TW201800018A

TW201800018A - 萃取物及萃取方法

Info

Publication number: TW201800018A
Application number: TW106108069A
Authority: TW
Inventors: 家明林
Original assignee: 家明林
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2018-01-01
Also published as: KR102456015B1; CN109069546A; SG11201807669VA; TWI713708B; AU2017230150A1; JP2019511571A; MY189662A; JP7104635B2; CA3017336A1; NZ747051A; CN109069546B; SG10201601905RA; KR20180128005A; US20200113947A1; AU2017230150B2; US10918674B2; WO2017155471A1; US11672833B2; US20210137996A1

Abstract

本發明係關於一種用於製備燕窩(bird’s nest)萃取物之方法及獲自該方法之各種萃取物。在本發明之一態樣中，提供一種用於製備燕窩萃取物之方法，該萃取物包含至少一種獲自可食用燕窩(edible bird’s nest)(EBN)之分子，該方法包含以下步驟：(a)洗滌原料EBN；(b)過濾該洗滌之EBN；(c)自該EBN萃取該分子；及(d)分離該分子。

Description

萃取物及萃取方法

本發明係關於一種用於製備燕窩萃取物之方法及獲自該方法之各種萃取物。

可食用燕窩(EBN)係由天然存在於東南亞地區之雨燕之唾液製成的巢穴。自野外或自專門為雨燕建構之棚舍收集廢棄巢穴。已報導，EBN呈現各種生物活性及營養價值，其包括促有絲分裂反應之潛力、表皮生長因子(EGF)樣活性、流感病毒抗體、血球凝集抑制活性、凝集素結合活性、骨強度及皮膚厚度以及激素含量之改良。EBN之加工可視應用而不同。已進行持續研究來闡明可食用燕窩之生物學及醫學功能。目前，藉由在水中煮沸EBN且食用來以湯或其他飲料形式使用EBN。在該情況下，EBN之分子係身體難以消化及吸收之大型生物巨分子。因此，以該方式製備之EBN之有益組分的生物可用性較低，且未使EBN之有益影響最大化。然而，食用整個EBN可導致免疫球蛋白E (IgE)介導之全身性過敏反應(Goh等人, 2001, J. Allergy Clin. Immun., 107(6), 1082-1088)，且認為EBN係食物誘發之全身性過敏反應之最常見的病因，該全身性過敏反應可能危及兒童生命。粗製EBN之另一問題係存在因天然形成或在加工期間有意添加之非所要化合物。通常進行EBN之摻雜，其降低EBN之品質。所用摻雜物包括豬皮、瓊脂、紅藻及加拉亞膠(karaya gum)。為了掩飾摻雜物及廢物，經常添加漂白劑。特別關注亞硝酸鹽之存在，該亞硝酸鹽主要衍生自雨燕之糞便。在加工期間，亦可將亞硝酸鹽添加至白色燕窩中，以使其變成更具商業價值的紅色燕窩。攝取過量亞硝酸鹽已與癌症相關聯(Bryan等人. Food Chem. Toxicol. 2012, 50 (10), 3646-3654)。病毒、細菌及真菌可能污染野外EBN，或在加工期間污染工廠中之EBN。有關野生鳥類中禽流感之問題可導致整個EBN本身之進口限制。因此，需要改良EBN之加工以改良整體品質及針對消費者之有益特性。藉由自EBN中萃取及分離所需化合物，有害影響得以避免或最小化，同時使EBN之治療效益最大化。在本說明書中，對明顯先前出版之文獻的列舉或論述未必應視為承認該文獻係目前先進技術之一部分或係公共常識。本文所提及之任何文獻均特此以全文引用之方式併入。

