7天每团块GAG含量在统计学上显著的增加。这可能是由于当GAG/DNA含量保持不变时，每团块DNA含量在统计学上显著增加(参见图16)。GAG是软骨组织中常见的主要类型的蛋白多糖。每团块GAG含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。GAG/DNA比反映了每细胞GAG产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况。

图21对于总共n＝7个团块的合并结果，从分化的第7天至第28天，加入本EBN提取物没有导致每团块GAG含量和GAG/DNA比在统计学上显著的增加。这可能是由于在每个指定的时间点，在相同条件下的团块之间观察到的GAG和DNA含量(参考图2.2.2.)的变化造成的。GAG是软骨组织中常见的蛋白多糖的主要类型。每团块GAG含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。GAG/DNA比反映了每细胞GAG产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。使用普通单向ANOVA和Tukey多重比较测试进行统计分析。蓝色方框突出了那些如果可以对更多的样本进行分析则可能潜在地显著的情况。红色框突出了那些统计上显著的情况。

图22添加本EBN提取物导致每团块II型胶原含量和II型胶原/DNA比增加，主要从分化的第21天至第28天。1.25％EBN的每团块II型胶原含量从分化的第7天至第14天的增加，以及2.5％EBN的每团块II型胶原含量从分化的第21天至第28天的增加是最显著且最一致的。II型胶原/DNA比的增加从使用1.25％的EBN的分化的第7天至第28天是最显著且最一致的。II型胶原是关节软骨组织中常见的胶原分子或原纤维的主要类型。每团块II型胶原含量表示了在体外干细胞源的软骨细胞样细胞的总功能输出。II型胶原/DNA比反映了每细胞II型胶原产量，并用作干细胞分化成软骨细胞样细胞情况如何的功能指标。虚线是指未添加EBN提取物时的每团块II型胶原和II型胶原/DNA比。数字是指相对于0％EBN的所引起的倍数变化。方框突出了那些倍数超过1.0的情况。

图23从培养的第2天至第5天，4.39％和10％的本EBN提取物都在诱导hMSC细胞生长方面显著优于10％的竞争对手A EBN。出人意料地，3生长因子+10％竞争对手A具有的细胞生长曲线(i)显著不同于只有3生长因子的细胞生长曲线(第2天p<0.05，其它所有天数p<0.001)，(ii)显著不同于4生长因子的细胞生长曲线(所有天数p<0.001)，且(iii)非显著不同于无生长因子的细胞生长曲线(所有天数p>0.05)。这表明竞争对手A EBN(i)具有抵消其它3种生长因子的作用的抑制作用，(ii)不能代替EGF以实现类似于4生长因子的生长曲线，且(3)不诱导细胞生长，其也意味着相反竞争对手A EBN可能导致细胞死亡。这组结果的统计分析没有显示在图上，而是单独完成的。最重要地，将本EBN提取物(GOA)与竞争对手AEBN通过蛋白量进行比较，显示4.39％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线在统计学上显著不同于10％竞争对手A EBN，从培养的第2天开始至第5天(所有天数^***p<0.001，p值在图中示出)。类似地，将本EBN提取物(GOA)与竞争对手A EBN通过体积进行比较，显示10％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线在统计学上显著不同于10％竞争对手A EBN，从培养的第2天开始至第5天(p值在图中示出)。这是显著的且新颖的，因为它表明本EBN提取物在(i)促进细胞生长而不像竞争对手A那样导致细胞死亡，以及(ii)其代替EGF的能力方面比竞争对手A EBN更有效。

图24分别从培养的第4天至第5天和从第2天至第5天，3.35％和10％的本EBN提取物都在诱导hMSC细胞生长方面显著优于10％的竞争对手B EBN。出人意料地，3生长因子+10％竞争对手B具有的细胞生长曲线(i)从第2天至第4天显著不同于只有3生长因子的细胞生长曲线(第2天p<0.01，第3天p<0.05，第4天p<0.001)，(ii)显著不同于4生长因子的细胞生长曲线(第3天p<0.01，第4天和第5天p<0.001)，且(iii)显著不同于无生长因子的细胞生长曲线(所有天数p<0.001)。这表明竞争对手B EBN(i)与只有3生长因子的相比，仅从第2天至第4天对细胞生长有显著的积极作用，(ii)从培养的第3天至第5天，不能代替EGF以实现类似于4生长因子的生长曲线，且(iii)与无生长因子的相比不诱导细胞死亡。这组结果的统计分析没有显示在图上，而是单独完成的。最重要地，将本EBN提取物(GOB)与竞争对手BEBN通过蛋白量进行比较，显示3.35％的GeneOasis EBN可以诱导的细胞生长曲线从培养的第4天开始至第5天在统计学上显著不同于10％竞争对手B EBN(第4天^**p<0.01且第5天^***p<0.001；p值在图中示出)。类似地，将本EBN提取物(GOB)与竞争对手B EBN通过体积进行比较，显示10％的本EBN提取物可以诱导的细胞生长曲线从培养的第2天开始至第5天在统计学上显著不同于10％竞争对手A EBN(第4天^**p<0.01，且第2天和第5天^***p<0.001；p值在图中示出)。这是显著的且新颖的，因为它表明本EBN提取物在(i)促进细胞生长，和(ii)其代替EGF的能力——特别是在细胞生长的后期(培养的第4天和第5天)——方面比竞争对手BEBN更有效。

具体实施方式

在本发明中，提出了利用EBN作为活性营养成分(ANIs)的低成本来源然而具有高疗效诸如活性药物成分(APIs)的方式。

环境温度或室温是指20℃至30℃的范围内的温度。

N-连接的聚糖所指的结构为，其中位于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中天冬酰胺的侧链中的氮(其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸)与聚糖形成糖苷键，且聚糖可以由N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖、海藻糖、甘露糖和其它单糖组成(VarkiA，Cummings RD，Esko JD，等人，编辑，Essentials of Glycobiology，第2版，Cold SpringHarbor(NY)：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009)。

O-连接的聚糖所指的结构为，其中位于丝氨酸或苏氨酸的侧链中的氧与N-乙酰-半乳糖胺形成糖苷键，N-乙酰-半乳糖胺附连到额外的糖的单糖。

硫酸乙酰肝素(HS)是由二糖单元(GlcNAcαl-4GlcAβ1-4/IdoAαl-4)n定义的糖胺聚糖，在不同位置包含N-和O-硫酸酯，且通常发现与蛋白聚糖核心蛋白共价连接。硫酸乙酰肝素中存在的主要的二糖单元的结构如下所示。

硫酸乙酰肝素中发现的二糖单元

缩写：

GlcA＝β-D-葡萄糖醛酸

IdoA＝α-L-艾杜糖醛酸

LdoA(2S)＝2-O-磺基-α-L-艾杜糖醛酸

GlcNAc＝2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基

GlcNS＝2-脱氧-2-磺酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基

GlcNS(6S)＝2-脱氧-2-磺酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基-6-O-硫酸基

