CN102438632A - 新颖的毛头鬼伞和黄金银耳蘑菇菌株及其产物和提取物以及包含它们的组合物 - Google Patents

Abstract

公开了新的且独特的高等担子菌蘑菇品种，其选自在布达佩斯条约下分别在登记号CBS123401和CBS123296下保藏在CentralbureauvoorSchimmelcultures(CBS)的毛头鬼伞HAI-1237和黄金银耳HAI-17，其生物质和提取物，和分离的组分诸如β-葡聚糖、岩藻半乳聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖，以及它们作为天然的食品添加物、营养制品、益生元、饮料产品、化妆品、宠物食品和农业杀昆虫和抗植物病毒组合物的应用。

Description

新颖的毛头鬼伞和黄金银耳蘑菇菌株及其产物和提取物以及包含它们的组合物

技术领域

本发明涉及药用蘑菇，更具体地，涉及鬼伞属（Coprinus）和银耳属（Tremella）蘑菇物种，和命名为毛头鬼伞（Coprinus comatus）CBS 123401和黄金银耳（Tremella mesenterica）CBS 123296的新的且独特的高等担子菌菌株。本发明另外涉及子实体、浸没培养的菌丝生物质或单细胞生物质、和来自包含多种生物活性化合物的这些新菌株的提取物，以及它们作为人和动物饮食添加物、益生元、药用化妆品的应用，和在多种疾病和病症的治疗中的应用，以及作为抗植物病毒剂（anti-phytoviral agent）的应用。

背景技术

蘑菇生物技术产品对人福利具有多种有益作用，例如，作为食品、健康补品和药品、饲料和肥料，和用于保护和再生环境。最近，从药用蘑菇中分离出了具有有效的且独特的增强健康性质的药用物质，并在全世界上分布。它们中的许多是药物产品， 而其它则代表着一类新颖的饮食添加物或“蘑菇营养制品”或“营养药”、真菌化学制品（mycochemical）、植物化学物质和设计者食品（designer food）。已经从药用蘑菇中分离出了几种抗肿瘤多糖诸如杂-β-葡聚糖和它们的蛋白复合物(例如，木糖葡聚糖和含有糖醛酸的酸性β-葡聚糖)以及膳食纤维、凝集素和三萜系化合物。

高等担子菌蘑菇含有大量多糖，特别是不同类型的β-葡聚糖。β-葡聚糖的抗肿瘤作用似乎与它们的分子量和溶解度有关。例如，仅低分子量香菇多糖显示出高抗肿瘤活性。不足令人惊奇的是，可溶性的β-葡聚糖似乎是比不溶性的β-葡聚糖更强的免疫刺激剂。

浸没培养的银耳属的某些物种、特别是黄金银耳（T. mesenterica）菌株的单细胞生物质和子实体含有高水平的葡糖醛酸木甘聚糖和β-葡聚糖，已经证实，所述生物质和纯化的多糖具有降血糖活性和降甘油三酯活性 (US 6,383,799; US 6,362,397)。

高等担子菌蘑菇含有大量多糖、蛋白、平衡的必需氨基酸、黑色素、包含必需脂肪酸的脂质、三萜系化合物、抗氧化剂、维生素和其它生物活性物质。另外，在所有蘑菇的组织中，富含属于葡聚糖、甲壳质和杂多糖的膳食纤维，包括果胶物质、半纤维素或多糖醛酸苷，它们能够吸附胆汁酸或肠中的危险物质，因而可以起制癌剂的作用，并减少不同种类的中毒。

另外，已知真菌物质是：(i) NF-κB活化途径的调节剂，该途径在多种生理学和病理学过程中起关键作用；(ii) 抗氧化剂，其适合作为人饮食的添加物，用于预防或减轻由氧化性应激反应造成的氧化损伤； (iii) 免疫调节剂；并会影响炎性过程。

发明内容

本发明涉及新的且独特的高等担子菌蘑菇品种，其选自：在布达佩斯条约下在登记号CBS 123401下保藏在荷兰真菌培养中心（Centralbureau voor Schimmelcultures(CBS)）的毛头鬼伞 HAI-1237(在下文中称作毛头鬼伞 CBS 123401)，和在布达佩斯条约下在登记号CBS 123296下保藏在荷兰真菌培养中心（Centralbureau voor Schimmelcultures(CBS)）的黄金银耳HAI-17(在下文中称作黄金银耳CBS 123296)。

在其它方面，本发明涉及本发明的蘑菇的生物质，其富含营养制品因子和生物活性物质，包括碳水化合物、富含必需氨基酸的蛋白、维生素、富含必需脂肪酸的脂质、抗氧化剂和矿物质。所述生物质可以从毛头鬼伞CBS 123401的子实体或菌丝体或黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到。黄金银耳CBS 123296的菌丝体培养物是单细胞生物质的形式。

在另一个方面，本发明涉及来自本发明的蘑菇的提取物，其具有营养制品和生物活性。所述提取物可以从蘑菇的菌丝体或子实体得到。

在其它方面，本发明涉及从提取物分离出的新颖的碳水化合物，包含来自本发明蘑菇的生物质或提取物或从所述提取物分离出的新颖的碳水化合物的组合物，包含本发明组合物的天然的食品添加物、药物、益生元、营养制品、饮料或化妆品，包含药学上可接受的载体和选自本发明组合物和新颖的碳水化合物之一的活性成分的药物组合物，和生产所述生物质和提取物的方法。