在本發明之第一態樣中，提供一種用於製備燕窩萃取物之方法，萃取物包含至少一種獲自可食用燕窩(EBN)之分子，該方法包含以下步驟：(a)洗滌原料EBN；(b)過濾洗滌之EBN；(c)自EBN中萃取分子；及(d)分離分子。較佳地，洗滌步驟包含：在環境溫度下，將EBN暴露於第一酶溶液約5分鐘，且將EBN及酶溶液浸泡於水中再5分鐘。更佳地，第一酶溶液包含亞硝酸鹽還原酶。在一實施例中，水可獲自逆滲透製程。洗滌步驟可包括：在含氧水中洗滌EBN約10分鐘，隨後在70℃下乾燥約12小時時間段。較佳地，該方法進一步包含：在萃取步驟之前，在121℃下對洗滌之EBN進行滅菌持續約10分鐘。或者，萃取製程可進行約20分鐘。萃取溶液可包含選自包含以下之群的任一者：抗N聚糖、抗O聚糖、抗唾液酸(特別是唾液酸結合性Ig樣凝集素14)、抗鋅指、抗串珠素、抗螺旋-轉折-螺旋、抗玻尿酸、抗核心蛋白聚糖、抗皮膚素、抗軟骨素、抗基膜聚糖、抗角質素、抗多配體蛋白聚糖、抗白胺酸拉鏈、抗硫酸乙醯肝素、抗短蛋白聚糖、抗神經蛋白聚糖、抗多功能蛋白聚糖。「抗」意指任何選擇性地靶向且結合至所關注目標的分子，即目標係聚糖(N或O聚糖)、唾液酸(特別是抗唾液酸結合Ig樣凝集素14)、抗鋅指、抗串珠素、抗螺旋-轉折-螺旋、抗玻尿酸、抗核心蛋白聚糖、抗皮膚素、抗軟骨素、抗基膜聚糖、抗角質素、抗多配體蛋白聚糖、抗白胺酸拉鏈、抗硫酸乙醯肝素、抗短蛋白聚糖、抗神經蛋白聚糖、抗多功能蛋白聚糖等。因而由此可見，本發明之萃取溶液將產生包含選自以下之群的任一者之EBN萃取物：N聚糖、O聚糖、唾液酸(特別是唾液酸結合Ig樣凝集素14)、鋅指、串珠素、螺旋-轉折螺旋、玻尿酸、核心蛋白聚糖、皮膚素、軟骨素、基膜聚糖、角質素、多配體蛋白聚糖、白胺酸拉鏈、硫酸乙醯肝素、短蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖。此等物質可以任何適合之量存在於萃取物中。在各種實施例中，組合物可包括以下中之任一者： (a)EBN 萃取物 1 20% N聚糖 30% O聚糖 50%唾液酸結合性Ig樣凝集素14 (b)EBN 萃取物 2 70%鋅指 15%串珠素 15% N聚糖 (c)EBN 萃取物 3 15% N聚糖 25%螺旋-轉折-螺旋 15%玻尿酸 35%核心蛋白聚糖 10%皮膚素 (d)EBN 萃取物 4 10%皮膚素 15%軟骨素 55%玻尿酸 20%基膜聚糖 (e)EBN 萃取物 5 10%角質素 25%多配體蛋白聚糖 35%軟骨素 30%玻尿酸 (f)EBN 萃取物 6 35%白胺酸拉鏈 30%核心蛋白聚糖 35%基膜聚糖 (g)EBN 萃取物 7 25%硫酸乙醯肝素 15%短蛋白聚糖 20%神經蛋白聚糖 20%多功能蛋白聚糖 20%核心蛋白聚糖。或者，此等量百分比可為整個組合物之重量百分比。較佳地，在一實施例中，萃取分子係藉由將洗滌之EBN暴露於選自包含以下之群的萃取溶液中之任一者來進行： (a) 包含抗N聚糖及抗O聚糖之溶液； (b) 包含抗硫酸乙醯肝素、抗軟骨素、抗角質素及抗皮膚素之溶液；及 (c) 包含抗白胺酸拉鏈、抗螺旋-轉折-螺旋及抗鋅指之溶液。存在於上文各溶液(a)至(c)中的量可為： (a) 50% 抗N聚糖及50% 抗O聚糖； (b) 25%抗硫酸乙醯肝素、25%抗軟骨素、25%抗角質素及25%抗皮膚素；及 (c) 37%抗白胺酸拉鏈、33%抗螺旋-轉折-螺旋及30%抗鋅指。此外，在替代性實施例中，萃取溶液之組合物可為選自以下之任一者： (a)組合物 1 20% 抗N聚糖(分子量在20 kDa至1000 kDa之間) 30% 抗O聚糖(分子量在30 kDa至3000 kDa之間) 50%抗唾液酸結合Ig樣凝集素14(分子量在20 kDa至700 kDa之間)；或 (b)組合物 2 70%抗鋅指(分子量在10 kDa至200 kDa之間) 15%抗串珠素(分子量在50 kDa至10000 kDa之間) 15% 抗N聚糖(分子量在20 kDa至700 kDa之間)；或 (c)組合物 3 15% 抗N聚糖(分子量在20 kDa至700 kDa之間) 25%抗螺旋-轉折-螺旋(分子量在10 kDa至300 kDa之間) 15%抗玻尿酸(分子量在100 kDa至3000 kDa之間) 35%抗核心蛋白聚糖(分子量在10 kDa至200 kDa之間) 10%抗皮膚素(分子量在50 kDa至500 kDa之間)；或 (d)組合物 4 10%抗皮膚素(分子量在50 kDa至500 kDa之間) 15%抗軟骨素(分子量在30 kDa至700 kDa之間) 55%抗玻尿酸(分子量在100 kDa至3000 kDa之間) 20%抗基膜聚糖(分子量在20 kDa至250 kDa之間)；或 (e)組合物 5 10%抗角質素(分子量在25 kDa至500 kDa之間) 25%抗多配體蛋白聚糖(分子量在20 kDa至100 kDa之間) 35%抗軟骨素(分子量在30 kDa至700 kDa之間) 30%抗玻尿酸(分子量在100 kDa至3000 kDa之間)；或 (f)組合物 6 35%抗白胺酸拉鏈(分子量在10 kDa至300 kDa之間) 30%抗核心蛋白聚糖(分子量在10 kDa至200 kDa之間) 35%抗基膜聚糖(分子量在20 kDa至250 kDa之間)；或 (g)組合物 7 25%抗硫酸乙醯肝素(分子量在30 kDa至300 kDa之間) 15%抗短蛋白聚糖(分子量在10 kDa至300 kDa之間) 20%抗神經蛋白聚糖(分子量在20 kDa至300 kDa之間) 20%抗多功能蛋白聚糖(分子量在50 kDa至500 kDa之間) 20%抗核心蛋白聚糖(分子量在10 kDa至200 kDa之間)。各組合物可具有不同特異性、影響，且因此具有不同用途。各組合物之概述如下：組合物 1 此獨特組合物提供一種EBN之萃取物，其可以0.5 g/l及1 g/l之最低濃度分別抑制H1N1及H3N2之血球凝集作用。僅具有唾液酸之類似萃取物僅可以5 g/l至160 g/l之最低濃度分別抑制H1N1及H3N2之血球凝集作用。其次，對於流感H1N1之活體外感染性，顯示在與不含萃取物組合物補充之培養物相比時，以0.03至2 g/l之間的濃度向哺乳動物細胞添加此組合物使所產生之病毒滴定濃度降低至少2倍。僅具有唾液酸之類似萃取物僅可以10至464 g/l之濃度，即以高出許多之濃度如此進行。此顯示，此萃取溶液可萃取一種有效預防流感病毒之組合物(亦即，EBN萃取物)，其比市場上的任何唾液酸或化合物都更加有效。亦顯示，在0.33 g/l之最低濃度存在下，感染H1N1及H3N2流感病毒1天後的哺乳動物細胞未觀測到細胞病變效應。亦在對甲型流感之血球凝集抑制分析中測試其他競爭者，即其他市售EBN溶液。發現此等EBN溶液對細胞具有細胞毒性或不呈現任何可偵測的抗流感病毒活性。總之，GeneOasis專屬EBN萃取物在流感病毒感染之預防中係有效且優越的。組合物 2 此獨特組合物提供一種EBN萃取物，其在與不含此GO之專屬EBN萃取物組合物之對照物相比時，以濃度依賴性方式促進腎細胞生長。存在3.3 g/l之此組合物時，腎細胞在第3天達到融合細胞密度(約5 × 10⁵ 個細胞/平方公分)，早於對照物(第4天)。生長促進可與此獨特EBN萃取物中發現之活性分子的存在有關。組合物 3 此萃取組合物提供一種EBN萃取物，其可在活體外細胞擴增期間引起人類幹細胞增殖的提高。最重要的是，按蛋白質的量比較本萃取物與競爭者A EBN揭示：自培養第2天至第5天，4.39% GeneOasis EBN可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者A EBN之細胞生長曲線(在所有天數中***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。類似地，按體積比較GeneOasis EBN (GOA)與競爭者A EBN揭示：自培養第2天至第5天，10%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者A EBN之細胞生長曲線(p值顯示於圖示中)。此情況係重要且新穎的，因為其顯示本EBN萃取物在以下方面比競爭者A EBN更加有效：(i)促進細胞生長且不導致如競爭者A所導致的細胞死亡，及(ii)其能夠代替EGF。最重要的是，按蛋白質的量比較本EBN萃取物(GOB)與競爭者B EBN揭示：自培養第4天至第5天，3.35%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者B EBN之細胞生長曲線(第4天**p ＜ 0.01，且第5天***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。類似地，按體積比較本EBN萃取物(GOB)與競爭者B EBN揭示：自培養第2天至第5天，10%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者B EBN之細胞生長曲線(第4天**p ＜ 0.01，且第2天及第5天***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。此情況係重要且新穎的，因為其顯示本EBN萃取物在以下方面比競爭者B EBN更加有效：(i)促進細胞生長，及(ii)其能夠代替EGF，特別是在細胞生長之靠後階段(培養第4天及第5天)。組合物 4 此組合物提供一種EBN萃取物，其可在活體外軟骨性分化期間在統計學上顯著提高人類幹細胞增殖。此情況係新穎的，因為此係首個不僅顯示DNA (細胞增殖)提高，而且顯示其在統計學上顯著提高之研究。組合物 5 此組合物提供一種EBN萃取物，其根據活體外蛋白聚糖含量引起人類幹細胞軟骨性分化之提高。添加本EBN萃取物主要自分化第14天至第28天導致每集結粒(pellet)之葡糖胺聚糖(GAG)含量及GAG/DNA比率提高。使用2.5%至5%，每集結粒之GAG含量的提高自分化第14天至第28天最顯著且最一致。使用5% EBN，GAG/DNA比率之提高自分化第14天至第28天最顯著且最一致。GAG係通常存在於軟骨組織中之主要類型的蛋白聚糖。組合物 6 此組合物提供一種EBN萃取物，其主要自分化第21天至第28天導致每集結粒之膠原蛋白II含量及膠原蛋白II/DNA比率提高。對於1.25% EBN，每集結粒之膠原蛋白II含量的提高自分化第7天至第14天最顯著且最一致，且對於2.5% EBN，自分化第21天至第28天最顯著且最一致。使用1.25% EBN，膠原蛋白II/DNA比率之提高自分化第7天至第28天最顯著且最一致。膠原蛋白II係通常存在於關節軟骨組織中之主要類型的膠原蛋白分子或原纖維。每集結粒之膠原蛋白II含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。膠原蛋白II/DNA比率反映每細胞之膠原蛋白II產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之充分程度的功能性指標。虛線係指在不添加EBN萃取物時每集結粒之膠原蛋白II及膠原蛋白II/DNA比率。組合物 7 此萃取溶液組合物提供一種EBN萃取物，其含有可有益於hNPC之長期培養的EGF樣組分。較佳地，萃取步驟係在酸存在下進行。較佳地，萃取係在25℃至37℃之間進行約20至120分鐘。較佳地，分子之分離係在第二酶溶液存在下進行。更佳地，第二酶溶液包含植物或水果蛋白酶。第二酶溶液之濃度可在10 ug/ml至100 ng/ml之間。另外，分離分子之步驟係在45℃下於pH 6.5至9.0下進行60分鐘。較佳地，分離步驟進一步包含在70℃下加熱混合物5分鐘，以使第二酶溶液中之酶失活。較佳地，本方法進一步包含使萃取之混合物脫水的步驟。更佳地，脫水步驟係冷凍乾燥。在本發明之第二態樣中，提供一種燕窩萃取物，其獲自根據本發明之第一態樣的方法。在本發明之第三態樣中，提供一種組合物，其包含根據本發明之第二態樣的萃取物。較佳地，組合物進一步包含麥芽糊精。在一實施例中，組合物中存在之麥芽糊精的量可在30重量%至75重量%之間。在本發明之一實施例中，萃取物可用於藥品。更明確而言，萃取物可用於製造用於治療及/或預防病症及/或疾病之藥物。甚至更明確而言，萃取物可用於改善皮膚且治療各種皮膚疾病、脫水及發炎皮膚；強化免疫系統；延緩衰老；促進代謝；保護個人視力；改善血液循環；調節血液膽固醇含量；保護心血管健康；激活且更新細胞；減輕關節炎不適；平衡激素含量；減小炎症發病率；控制糖尿病；治療退化性關節、退化性皮膚、退化性神經系統及大腦；及防止腎衰竭。在本發明之第四態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含根據本發明之第二態樣的萃取物、醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。較佳地，組合物或調配物係單位劑量，其含有日劑量或單位劑量、每日次劑量或其適當部分之活性成分。本發明之組合物通常可以包含燕窩萃取物之醫藥組合物形式、視情況以無毒有機或無機酸或鹼加成鹽形式、以醫藥學上可接受之劑型經口或藉由任何非經腸途徑投與。視待治療之病症、障礙及患者以及投與途徑而定，組合物可以不同劑量投與。在人類治療中，本發明之燕窩萃取物或組合物可單獨投與，但將通常以與就預期投與途徑及標準醫藥實踐所選擇之適合醫藥賦形劑稀釋劑或載劑的摻合物形式投與。其可經口(經由錠劑及膠囊)或非經腸投與，例如靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、室內、胸骨內、顱內、肌內或皮下投與，或者其可藉由輸液技術投與。其最佳以無菌水溶液形式使用，該無菌水溶液可含有其他物質，例如含有足夠鹽或葡萄糖以使溶液與血液等張。必要時，應適當地緩衝水溶液(較佳達pH 3至9)。在無菌條件下製備適合的非經腸調配物易於藉由熟習此項技術者所熟知的標準醫藥技術來實現。適於非經腸投與之組合物或調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。調配物可存於單位劑量或例如密封安瓿及小瓶之多劑量容器中，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)之條件下，僅需要在即將使用之前添加用於注射之無菌液體載劑，例如水。即用型注射溶液及懸浮液可由上述種類之無菌散劑、顆粒及錠劑製備。對於向人類患者經口及非經腸投與，本發明之化合物的日劑量濃度將通常係1 mg/kg至30 mg/kg。因此，舉例而言，本發明之化合物的錠劑或膠囊可含有一定劑量之活性化合物以單個投與或適當地一次投與兩個或更多個。在任何情況下，醫師會確定將最適於任何個別患者之實際劑量，且其將隨特定患者之年齡、體重及反應而變化。上文劑量係一般情況之例示。當然，可存在值得較高或較低劑量範圍之個別實例，且該等實例係在本發明之範疇內。或者，本發明之組合物可以栓劑或子宮托形式投與，或者其可以洗劑、溶液、乳膏、軟膏或敷粉形式局部施用。本發明之組合物，特別是燕窩萃取物，亦可例如藉由使用皮膚貼片劑來經皮投與。其亦可藉由經眼途徑投與，尤其用於治療眼部疾病。對於局部施用於皮膚，本發明之化合物可調配成含有活性化合物之適合軟膏，該活性化合物懸浮或溶解於例如與以下中之一或多者的混合物中：礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚環氧乙烷聚環氧丙烷化合物、乳化蠟及水。或者，其可調配成適合的洗劑或乳膏，其懸浮或溶解於例如以下中之一或多者的混合物中：礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨醇酯60、十六酯蠟、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苄醇及水。一般而言，在人類中，經口或局部投與本發明之組合物係較佳途徑，其係最適宜的。在接受者遭受吞咽障礙或遭受經口投與後的藥物吸收障礙之情況下，藥物可以非經腸，例如舌下、頰內、經黏膜或經皮方式投與。目前，如硫酸軟骨素(CS)、硫酸角質素(KS)及玻尿酸(HA)之廣泛用於補充關節軟骨健康的生物活性分子係主要萃取自動物部分或在生物反應器中克隆之遺傳修飾的微生物。在萃取之產物的純度及產率及安全方面缺少一致性標準。當此等化合物萃取自可食用燕窩(EBN)之天然來源時，其解決了安全性及可持續性問題，因為EBN係該等生物活性因子極其豐富且充足之來源。硫酸軟骨素以乳膏、膠囊及健康補充藥劑形式用於關節炎治療。玻尿酸在全球範圍內廣泛用於化妝品及醫藥行業。藉由皮膚及關節、膠囊或藉由經口投與途徑對該等水溶性因子(CS)、(KS)及(HA)的吸收已由於對皮膚或腸道中之疏水性膜或結構的較差滲透性而成為問題。因此，對於全球數百萬患有關節炎及關節痛之患者，此等化合物難以發揮最大及即時效果來到達體內之必要部位。此已成為可持續及長期方案之巨大挑戰。在化合物與其諸如硫酸軟骨素、玻尿酸及硫酸角質素之水解產物的分離製程中，提供一種低成本方法來以高純度及可變劑量供應化合物以滿足目標。在此製程中分離之產物能夠以各種方式及方法遞送至使用者，以使化合物有效且快速地遞送至作用部位。尤其在伴以適合調配物時，硫酸軟骨素、玻尿酸及硫酸角質素可以有效及適用的劑量遞送至疼痛及發炎部位。調配成脂質形式之本萃取物可用於生產首個市售低成本產品，其經皮投與且由萃取自EBN再循環碎屑之天然但充足供給的安全且可持續生物活性分子構成。為了本發明可經充分理解且易於付諸實踐，現將僅藉助於本發明之較佳實施例的非限制性實例描述，該描述係參考隨附說明性圖式。