硫酸乙酰肝素中最常见的二糖单元是由连接到N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的D-葡萄糖醛酸(GlcA)组成，通常占总二糖单元的50％左右。未示出的是包含3-O-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS(3S，6S)或游离胺基(GlcNH₃ ⁺)的罕见双糖。

硫酸软骨素是由二糖单元(GalNAcβ1-4GlcAβ1-3)_n定义的硫酸化糖胺聚糖(GAG)，具有结构通式I，在某些位置有酯连接的硫酸基修饰，且通常发现与蛋白聚糖核心蛋白共价连接。软骨素链可以具有超过100个单独的糖，其每个都可以在不同的位置并以不同的数量被硫酸化。

硫酸皮肤素是类似硫酸软骨素的硫酸化糖胺聚糖，其中D-葡萄糖醛酸被L-艾杜糖醛酸代替，且二糖单体示于结构通式II。

硫酸角质素(KS)是由重复的二糖单元组成的线性多糖。硫酸角质素以蛋白聚糖(PG)存在，其中KS链附连到细胞表面或细胞外基质蛋白。硫酸角质素中基本重复的二糖单元是(-3半乳糖β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖β1-)。这可以在Gal或GlcNAc单糖之一或两者的碳位6(C6)处被硫酸化。然而，具体的KS类型的详细的主要结构被认为最好由三个区域组成：连接区域，在连接区域一端，KS链连接到蛋白质；重复区域，由重复的二糖单元-3Galβl-4GlcNAcβl-组成；和链封端区域，存在于KS链的与蛋白质连接区域相对的端。

透明质酸是广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织的阴离子的、非硫酸化的糖胺聚糖。它在糖胺聚糖中是独特的，因为它是非硫酸化的且可以是非常大的，它在体内的分子量经常在大小从5至20kDa之间变化。透明质酸是二糖的聚合物，由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖组成，通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接。

硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸是N或O-聚糖的类型，伴随糖部分与蛋白质在Asn或Ser/Thr处结合。

亮氨酸拉链是真核转录因子的bZIP(碱性区亮氨酸拉链)类的二聚化结构域。bZIP结构域的长度为60至80个氨基酸，具有高度保守的DNA结合碱性区域和更加多样化的亮氨酸拉链二聚化区域。亮氨酸拉链是蛋白质中常见的三维结构基序(motif)，且之所以有此名字是因为在二聚化结构域中每七个氨基酸中的第七个氨基酸是亮氨酸。

在蛋白质中，螺旋-转角-螺旋(HTH)是能够结合DNA的主要结构基序。它由通过短链氨基酸相连的两个α-螺旋组成，且存在于许多调控基因表达的蛋白质。

锌指是小的蛋白质结构基序，其特征是一个或多个锌离子的配位以稳定折叠。通常，锌指将锌离子与半胱氨酸和组氨酸残基的组合配位。最初，使用这些残基的数量和顺序来分类不同类型的锌指(例如，Cys₂His₂、Cys₄和Cys₆)。最近，改为用一种更系统的方法对锌指蛋白进行分类。这种方法基于折叠的结构域中蛋白质骨架的整体形状将锌指蛋白分为多个“折叠组”。最常见的锌指的“折叠组”是Cys₂His₂-型(“经典锌指”)、高音谱号(trebleclef)和锌带(Krishna SS，Majumdar I，Grishin NV，2003，Nucleic Acids Research 31(2)，532-50)。

对于自然存在的聚糖-结合的蛋白(GBP)，不包括聚糖特异性抗体，可以将GBP大致分为两大类——凝集素和糖胺聚糖结合的蛋白。大多数凝集素都是具有明确的“糖识别结构域”(CRD)的族的成员，明显从共同的始祖基因进化而来，经常保留主要氨基酸序列或三维结构的特定特征。因此，可以通过搜索蛋白质序列或结构数据库来识别新的族成员。尽管有这种预测新GBPs的能力，但是单个凝集素族的成员所识别的聚糖的结构是相当多样化的。尽管一些凝集素识别聚糖具有高得多的亲和性(K_d值在纳摩尔的范围内)，但许多凝集素中的单个-位点-结合的亲和性似乎低(具有K_d值在微摩尔的范围内)。对于那些具有低亲和性的凝集素，经常需要多个CRD和多个聚糖之间的多价相互作用以产生体内相关的高亲和性结合的相互作用。凝集素倾向于通过将聚糖链的特定末端方面配合入较浅的、但相对明确的结合袋中，从而识别它们。相比之下，蛋白质与硫酸化糖胺聚糖的相互作用似乎涉及靠着延伸的阴离子的糖胺聚糖链的内部区域排列的带正电的氨基酸的表面簇。凝集素可以进一步归类为R-型、L-型、P-型、C-型、I-型和半乳凝素。示出了被一些凝集素识别的N-聚糖的实例的结构。在方框区域中表明了结合所需的决定因素。

从EBN中提取和分离ANI的一般工艺如下(在图1中示出):

(a)清洁EBN以去除污染物。

(b)研磨清洁后的EBN并通过筛网过滤。

(c)将EBN粉末溶于水中，并用包含至少一种抗体的溶液处理。

(d)可以分离抗体和结合分子。

(e)使用酸溶液将被结合的分子部分水解，并通过加入大分子量的肽释放被结合的分子。

(f)通过透析分离被释放的小分子。

(g)用酶解液处理分离出的部分以进一步分解化合物。

(h)在酶变性并移除之后，干燥分离出的部分以得到固体产物。

粗品EBN(1片约10至50g)的清洁通过将其浸泡在水中以去除亚硝酸盐、螨类和其他污染物来进行。其它被去除的可能的污染物可以包括重金属、漂白剂和其它微小碎片，包括污渍。

使用包含来自水果、植物和土壤的亚硝酸还原酶酶类的溶液是去除亚硝酸盐的有效方法。此外，该溶液可以包含另一种酶以灭活任何产生亚硝酸盐的伴生细菌。为去除螨类，使用包含特殊的水果蛋白酶的溶液。这样的实例包括来自木瓜(木瓜蛋白酶)、奇异果(奇异果酵素)、菠萝(菠萝蛋白酶)、无花果(无花果蛋白酶)等的任何这样的蛋白酶。这些蛋白酶可以以将使得细菌灭活的任何适当的浓度使用。

将EBN混合物循序地用每种酶解液在从室温至40℃下处理至少5分钟。酶解液中所得的EBN悬浮液的纳米气泡将导致降解的细胞碎片浮到水面，在水面可以很容易地将它去除。随后将酶解液从固体EBN去除。可以进一步清洗固体EBN以去除任何残留的酶和污染物。