附图说明

图1描述了在发酵罐或在生物反应器技术中生产浸没培养的毛头鬼伞或黄金银耳菌丝体的一般方法学的方案：a- 制备用于培养皿的标准琼脂培养基；b- 用于制备培养物的子实体的孢子或部分；c- 在培养皿上培养；d- 在试管中的琼脂斜面上的储存培养物（museum culture）；e- 储存培养物的显微镜检查；f- 在250 mL锥形瓶中的前接种物培养物；g- 前接种物培养物的匀浆化；h- 在2 L锥形瓶中培养匀浆化的菌丝生物质；i – 用于接种发酵罐培养基的菌丝生物质的匀浆化；j- 用于发酵罐的生长培养基；k- 在发酵罐中培养菌丝生物质；l-收获菌丝生物质；m- 用于饮食添加物(DS)、药物和其它产品的干燥的生物质制剂；HM，收获菌丝体；

图2显示了通过蛋白免疫印迹测得的E1和E2提取物对pIκBα水平的影响。该图代表了具有类似结果的2个独立实验。E1 - 培养液 (水)提取物；E2 -乙酸乙酯提取物。

图3显示了图2的蛋白免疫印迹的密度计分析，其显示了与100 μM H₂O₂作用相比，E1和E2提取物对pIκBα的作用 (将结果表示为2个独立实验相对于仅H₂O₂-处理的平均值±标准差的倍数)。

图4显示了毛头鬼伞提取物E1和E2的IKKβ 抑制活性。与100 ng GST-IκBα底物和5 ng IKK-β 酶一起温育提取物E1和E2 (100和200 μg/ml)和600 nM的IKK-β抑制剂Fuct (1 μM)，并使用在材料和方法中所述的基于ELISA的激酶活性试验，测试它们的抑制IKK-β活性的能力。E1 -粗培养液(水)提取物；E2 - 粗乙酸乙酯提取物。

图5描述了鬼伞属水提取物的1H NMR谱。

图6A-D显示了完整细胞、提取物和提取后的残余物的单糖含量的气相色谱法(GC)分析。(A) 水提取物；(B) 完整细胞；(C) 水提取后的细胞；和(D) NaOH提取后的细胞。

图7描述了来自毛头鬼伞的水和NaOH提取物的多糖（部分地通过Sephadex G-50上的尺寸排阻色谱法来分离）的尺寸分离色谱图。

图8A-B显示了从灵芝属（Ganoderma sp.）(A)和毛头鬼伞 CBS 123401 (B) 提取的β-葡聚糖的甲基化分析。

图9描述了从分离自黄金银耳CBS 123296的β-葡聚糖得到的甲基化的糖类的GC迹线。

图10显示了从新分离的黄金银耳CBS 123296菌株得到的甲基化的糖类 (A)和纯的葡糖醛酸木甘聚糖(B)的GC迹线。

图11显示了与烟草花叶病毒 (TMV)相比，GXM (1000 µg/mL)对烟草植物品种免疫580的感受性的作用。横坐标：导入GXM和接种TMV之间的间隔 (天)。纵坐标:实验 (深色实心条)和对照 (带阴影的浅色条)中的局部病变数目之比(%)。

图12显示了与TMV相比，GXM (2500 µg/ml)对烟草（Nicotiana tabacum）植物品种免疫580的感受性的影响。横坐标：导入GXM和接种TMV之间的间隔 (天)。纵坐标:实验 (深色实心条)和对照 (带阴影的浅色条)中的局部病变数目之比(%)。

图13显示了GXM (2500 µg/ml)对TMV在烟草植物品种免疫580中诱导的局部病变的生长的影响。横坐标：导入GXM和接种TMV之间的间隔 (天)。纵坐标:实验 (深色实心条)和对照 (带阴影的浅色条)中的局部病变的大小(mm)。

图14显示了放线菌素D (AMD)对在接种了TMV的烟草植物品种免疫580中诱导的GXM抗性的影响。横坐标:实验的变体: 1 – GXM; 2 - GXM和AMD (10 µg/mL)的混合物; 3 – 在GXM之后2天导入AMD (10 µg/mL); 4 –在GXM之后2天导入AMD (20 µg/mL); 5 – AMD (10 µg/mL)。纵坐标:实验 (深色实心条)和对照(带阴影的浅色条)中局部病变的数量之比(%)。

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及担子菌蘑菇毛头鬼伞 CBS 123401和黄金银耳CBS 123296的生物质，其富含营养制品因子和生物活性化合物，包括富含必需氨基酸的蛋白和碳水化合物，且另外包含维生素、富含必需脂肪酸的脂质、抗氧化剂和矿物质。

在一个实施方案中，从毛头鬼伞CBS 123401的子实体或菌丝体或单细胞生物质形式的黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到所述生物质，例如通过在营养培养基上以浸没培养方式培养菌株。