在本發明中，呈現一種利用EBN作為活性類藥劑營養品成分(ANI)之低成本來源但又具有諸如活性醫藥成分(API)之高療效的方式。環境溫度或室溫係指在20至30℃範圍內之溫度。 N鍵聯聚糖係指以下結構：其中序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中天冬醯胺側鏈中之氮與聚糖形成糖苷鍵，其中X係除脯胺酸外之任何胺基，且聚糖可由以下構成：N-乙醯半乳胺糖、半乳糖、神經胺酸、N-乙醯葡糖胺、海藻糖、甘露糖及其他單醣(Varki A, Cummings RD, Esko JD等人編, Essentials of Glycobiology, 第2版, Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009)。 O鍵聯聚糖係指以下結構：其中絲胺酸或蘇胺酸之側鏈中的氧與N-乙醯基-半乳胺糖形成糖苷鍵，該N-乙醯基-半乳胺糖與其他糖類單醣連接。硫酸乙醯肝素(HS)係由雙醣單元(GlcNAcα1-4GlcAβ1-4/IdoAα1-4)_n 定義之葡糖胺聚糖，該雙醣單元在各種位置含有N-及O-硫酸酯且通常發現其共價鍵聯至蛋白聚糖核心蛋白。存在於硫酸乙醯肝素中之主要雙醣單元在結構上顯示如下。

縮寫： GlcA = β-D-葡糖醛酸 IdoA = α-L-艾杜糖醛酸 IdoA(2S) = 2-O-磺酸基-α-L-艾杜糖醛酸 GlcNAc = 2-去氧-2-乙醯胺基-α-D-葡糖哌喃糖基 GlcNS = 2-去氧-2-磺醯胺基-α-D-葡糖哌喃糖基 GlcNS(6S) = 2-去氧-2-磺醯胺基-α-D-葡糖哌喃糖基-6-O-硫酸酯硫酸乙醯肝素中之最常見的雙醣單元係由鍵聯至通常組成約50%總雙醣單元之N - 乙醯葡糖胺(GlcNAc)的D-葡糖醛酸(GlcA)構成。未顯示含有3-O-硫酸化葡糖胺(GlcNS(3S,6S))或游離胺基(GlcNH₃ ⁺ )之罕見雙醣。硫酸軟骨素係由具有通用結構式I 之雙醣單元(GalNAcβ1-4GlcAβ1-3) _n 定義的硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)，該雙醣單元在某些位置經酯鍵聯之硫酸酯修飾且通常發現其共價鍵聯至蛋白聚糖核心蛋白。軟骨素鏈可具有超過100個個別糖，可在不同位置及以不同量使其中之每一者硫酸化。

硫酸皮膚素係硫酸酯化葡糖胺聚糖樣硫酸軟骨素，其中D-葡糖醛酸替換為L-艾杜糖醛酸，且雙醣單體顯示於通用結構式II 中。

硫酸角質素(KS)係由重複雙醣單元組成之線性多醣。硫酸角質素作為蛋白聚糖(PG)存在，其中KS鏈連接至細胞表面或細胞外基質蛋白。硫酸角質素中之基本重複雙醣單元係(-3Galactoseβ1-4-N -acetylglucosamineβ1-)。此可在Gal或GlcNAc單醣之任一者或兩者的碳6位置(C6)受到硫酸化。然而，特定KS類型之具體一級結構最佳視為由三個區域構成：鍵聯區域，在其一端KS鏈鍵聯至蛋白質；重複區域，其由-3Galβ1-4GlcNAcβ1-重複雙醣單元構成；及鏈封端區域，其出現在蛋白質鍵聯區域之相對KS鏈端。玻尿酸係廣泛分佈在結締組織、上皮組織及神經組織中之陰離子型非硫酸化葡糖胺聚糖。其在葡糖胺聚糖中係獨特的，此係因為其未硫酸化，且可為極大的，其活體內分子量通常在5至20 kDa尺寸範圍內。玻尿酸係雙醣之聚合物，其由D-葡糖醛酸及D-N-乙醯基葡糖胺構成，經由交替之β-1,4及β-1,3糖苷鍵鍵聯。當糖部分在Asn或Ser/Thr處與蛋白質連接時，硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、玻尿酸係N-聚糖或O-聚糖類型。白胺酸拉鏈係真核轉錄因子之鹼性區域白胺酸拉鏈(bZIP)類別的二聚合結構域。bZIP結構域之長度係60至80個胺基酸，其具有高度保守的DNA結合鹼性區域及較多樣化的白胺酸拉鏈二聚合區域。白胺酸拉鏈蛋白質中之常見三維結構性基元，且其具有該名稱是因為二聚合結構域中之每七個胺基酸係白胺酸。在蛋白質中，螺旋-轉折-螺旋(HTH)係能夠結合DNA之主要結構性基元。其係由經短股胺基酸連接之兩個α-螺旋構成，且存在於調節基因表現之多種蛋白質中。鋅指係較小蛋白質結構性基元，其特徵在於對一或多個鋅離子進行配位以使摺疊穩定化。一般而言，鋅指使鋅離子與半胱氨酸與組氨酸殘基之組合配位。最初，此等殘基之數字及順序用於對不同類型之鋅指進行分類(例如，Cys₂ His₂ 、Cys₄ 及Cys₆ )。最近，更系統性的方法已取而代之地用於對鋅指蛋白質進行分類。此方法基於摺疊結構域中之蛋白質主鏈的總體形狀將鋅指蛋白質歸類為「摺疊群」。最常見之鋅指「摺疊群」係Cys₂ His₂ 樣(「典型鋅指」)、高音譜號及帶狀鋅指(Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV, 2003,Nucleic Acids Research 31 (2), 532-50)。對於除聚糖特異性抗體外之天然存在的聚糖-結合蛋白(GBP)，可將GBP大致歸類為兩種主要群組-凝集素及葡糖胺聚糖結合蛋白。大部分凝集素係具有明顯自共同上代基因演進之規定「碳水化合物識別結構域」(CRD)之家族的成員，其通常保留一級胺基酸序列或三維結構之具體特徵。因此，新家族成員可由搜索蛋白質序列或結構性資料庫識別。儘管具有此預測新GBP之能力，由單一凝集素家庭之成員識別之聚糖結構仍可完全不同。儘管一些凝集素以非常高的親和力識別聚糖(K _d 值在奈莫耳濃度範圍內)，但許多凝集素中之單點結合親和力似乎較低(K _d 值在微莫耳濃度範圍內)。對於具有低親和力之彼等凝集素，通常需要多個CRD與多個聚糖之間的多價相互作用以產生活體內恰當的高親合力結合相互作用。凝集素往往藉由將聚糖鏈之特定封端面納入較淺但相對輪廊分明的結合袋來進行識別。相比之下，蛋白質與硫酸化葡糖胺聚糖之相互作用似乎涉及帶正電之胺基酸的表面叢集，該等胺基酸逆著延長陰離子型葡糖胺聚糖鏈之內部區域排成一行。凝集素可進一步歸類為R型、L型、P型、C型、I型及半乳糖凝集素。由一些凝集素識別之N-聚醣的實例在結構上顯示如下。結合所需之決定子指示於加框區域中。