干燥清洁后的EBN以去除多余的水，优选地于70℃下干燥12h。

研磨清洁后的EBN并通过筛网过滤。筛网的尺寸应足以移除任何大的剩余杂质，优选地尺寸为200至700μm。最优选地筛网尺寸为600μm。

将EBN粉末在5℃下放置于水(优选地蒸馏水或去离子水)中5小时。合适的浓度为1000ml水中25g EBN。如果需要，可以进一步在121℃下将混合物灭菌10分钟。

使用包含至少一种抗体的水溶液在从4℃至37℃的温度范围内处理EBN混合物至少20分钟。温度为25℃至37℃时，20至120分钟足够。温度为4℃时，保持抗体和EBN的混合物至少9个小时。通常，温度越低抗体溶液与目标化合物完全结合所需的时间越长。

一种或多种抗体从以下选择：

1.抗-N-聚糖

2.抗-O-聚糖

3.抗-硫酸乙酰肝素

4.抗-硫酸软骨素

5.抗-硫酸角质素

6.抗-硫酸皮肤素

7.抗-亮氨酸拉链

8.抗-螺旋-转角-螺旋

9.抗-锌指

10.透明质酸抗体

可以通过任何通常已知的方法将抗体和被结合的分子从混合物中分离。其中一些方法包括物化分级、类别特异性亲和以及抗原特异性亲和。物化分级包括基于抗体的大小、电荷或其他共同的化学特性的微差沉淀(differential precipitation)、尺寸排阻或免疫球蛋白的固相结合。类别特异性亲和包括通过对免疫球蛋白具有特异性亲和性的固定化生物配体的特定抗体类(例如IgG)的固相结合。抗原特异性亲和包括使用特异性抗原以通过它们的特异性抗原结合结构域纯化抗体。

要使用的抗体可以包括自然存在的抗体，或修饰后的抗体，例如可以促进抗体分离的带标签抗体。一些常见的与抗体一起使用的标签的实例是His标签和FLAG标签。此外，用于提取目标分子的抗体可以与固体载体结合。固体载体可以由铁磁材料或常规惰性载体材料制成。这些抗体可以商购且可以如这样使用。如果抗体的修饰是需要的，则有很多如文献中普遍已知的方法来修饰抗体以获得需要的特性。通常在“钓鱼”方法中进行抗体分离以提取出目标蛋白。

如前所述，在加入抗体一段时间后，用酸溶液处理混合物并加热至100℃以导致目标化合物部分水解。优选地，酸为食品酸，例如柠檬酸、苹果酸、醋酸、酒石酸、富马酸和乳酸。将混合物冷却至室温并中和至pH值为7。

通过添加过量的天然糖胺聚糖和细胞转录调控因子的更大的肽，将抗体结合的化合物从抗体中释放。

随后通过使用透析袋将释放的化合物从添加的肽、酶和抗体中分离。

在另一种实施方式中，抗体溶液可以包含至少两种抗体。例如，包含抗-N-聚糖和抗-O-聚糖的溶液，包含抗-硫酸乙酰肝素、抗-软骨素、抗-角质素和抗-皮肤素的溶液，包含抗-亮氨酸拉链、抗-转角-螺旋-转角和抗-锌指的溶液。

优选地，抗体溶液组合物如下所示，其中给出的百分比是该抗体重量相对于溶液中存在的抗体总重量的百分比：

1.50％抗-N-聚糖和50％抗-O-聚糖。

2.25％抗-硫酸乙酰肝素、25％抗-软骨素、25％抗-角质素和25％抗-皮肤素。

3.37％抗-亮氨酸拉链、33％抗-转角-螺旋-转角和30％抗-锌指。

可替代地，可以循序地用包含不同的一种或多种抗体的溶液处理包含EBN的混合物，然后循序地进行分离以提取所需的化合物。

可以进一步将分离后的化合物用蔬菜和食品蛋白酶于45℃在pH值为6.5至9.0下水解1小时。所使用的酶的浓度应为至少10μg/ml以用于有效的水解。优选地，酶的浓度为最高至100μg/ml，且使用玉米或包谷末端蛋白酶。通过在70℃下加热混合物5分钟来使酶变性。酶在温度高于55℃时沉淀析出，因此可以在温度高于55℃时过滤混合物以提供滤液中溶液形式的所需化合物。

干燥所需化合物的溶液以提供粉末形式的化合物。优选地，通过冷冻干燥或喷雾干燥来干燥化合物。冷冻干燥通过使用液氮或干冰将溶液冷却至温度在-180℃至-70℃之间，然后将冷冻的混合物提交至真空中以使冰升华来进行。如果需要，可以重复冷冻干燥以提供干粉产品。

干粉产品可以与其它添加剂混合以制成食物或药物产品。可替代地，该产品可以与其他添加剂一起溶于水中。

通过分离产品诸如硫酸软骨素、透明质酸和硫酸角质素以及它们的水解产物的过程，提供了以高纯度、可变剂量供应该化合物以适合目的经济的方法。在这种工艺中分离的产品可修整的以各种方式和方法递送给使用者，以允许将化合物有效且快速地递送到作用部位。特别是使用合适的制剂，可以将硫酸软骨素、透明质酸和硫酸角质素以有效且有用的剂量递送到疼痛和炎症部位。

提供了一些可能的制剂的实例，其中给出的百分比是该成分重量相对于产品总重量的百分比。重量计25％至70％的EBN提取物与补足剩余部分至100％的糖混合。合适的糖是糊精或麦芽糖糊精。

以下提供了一些可能的制剂：

1.70％EBN提取物产品和30％麦芽糖糊精。

2.60％EBN提取物产品和40％麦芽糖糊精。

3.50％EBN提取物产品和50％麦芽糖糊精。

4.25％EBN提取物产品和75％麦芽糖糊精。

从EBN中提取的产品具有治疗性或预防性益处，并可以用于医药或用作预防措施。提取物可以用于改善皮肤和治疗各种皮肤病、脱水和炎症性皮肤、推动免疫系统、延缓衰老、促进代谢、保护人的视力、改善血液循环、调节血液胆固醇水平、保护心血管健康、活跃和更新细胞、缓解关节炎不适、平衡激素水平、减少炎症的发病率、控制糖尿病、治疗退行性关节、退行性皮肤、退行性神经系统和大脑，并保护免受肾衰竭。

体外细胞试验结果

通过体外细胞分析实验研究了从EBN分离的产品的潜在治疗作用，并在此对其结果进行进一步讨论。

图2示出了从所述使用抗-锌指的工艺获得的4个浓度的EBN提取物产品对Vero细胞生长的作用。在第3天，EBN提取物显示vero细胞生长以剂量依赖的方式被增强。此外，在所测试的最高浓度(3.3g/l)下，细胞生长达到最大且显著高于未添加EBN提取物产品的阴性对照组。这表明EBN产品促进了Vero细胞生长。