本发明另外涉及毛头鬼伞 CBS 123401和黄金银耳CBS 123296的纯的浸没的菌丝体培养物，其中黄金银耳CBS 123296的菌丝体培养物是单细胞生物质的形式。黄金银耳菌丝体培养物作为单细胞生物体（象酵母一样）进行生长的事实，会提供非常高的生长速率和在所有担子菌蘑菇中最高的生物质生产力，最高达到27g干生物质/升培养基。如实施例4和7所示，测定了本发明的两种蘑菇的菌丝体的化学组成。在本文中证实存在于本发明的蘑菇中的许多组分具有多种有益的性质，诸如抗癌活性、免疫调控活性、抗血糖活性、抗糖尿活性和杀昆虫活性。

按照菌丝体干重计算，毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝生物质具有约39%碳水化合物和约37%蛋白，黄金银耳CBS 123296的菌丝生物质具有约54%碳水化合物和约20%蛋白。蘑菇多糖生产者的浸没培养，允许使用确定组成的培养基在短时间段内在恒定组成的受控条件下进行生产。

生物质中的碳水化合物包括多糖和二糖和单糖。毛头鬼伞 CBS 123401的生物质的多糖的实例包括β-葡聚糖，优选低分子量水溶性的β-葡聚糖和半乳聚糖，优选中性岩藻半乳聚糖。

因而，本发明涉及新颖的低分子量水溶性的β-葡聚糖，其由在某些6-位携带本文实施例4.2所示的β-1-6-D-葡萄糖残基侧链的β-1-3-连接的D-葡萄糖残基的主链结构组成。β-葡聚糖从毛头鬼伞、优选毛头鬼伞 CBS 123401得到，且具有小于10,000 Da、优选约1000至约10,000 Da的分子量。

黄金银耳CBS 123296的生物质的多糖的实例包括β-葡聚糖，优选直链的3,4 β-葡聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖。因而，本发明另外涉及新颖的水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖，和如本文实施例7.4所示从黄金银耳CBS 123296得到的葡糖醛酸木甘聚糖。葡糖醛酸木甘聚糖由α-(1→3)-连接的甘露聚糖的线性主链组成，所述甘露聚糖被β-(1→2)(1→4)-连接的木糖和葡糖醛酸的寡糖二醇化，并产生聚阴离子性质，且可以用作抗血糖剂和抗糖尿病剂。

本发明的β-葡聚糖具有抗肿瘤活性和免疫调控活性，尤其是免疫刺激活性，且本发明的葡糖醛酸木甘聚糖具有降血糖活性、免疫刺激活性和降血胆固醇活性，且在下述用途中是有前途的：作为用于预防和治疗疾病和病症（其中免疫系统的强化是重要的）的草药，诸如用于预防和治疗糖尿病、癌症、病毒病诸如AIDS、心脏病、血压，以及作为用于治疗高胆固醇病症的降血胆固醇药。两个物种的多糖可以是新益生元的来源。“益生元因子”在本文中被定义为选择性地发酵的成分，其允许赋予宿主康乐和健康益处的胃肠道微生物区系在组成和/或活性方面的特异性变化。甲壳质（也存在于生物质中）是膳食纤维的一种重要组分。

在菌丝生物质中发现的单糖和二糖包括葡萄糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡糖胺和海藻糖。所有这些单糖和二糖对于健康而言是重要的。另外，已经证实，甘露糖会阻止细菌向泌尿道和膀胱组织的粘附，且已知葡糖胺可用于治疗骨关节炎和再建软骨。

本发明的蘑菇的菌丝生物质蛋白富含谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸（cystein）、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸。毛头鬼伞（C. comatus）另外含有γ-氨基丁酸。因而，菌丝体蛋白含有11种必需氨基酸中的10种：苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。由于富含必需氨基酸的蛋白的存在，本发明的生物质因此构成一种重要的饮食添加物。

毛头鬼伞 CBS 123401的生物质包含维生素：A、B₁、B₂、B₃、C和E；黄金银耳CBS 123296的生物质包含维生素：A、B₁、B₂、B₃、B₆、B₇、C和E。因而，含有高水平的重要维生素的本发明的蘑菇的生物质和提取物可以作为维生素的优良来源，且可以用作营养制品，和/或可以作为饮食添加物加入到食品和饮料产品中。

毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝生物质另外包含：脂质，其包括脂肪酸十五酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七酸、硬脂酸、油酸、亚油酸(C18:2n6)、α-亚麻酸(C18:3n3)、γ-亚麻酸 (C18:3n6)、花生酸、廿一烷酸、二十二烷酸和木蜡酸；黄金银耳CBS 123296的生物质包含：脂肪酸油酸-(C18:1)、亚油酸 (C18:2n6)、棕榈酸 (C16:0)、棕榈油酸 (C16:1)、硬脂酸 (C18:0)和肉豆蔻酸。蘑菇中的脂肪酸以它们与甘油的酯的形式存在。通过必需的不饱和脂肪酸α-亚麻酸 (C18:3n3)和亚油酸 (C18:2n6)的存在，证实蘑菇的高营养品质。后者产生了ω-6系列的多不饱和的脂肪酸，它们向磷脂中的掺入会影响细胞膜性质诸如膜结合的酶的流动性、柔性、渗透性和活性。