自EBN中萃取及分離ANI之一般製程如下(顯示於圖1中)： (a)清潔EBN以移除污染物。 (b)磨碎清潔之EBN且藉由篩網進行篩分。 (c)將EBN粉末溶解於水中且用含有至少一種抗體之溶液處理。 (d)可分離抗體與結合分子。 (e)用酸性溶液使結合之分子部分水解，且結合之分子係藉由添加大分子量之肽來釋放。 (f)經由透析使所釋放之小分子分離。 (g)用酶溶液處理所分離之部分以進一步分解化合物。 (h)在酶變性且移除後，乾燥所分離之部分以獲得固體產物。藉由浸泡於水中來清潔粗製EBN (1片係約10至50 g)，以移除亞硝酸鹽、蟎蟲及其他污染物。所移除之其他可能的污染物可包括重金屬、漂白劑及其他細微碎片，包括染色劑。一種移除亞硝酸鹽之有效方法係使用含有來自水果、植物及土壤之亞硝酸鹽還原酶的溶液。此外，溶液可含有另一種酶以使產生亞硝酸鹽之任何伴隨細菌失活。為了移除蟎蟲，使用含有特定水果蛋白酶之溶液。該等實例包括任何來自番木瓜(木瓜酶)、獼猴桃(獼猴桃蛋白酶)、菠蘿(鳳梨酵素)、無花果(無花果蛋白酶)等的蛋白酶。可以將使細菌失活之任何適合的濃度使用此等蛋白酶。自室溫至40℃，用各酶溶液依次處理EBN混合物至少5分鐘。所得內含EBN懸浮液之酶溶液的奈米微泡將使降解之細胞碎片浮於水表面，在該處可輕易地將其移除。隨後自固體EBN中移除酶溶液。可進一步洗滌固體EBN以移除任何殘餘酶及污染物。較佳在70℃下乾燥所清潔之EBN 12 h以移除過量水。磨碎清潔之EBN且藉由篩網進行篩分。篩網之尺寸應足以移除任何剩餘之較大雜質，較佳尺寸係200至700 µm。最佳地，篩孔尺寸係600 µm。在5℃下，將EBN粉末放入水中，較佳放入蒸餾水或去離子水中持續5小時。適合濃度係25 g EBN於1000 mL水中。視需要，可在121℃下進一步對混合物進行滅菌持續10分鐘。在4至37℃溫度範圍內，用含有至少一種抗體之水溶液處理EBN混合物至少20分鐘。在25至37℃之溫度下，20至120分鐘即可。在4℃之溫度下，保持抗體與EBN之混合物至少9小時。一般而言，溫度愈低，抗體溶液與目標化合物完全結合所需的時間愈長。抗體選自以下： 1. 抗N-聚糖 2. 抗O-聚糖 3. 抗硫酸乙醯肝素(硫酸酯) 4. 抗硫酸軟骨素(硫酸酯) 5. 抗硫酸角質素(硫酸酯) 6. 抗硫酸皮膚素(硫酸酯) 7. 抗白胺酸拉鏈 8. 抗螺旋-轉折-螺旋 9. 抗鋅指 10. 抗玻尿酸可藉由任何通常已知的方法使抗體及結合之分子自混合物分隔。此等方法中之一些包括物理化學分離、類別特異性親和力及抗原特異性親和力。物理化學分離包括基於抗體之尺寸、電荷或其他共享化學特徵的免疫球蛋白差示沈澱、尺寸排外或固相結合。類別特異性親和力包括藉由對免疫球蛋白具有特定親和力之固定生物學配體來固相結合特定抗體種類(例如，IgG)。抗原特異性親和力包括使用特定抗原以藉由其特定抗原結合域來純化抗體。待使用之抗體可包括天然存在的抗體或經修飾之抗體，例如可促進抗體分離之經標記的抗體。與抗體一起使用之標記的一些常見實例係His標記及FLAG標記。此外，用於萃取目標分子之抗體可結合至固體載體。固體載體可由鐵磁性材料或習知惰性載體材料製成。抗體可在市面上購得且可照此使用。若需要修飾抗體，則如文獻中通常已知，存在許多方法來改質抗體以獲得所需特徵。在「釣魚」方法中，通常使用抗體分離以萃取出目標蛋白質。如先前所描述歷時一段時間添加抗體後，用酸性溶液處理混合物且將其加熱至100℃以使目標化合物部分水解。酸較佳係食物酸，例如檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸及乳酸。將混合物冷卻至室溫且中和至pH 7。抗體結合之化合物係藉由添加過量天然糖基胺基聚醣之較大肽及細胞轉錄調節子而自抗體釋放。隨後經由使用透析袋使所釋放之化合物與所添加之肽、酶及抗體分離。在另一實施例中，抗體溶液可含有至少兩種抗體。舉例而言，一種含有抗N-聚糖及抗O-聚糖之溶液；一種含有抗硫酸乙醯肝素、抗軟骨素、抗角質素及抗皮膚素之溶液；一種含有抗白胺酸拉鏈、抗螺旋-轉折-螺旋及抗鋅指之溶液。較佳地，抗體溶液組合物如下，其中給定之百分比係抗體相對於存在於溶液中之抗體的總重量之重量百分比： 1. 50% 抗N-聚糖及50% 抗O-聚糖。 2. 25%抗硫酸乙醯肝素、25%抗軟骨素、25%抗角質素及25%抗皮膚素。 3. 37%抗白胺酸拉鏈、33%抗螺旋-轉折-螺旋及30%抗鋅指。或者，可依次用含有不同抗體之溶液處理含有EBN之混合物，且依次分離以萃取出所需化合物。可在45℃下於pH 6.5至9.0下用植物及食物蛋白酶進一步水解所分離之化合物持續1小時。所用酶之濃度應為至少10 µg/mL以供有效水解。較佳地，酶濃度係至多100 µg/mL，且使用玉蜀黍或玉米末端蛋白酶。藉由在70℃下加熱混合物5分鐘使酶變性。酶在高於55℃之溫度下沈澱，因此可在高於55℃之溫度下過濾混合物以獲得呈溶液於濾過物中之形式的所需化合物。乾燥所需化合物之溶液以獲得呈粉末狀之化合物。較佳地，化合物係藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥來乾燥。冷凍乾燥係藉由以下進行：用液態氮或乾冰將溶液冷卻至-180至-70℃之間的溫度，且使冷凍之混合物經受真空以使冰昇華。必要時可重複冷凍乾燥以獲得乾燥粉末狀產物。可使乾燥粉末狀產物與其他添加劑混合以獲得食品或醫藥產物。或者，可將產物與其他添加劑一起溶解於水中。在分離諸如硫酸軟骨素、玻尿酸及硫酸角質素之產物及其水解之製程中，提供一種低成本方法來以高純度及可變劑量供應化合物以滿足目標。在此製程中分離之產物能夠以各種方式及方法遞送至使用者，以使化合物有效且快速地遞送至作用部位。尤其在伴以適合調配物時，硫酸軟骨素、玻尿酸及硫酸角質素可以有效及適用的劑量遞送至疼痛及發炎部位。提供一些可能的調配物之實例，其中給定之百分比係組分相對於產物之總重量的重量百分比。使25至70重量%之EBN萃取物與構成其餘部分之糖混合達到100%。適合的糖係糊精或麥芽糊精。一些可能的配方提供如下： 1. 70% EBN萃取物產物及30%麥芽糊精。 2. 60% EBN萃取物產物及40%麥芽糊精。 3. 50% EBN萃取物產物及50%麥芽糊精。 4. 25% EBN萃取物產物及75%麥芽糊精。萃取自EBN之產物具有治療性或預防性優勢且可用於藥品或用作預防性措施。萃取物可用於改善皮膚且治療各種皮膚疾病、脫水及發炎皮膚；強化免疫系統；延緩衰老；促進代謝；保護個人視力；改善血液循環；調節血液膽固醇含量；保護心血管健康；激活且更新細胞；減輕關節炎不適；平衡激素含量；減小炎症發病率；控制糖尿病；治療退化性關節、退化性皮膚、退化性神經系統及大腦；及防止腎衰竭。活體外細胞分析結果 進行活體外細胞分析實驗來研究分離自EBN之產物的潛在治療性作用，且在此進一步論述結果。圖2顯示獲自所描述之使用抗鋅指之製程的4種濃度之EBN萃取物產物對非洲綠猴腎細胞生長的影響。在第3天，EBN萃取物表明以劑量依賴性方式促進非洲綠猴腎細胞生長。此外，在所測試之最高濃度(3.3 g/l)下，細胞生長最大化且明顯高於未添加EBN萃取物產物之陰性對照。此表明EBN產物促進非洲綠猴腎細胞生長。為了測定獲自所描述之使用抗O-聚糖之製程的EBN萃取物產物對位於流感病毒表面上之血球凝集素分子與紅血球相互作用之能力的抑制性作用，進行血球凝集抑制(HAI)分析。圖3顯示針對流感病毒之H1N1病毒株之HAI分析的結果。不與流感病毒結合之紅血球將沈降至孔底且觀測為紅色鈕狀物。與流感病毒結合之紅血球將形成晶格。對於所測試之兩種病毒濃度，直至2⁷ 倍稀釋度時才觀測到血球凝集(在1至6行，圓點可見於培養盤之孔中，所有行在虛線左側)。在此稀釋度下，EBN萃取物之相應濃度係0.5 g/l。換言之，0.5 g/l濃度之此EBN萃取物產物能夠抑制H1N1流感病毒與紅血球之結合。圖4顯示使用H3N2病毒株之HAI分析。在16及8 HAU/50 µL之病毒濃度下，EBN萃取物產物之濃度分別係2.1 g/l及1.0 g/l。圖5顯示獲自所描述之使用抗O-聚糖之製程的EBN萃取物產物對非洲綠猴腎細胞之流感病毒感染的抑制作用。圖5顯示使用HAI之病毒滴定濃度量化。下文表1顯示：EBN萃取物產物減小非洲綠猴腎細胞上H1N1流感病毒之感染性。表1：EBN萃取物對非洲綠猴腎細胞中之H1N1病毒複製的影響。血球凝集分析之結果自圖5導出。

比較獲自所描述之使用抗 O - 聚糖之製程的EBN萃取物產物與兩種市售EBN溶液(競爭者A及B)對H1N1病毒活性之抑制作用。EBN萃取物溶液、競爭者A及B中之可溶性蛋白質含量係藉由DC^TM 蛋白質分析(Bio-Rad，目錄號5000116)測定，且使用牛血清白蛋白作為蛋白質標準物。三種溶液之可溶性蛋白質含量係分別測定為2021 µg/mL、823 µg/mL及628 µg/mL (表3)。因此，稀釋獲自該製程之EBN萃取物溶液以符合各別競爭者溶液。然而，發現競爭者A EBN溶液對細胞具有細胞毒性且不進行進一步測試，而競爭者B EBN溶液不顯示對H1N1病毒之抑制。因此，圖6顯示本發明之EBN萃取物溶液與競爭者B之EBN溶液的比較。表 3 . 來自競爭者 A 及 B 之 EBN 溶液的物理特性