为了确定从所述使用抗-O-聚糖的工艺获得的EBN提取物产品对位于流感病毒表面的血凝素分子与红细胞相互作用的能力的抑制作用，进行了血细胞凝集抑制(HAI)试验。图3示出了对H1N1流感病毒株的HAI试验结果。不与流感病毒结合的红细胞会沉降到孔底，并以红色的钮扣状被观察到。与流感病毒结合的红细胞会形成网格。直到将2⁷倍稀释度用于所测试的两种病毒浓度时才观察到血细胞凝集(1至6列，虚线左侧的所有列可以在板的孔中看到圆点)。以这种稀释度时相应的EBN提取物的浓度为0.5g/l。换句话说，0.5g/l浓度的这种EBN提取物产品能够抑制H1N1流感病毒与红细胞的结合。

图4示出了使用H3N2病毒株的HAI试验。当病毒浓度为16HAU/50μL和8HAU/50μL时EBN提取物产品的浓度分别为2.1g/l和1.0g/l。

图5示出了从所述使用抗-O-聚糖的工艺获得的EBN提取物产品对Vero细胞的流感病毒感染的抑制的作用。图5示出了使用HAI的病毒滴度量化。下面的表1示出了EBN提取物产品降低了H1N1流感病毒对Vero细胞的感染性。

表1：EBN提取物对Vero细胞中H1N1病毒复制的作用。血细胞凝集试验的结果源自图5。

将从所述使用抗-O-聚糖的工艺获得的EBN提取物产品对H1N1病毒活性的抑制的作用与两种可商购的EBN溶液(竞争对手A和B)进行比较。EBN提取物溶液、竞争对手A和B中的可溶性蛋白质含量由DC^TM蛋白质试验(Bio-Rad，Cat.No.5000116)使用牛血清白蛋白作为蛋白标准来确定。确定出三种溶液的可溶性蛋白质含量分别为2021μg/mL、823μg/mL和628μg/mL(表3)。因此，将从该过程获得的EBN提取物溶液稀释以匹配各竞争对手溶液。然而，发现竞争对手A EBN溶液对细胞有细胞毒性因而没有进一步测试，而竞争对手B EBN溶液对H1N1病毒没有表现出抑制作用。因此，图6示出了本发明的EBN提取物溶液与竞争对手B的EBN溶液的比较。

表3：来自竞争对手A和B的EBN溶液的物理性质。

图8和图9示出了在对人类干细胞增殖方面，从所述使用抗-N-聚糖和/或抗-螺旋-转角-螺旋的工艺中获得的EBN提取物产品与来自竞争对手A和B的EBN提取物之间的比较。EBN提取物与竞争对手A和B两者产品相比，EBN提取物代替EGF的作用要显著得多。

EBN的提取物对流感的作用

材料和方法

1.提取方法

参照图1，将一片10-50g重的EBN在酶溶液中清洗5分钟以去除螨类，将溶液去除。用包含亚硝酸还原酶的水溶液清洗燕窝，将溶液去除。将清洗后的EBN在70℃下干燥12h。研磨干燥且清洁后的EBN并通过筛网(孔隙尺寸600μm)以去除羽毛和外来物质。将研磨后的EBN于5℃下保存在蒸馏水中(25g/1000ml水)5h，并然后在121℃下加热10min以灭菌。

将悬浮液与270ml包含抗体的溶液混合20min，并随后与200ml酸混合，在4℃下过夜。使用均质器将提取物均质化并在100℃下加热。冷却至室温后，通过在搅拌下逐滴地加入碱将溶液pH值调至7.0。通过添加过量的天然糖胺聚糖和细胞转录调控因子的更大的多肽，将抗体结合的化合物从抗体中释放。随后通过使用透析袋将释放的化合物从添加的肽、酶和抗体中分离。

使用玉米或包谷末端蛋白酶在pH值为6.5-9.0在45℃下处理提取物1小时。通过加热悬浮液至70℃持续5min使酶灭活，然后在温度高于55℃下将沉淀的酶过滤出。将滤液中分离出的产品冷冻干燥至少24小时。

对于体外试验测试，将各自的冷冻干燥后的EBN粉末溶解于蒸馏水中以制备浓度为33.3g/l的原液，并在25kGry的伽马辐射下灭菌1小时。通过8000RPM下的离心分离将任何不溶性物质去除。原液储存在-20℃下，直到需要时。

SF-EBN中的可溶性蛋白质浓度由DC^TM蛋白质试验(Bio-Rad，Cat.No.5000116)来确定并使用牛血清白蛋白作为蛋白标准。分别用蒸汽压渗透压摩尔浓度计(VAPRO)和酶标仪(Tecan Infinite M200)测量渗透压摩尔浓度和浊度。

在替代的方法中，将燕窝清洗10min并在70℃下干燥12h。将干燕窝研磨并通过筛网(孔隙尺寸600μm)以去除羽毛和外来物质。将研磨后的燕窝于5℃下保存在蒸馏水中(25g/1000ml水)5h，并然后在121℃下加热l0min(灭菌)。将悬浮液与270ml提取溶液混合20min，并随后与200ml酸混合，在4℃下过夜。使用均质器将提取物均质化并在100℃下加热。

冷却至室温后，通过在搅拌下逐滴地加入碱将溶液pH值调至7.0。使用专有酶(浓度取决于酶规格)在pH值为6.5-9.0在45℃下处理提取物1小时。然后，通过加热悬浮液至70℃持续5min使酶灭活。将处理后的提取物冷冻干燥。对于体外试验测试，将冷冻干燥后的EBN粉末以浓度为33.3g/l溶解于蒸馏水中，并在25kGry的伽马辐射下灭菌1小时。通过8000RPM下的离心分离将不溶性EBN提取物去除。将可溶性部分(SF-EBN)存储于-20℃下，用于流感中和研究。

2.Vero细胞库的扩增和创建

将来自主细胞库129代的Vero细胞(ATCC CCL-81)在补充有4mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies，Cat.No.25030149)的无血清培养基——OptiPro无血清培养基(LifeTechnologies，Cat.No.12309-019)中解冻并扩增，以产生具有20小瓶每瓶2×10⁶个细胞的工作细胞库。使用StemProAccutase(Life Technologie，Cat.No.A11105-01)将Vero细胞每4天传代一次，用于细胞脱附，且将产生的单细胞在细胞密度为1.5x10⁴细胞/cm²下接种。

3.EBN提取物溶液对Vero细胞生长的作用

为了测试SF-EBN对细胞生长的作用，将Vero细胞以3×10⁴细胞/孔接种在OptiPro无血清培养基中的24-孔组织培养板中。接种后一天，将SF-EBN(33.3g/l)添加到各个孔中以达到3.3g/l(10％v/v)、1.65g/l(5％v/v)、0.83g/l(2.5％v/v)和0.33g/l(1％v/v)的最终浓度。4天中每天监测细胞生长。使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec，Inc.)根据推荐的方法进行细胞计数。