本发明的蘑菇的菌丝生物质也包含矿物质，大量元素和微量元素，包括铝、铜、铁、钾、镁、锰、磷、硅、钠、钛和锌。本发明的两种蘑菇中的任一种的生物质的日剂量会提供铁和其它矿物质的优良来源。

根据本发明，还已经发现，本发明的毛头鬼伞 CBS 123401菌株的菌丝体和生物质包含抗氧化剂、自由基清除剂、黑色素 (赋予抗皮肤光老化的保护，特别是保护皮肤免于日光紫外线辐射，还针对由电离辐射造成的内部器官的损伤进行保护，且可以用于通过它的羧基和酚羟基分离潜在有毒的金属离子)和凝集素(参见实施例4.3)，尤其是结合乳糖、半乳糖和葡糖胺的凝集素，它们可以用于包含鉴别多糖和糖蛋白的糖部分的试验中。

本发明的蘑菇的生物质可以进一步用于益生元或营养制品组合物中。“蘑菇营养制品”被定义为来自蘑菇的菌丝体或子实体的精制的或部分精制的提取物或干燥的生物质，其作为饮食添加物(不是常规食物)以胶囊或片剂的形式被消耗，且具有潜在的治疗用途。定期摄入可以增强人体的免疫应答，从而增加对疾病的抗性，且在有些情况下，造成疾病状态的消退。

在另一个方面，本发明提供了具有营养制品和生物活性的本发明的蘑菇的提取物。在一个实施方案中，所述提取物来自毛头鬼伞 CBS 123401。在另一个实施方案中，所述提取物来自黄金银耳CBS 123296。所述提取物是从毛头鬼伞CBS 123401的子实体或菌丝体得到，或从黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到。在一个优选的实施方案中，本发明的蘑菇的提取物是从纯的浸没的菌丝体培养物得到。

从毛头鬼伞 CBS 123401培养物得到的提取物富含低分子量水溶性的β-葡聚糖和/或半乳聚糖，优选中性岩藻半乳聚糖，从黄金银耳CBS 123296培养物得到的提取物富含直链的3,4 β-葡聚糖和/或葡糖醛酸木甘聚糖，其具有抗血糖和抗糖尿病活性。

在一个实施方案中，在本发明的蘑菇的提取物中存在的生物活性是：NF-κB途径调控活性、抗氧化剂活性、自由基清除活性、抗辐射活性、金属离子清除活性、产干扰素（interferonogenous）活性、免疫调控活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、降血胆固醇活性、抗变应性活性、抗寄生虫活性、杀昆虫活性和/或抗植物病毒活性。

本文使用的术语“产干扰素活性”和“产干扰素药剂”表示增加哺乳动物血浆中的干扰素浓度的活性或药剂。

本文使用的术语“免疫调控活性”和“免疫调控剂”表示，但不限于：促有丝分裂活性、刺激造血干细胞、活化替代补体途径和活化免疫细胞诸如T_H细胞、Tc细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞和天然杀伤(NK)细胞。

术语“抗血糖活性”和“抗血糖剂”表示降低血糖水平的活性或药剂，而术语“抗糖尿病活性”和“抗糖尿病剂”表示通过降低血液中的葡萄糖水平来治疗糖尿病的活性或药剂。

杀昆虫活性包含吸引社会昆虫诸如木蚁、火蚁、乳白蚁（coptotermes）、台湾白蚁(Formosan termites)和散白蚁(reticulitermes termites)，并感染和杀死这些昆虫。

具体地，如本文在下面在实施例中所证实的，毛头鬼伞 CBS 123401乙酸乙酯提取物具有NF-κB途径调控活性 (实施例3)和抗氧化剂活性和/或自由基清除活性(实施例2)。这样的提取物可以用于治疗NF-κB-依赖性的疾病，例如，但不限于：癌症、免疫学障碍、脓毒性休克、移植排斥、辐射损伤、缺血后再灌注损伤、动脉硬化和神经变性疾病。

从黄金银耳CBS 123296培养物得到的提取物包含葡糖醛酸木甘聚糖，因此具有抗糖尿病活性，且另外包含：免疫调控活性，例如造成巨噬细胞的机能储备的增加的活性，和干扰（interferrouneus）活性 (参见实施例8)和/或抗植物病毒活性 (参见实施例9)。本文使用的术语“机能活性”表示自发的和刺激的(NBT-实验)活性指数之间的差异，即吞噬细胞（诸如巨噬细胞）在它的休眠状态的活性与它在被活化（例如通过暴露于致病细菌）以后的活性的对比。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含根据本发明的生物质或提取物。在某些实施方案中，所述组合物包含：从毛头鬼伞 CBS 123401和黄金银耳CBS 123296得到的生物质的混合物，或从毛头鬼伞 CBS 123401和黄金银耳CBS 123296得到的提取物的混合物。在一个实施方案中，所述组合物包含：从毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝体或子实体得到的富含营养制品因子和生物活性物质的生物质，或所述生物质的提取物。在另一个实施方案中，所述组合物包含从黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到的富含营养制品因子和生物活性物质的生物质，或所述生物质的提取物。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含选自下述的碳水化合物：低分子量水溶性的β-葡聚糖、水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖、葡糖醛酸木甘聚糖（它们都如本文上面和在本文下面的实施例中所定义）或这些碳水化合物中至少两种的组合。考虑到上述内容，在另一个方面，本发明提供了包含本发明组合物的天然的食品添加物、益生元、营养制品、饮料和化妆品。本发明另外提供了包含本发明组合物的宠物食品、杀昆虫产品、抗寄生虫产品和抗植物病毒产品。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下述的活性成分：(a) 本发明的组合物；(b) 低分子量水溶性的β-葡聚糖；(c) 水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖；(d) 葡糖醛酸木甘聚糖；它们都如本文上面和在本文下面的实施例中所定义；或(e) (b)至(d)的活性成分中的至少两种的组合。