圖7顯示獲自所描述之使用抗 N - 聚糖及 / 或抗螺旋 - 轉折 - 螺旋之製程的EBN萃取物產物在細胞擴增期間對人類幹細胞增殖的影響。圖7中之資料顯示：10% EBN萃取物與3種生長因子之組合對人類幹細胞增殖的正面影響與使用4種生長因子類似。10% EBN僅可代替表皮生長因子(EGF)且充當EGF之替代物。 EGF不可用作食物補充品，且Pan等人(Environ. Health Perspect., DOI: 10.1289/ehp1409200)已表明：人類EGF及對羥基苯甲酸酯可導致乳癌細胞株之增殖提高。因此，EBN萃取物將係個體之可用替代物，該等個體不產生人類間葉細胞幹細胞(hMSC)活化且分化成軟骨細胞所需之內源性EGF。圖8及圖9顯示獲自所描述之使用抗 N - 聚糖及 / 或抗螺旋 - 轉折 - 螺旋之製程的EBN萃取物產物與來自競爭者A及B之EBN萃取物對人類幹細胞增殖的影響之間的比較。對於與競爭者A及B產物相比之EBN萃取物，EBN萃取物代替EGF之作用更加顯著。EBN 之 萃取物對流感的影響 材料及方法 1. 萃取方法 參考圖1，在酶溶液中洗滌重10-50 g之EBN片持續5分鐘以移除蟎蟲，移除溶液。用含有亞硝酸鹽還原酶之水溶液洗滌燕窩，移除溶液。在70℃下乾燥經清潔之EBN持續12 h。磨碎經乾燥及清潔之EBN，且藉由篩網(600 µm孔隙尺寸)進行篩分以移除羽毛及異物。在5℃下將磨碎之EBN保持在蒸餾水中(25 g/1000 ml水)持續5 h，且隨後在121℃下加熱10 min來滅菌。將懸浮液與270 ml含有抗體之溶液混合20 min，且隨後在4℃下與200 ml酸混合隔夜。用均勻器使萃取物均勻化且在100℃下加熱。冷卻至室溫後，藉由在攪拌下逐滴添加鹼來將溶液pH調節至7.0。抗體結合之化合物係藉由添加過量天然糖基胺基聚醣之較大肽及細胞轉錄調節子而自抗體釋放。隨後經由使用透析袋使所釋放之化合物與所添加之肽、酶及抗體分離。在45℃於pH 6.5-9.0用玉蜀黍或玉米末端蛋白酶處理萃取物1小時。藉由將懸浮液加熱至70℃歷時5 min使酶失活，且在高於55℃之溫度過濾出沈澱之酶。冷凍乾燥濾過物中之分離產物至少24小時。對於活體外分析測試，將各別冷凍乾燥之EBN粉末溶解於蒸餾水中以製備濃度33.3 g/l之儲備溶液，且藉由γ輻射在25 kGry滅菌1小時。經由8000 RPM離心移除任何不溶性物質。將儲備溶液儲存在-20℃直至需要為止。 SF-EBN中之可溶性蛋白質濃度係藉由DC™蛋白質分析(Bio-Rad，目錄號5000116)測定，且使用牛血清白蛋白作為蛋白質標準。容積滲透濃度及濁度係分別藉由蒸氣壓滲透計(VAPRO)及微定量盤式讀取器(Tecan Infinite M200)量測。在一替代性方法中，洗滌燕窩10 min且在70℃乾燥12 h。磨碎乾燥燕窩，且藉由篩網(600 µm孔隙尺寸)篩分以移除羽毛及異物。將磨碎之燕窩保持在5℃蒸餾水(25 g/1000 ml水)中5 h，且隨後在121℃加熱10 min (滅菌)。將懸浮液與270 ml萃取溶液混合20 min，且隨後在4℃與200 ml酸混合隔夜。用均勻器使萃取物均勻化且在100℃加熱。冷卻至室溫後，藉由攪拌時逐滴添加鹼來將溶液pH調節至7.0。在45℃於pH 6.5-9.0用專屬酶(濃度視酶規格而定)處理萃取物1小時。隨後藉由懸浮液加熱至70℃歷時5 min使酶失活。冷凍乾燥經處理之萃取物。對於活體外分析測試，以33.3 g/l之濃度將冷凍乾燥之EBN粉末溶解於蒸餾水中，且藉由γ輻射在25 kGry滅菌1小時。經由8000 RPM離心移除不溶性EBN萃取物。將儲存於-20℃之可溶性部分(SF-EBN)用於流感中和研究。 SF-EBN中之可溶性蛋白質濃度係藉由DC™蛋白質分析(Bio-Rad，目錄號5000116)測定，且使用牛血清白蛋白作為蛋白質標準物。容積滲透濃度及濁度係分別藉由蒸氣壓滲透計(VAPRO)及微定量盤式讀取器(Tecan Infinite M200)來量測。2 . 非洲綠猴腎細胞庫之擴增及形成 使來自主細胞庫之第129代非洲綠猴腎細胞(ATCC CCL-81)解凍且在無血清培養基、補充有4 mM L-麩醯胺酸(Life Technologies，目錄號25030149)之OptiPro無血清培養基(Life Technologies，目錄號12309-019)中擴增以產生20小瓶(2 × 10⁶ 個細胞/小瓶)工作細胞庫。使用StemProAccutase (Life Technologies，目錄號A11105-01)每4天進行非洲綠猴腎細胞傳代以供細胞分離，且以1.5 × 10⁴ 個細胞/平方公分之細胞密度接種產生之單細胞。3 . EBN 萃取物溶液對非洲綠猴腎細胞生長之影響 為了測試SF-EBN對細胞生長之影響，在24孔組織培養盤中以3 × 10⁴ 個細胞/孔將非洲綠猴腎細胞接種於OptiPro無血清培養基中。接種一天後，將SF-EBN (33.3 g/l)添加至各別孔中以獲得3.3 g/l (10% v/v)、1.65 g/l (5% v/v)、0.83 g/l (2.5% v/v)及0.33 g/l (1% v/v)之最終濃度。在4天內每天監測細胞生長。根據推薦之方案使用Nucleocounter NC-3000 (Chemometec, Inc.)進行細胞計數。4 . 非洲綠猴腎細胞中之流感病毒增殖 以2.5 × 10⁴ 個細胞/平方公分接種非洲綠猴腎細胞以獲得次融合，培養2天後以0.001至0.01之感染倍率(MOI)感染甲型流感H1N1病毒(IVR-116，NIBSC碼06/108)及H3N2 (A/Wisconsin/67/2005 HGR，NIBSC碼06/112)。使用去離子水製備用於活化流感病毒之豬胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，目錄號T5266，1500 BAEE單位/mg)且過濾滅菌以獲得5 mg/ml之儲備濃度。在病毒擴增期間，在病毒接種後30分鐘添加胰蛋白酶以獲得5 µg/ml之最終濃度。 2-3天後(當觀測到80%細胞病變效應(CPE)時)收集含有培養物上清液之病毒，且離心以移除細胞碎片。將病毒儲備溶液(H1N1及H3N2)儲存在-80℃下。使用如下文所描述之血球凝集及組織培養感染劑量(TCID50)分析來量化其病毒滴定濃度。5 . 量化流感病毒滴定濃度 使用如Chen等人(BMC Biotechnol., 2011, 11-81)中所描述之血球凝集分析及組織培養感染劑量(TCID50)分析來量化病毒滴定濃度。對於血球凝集分析，將4%人類紅血球(Siemens Healthcare Diagnostics)稀釋於杜氏磷酸鹽緩衝溶液(Dulbecco's phosphate buffer solution，DPBS，Life Technologies，目錄號14190-250)中以獲得0.75%細胞懸浮液。隨後將稀釋之紅血球懸浮液添加至病毒之2倍連續稀釋液及對照樣品中。將引起紅血球之完全血球凝集的最高病毒稀釋度視為HA滴定終點。 HA滴定濃度(HAU/50 µl)係完全血球凝集時最末孔中病毒之稀釋度的倒數(例如，2⁷ 之稀釋度得到128之血球凝集單位(HAU/50 µl))。藉由以下一式三份地進行TCID50分析：將10倍連續稀釋之病毒樣品添加至非洲綠猴腎細胞中，該等細胞係使用補充有5 µg/ml之豬胰蛋白酶的OptiPro無血清培養基培養於96孔培養盤中。在37℃下於5% CO2氛圍中培養培養盤3天，且隨後在光學顯微鏡下檢測培養物之細胞病變效應。根據Reed-Muench公式(1938)計算在50%培養物(中值組織培養感染劑量，TCID50/ml)中引起細胞病變效應之懸浮液稀釋度。6 . 血球凝集抑制分析 使用如先前所描述之96孔微量滴定培養盤進行血球凝集抑制(HAI)分析(Guo等人, 2006, Antiviral Res., 70, 140-146)。含有Mg2+及Ca2+之DPBS用作稀釋緩衝液。人類紅血球用作指示細胞。將病毒懸浮液(分別係8 HAU/50 µl於0.05 ml DPBS中及16 HAU/50 µl於0.05 ml DPBS中)添加至各孔中，該等孔含有EBN溶液於使用稀釋緩衝液之兩倍連續稀釋液中。將內含0.05 ml之0.75% (v/v)人類O型紅血球的DPBS添加至培養盤中，且在4℃下培養1 h。顯示出血球凝集之完全抑制的樣品最大稀釋度定義為EBN溶液之HAI滴定濃度。7 . EBN 對 抑制流感病毒複製之影響 在T25燒瓶中，將非洲綠猴腎細胞培養於OptiPro無血清培養基中，其中接種密度係3 × 10⁴ 個細胞/平方公分。當細胞培養物達到90%融合度時，以0.001之MOI使培養物感染流感病毒。隨後添加SF-EBN以到達2 g/l (6.25% v/v)、0.26 g/l (0.78% v/v)及0.03 g/l (0.10% v/v)之最終濃度。在2 h後，移除含有SF-EBN之培養基。用OptiPro無血清培養基洗滌細胞三次。添加豬胰蛋白酶以獲得5 µg/ml之最終濃度。在24 h後，收集培養物上清液。經由血球凝集及TCID50分析來證實SF-EBN抗流感作用。8 . 人類間葉細胞 幹細胞 ( hMSC ) 細胞培養 在T175 cm² 細胞培養燒瓶或Nunc^TM EasyFill^TM Cell Factory^TM 系統中，以2400至2800個細胞/平方公分之密度將hMSC (第8代至第9代)接種於MSC生長培養基中，該生長培養基由最低必需培養基α、10%胎牛血清(FBS)及1%青黴素-鏈黴素(所有均來自Gibco)組成。每2至3天更換培養基。當在37℃下使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco)收集hMSC 5 min時，hMSC係在約70%融合度下傳代。使用自動化NucleoCounter® NC-3000 (Chemometec)進行生存力及細胞計數分析。在5% CO₂ 含濕氣培育箱(Thermo Scientific)中將所有培養物維持在37℃。9 . 細胞生長曲線之 hMSC 細胞擴增 hMSC係以1000個細胞/平方公分之密度接種於NunclonTM Delta Surface 24孔培養盤中。在第0天接種hMSC且培養4天。將僅生長於不含任何生長因子及GeneOasis Pte Ltd之EBN萃取物的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陰性對照，且其稱為「無生長因子」。亦將生長於補充有10 ng/ml之PDGF (Peprotech)、5 ng/ml之TGFβ-1 (Peprotech)及10 ng/ml之FGFβ (Gibco)的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陰性對照，其亦稱為「3種生長因子」。將生長於補充有10 ng/ml之PDGF (Peprotech)、5 ng/ml之TGFβ-1 (Peprotech)、1 ng/ml之EGF (Peprotech)及10 ng/ml之FGFβ (Gibco)的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陽性對照，其亦稱為「4種生長因子」。測試生長於補充有3種生長因子(不包括EGF)與10% EBN (vol/vol)之無血清MSC生長培養基中的hMSC，且其稱為「3種生長因子+ 10% EBN」。在第1天添加10% (vol/vol) EBN。使用自動化NucleoCounter® NC-3000 (Chemometec)針對各條件每日一式三份地進行細胞計數分析。在5% CO2含濕氣培育箱(Thermo Scientific)中將所有培養物維持在37℃。10 . 軟骨性分化 hMSC在透明圓底超低黏附96孔培養盤(Corning)中生長為微團集結粒以供軟骨性分化。集結粒係藉由使用每孔2 × 10⁵ hMSC/集結粒在室溫下(rt)以1000 rpm離心5 min而形成。其培養於含有以下之軟骨性分化培養基中：DMEM-高葡萄糖(Gibco)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco)、100 nM地塞米松(dexamethasone，Sigma)、0.1 mM L-抗壞血酸-2-磷酸酯(Sigma)、1% ITS+1 (Sigma)、L-脯胺酸(Sigma)及1%青黴素/鏈黴素(Gibco)。將僅生長於不含EBN萃取物之軟骨性分化培養基中的集結粒用作陰性對照。測試生長於具有不同濃度之EBN (1.25%、2.5%、5%及10% vol/vol)的軟骨性分化培養基中之集結粒。將生長於補充有100 ng/ml之BMP2的軟骨性分化培養基中之集結粒用作陽性對照。每2至3天更換含有或不含補充物之軟骨形成培養基。11 . DNA 、 GAG 及膠原蛋白 II 含量評估 用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗集結粒(每時間點每條件下至少3種)一次，隨後立即儲存於-80℃下。解凍後，在65℃下用0.125 mg/ml木瓜酶消化集結粒隔夜以供DNA及GAG量化；或在4℃下用0.1 mg/ml胃蛋白酶消化超過2夜，隨後在4℃下用0.1 mg/ml彈性蛋白酶消化隔夜以供膠原蛋白II評估。使用Quant-iT Picogreen dsDNA分析進行DNA量化，使用Blyscan硫酸化葡糖胺聚糖分析(Biocolor)進行GAG量測且藉由針對II型膠原蛋白之ELISA (Chondrex)進行膠原蛋白II量化，以上所有均根據製造商之指令進行。使用Tecan Infinite M200獲取所有螢光及光學讀數。12. 統計分析 使用統計軟體Prism 6 (GraphPad)分析資料。藉由杜凱多重比較測試(Tukey's multiple comparisons test)使用普通單因子變異數分析(ANOVA)在統計學上比較不同條件中之多重比較。對於所有統計測試，小於0.05之p值均視為顯著的。13 . 比較 GeneOasis EBN 與 競爭者 A EBN 及競爭者 B EBN hMSC係以第9部分中詳述之類似方式生長。在第0天接種hMSC且培養5天。對EBN萃取物與競爭者A EBN或競爭者B EBN進行2種類型之比較。一種類型之比較係藉由標準化或控制蛋白質含量來比較10%競爭者EBN與GeneOasis EBN(亦即，GeneOasis EBN對照物之蛋白質的量將與各別競爭者之蛋白質的量相同)。如所量測，10%競爭者A EBN等效於4.39% GeneOasis EBN。因此，測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與4.39% GeneOasis EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「GOA」。測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與10%競爭者A EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「3種生長因子+ 10%競爭者A」。同樣地，對於競爭者B，10%競爭者B EBN等效於3.35% GeneOasis EBN。因此，測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與3.35% GeneOasis EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「GOB」。測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與10%競爭者B EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「3種生長因子+ 10%競爭者B」。第二種類型之比較係藉由標準化或控制體積來比較10%競爭者EBN與GeneOasis EBN (亦即，將按體積比較10% GeneOasis EBN與10%競爭者EBN)。在相關實驗之執行及資料分析中，研究者忽略競爭者A及B之特性。總之，吾等描述新穎的EBN萃取方法且發現本發明之EBN萃取物可抑制甲型流感對人類紅血球之血球凝集作用且減小在非洲綠猴腎細胞中之感染性。使用EBN萃取物之可溶性部分(SF-EBN)，吾等表示：EBN可以0.5 g/l及1 g/l之最低濃度分別抑制H1N1及H3N2之血球凝集作用。對於流感H1N1之活體外感染性，吾等表示：在與不含SF-EBN補充物之培養物相比時，以0.03至2 g/l之間的濃度將SF-EBN添加至非洲綠猴腎細胞培養物中使所產生之病毒滴定濃度降低至少2倍。亦在對甲型流感之血球凝集抑制分析中測試市售EBN溶液。發現此等EBN溶液對細胞具有細胞毒性或不呈現任何可偵測的抗流感病毒活性。總之，GeneOasis專屬EBN萃取物在流感病毒感染之預防中係有效且優越的。結果在測試SF-EBN對細胞及流感病毒複製的影響之前，吾等已使用牛血清作為標準物來進行可溶性蛋白質分析，如下文表1中所示。此將為各種來源與EBN之萃取方法之間的後續比較提供參考點。表 1 . SF - EBN 之特性