4.流感病毒在Vero细胞中传播

以2.5×10⁴细胞/cm²接种Vero细胞以在培养2天后达到半汇合(sub-confluence)，用甲型H1N1病毒(IVR-116，NIBSC code 06/108)和H3N2(A/Wisconsin/67/2005HGR，NIBSCcode 06/112)在0.001至0.01的MOI(感染复数)下感染Vero细胞。使用去离子水制备用于激活流感病毒的猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，Cat.No.T5266，1500BAEE unit/mg)，并过滤器灭菌以制成5mg/ml的原液浓度。病毒扩增期间，在接种病毒后30分钟加入胰蛋白酶以获得最终浓度为5μg/ml。2-3天后收获包含病毒的培养上清(当观察到80％的致细胞病变效应(CPE)时)并将其离心以去除细胞碎片。病毒原液(H1N1和H3N2)储存于-80℃下。使用如下所述的血细胞凝集和组织培养感染剂量(TCID50)试验对它们的病毒滴度进行量化。

5.流感病毒滴度的量化

使用如Chen等人(BMC Biotechnol.，2011，11-81)中所述的血细胞凝集试验和组织培养感染剂量(TCID50)试验对病毒滴度进行量化。对于血细胞凝集试验，将4％人红细胞(Siemens Healthcare Diagnostics)稀释在杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲液(DPBS，Life Technologies，Cat.No.14190-250)中以获得0.75％的细胞悬浮液。然后，将稀释后的红细胞悬浮液加入病毒和对照样品的2倍连续稀释液中。导致红细胞完全凝集的病毒的最高稀释度被认为是HA滴定终点。HA滴度(HAU/50μl)是具有完全血细胞凝集的最后一个孔中的病毒的稀释度的倒数(例如，2⁷的稀释度给出血细胞凝集单位(HAU/50μl)为128。

通过将10倍连续稀释的病毒样品加入在使用补充有5μg/ml猪胰蛋白酶的OptiPro无血清培养基的96-孔板中培养的Vero细胞中来进行TCID50试验，以三个平行样品进行。将板在37℃下5％CO2的气氛中培育3天，且然后在光学显微镜下检查培养物的致细胞病变效应。根据Reed和Muench(1938)的公式计算导致50％的培养物中出现致细胞病变效应的悬浮液的稀释度(中值组织培养感染剂量，TCID50/ml)。

6.血细胞凝集抑制试验

如前所述，使用96-孔微量滴定板进行血细胞凝集抑制(HAI)试验(Guo等人，2006，Antiviral Res.，70，140-146)。使用包含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS作为稀释缓冲液。使用人红细胞作为指示细胞。将病毒悬浮液(分别为0.05ml DPBS中8HAU/50μl和0.05ml DPBS中16HAU/50μl)添加到每个包含用稀释缓冲液两倍连续稀释的EBN溶液的孔中。将在DPBS中0.05ml的0.75％(v/v)人O型红细胞添加到板上并在4℃下培育1h。将表现为完全抑制血细胞凝集的样品的最大稀释度定义为EBN溶液的HAI滴度。

7.EBN对抑制流感病毒复制的作用

在T25瓶中在OptiPro无血清培养基中培养Vero细胞，接种密度为3×10⁴细胞/cm²。当细胞培养达到90％汇合时，用流感病毒在0.001的MOI下感染培养物。然后，加入SF-EBN以达到2g/l(6.25％v/v)、0.26g/l(0.78％v/v)和0.03g/l(0.10％v/v)的最终浓度。2h后，去除包含SF-EBN的培养基。用OptiPro无血清培养基清洗细胞三次。添加猪胰蛋白酶以获得最终浓度5μg/ml。24h后收集培养上清液。通过血细胞凝集和TCID50试验验证SF-EBN抗流感作用。

8.人间充质干细胞(hMSC)细胞培养

将hMSC(8至9代)以2400至2800细胞/cm²的密度铺板于由极限必需培养基α、10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(所有均来自Gibco)组成的MSC生长培养基中的Nunc^TMEasyFill^TM细胞Factory^TM系统或T175cm²细胞培养瓶。每2至3天更换一次培养基。当hMSC大约70％汇合时进行传代，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)在37℃下处理5分钟将它们收获。使用自动化

NC-3000(Chemometec)进行存活力和细胞计数试验。所有培养物都保持在37℃下5％CO₂湿润培育箱中(Thermo Scientific)。

9.用于细胞生长曲线的hMSC细胞扩增

将hMSC以1000细胞/cm²的密度铺板于NunclonTM Delta Surface 24-孔板上。hMSC在第0天接种并培养4天。

使用仅在不具有任何生长因子和GeneOasis Pte Ltd的EBN提取物的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阴性对照，并称之为“无生长因子”。另使用在补充有10ng/ml的PDGF(Peprotech)、5ng/ml的TGFβ-1(Peprotech)和10ng/ml的FGFβ(Gibco)的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阴性对照，也称之为“3生长因子”。使用在补充有10ng/ml的PDGF(Peprotech)、5ng/ml的TGFβ-1(Peprotech)、1ng/ml的EGF(Peprotech)和10ng/ml的FGFβ(Gibco)的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阳性对照，也称之为“4生长因子”。测试了在补充有3生长因子(不包括EGF)和10％EBN(vol/vol)的无血清MSC生长培养基中生长的hMSC，并称之为“3生长因子+10％EBN”。在第1天加入10％(vol/vol)EBN。使用自动化

NC-3000(Chemometec)对每个条件每天进行细胞计数试验，以三个平行样品进行。所有培养物都保持在37℃下5％CO₂湿润培育箱中(Thermo Scientific)。

10.成软骨分化

hMSC在透明圆底超低附着96孔板(Corning)中作为微团团块生长，以成软骨分化。通过使用每孔每团块2×10⁵hMSC在室温(rt)下以1000rpm离心5分钟来形成团块。它们在包含DMEM-高葡萄糖(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、100nM地塞米松(Sigma)、0.1mM L-抗坏血酸-2-磷酸酯(Sigma)、1％ITS+1(Sigma)、L-脯氨酸(Sigma)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的成软骨分化培养基中培养。使用仅在无EBN提取物的成软骨分化培养基中生长的团块作为阴性对照。测试了在具有不同浓度的EBN(1.25％、2.5％、5％和10％vol/vol)的成软骨分化培养基中生长的团块。使用在补充有100ng/ml的BMP2的成软骨分化培养基中生长的团块作为阳性对照。具有或没有补充物的成软骨培养基每2至3天更换一次。