在某些实施方案中，本发明的天然的食品添加物、益生元或营养制品和药物组合物可以用于：(a) 治疗糖尿病或降低血糖水平；(b) 诱导免疫调节应答；或(c) 降低血液胆固醇水平或减少胆固醇的积累。

本发明的天然的食品添加物、益生元或营养制品或药物组合物可以单独地或与抗癌药联合地施用给癌症患者，以便诱导免疫刺激应答，从而治疗癌症。

本文使用的术语“治疗”表示疾病或障碍的减轻、进展的减少或完全治愈，或与疾病或障碍有关或由其造成的症状的减少。

使用一种或更多种药学上可接受的载体（包括赋形剂和辅料），可以以常规方式配制用于根据本发明的用途的药物组合物。关于药物的制剂和给药的技术，可以参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版。

可以将本发明的药物组合物配制成用于通过任意合适的途径的全身给药，例如，用于经口递送、肠胃外递送（包括肌肉内的、静脉内的、皮下的、鞘内的或腹膜内的注射），或用于通过局部药物递送的局部给药。

对于用于本发明方法中的任意组合物，最初可以从体外和细胞培养试验估测治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以达到希望的浓度或效价。这样的信息可以用于更准确地确定在人类中有用的剂量。

在另一个方面，本发明涉及一种农业组合物，其包含农业载体和选自下述的活性成分：本发明的组合物，或本文定义的葡糖醛酸木甘聚糖。在某些实施方案中，所述农业组合物用于诱导植物对植物病原体（诸如植物病毒）的抗性。

在一个实施方案中，所述植物病毒是能够在受感染的植物中诱导过敏反应的植物病毒，例如包括烟草花叶病毒和其它烟草花叶病毒组诸如番茄花叶病毒, 胡椒绿斑点病毒和ondontoglossum环斑病毒在内的植物病毒。在某些实施方案中，所述病毒是烟草花叶病毒。

本发明的农业组合物可以另外包含惰性的添加剂。这样的添加剂包括增稠剂、流动增强剂、润湿剂、消泡剂、缓冲剂、润滑剂、填充剂、漂移控制剂、沉积增强剂、佐剂、蒸发阻滞剂、霜冻保护剂、吸引昆虫的气味剂、紫外保护剂、芳香剂等。所述增稠剂可以是可溶于水或能够在水中溶胀的化合物，例如，黄原胶多糖(例如，阴离子的杂多糖)、海藻酸盐、瓜耳胶或纤维素；合成的大分子诸如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、形成可溶胀结构的硅酸盐的聚羧化物诸如产热的或沉淀的硅酸、皂粘土、蒙脱石、hectonites或attapulgites；或硅酸铝的有机衍生物。霜冻保护剂可以是，例如，乙二醇、丙二醇、甘油、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、脲或其混合物。所述消泡剂可以是，例如，聚二甲基硅氧烷。所述农业组合物还可以包含适合基于水或油的产物的表面活性剂系统，如本领域通常已知的。

本发明另外提供了从本发明的蘑菇生产具有生物活性的提取物的方法，其中所述生物活性是：NF-κB途径调控活性、抗氧化剂活性、自由基清除活性、抗辐射活性、金属离子清除活性、产干扰素活性、免疫调控活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、降血胆固醇活性、抗变应性活性、抗寄生虫活性或抗植物病毒活性，所述方法包括：在营养培养基中以浸没培养方式培养真菌毛头鬼伞 CBS 123401或黄金银耳CBS 123296，从培养液分离得到的可食用真菌的生物质，干燥并研磨所述生物质成细粉，对所述细粉进行溶剂提取和冷冻干燥。具体地，所述方法用于生产黄金银耳、优选黄金银耳CBS 123296的提取物，其富含葡糖醛酸木甘聚糖。

提供了从本发明的蘑菇生产富含多糖、单糖、蛋白、必需氨基酸、维生素、必需脂肪酸、矿物质和微量元素的生物质的另一种方法，所述方法包括：在营养培养基上以浸没培养方式培养所述蘑菇，从培养液分离得到的可食用真菌的生物质，干燥并研磨所述生物质成细粉。

特别重要的是，本发明提供的在营养培养基上培养蘑菇的单细胞浸没培养物的另一种方法，所述蘑菇包括选自下述的银耳属：黄金银耳、银耳（Tremella fuciformis）和金耳（Tremella aurantia），优选黄金银耳CBS 123296。