EBN 對 非洲綠猴腎細胞生長之影響 在組織培養盤中測試四種SF-EBN濃度(3.3 g/l (10% v/v)、1.65 g/l (5% v/v)、0.83 g/l (2.5% v/v)及0.33 g/l (1% v/v))對非洲綠猴腎細胞生長之影響。如圖2中所示，當與不含SF-EBN之對照物相比時，SF-EBN以濃度依賴性方式促進非洲綠猴腎細胞生長。在3.3 g/l SF-EBN存在下，非洲綠猴腎細胞在第3天達到融合細胞密度(約5 × 10⁵ 個細胞/平方公分)，早於對照物(第4天)。生長促進可與EBN萃取物中發現之EGF樣分子的存在有關，其中EGF係非洲綠猴腎細胞生長所必需的已知生長因子。EBN 萃取物對流感病毒感染之抑制性作用 為了測定SF-EBN對位於流感病毒表面上之血球凝集素分子與紅血球相互作用之能力的抑制性作用，吾等已進行血球凝集抑制(HAI)分析，即一種用於使流感病毒之濃度定量的常用分析。製備16及8 HAU/50 µl之兩種病毒濃度(8 HAU/50 µl係存在於世界衛生組織(WHO)用於在血清學上偵測流感病毒之實驗室程序中的推薦濃度)。如圖3中所示，使SF-EBN之兩倍連續稀釋液(2-12行)與人類紅血球混合，隨後以16及8 HAU/50 µl之兩種濃度(上文提及)將流感病毒添加至96孔培養盤中。不與流感病毒結合之紅血球將沈降至孔底且形成紅色鈕狀物。在病毒與紅血球結合之情況下，形成晶格。對於所測試之兩種流感病毒濃度，直至2⁷ 倍稀釋度時才觀測到血球凝集。在該稀釋度下，相應SF-EBN濃度係0.5 g/l。此表明：此0.5 g/l (但不低於該濃度)之EBN濃度阻止血球凝集。如圖4中所示，使用流感病毒H3N2重複該實驗。在16及8 HAU/50 µl濃度之H3N2病毒存在下，分別需要2.1 g/L及1.0 g/L之較高SF-EBN濃度來阻止血球凝集。此等結果顯示：EBN萃取物可與病毒性血球凝集素分子對抗(藉由人類紅血球之血球凝集所量測)以減小流感病毒感染性(類似於特定抗血清之活性)。吾等亦研究SF-EBN對非洲綠猴腎細胞之流感病毒感染的抑制作用。在2 g/l、0.26 g/l及0.03 g/l之SF-EBN存在下，使融合非洲綠猴腎細胞感染流感病毒H1N1 (MOI為0.001)。在感染24 h後，收集培養物上清液以使用血球凝集分析進行病毒滴定濃度量化。如下文表2中所示，0.03至2 g/l之間的SF-EBN濃度顯示H1N1病毒滴定濃度減小約兩倍。此表明EBN萃取物可減小流感病毒之感染性(使用非洲綠猴腎細胞)。表 2 SF - EBN 在 非洲綠猴腎細胞中 對 流感病毒 H1N1 複製的影響

#血球凝集分析之結果自圖5導出評估來自競爭者之 SF - EBN 的 抗病毒作用 選擇兩種市售EBN溶液(競爭者A及B)以供抗病毒活性測定。如下文表3中所示，此等市售EBN溶液所呈現之可溶性蛋白質濃度及容積滲透濃度低於SF-EBN。表 3 . 來自競爭者 A 及 B 之 EBN 溶液的物理特性

因此，用水稀釋SF-EBN以符合市售EBN溶液之可溶性蛋白質濃度以供血球凝集分析。因為發現競爭者A EBN溶液對細胞具有細胞毒性，所以將其自分析中去除，而其他EBN溶液(競爭者B)不顯示生長抑制作用。血球凝集分析之結果顯示於圖6中。吾等發現市售EBN溶液(競爭者B)不呈現任何防止H1N1病毒介導之紅血球血球凝集的活性。此表明：此市售EBN溶液不具有如SF-EBN所示之抗病毒特性。因為已知EBN具有抗流感病毒活性，吾等可得出以下結論：由具有才華者研發之用於EBN萃取的新穎方法在保持抗病毒特性中具有優越性。EBN 之 萃取物對人類神經祖細胞生長及分化的影響 1.材料及方法 1.1 衍生及維護人類神經祖細胞人類神經祖細胞(hNPC)係藉由使用微載體懸浮培養物而產生自人類胚胎幹細胞株(hESC) HES-3。隨後，hNPC接著生長於塗佈有geltrex之培養盤上，且饋入補充有EGF (20 ng/ml，Peprotech)及FGF (20 ng/ml，Peprotech)之NPC培養基(神經基質培養基、1x NEAA、1x青黴素-鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、1x N2、1x B27不含維生素A，均來自Life Technologies)。每隔一天更換培養基。當細胞達到約80-90%融合度時，使用StemPro Accutase (Life Technologies)進行hNPC傳代。 1.2 人類神經祖細胞之細胞生長及細胞計數 hNPC係以2000個細胞/孔之密度接種於塗佈有geltrex之48孔培養盤中且生長1週。將補充有不同組合之生長因子(EGF、FGF)及GeneOasis Pte Ltd之EBN萃取物的NPC培養基饋入hNPC。隨後細胞溶解以用於根據製造商之指令藉由NucleoCounter NC3000 (Chemometec)使用細胞核計數方法用DAPI進行總細胞及活細胞計數。 1.3 人類神經祖細胞之細胞增殖及分化 hNPC係以150,000個細胞/孔之密度接種於塗佈有geltrex之6孔培養盤中且生長1週及3週。將補充有不同組合之生長因子(EGF、FGF)及GeneOasis Pte Ltd之EBN萃取物的NPC培養基饋入hNPC。在培養期間，當細胞達到80%融合度時進行hNPC傳代。在時間點處(第1週及第3週)，hNPC藉由Tryple (Life Technologies)分離成單細胞。隨後，細胞經固定、滲透且與一級抗體一起培育，Ki-67抗體(1:200，BD Bioscience)用於細胞增殖且微管蛋白ß 3抗體(1:1000，Covance)用於神經元分化評估。Alexa Fluor 488®山羊抗小鼠抗體(Life Technologies)用作二級抗體。所有培育均在4℃下進行20 min。使用流式細胞儀(GUAVA，Millipore)進行螢光量測。FlowJo軟體用於分析流式細胞量測術資料。 2. 結果在此研究中，吾等研究EBN萃取物是否可支持衍生自人類胚胎幹細胞(hESC)之hNPC的擴增。如圖10中所示，在FGF-2及EGF存在下培養之hNPC在7天後呈現最高細胞產率。與生長因子FGF-2組合之EBN萃取物所獲得之細胞生長曲線與使用FGF-2+EGF及單獨FGF-2之條件的細胞生長曲線類似。添加不含FGF-2之EBN導致降低細胞生長。結果表明：EBN萃取物無法代替FGF2，FGF2係hNPC增殖之最關鍵的生長因子。另一方面，即使EBN含有顯示於描述EBN萃取物在無血清培養基中對人類間葉細胞幹細胞增殖的影響之報導中的EGF樣活性，在FGF-2存在下，吾等仍未觀測到EBN萃取物在hNPC之短期擴增中的有益影響。吾等對擴增之hNPC進行進一步分析。如圖10B中所示，具有FGF-2及EBN萃取物之NPC培養物呈現表現細胞增殖標記物、ki67及神經元分化標記物、β-微管蛋白之類似細胞群體。不含FGF-2之補充有EBN萃取物之培養物呈現較低ki67及高β-微管蛋白細胞群體。ki67之趨勢與EBN萃取物可能不支持不含FGF-2之NPC生長的細胞生長研究一致。低ki67表現量與所報導之現象一致，該現象係細胞增殖的降低出現於神經元分化開始處。吾等將研究延長至三週。如圖11中所示，與FGF-2組合之EBN萃取物所呈現的細胞產率似乎高於僅具有FGF-2之培養物。在所有條件下，細胞增殖標記物ki67之表現均類似於早期培養。然而，吾等發現在補充有EBN萃取物且不含FGF-2之hNPC培養物中，神經元分化標記物(β-微管蛋白)顯著提高且達到與不含EGF及FGF-2之培養物類似之含量。β微管蛋白陽性細胞群體之提高表明神經元細胞之發展。此與圖12中顯示之細胞形態圖像一致，其中神經元細胞形態(神經突延伸部分)在具有高β-微管蛋白表現之培養物中變得顯著。在10% EBN萃取物+ FGF之條件下生長時，hNPC維持其典型形態。總之，吾人之研究表明本EBN萃取物含有可有益於長期培養hNPC之EGF樣組分。可考慮之一種未來研究係EBN萃取物之分離從而分離EGF樣組分以供進一步特徵化。EBN 之 萃取物對細胞培養、細胞生長之影響及軟骨形成分析 1.2.1. hMSC細胞培養在T175 cm² 細胞培養燒瓶或NuncTM EasyFillTM Cell FactoryTM系統中，以2400至2800個細胞/平方公分之密度將hMSC (第8代至第9代)接種於MSC生長培養基中，該生長培養基由最低必需培養基a、10%胎牛血清(FBS)及1%青黴素-鏈黴素(所有均來自Gibco)組成。每2至3天更換培養基。當在37℃下使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco)收集hMSC 5 min時，hMSC係在約70%融合度下傳代。使用自動化NucleoCounter® NC-3000 (Chemometec)進行生存力及細胞計數分析。在5% CO2含濕氣培育箱(Thermo Scientific)中將所有培養物維持在37℃。參見下表，其顯示孔盤設計。