11.DNA、GAG和II型胶原含量评估

用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗团块(至少每时间点每条件3个)一次，然后立即将团块存储于-80℃下。解冻之后，将团块使用0.125mg/ml木瓜蛋白酶在65℃下消化过夜以量化DNA和GAG，或使用0.1mg/ml胃蛋白酶在4℃下消化2个夜晚，之后通过0.1mg/ml弹性蛋白酶在4℃下消化过夜以评估II型胶原。DNA量化使用Quant-iT Picogreen dsDNA测试进行，GAG测定使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖试验(Biocolor)进行，且II型胶原量化使用针对II型胶原(Chondrex)的ELISA进行，均按照制造商的说明。所有的荧光和光学读数都使用TecanInfinite M200取得。

12.统计分析

使用统计软件Prism 6(GraphPad)分析数据。使用普通的单向方差分析(ANOVA)与Tukey's多重比较测试对不同条件间的多重比较进行统计学对比。对于所有的统计测试，p值小于0.05被认为是显著的。

13.GeneOasis EBN与竞争对手A EBN和竞争对手B EBN的比较

hMSC以类似于第9部分中所详细描述的方式生长。hMSC在第0天接种并培养5天。对EBN提取物与竞争对手A EBN或竞争对手B EBN进行了2种类型的比较。一种类型的比较是在蛋白质含量方面通过归一化或对照比较GeneOasis EBN与10％的竞争对手EBN(即GeneOasis EBN具有的蛋白量将与各竞争对手的蛋白量相同)。据测定，10％的竞争对手AEBN相当于4.39％的GeneOasis EBN。因此，测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和4.39％GeneOasis EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“GOA”。测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和10％竞争对手A的EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“3生长因子+10％竞争对手A”。同样地对于竞争对手B，10％的竞争对手B EBN相当于3.35％的GeneOasisEBN。因此，测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和3.35％GeneOasis EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“GOB”。测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和10％竞争对手B的EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“3生长因子+10％竞争对手B”。第二种比较是在体积方面通过归一化或对照比较10％的竞争对手EBN与GeneOasis EBN(即10％的GeneOasisEBN将与10％的竞争对手EBN通过体积进行比较)。在整个相关实验的执行和数据分析过程中，研究者对竞争对手A和B的身份是不知情的。

总之，我们描述了新颖的EBN提取方法，并发现本发明的EBN提取物可以抑制A型流感对人红细胞的血细胞凝集并降低在Vero细胞中的感染性。使用EBN提取物的可溶性部分(SF-EBN)，我们表明可以在0.5g/l和1g/l EBN的最低浓度时分别抑制H1N1和H3N2的血细胞凝集。对于H1N1流感的体外感染，我们表明以0.03g/l至2g/l之间的浓度向Vero细胞培养物添加SF-EBN，与没有SF-EBN补充物的培养液相比时，至少将所产生的病毒滴度减少至2分之一。在使用甲型流感的血细胞凝集抑制试验中也对商业EBN溶液进行了测试。发现这些EBN溶液或对细胞有细胞毒性，或没有表现出任何可检测到的抗流感病毒活性。综上所述，GeneOasis的专有EBN提取物在预防流感病毒感染方面是有效并优越的。

结果

在测试SF-EBN对细胞和流感病毒复制的作用之前，我们以牛血清为标准进行了可溶性蛋白质测试，如下表1所示。这将为EBN的不同来源和提取方法之间的进一步比较提供参考点。

表1.SF-EBN的性质

EBN对Vero细胞生长的作用

测试了四种SF-EBN浓度(3.3g/l(10％v/v)、1.65g/l(5％v/v)、0.83g/l(2.5％v/v)和0.33g/l(1％v/v)对组织培养板中Vero细胞生长的作用。如图2所示，与没有SF-EBN的对照组相比时，SF-EBN以浓度依赖的方式提高了Vero细胞的生长。在存在3.3g/l SF-EBN的情况下，Vero细胞在第3天达到汇合细胞密度(～5xl05细胞/cm²)，比对照组(第4天)早。生长提高可能与EBN提取物中发现的EGF样分子的存在有关，其中EGF是已知的Vero细胞用于生长所需的必需生长因子。

EBN提取物对流感病毒感染的抑制作用

为了确定SF-EBN提取物对位于流感病毒表面的血凝素分子与红细胞相互作用的能力的抑制作用，我们进行了血细胞凝集抑制(HAI)试验——用于量化流感病毒浓度的常用的试验。制备了16HAU/50μl和8HAU/50μl两种病毒浓度，(存在于WHO实验室程序的用于流感病毒的血清学检测的推荐浓度是8HAU/50μl)。如图3所示，将SF-EBN的两倍连续稀释液(列2-12)与人红细胞混合，之后将流感病毒以16HAU/50μl和8HAU/50μl(上面提到的)两种浓度添加到96-孔板中。不与流感病毒结合的红细胞会沉降到孔的底部并形成红色钮扣状。在病毒与红细胞结合的情况下，会形成网格。直到将27倍稀释液用于所测试的两种流感病毒浓度时才观察到血细胞凝集。这种稀释度时相应的SF-EBN浓度为0.5g/l。这表明在0.5g/l(但不更低)的浓度下，EBN阻止血细胞凝集。使用H3N2流感重复实验，如图4所示。在H3N2病毒分别以16HAU/50μl和8HAU/50μl的浓度存在的情况下，需要2.1g/L和1.0g/L的更高的SF-EBN浓度以阻止血细胞凝集。这些结果表明，EBN提取物可以与病毒的血凝素分子竞争(通过人红细胞的血细胞凝集测定)，以降低流感病毒的感染性(类似于特异性抗血清的活性)。

我们还研究了SF-EBN对Vero细胞的流感病毒感染的抑制的作用。在存在2g/l、0.26g/l和0.03g/l的SF-EBN的情况下，用HlNl流感病毒(MOI为0.001)感染汇合的Vero细胞。感染后24h之后，收集培养上清液用于使用血细胞凝集试验进行病毒滴度量化。如下表2所示，SF-EBN浓度在0.03g/l至2g/l之间时，显示HlNl病毒滴度降低大约二分之一。这表明EBN提取物可以降低流感病毒的感染性(使用Vero细胞)。

表2 SF-EBN对Vero细胞中流感病毒H1N1复制的作用。

#血细胞凝集试验的结果源自图5

来自竞争对手的SF-EBN的抗病毒作用评估

选择了两种可商购的EBN溶液(竞争对手A和B)用于抗病毒活性的确定。如下表3所示，这些商业EBN溶液表现出的可溶性蛋白质浓度和渗透压摩尔浓度均低于SF-EBN。

表3来自竞争对手A和B的EBN溶液的物理性质。

因此，将SF-EBN用水稀释以匹配商业EBN溶液的可溶性蛋白质浓度以用于血细胞凝集试验。由于发现竞争对手A EBN溶液对细胞有细胞毒性，所以将竞争对手A EBN溶液从试验中排除，而其它的EBN溶液(竞争对手B)没有显示出生长抑制作用。血细胞凝集试验的结果如图6所示。我们发现，商业EBN溶液(竞争对手B)对预防H1N1病毒介导的红细胞的血细胞凝集没有表现出任何活性。这表明这种商业EBN溶液没有如SF-EBN所表现的抗病毒性质。由于已知EBN具有抗流感病毒活性，因此我们可以得出结论，由发明人开发的用于EBN提取的新颖的方法将在抗病毒性质的保留方面具有优越性。