根据本发明已经发现，为了上面定义的方法的目的，用于培养毛头鬼伞的营养培养基应当具有下述的组成(g/L蒸馏水)：葡萄糖，15；蛋白胨，3；酵母浸出物，5；KH₂PO₄，0.8；K₂HPO₄，0.2；MgSO₄•7H₂O，0.5；为了上面定义的方法的目的，用于培养黄金银耳的营养培养基应当具有下述的组成(g/L蒸馏水)：蔗糖，50；酵母浸出物，0.5；KCl，1；乙酸镁•4H₂O，1.0；NaH₂PO₄•H₂O，0.5；Na₂HPO₄•7H₂O，1.0。

现在，通过下面的非限制性实施例，例证本发明。

实施例

材料和方法。

1. 在锥形瓶和发酵罐中浸没培养毛头鬼伞的菌丝生物质

图1显示了使用发酵罐或生物反应器技术，生产浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401和黄金银耳CBS 123296的菌丝体的一般方法学。

蘑菇浸没培养菌丝体(SCM)生产的一般方案包括5个培养物生长步骤：

储存培养物(I) —> 中间培养物 (II) —> 前接种物培养物 (III) —> 接种物培养物 (IV) —> 发酵培养物 (V)。

3类培养基用于SCM生产：标准的琼脂培养基 (步骤I和II)、液体标准接种物培养基 (步骤III和IV)和发酵培养基 (步骤V)。在试管中的琼脂斜面上形成储存培养物(museum culture); 在试管或培养皿中的琼脂斜面上形成中间培养物。使用旋转摇床，在锥形瓶中形成前接种物和接种物培养物。在发酵罐 Bioflo 2000 (New Brunswick Scientific, USA)中，形成发酵培养物，所述发酵罐配有用于测量和/或控制搅拌、温度、pH、溶解氧浓度 (pO₂)和泡沫的仪器。

对于第一种前接种物培养物，给250 ml锥形瓶接种来自培养皿的1-3周龄蘑菇菌丝体。将来自在琼脂平板边缘生长的菌丝体的5-6片(直径5-7 mm)转移进锥形瓶中，并在瓶壁上切成小片，以增加菌丝体的生长点的数目。在装有100 ml确定的合成培养基的250-mL锥形瓶中，接种菌丝体。在由下述组分(g/L蒸馏水)组成的合成培养基上，培养真菌接种物：(g l^-1)：葡萄糖，15；蛋白胨，3.0；酵母浸出物，5.0；KH₂PO₄，0.8；K₂HPO₄，0.2；MgSO₄ ^.7H₂O，0.5。培养基的初始pH是6.0。单独灭菌磷酸盐 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)。在100 rpm和27℃，在旋转摇床上培养接种的烧瓶6-7天。在培养结束时，从培养物取出1 ml样品，用于培养物纯度的显微镜观察。

对于第二种接种物培养物，使用Waring Laboratory Blender (Waring, USA)，将来自第一种前接种物培养物(沉淀物)的生物质匀浆化2 x 30 秒，并接种在含有700 mL相同培养基的2 L 烧瓶中。

培养5-7天后，将菌丝生物质(沉淀物)匀浆化，并用作接种物培养物，用于在发酵罐(Bioflo 2000 10 L, New Brunswick Scientific, USA) 中生长，所述发酵罐具有10 L 工作体积的相同的上述合成培养基。培养的起始参数如下：温度27℃；pH–6.1；搅拌–100rpm，通气–0.2v/v/min。 使用的消泡剂是聚丙二醇 2000；并使用4%NaOH和4%HCl来控制pH。

表1. 浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝生物质生产随时间而变化。

最初，没有控制培养基的pH。但是，当它降低至5.2时，pH自动保持恒定在6.0的水平，以利于真菌生长。24 h后，搅拌速度增加至200 rpm，然后在48 h后达到300 rpm。48 h后，培养基的通气速率增加至0.4，然后(在72 h后)达到0.5 v/v/min。

菌丝生物质的最大产率是在真菌培养第7天达到的93 g/L湿生物质或9.3 g干生物质。培养条件如在表1中所定义。在真菌培养7天后，可以看到具有毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝生物质的锁状联合的具液泡的菌丝 (未显示)。

2. 毛头鬼伞抗氧化剂活性的评价

生物质评估。在毛头鬼伞浸没培养8-11天以后，过滤收获菌丝生物质，并在50℃干燥至恒重。将干燥的菌丝体研磨成粉状进行提取。

从毛头鬼伞生物质进行抗氧化剂提取。在50℃干燥收获的蘑菇菌丝体，并研磨成粉末(4-10 g)。使用3种不同的溶剂(用培养液替代水、乙醇和乙酸乙酯)，以递增的极性从蘑菇菌丝体提取抗氧化剂化合物。尽管没有关于在担子菌培养过程中在培养液中存在的抗氧化剂的文献数据，假定这些蘑菇能够在细胞外积累这些化合物。因此，为了正确地评价筛选的蘑菇的总抗氧化剂活性，决定使用适当的培养液替代水， 用于从真菌生物质进行抗氧化剂提取。

在第一个阶段，用培养液 (1g/10ml)在80℃ (使用水浴)提取菌丝体3 h。提取后，通过在6000 rpm离心15 min，分离不溶性的化合物，并通过Wathman滤纸N 4过滤。蒸发滤液。然后在150 rpm的旋转摇床上用27℃的乙醇 (80%)连续提取离心后的残余物3 h。提取后，离心溶液，过滤，并从提取物蒸发有机溶剂。