1.2.2. 細胞生長曲線之hMSC細胞擴增 hMSC係以1000個細胞/平方公分之密度接種於NunclonTM Delta Surface 24孔培養盤中。在第0天接種hMSC且培養4天。將僅生長於不含任何生長因子及GeneOasis Pte Ltd之EBN萃取物的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陰性對照，且其稱為「無生長因子」。亦將生長於補充有10 ng/ml之PDGF (Peprotech)、5 ng/ml之TGFß-1 (Peprotech)及10 ng/ml之FGFß (Gibco)的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陰性對照，其亦稱為「3種生長因子」。將生長於補充有10 ng/ml之PDGF (Peprotech)、5 ng/ml之TGFß-1 (Peprotech)、1 ng/ml之EGF (Peprotech)及10 ng/ml之FGFß (Gibco)的BTI專屬無血清MSC生長培養基中之hMSC用作陽性對照，其亦稱為「4種生長因子」。測試生長於補充有3種生長因子(不包括EGF)與10% EBN (vol/vol)之無血清MSC生長培養基中的hMSC，且其稱為「3種生長因子+ 10% EBN」。在第1天添加10% (vol/vol) EBN。使用自動化NucleoCounter® NC-3000 (Chemometec)針對各條件每日一式三份地進行細胞計數分析。在5% CO2含濕氣培育箱(Thermo Scientific)中將所有培養物維持在37℃。 1.2.3. 軟骨性分化 hMSC在透明圓底超低黏附96孔培養盤(Corning)中生長為微團集結粒以供軟骨性分化。集結粒係藉由使用每孔2 × 10⁵ hMSC/集結粒在室溫下(rtm)以1000 rpm離心5 min而形成。其培養於含有以下之軟骨性分化培養基中：DMEM-高葡萄糖(Gibco)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco)、100 nM地塞米松(Sigma)、0.1 mM L-抗壞血酸-2-磷酸酯(Sigma)、1% ITS+1 (Sigma)、L-脯胺酸(Sigma)及1%青黴素/鏈黴素(Gibco)。將僅生長於不含本發明之萃取物的軟骨性分化培養基中之集結粒用作陰性對照。測試生長於具有不同濃度之EBN (1.25%、2.5%、5%及10% vol/vol)的軟骨性分化培養基中之集結粒。將生長於補充有100 ng/ml之BMP2的軟骨性分化培養基中之集結粒用作陽性對照。每2至3天更換含有或不含補充物之軟骨形成培養基。 1.2.4. DNA、GAG及膠原蛋白II含量評估用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗集結粒(每時間點每條件下至少3種)一次，隨後立即儲存於-80℃下。解凍後，在65℃下用0.125 mg/ml木瓜酶消化集結粒隔夜以供DNA及GAG量化；或在4℃下用0.1 mg/ml胃蛋白酶消化超過2夜，隨後在4℃下用0.1 mg/ml彈性蛋白酶消化隔夜以供膠原蛋白II評估。使用Quant-iT Picogreen dsDNA分析進行DNA量化，使用Blyscan硫酸化葡糖胺聚糖分析(Biocolor)進行GAG量測且藉由針對II型膠原蛋白之ELISA (Chondrex)進行膠原蛋白II量化，以上所有均根據製造商之指令進行。使用Tecan Infinite M200獲取所有螢光及光學讀數。 1.2.5. 統計分析使用統計軟體Prism 6 (GraphPad)分析資料。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析(ANOVA)在統計學上比較不同條件中之多重比較。對於所有統計測試，小於0.05之p值均視為顯著的。 1.2.6. 比較本EBN萃取物與競爭者A EBN及競爭者B EBN hMSC係以1.2.2.中詳述之類似方式生長。在第0天接種hMSC且培養5天。對本EBN萃取物與競爭者A EBN或競爭者B EBN進行2種類型之比較。一種類型之比較係藉由標準化或控制蛋白質含量來比較10%競爭者EBN與本EBN萃取物(亦即，本EBN萃取物對照物之蛋白質的量將與相應競爭者之蛋白質的量相同)。如所量測，10%競爭者A EBN等效於4.39%本EBN萃取物。因此，測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與4.39% GeneOasis EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「GOA」。測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與10%競爭者A EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「3種生長因子+ 10%競爭者A」。同樣地，對於競爭者B，10%競爭者B EBN等效於3.35%本EBN萃取物。因此，測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與3.35% 本EBN萃取物 (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「GOB」。測試補充有3種生長因子(不包括EGF)與10%競爭者B EBN (vol/vol)之MSC生長培養基，且其稱為「3種生長因子+ 10%競爭者B」。第二種類型之比較係藉由標準化或控制體積來比較10%競爭者EBN與本EBN萃取物(亦即，將按體積比較10%本EBN萃取物與10%競爭者EBN)。在相關實驗之執行及資料分析中，研究者忽略競爭者A及B之特性。下表係比較本EBN萃取物與競爭者A EBN或競爭者B之方法的概述。

2. 結果如圖13至圖24中所示，本EBN萃取物可在活體外細胞擴增期間使人類幹細胞增殖提高。儘管已在先前描述中描述了本發明之較佳實施例，但有關技術中之技術人員應理解，可在不脫離本發明之情況下對設計或建構之細節作出許多變化或修改。