EBN的提取物对人神经祖细胞生长和分化的作用

1.材料和方法

1.1人神经祖细胞的衍生与维持

使用微载体悬浮培养从人胚胎干细胞系(hESC)HES-3中产生人神经祖细胞(hNPC)。随后，使hNPCs在geltrex涂覆的板上生长，并且补料补充有EGF(20ng/ml，Peprotech)和FGF(20ng/ml，Peprotech)的NPC培养基(Neurobasal培养基、l×NEAA、l×青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺、l×N2、l×B27，无维生素A，均来自Life Technologies)。

培养基每隔一天更换一次。当细胞达到大约80％-90％汇合度时，使用StemProAccutase(Life Technologies)对hNPCs进行传代。

1.2人神经祖细胞的细胞生长和细胞计数

将hNPC以2000细胞/孔的密度铺板于geltrex包被的48孔板中，并生长1周。向hNPC补料补充有生长因子(EGF、FGF)和GeneOasis Pte Ltd的EBN提取物的不同组合的NPC培养基。然后，溶解细胞以使用具有DAPI的核计数法通过NucleoCounter NC3000(Chemometec)按照制造商的说明进行总细胞计数和活细胞计数。

1.3人神经祖细胞的细胞增殖和分化

将hNPC以150,000细胞/孔的密度铺板于geltrex包被的6孔板中，并生长1周和3周。向hNPC补料补充有生长因子(EGF、FGF)和GeneOasis Pte Ltd的EBN提取物的不同组合的NPC培养基。在培养过程期间，当细胞达到80％汇合度时对hNPCs进行传代。在时间点(第1周和第3周)，使用Tryple(Life Technologies)将hNPCs分离成单个细胞。随后，将细胞固定、透化并与一级抗体温育，即用于细胞增殖评估的抗-Ki-67(1:200，BD Bioscience)以及用于神经细胞分化评估的抗-微管蛋白β3(1:1000，Covance)。使用Alexa Fluor

山羊抗小鼠(Life Technologies)作为二级抗体。所有的培育均在4℃下进行20min。使用流式细胞仪(GUAVA，Millipore)进行荧光测量。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。

2.结果

在这一研究中，我们考察了EBN提取物是否可以支持来源于人胚胎干细胞(hESC)的hNPC扩增。如图10所示，在FGF-2和EGF的存在下培养的hNPC在7天后表现出最高的细胞产量。EBN提取物与生长因子FGF-2的结合达到了与使用FGF-2+EGF和单独FGF-2的条件下相当的细胞生长情况。添加EBN而不添加FGF-2导致较低的细胞生长。结果表明，EBN提取物不能替代FGF2，FGF2是hNPC增殖的最关键的生长因子。另一方面，尽管描述EBN提取物对人间充质干细胞在无血清培养基中的增殖的作用的报告中显示EBN包含EGF样活性，但我们没有观察到EBN提取物对在FGF-2的存在下hNPCs的短期扩增的有益作用。

我们对扩增的hNPC进行了进一步分析。如图10B所示，具有FGF-2和EBN提取物的NPC培养表现出相似的表达细胞增殖标志物ki67和神经元分化标志物β-微管蛋白的细胞数量。补充有EBN提取物而没有FGF-2的培养表现出较低的ki67和高的β-微管蛋白细胞数量。ki67的趋势与细胞生长研究一致，其中EBN提取物在没有FGF-2的情况下不能支持NPC生长。低ki67表达水平与所报告的在神经元分化开始时细胞增殖减少的现象一致。

我们将研究延长至三周。如图11所示，EBN提取物与FGF-2的结合似乎表现出比仅用FGF-2的培养更高的细胞产量。细胞增殖标志物ki67的表达在所有条件下均与前面的培养相似。然而，我们发现在补充有EBN提取物而没有FGF-2的hNPC培养中神经元分化标志物(β-微管蛋白)显著增加，并达到与没有EGF和FGF-2两者的培养相似的水平。增加的β微管蛋白阳性细胞数量表明了神经元细胞的发育。这与图12所示的细胞形态学图像一致，其中神经细胞形态学(神经突延伸)在具有高β-微管蛋白表达的培养中变得显著。当在10％EBN提取物+FGF的条件下生长时，hNPC保持了它们的典型形态。

总之，我们的研究表明本EBN提取物包含EGF样成分，其可以有利于hNPC的长期培养。可以考虑的进一步研究之一为EBN提取物的分级以分离EGF样成分用于进一步表征。

EBN的提取物对细胞培养、细胞生长和成软骨试验的作用

1.2.1.hMSC细胞培养

将hMSC(8至9代)以2400至2800细胞/cm²的密度铺板于由极限必需培养基α、10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(所有均来自Gibco)组成的MSC生长培养基的Nunc^TMEasyFill^TMCell Factory^TM系统或T175cm²细胞培养瓶。每2至3天更换一次培养基。当hMSC大约70％汇合时进行传代，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)在37℃下处理5分钟将它们收获。使用自动化

NC-3000(Chemometec)进行存活力和细胞计数试验。所有培养物都保持在37℃下5％CO₂湿润培育箱中(Thermo Scientific)。参见下表显示的孔板设计。

1.2.2.hMSC细胞扩增用于细胞生长曲线

将hMSC以1000细胞/cm²的密度铺板于NunclonTM Delta Surface 24孔板上。hMSC在第0天接种并培养4天。使用仅在不具有任何生长因子和GeneOasis Pte Ltd的EBN提取物的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阴性对照，并称之为“无生长因子”。另使用在补充有10ng/ml的PDGF(Peprotech)、5ng/ml的TGFβ-1(Peprotech)和10ng/ml的FGFβ(Gibco)的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阴性对照，也称之为“3生长因子”。使用在补充有10ng/ml的PDGF(Peprotech)、5ng/ml的TGFβ-1(Peprotech)、1ng/ml的EGF(Peprotech)和10ng/ml的FGFβ(Gibco)的BTI的专有无血清MSC生长培养基中生长的hMSC作为阳性对照，也称之为“4生长因子”。测试了在补充有3生长因子(不包括EGF)和10％EBN(vol/vol)的无血清MSC生长培养基中生长的hMSC，并称之为“3生长因子+10％EBN”。在第1天加入10％(vol/vol)EBN。使用自动化