从毛头鬼伞 CBS 123401的培养液进行抗氧化剂提取。生物质过滤后，使用96%硫酸，将培养物生长培养基的pH降低至2.0。使用500 ml乙酸乙酯，分离每个菌株的1升生长培养基3次，并使用玻璃化学分离器，用0.5 l蒸馏水洗涤提取物-溶剂混合物一次。将提取物-溶剂混合物放置在化学通风橱中，进行溶剂蒸发，直到形成树脂(或粉末)，其代表实际的粗真菌提取物，将其收集在以前称重的4 ml塑料试管中。用99.9%二甲基亚砜(DMSO)稀释所有提取物至终浓度50 mg/ml，分配进埃彭道夫管中，并在70℃保存备用。

抗氧化剂活性试验

β-胡萝卜素漂白方法。根据β-胡萝卜素漂白方法，测定毛头鬼伞提取物的抗氧化剂活性。在氮流下，将含有1 ml β-胡萝卜素 (Sigma) 溶液 (0.2 mg/ml在氯仿中)、0.02 ml 亚油酸 (Sigma)和0.2 ml吐温80 (Sigma)的试剂混合物蒸发至干燥。加入50毫升氧合的蒸馏水和0.2 ml不同浓度(2-8 mg/ml)的蘑菇粗提取物(乙醇或培养液)。使用纯的甲醇或水(0.2 ml)作为对照，空白含有除了β-胡萝卜素以外的所有以前的化学试剂。然后摇动所有这些混合物，形成脂质体溶液，然后在50℃温育2 h。以20 min的时间间隔，通过分光光度计，监测这些脂质体溶液的等分试样 (1 ml)在470 nm的吸光度。使用丁羟茴醚 (BHA) (Sigma) (2mg/ml在甲醇中) 作为标准品。使用β-胡萝卜素的漂白速率 (R) 作为标准。根据方程 (1)，计算β-胡萝卜素的漂白速率(R)

R=ln(a/b)/t 方程 (1)

其中：ln - 自然对数，a - 在时间0的吸光度，b - 在时间t的吸光度，t – 温育间隔20、40、60、80、100或120 min。

使用方程(2)，以相对于对照的抑制百分比的方式，计算抗氧化剂活性 (AOA)

AOA= [(R_对照-R_样品)/R_对照] x 100 方程 (2)

对1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼基的清除活性。测量来自毛头鬼伞的提取物对1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼基 (DPPH)基团的清除活性。将0.5 ml 0.1 mM DPPH基团 (Sigma)在甲醇中的等分试样加入装有1 mL不同浓度(0.5-9 mg/mL)的蘑菇乙醇或水提取物的试管中。使用甲醇或水替代蘑菇样品，作为对照。在室温涡旋混合反应混合物，并在混合后，立即通过分光光度计在520 nm测量，测定吸光度。如下计算DPPH对自由基的抑制：I (%) = (A_空白- A_样品/ A_空白) x 100，其中I是抑制(%)，A_空白是对照反应(含有除了实验化合物以外的所有试剂)的吸光度，A_样品是实验化合物的吸光度。从基团清除活性百分比相对于提取物浓度的图，计算提供50%抑制的提取物浓度 (EC₅₀)。使用在1 mg/ml甲醇的丁羟茴醚 (BHA) 浓度作为标准。将每个值表达为平均值±标准差 (n=3)。

3. 对来自浸没的毛头鬼伞的提取物的生物活性的研究

用于实验工作的细胞培养物制备。在无菌生物罩中，进行使用癌症细胞培养物的所有实验工作。在每个实验之前，用胰蛋白酶处理细胞，收集，并计数，以便根据提供的实验的需要，接种适当数量的细胞。

MCF7 乳腺癌细胞培养物通常粘附在瓶底上生长。为了制备这些细胞备用，使用一次性使用的吸管，从烧瓶吸出培养基，然后加入1-2 ml 胰蛋白酶2-3 min。在胰蛋白酶化过程中，在湿化培养箱中在37℃保持细胞。在细胞脱离瓶底以后，为了终止胰蛋白酶化过程，根据使用的烧瓶的尺寸，加入5-10 ml新鲜的培养基。通过多次抽吸，使细胞混合均匀，并用100 µl 0.4%锥虫蓝溶液将100 µl细胞悬浮液染色，混合均匀，并在锥虫蓝排除方法以后，使用血球计数器在显微镜下计数。

建立可利用的细胞数目以后，另外稀释细胞悬浮液，并根据每个实验的需要，接种特定数量的细胞。总是保留一些细胞，以便再生长和维持可用于其它实验工作的细胞系。将所有细胞系的原悬液保持在液氮中，并每2-3个月更新实验细胞培养物一次。