在圖式中：圖 1 顯示根據本發明之一實施例的燕窩萃取物之製備方法的流程圖。圖 2 SF-EBN對非洲綠猴腎細胞(Vero cell)生長之影響。培養基中SF-EBN之存在顯示細胞生長之顯著改良(量測於第3天)。圖 3 來自GeneOasis之SF-EBN可預防流感病毒(H1N1)介導之血球凝集。基於世界衛生組織(WHO)推薦之8 HAU/50 ul病毒濃度，血球凝集在0.5 g/l (2⁶ )之SF-EBN下得到預防。圖 4 來自GeneOasis之SF-EBN對流感病毒(H3N2)介導之血球凝集之抑制性作用的影響。基於WHO推薦之8 HAU/50 ul病毒濃度，血球凝集在1.0 g/l (2⁵ )之SF-EBN濃度下得到預防。圖 5 在SF-EBN存在下使非洲綠猴腎細胞感染後對培養物上清液中流感病毒滴定濃度量測之血球凝集分析。在以0.001感染倍率(MOI)感染H1N1後，分析24 h。虛線劃分出在其中可觀測到血球凝集之列內的孔。圖 6 對流感病毒(H1N1)介導之血球凝集中來自競爭者B之SF-EBN的評估。使用16 HAU/50 ul之H1N1病毒濃度。稀釋本發明之SF-EBN以符合來自競爭者B之SF-EBN的可溶性蛋白質濃度。圖 7 顯示獲自所描述之使用抗N-聚糖及/或抗螺旋-轉折-螺旋之製程的EBN萃取物產物在細胞擴增期間對人類幹細胞增殖的影響。圖7中之資料顯示：10% EBN萃取物與3種生長因子之組合對人類幹細胞增殖的正面影響與使用4種生長因子類似。10% EBN僅可代替表皮生長因子(EGF)且充當EGF之替代物。EGF不可用作食物補充品，且Pan等人(Environ. Health Perspect., DOI: 10.1289/ehp1409200)已表明：人類EGF及對羥基苯甲酸酯可導致乳癌細胞株之增殖提高。因此，EBN萃取物將係個體之可用替代物，該等個體不產生人類間葉細胞幹細胞(hMSC)活化且分化成軟骨細胞所需之內源性EGF。圖 8 及圖 9 顯示獲自所描述之使用抗N-聚糖及/或抗螺旋-轉折-螺旋之製程的EBN萃取物產物與來自競爭者A及B之EBN萃取物對人類幹細胞增殖的影響之間的比較。對於與競爭者A及B產物相比之EBN萃取物，EBN萃取物代替EGF之作用更加顯著。圖 10 EBN萃取物對hNPC之增殖及分化的影響。細胞生長(A)、增殖之細胞標記物(ki67)及神經元分化(β-微管蛋白) (B)係在培養1週後量測。圖 11 EBN萃取物對hNPC之增殖及分化的長期影響。hNPC係在生長因子及EBN萃取物之任一者存在下連續培養三週。之後，收集hNPC且以20,000個細胞/孔將其接種於新培養盤中用於細胞生長研究。細胞生長(A)、增殖之細胞標記物(ki67)及神經元分化(β-微管蛋白) (B)係在培養3週後量測。圖 12 EBN萃取物對NPC培養物形態之影響。圖 13 10%本EBN萃取物可代替EGF獲得活體外hMSC擴增之類似生長曲線。用雙因子變異數分析(two way ANOVA)進行統計分析揭示：3種生長因子+ 10% EBN之細胞生長僅明顯不同於3種生長因子之細胞生長，顯示出自細胞培養第2天至第4天，10% EBN藉由提高細胞生長而引起正面影響。相比之下，用雙因子變異數分析進行統計分析揭示：3種生長因子+ 10% EBN之細胞生長並非明顯不同於4種生長因子之細胞生長，顯示出自細胞培養第0天至第4天，10% EBN可代替EGF獲得類似hMSC生長。p值，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。圖 14 添加本EBN萃取物主要自分化第7天至第14天導致每集結粒之DNA含量提高，其中使用2.5%至5% EBN在第7天時結果最顯著且一致。DNA含量之提高常用作細胞增殖之量度。虛線係指在不添加EBN萃取物時每集結粒之DNA含量。數字係指相比於0% EBN所引起之倍數變化。方框突顯倍數增加大於1.0者。圖 15 對於總計n = 3集結粒之第一獨立實驗，添加本EBN萃取物自分化第7天至第28天未導致每集結粒之DNA含量在統計學上顯著提高。此可能歸因於在各指定時間點所觀測到的相同條件之集結粒之間的DNA含量變化。DNA含量之提高常用作細胞增殖之量度。藉由杜凱多重比較測試(Tukey's multiple comparisons test)使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可於較多樣品上進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。圖 16 對於總計n = 4集結粒之第二獨立實驗，在與不含任何EBN萃取物(0%)之對照條件相比時，2.5%及10%本EBN萃取物在分化第7天導致每集結粒之DNA含量在統計學上顯著提高。此顯示：本EBN萃取物可在活體外軟骨性分化過程期間在統計學上顯著提高人類幹細胞增殖。此情況係新穎的，因為此係首個不僅顯示DNA (細胞增殖)提高，而且顯示其在統計學上顯著提高之研究。DNA含量之提高常用作細胞增殖之量度。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可於較多樣品上進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。p值，*p ＜ 0.05。圖 17 對於總計n = 7集結粒之組合結果，在與不含任何EBN萃取物(0%)之對照條件相比時，2.5%本EBN萃取物在分化第7天導致每集結粒之DNA含量在統計學上顯著提高。此顯示：本EBN萃取物可在活體外軟骨性分化過程期間在統計學上顯著提高人類幹細胞增殖。此情況係新穎的，因為此係首個不僅顯示DNA (細胞增殖)提高，而且顯示其在統計學上顯著提高之研究。DNA含量之提高常用作細胞增殖之量度。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可於較多樣品上進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。p值，*p ＜ 0.05。圖 18 添加本EBN萃取物主要自分化第14天至第28天導致每集結粒之葡糖胺聚糖(GAG)含量及GAG/DNA比率提高。使用2.5%至5%，每集結粒之GAG含量的提高自分化第14天至第28天最顯著且最一致。使用5% EBN，GAG/DNA比率之提高自分化第14天至第28天最顯著且最一致。GAG係通常存在於軟骨組織中之主要類型的蛋白聚糖。每集結粒之GAG含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。GAG/DNA比率反映每細胞之GAG產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之充分程度的功能性指標。虛線係指在不添加EBN萃取物時每集結粒之GAG及GAG/DNA比率。數字係指相比於0% EBN所引起之倍數變化。方框突顯倍數增加大於1.0者。圖 19 對於總計n = 3集結粒之第一獨立實驗，添加本EBN萃取物自分化第7天至第28天未導致每集結粒之GAG含量及GAG/DNA比率在統計學上顯著提高。此可能歸因於在各指定時間點所觀測到的相同條件之集結粒之間的GAG及DNA含量變化(參考圖15)。GAG係通常存在於軟骨組織中之主要類型的蛋白聚糖。每集結粒之GAG含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。GAG/DNA比率反映每細胞之GAG產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之充分程度的功能性指標。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可於較多樣品上進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。圖 20 對於總計n = 4集結粒之第二獨立實驗，添加本EBN萃取物自分化第7天至第28天未導致每集結粒之GAG含量及GAG/DNA比率在統計學上顯著提高。此可能歸因於在各指定時間點相同條件之集結粒之間所觀測的GAG及DNA含量變化(參考圖15)。然而，在與不含任何EBN萃取物(0%)之對照條件相比時，2.5%及10%本EBN萃取物可能在分化第7天導致每集結粒之GAG含量在統計學上顯著提高。此可歸因於當GAG/DNA含量比率保持不變時，每集結粒之DNA含量在統計學上顯著提高(參考圖16)。GAG係通常發現於軟骨組織中之主要類型的蛋白聚糖。每集結粒之GAG含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。GAG/DNA比率反映每細胞之GAG產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之程度的功能性指標。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可以較多樣品進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。圖 21 對於總計n = 7集結粒之組合結果，添加本EBN萃取物自分化第7天至第28天未導致每集結粒之GAG含量及GAG/DNA比率在統計學上顯著提高。此可能歸因於在各指定時間點相同條件之集結粒之間所觀測的GAG及DNA含量變化(參考圖17)。GAG係通常發現於軟骨組織中之主要類型的蛋白聚糖。每集結粒之GAG含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。GAG/DNA比率反映每細胞之GAG產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之程度的功能性指標。藉由杜凱多重比較測試使用普通單因子變異數分析進行統計分析。藍色方框突顯在可以較多樣品上進行分析之情況下可能顯著者。紅色方框突顯在統計學上顯著者。圖 22 添加本EBN萃取物主要自分化第21天至第28天導致每集結粒之膠原蛋白II含量及膠原蛋白II/DNA比率提高。對於1.25% EBN自分化第7天至第14天，且對於2.5% EBN自分化第21天至第28天，每集結粒之膠原蛋白II含量的提高最顯著且最一致。使用1.25% EBN，膠原蛋白II/DNA比率之提高自分化第7天至第28天最顯著且最一致。膠原蛋白II係通常發現於關節軟骨組織中之主要類型的膠原蛋白分子或原纖維。每集結粒之膠原蛋白II含量指示活體外幹細胞衍生之軟骨細胞樣細胞的總功能性輸出。膠原蛋白II/DNA比率反映每細胞之膠原蛋白II產量，且用作幹細胞分化成軟骨細胞樣細胞之程度的功能性指標。虛線係指在不添加EBN萃取物時每集結粒之膠原蛋白II及膠原蛋白II/DNA比率。數字係指相比於0% EBN所引起之倍數變化。方框突顯倍數增加大於1.0者。圖 2 3 自培養第2天至第5天，4.39%及10%本EBN萃取物在誘發hMSC細胞生長方面均明顯優於10%競爭者A EBN。出人意料地，3種生長因子+ 10%競爭者A之細胞生長曲線：(i)明顯不同於僅有3種生長因子之細胞生長曲線(第2天p ＜ 0.05，在所有其他天數中p ＜ 0.001)，(ii)明顯不同於4種生長因子之細胞生長曲線(在所有天數中p ＜ 0.001)，且(iii)並非明顯不同於不含生長因子之細胞生長曲線(在所有天數中p ＞ 0.05)。此顯示競爭者A EBN：(i)具有抵消其他3種生長因子之作用的抑制性作用，(ii)無法代替EGF獲得類似於4種生長因子之生長曲線，且(iii)並不誘發細胞生長，其亦暗示競爭者A EBN實際上可導致細胞死亡。此組結果之統計分析未顯示於圖示中且單獨完成。最重要的是，按蛋白質的量比較本EBN萃取物(GOA)與競爭者A EBN揭示：自培養第2天至第5天，4.39%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者A EBN之細胞生長曲線(在所有天數中***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。類似地，按體積比較本EBN萃取物(GOA)與競爭者A EBN揭示：自培養第2天至第5天，10%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者A EBN之細胞生長曲線(p值顯示於圖示中)。此情況係重要且新穎的，因為其顯示本EBN萃取物在以下方面比競爭者A EBN更加有效：(i)促進細胞生長且不導致如競爭者A所導致的細胞死亡，及(ii)其能夠代替EGF。圖 2 4 分別自培養第4天至第5天及自第2天至第5天，3.35%及10%本EBN萃取物在誘發hMSC細胞生長方面均明顯優於10%競爭者B EBN。出人意料地，3種生長因子+ 10%競爭者B之細胞生長曲線：(i)自第2天至第4天明顯不同於僅有3種生長因子之細胞生長曲線(第2天p ＜ 0.01，第3天p ＜ 0.05，第4天p ＜ 0.001)，(ii)明顯不同於4種生長因子之細胞生長曲線(第3天p ＜ 0.01，第4天及第5天p ＜ 0.001)，且(iii)明顯不同於不含生長因子之細胞生長曲線(在所有天數中p ＜ 0.001)。此顯示競爭者B EBN：(i)在與僅有3種生長因子之細胞生長相比時，僅自第2天至第4天對細胞生長具有顯著正面影響，(ii)自培養第3天至第5天，無法代替EGF獲得類似於4種生長因子之生長曲線，且(iii)相比於無生長因子之細胞生長，並不誘發細胞死亡。此組結果之統計分析未顯示於圖示中且單獨完成。最重要的是，按蛋白質的量比較本EBN萃取物(GOB)與競爭者B EBN揭示：自培養第4天至第5天，3.35% GeneOasis EBN可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者B EBN之細胞生長曲線(第4天**p ＜ 0.01，且第5天***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。類似地，按體積比較本EBN萃取物(GOB)與競爭者B EBN揭示：自培養第2天至第5天，10%本EBN萃取物可導出在統計學上明顯不同於10%競爭者B EBN之細胞生長曲線(第4天**p ＜ 0.01，且第2天及第5天***p ＜ 0.001；p值顯示於圖示中)。此情況係重要且新穎的，因為其顯示本EBN萃取物在以下方面比競爭者B EBN更加有效：(i)促進細胞生長，及(ii)其能夠代替EGF，特別是在細胞生長之靠後階段(培養第4天及第5天)。

Claims

一種用於製備燕窩(bird’s nest)萃取物之方法，該萃取物包含至少一種獲自可食用燕窩(edible bird’s nest)(EBN)之分子，該方法包含以下步驟： (a) 洗滌原料EBN； (b) 過濾該洗滌之EBN； (c) 自該EBN萃取該分子；及 (d) 分離該分子。
如請求項1之方法，其中洗滌包含在環境溫度將該EBN暴露於第一酶溶液約5分鐘，且將該EBN及酶溶液浸泡於水中再5分鐘。
如請求項2之方法，其中該第一酶溶液包含亞硝酸鹽還原酶。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含在該萃取步驟之前，在121℃對該洗滌之EBN滅菌約10分鐘。
如請求項1至3中任一項之方法，其中萃取該分子係由將該洗滌之EBN暴露於選自包含以下之群的萃取溶液中之任一者進行： (a) 包含抗N聚糖及抗O聚糖之溶液； (b) 包含抗硫酸乙醯肝素、抗軟骨素、抗角質素及抗皮膚素之溶液；及 (c) 包含抗白胺酸拉鏈、抗螺旋-轉折-螺旋及抗鋅指之溶液。
如請求項5之方法，其中存在於各溶液中之量係： (a) 50% 抗N聚糖及50% 抗O聚糖； (b) 25%抗硫酸乙醯肝素、25%抗軟骨素、25%抗角質素及25%抗皮膚素；及 (c) 37%抗白胺酸拉鏈、33%抗螺旋-轉折-螺旋及30%抗鋅指。
如請求項5之方法，其中該萃取步驟係在酸存在下進行。
如請求項1至3中任一項之方法，其中萃取係在25℃至37℃之間進行約20至120分鐘。
如請求項1至3中任一項之方法，其中分離該分子係在第二酶溶液存在下進行。
如請求項9之方法，其中該第二酶溶液包含植物或水果蛋白酶。
如請求項9之方法，其中該第二酶溶液之濃度係在10 ug/ml至100 ng/ml之間。
如請求項9之方法，其中分離該分子之步驟係在45℃於pH 6.5至9.0進行60分鐘。
如請求項9之方法，其進一步包含在70℃加熱該混合物5分鐘，以使該第二酶溶液中之酶失活。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含使該萃取之混合物脫水的步驟。
如請求項14之方法，其中該脫水步驟係冷凍乾燥。
一種燕窩萃取物，其獲自如請求項1至15中任一項之方法。
一種組合物，其包含如請求項16之萃取物。
如請求項17之組合物，其進一步包含麥芽糊精。
如請求項18之組合物，其中存在於該組合物中之麥芽糊精的量係在30重量%至75重量%之間。
一種如請求項16之萃取物的用途，其用於藥品中。
一種如請求項16之萃取物的用途，其用於製造用以治療及/或預防病症及/或疾病之藥物。
一種醫藥組合物，其包含如請求項16之萃取物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。