1.2.3.成软骨分化

hMSC在透明圆底超低附着96孔板(Corning)中作为微团团块生长，以成软骨分化。通过使用每孔每团块2×10⁵hMSC在室温(rtm)下以1000rpm离心5分钟来形成团块。它们在包含DMEM-高葡萄糖(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、100nM地塞米松(Sigma)、0.1mM L-抗坏血酸-2-磷酸酯(Sigma)、1％ITS+1(Sigma)、L-脯氨酸(Sigma)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的成软骨分化培养基中培养。使用仅在无本发明的提取物的成软骨分化培养基中生长的团块作为阴性对照。测试了在具有不同浓度的EBN(1.25％、2.5％、5％和10％vol/vol)的成软骨分化培养基中生长的团块。使用在补充有100ng/ml的BMP2的成软骨分化培养基中生长的团块作为阳性对照。具有或没有补充物的成软骨培养基每2至3天更换一次。

1.2.4.DNA、GAG和II型胶原含量评估

用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗团块(至少每时间点每条件3次)，然后立即将团块存储于-80℃下。解冻之后，将团块使用0.125mg/ml木瓜蛋白酶在65℃下消化过夜以量化DNA和GAG，或使用0.1mg/ml胃蛋白酶在4℃下消化2个夜晚，之后通过0.1mg/ml弹性蛋白酶在4℃下消化过夜以评估II型胶原。DNA量化使用Quant-iT Picogreen dsDNA测试进行，GAG测定使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖试验(Biocolor)进行，II型胶原量化使用针对II型胶原的ELISA(Chondrex)进行，均按照制造商的说明。所有的荧光和光学读数都使用TecanInfinite M200取得。

1.2.5.统计分析

使用统计软件Prism 6(GraphPad)分析数据。使用普通的单向方差分析(ANOVA)与Tukey's多重比较测试对不同条件间的多重比较进行统计学对比。对于所有的统计测试，均认为p值小于0.05为显著的。

1.2.6.本发明EBN提取物与竞争对手A EBN和竞争对手B EBN的比较

hMSC以类似于1.2.2.中所详细描述的方式生长。hMSC在第0天接种并培养5天。对本EBN提取物与竞争对手A EBN或竞争对手B EBN进行了2种类型的比较。一种类型的比较是在蛋白质含量方面通过归一化或对照来比较本发明EBN提取物与10％的竞争对手EBN(即本EBN提取物对照具有的蛋白量将与各竞争对手的蛋白量相同)。据测定，10％的竞争对手AEBN相当于4.39％的本发明EBN提取物。因此，测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和4.39％GeneOasis EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“GOA”。测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和10％竞争对手A的EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“3生长因子+10％竞争对手A”。

同样地对于竞争对手B，10％的竞争对手B EBN相当于3.35％的本发明EBN提取物。因此，测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和3.35％本发明EBN提取物(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“GOB”。测试了补充有3生长因子(不包括EGF)和10％竞争对手B的EBN(vol/vol)的MSC生长培养基，并称之为“3生长因子+10％竞争对手B”。第二种比较是在体积方面通过归一化或对照来比较10％的竞争对手EBN与本发明EBN提取物(即10％的本发明EBN提取物将与10％的竞争对手EBN通过体积进行比较)。在整个相关实验的执行和数据分析过程中，研究者对竞争对手A和B的身份是不知情的。

下表是对本EBN提取物与竞争对手A EBN或竞争对手B的比较的方法的汇总。

目的——考察10％的竞争对手A和B是否具有与Gene Oasis EBN对在无血清条件下细胞生长的相同的作用(归一化至培养基中的总蛋白(ug/ml)或培养基中的EBN的体积比)

条件

细胞系：hMSC

培养基：内部无血清培养基

对照

1)4生长因子(阳性对照)

2)无生长因子(阴性对照)

3)仅3生长因子-无EGF(基线对照)

3)竞争对手A的Gene oasis对照(GOA)——与竞争对手A蛋白量相同

4)竞争对手B的Gene oasis对照(GOB)——与竞争对手B蛋白量相同

根据来自Gerine的蛋白质浓度

10％竞争对手A EBN相当于4.39％Gene Oasis EBN(GOA)

10％竞争对手B EBN相当于3.35％Gene Oasis EBN(GOB)

2.结果

本EBN提取物可以在体外细胞扩增期间诱导人干细胞增殖的增加，如图13至图24所示。

虽然在前面的描述中已经描述了本发明优选的实施方式，但相关领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下可以对设计或构造的细节进行许多变更或修改。

Claims

1.一种制备燕窝提取物的方法，所述提取物包括从可食用燕窝（EBN）中获得的至少一种分子，所述方法包括以下步骤：

（a）清洗未加工的EBN；

（b）过滤清洗后的EBN；

（c）从所述EBN中提取所述分子，

其中，提取所述分子是通过将所述清洗后的EBN暴露于选自包括以下的组的提取溶液中的任何一种来进行的：

（a）包括抗-N聚糖和抗-O聚糖的溶液；

（b）包括抗-硫酸乙酰肝素、抗-软骨素、抗-角质素和抗-皮肤素的溶液；以及

（c）包括抗-亮氨酸拉链、抗-螺旋-转角-螺旋和抗-锌指的溶液，

其中，清洗包括将所述EBN在环境温度下暴露于第一酶溶液5分钟，并将所述EBN和酶溶液在水中再浸泡5分钟，所述第一酶溶液包括亚硝酸还原酶，

其中，提取步骤在酸的存在下进行，

还包括在步骤（c）中提取所述分子后分离所述分子，其中，分离所述分子在第二酶溶液的存在下进行，所述第二酶溶液包括蔬菜或水果蛋白酶，且所述第二酶溶液的浓度在10ug/ml至100ng/ml之间。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括在提取步骤前将所述清洗后的EBN在121℃下灭菌10分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，每种溶液中存在的量为：

（a）50%抗-N聚糖和50%抗-O聚糖；

（b）25%抗-硫酸乙酰肝素、25%抗-软骨素、25%抗-角质素和25%抗-皮肤素；以及

（c）37%抗-亮氨酸拉链、33%抗-螺旋-转角-螺旋和30%抗-锌指。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，提取在25℃至37℃之间进行20至120分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，分离所述分子的步骤在pH值6.5至9.0在45℃下进行60分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，还包括在70℃下加热分离的所述分子和所述第二酶溶液的混合物5分钟以使所述第二酶溶液中的酶失活。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括使步骤（c）的被提取的产物脱水的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，脱水步骤是冷冻干燥。

9.一种燕窝提取物，从根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得。

10.一种组合物，包括权利要求9所述的提取物。

11.根据权利要求10所述的组合物，还包括麦芽糖糊精。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物中存在的麦芽糖糊精的量在30wt%至75wt%之间。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物在用于制备治疗和/或预防病症和/或疾病的药物中的用途。

14.一种药物组合物，包括根据权利要求9所述的提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。