细胞裂解、全细胞裂解物的制备。为了测量粗真菌提取物处理引起的某些蛋白的细胞内水平，在每次收集细胞以后，进行全细胞裂解。下面描述了全细胞裂解的确切规程。

收集细胞，并通过在3,000 rpm和4℃离心5 min，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。在埃彭道夫管中收集最终的细胞数，并抛弃来自最后一次洗涤的在PBS上面的剩余物（the left over PBS），使得仅细胞沉淀物保留在每个试管中。对于细胞裂解，每次使用具有下述含量的新鲜制备的裂解缓冲液：500-1000 µL细胞裂解剂（根据样品的数目）、蛋白酶抑制剂混合液、和终浓度为1%的磷酸酶抑制剂混合液1和2以及0.3 M苯甲基磺酰氟化物 (PMSF)。加入50 µL裂解缓冲液，并每隔10 min在剧烈涡旋下在冰上将样品温育30 min，最后在13,000 rpm和4℃离心10 min。将代表全细胞裂解物的上清液转移至新的埃彭道夫管，并保持在-70℃，抛弃细胞沉淀物。

根据H₂O₂-刺激的PIκBα-动力学。使用25 ml塑料烧瓶，将MCF7 乳腺癌细胞 (2x10⁵)接种进5 ml RPMI 1640培养基中，并维持在37℃。24 h后，使用含有0.5%FCS的培养基替代生长培养基，以便使血清中存在的生长因子对信号转导级联的活化最小化。24小时后，给细胞添加50或100 μM H₂O₂ 5、10、20、30、40和60 min，以检测MCF7 乳腺癌细胞系在H₂O₂ 刺激以后的抑制蛋白κ B (IkBα)磷酸化。

使用无H₂O₂处理作为对照，据此测定pIκBα的动力学。如前所述，收集细胞，洗涤，并裂解。一式两份地进行实验。

使用IKK-β-抑制剂筛选试剂盒(Calbiochem, USA)，即利用50-氨基酸 GST-IkBα融合多肽底物（其包括Ser32和Ser36 IKK-β磷酸化位点）的基于ELISA的活性试验，评价IKK 激酶试验IκB激酶复合物(IKK-β)活性。在有600 nM IKK-β抑制剂5-(对-氟苯基)-2-脲基]噻吩-3-羧酰胺 (Fuct)和100或200 μg/ml 毛头鬼伞提取物存在下，温育100 ng GST-IkBα底物和5 ng 重组IKK-β。将反应混合物加入用谷胱甘肽预包被的孔中，以允许捕获GST-IkBα。使用抗-磷酸-IκBα (Ser32/Ser36) 抗体检测磷酸化的GST-IkBα底物，随后进行HRP-缀合和TMB底物的显色。在450 nm监测吸光度，并与IKK-β活性水平直接相关联。

密度计分析。使用TotalLab 软件，已经进行了通过蛋白印迹检测到的蛋白带的密度计定量分析，并表示为蛋白带体积的倍数。将由真菌提取物的作用引起的pIκBα水平的蛋白印迹的密度计分析表示为对照值的平均值± 标准差。

4. 毛头鬼伞的内容物和化学组成

使用煮沸的96%乙醇 (300 ml)，洗涤毛头鬼伞 CBS 123401浸没培养的菌丝生物质的多糖组成分析物(10 g) 2 h。在高压釜中在120℃用水(300 ml) 提取不溶性的残余物(8.2 g, 82%) 2次各1 h。干燥一小部分提取物，并通过NMR进行分析，透析剩余物，浓缩至100 ml，在120000g超速离心3 h，用几滴溴处理溶液进行脱色(此后沉淀出一些蛋白，通过离心进行去除)，通过Sephadex G-50上的凝胶色谱法进行分离，得到 3个含有不同比例的淀粉、β-葡聚糖和半乳聚糖的级分 (150、220和130 mg)。用煮沸的5%KOH提取不溶性的残余物(5.8 g) 3 h，如上透析溶液和处理，得到蛋白-β-葡聚糖混合物(300 mg)。

甲基化分析。将样品 (1-3 mg) 溶解于 1 ml 在100℃的无水DMSO中。将不溶性的葡聚糖放置过夜，仍然没有完全溶解。在冷却至室温以后，加入粉末化的NaOH (~30 mg)，将混合物搅拌30 min，加入0.5 ml MeI，继续搅拌30 min，通过空气流去除多余的MeI，加入水(5 ml)。对于可溶性的样品，用CH₂Cl₂提取产物，用水洗涤，用3 M TFA (120°, 3h)水解，用NaBD₄还原，乙酰化，通过GC-MS进行分析。通过透析，回收不溶性的化合物，并另外甲基化一次。

使用具有Varian Z 梯度探头的Varian INOVA 500 MHz波谱仪，在25 ℃进行NMR实验，其中使用丙酮内部参照 (2.225 ppm的¹H和31.5 ppm的¹³C)，使用标准的脉冲序列DQCOSY、TOCSY (混合时间120 ms)、NOESY (混合时间200 ms)、HSQC和HMBC (100 ms长范围转移延迟)。使用Bruker Topspin程序，进行数据处理。

单糖分析。将样品 (1-5 mg) 溶解于40℃的浓HCl (0.2 ml)中1 h，加入肌醇标准品(0.5 mg)，用水(0.4 ml)稀释混合物，并在100℃加热2h。在空气流下蒸发酸，用NaBH₄ (10 mg, 30 min)还原糖类，加入AcOH (0.5 ml)，干燥样品，然后从MeOH (1 ml)干燥2次，并用0.5 ml Ac₂O乙酰化，干燥，通过气相色谱法（GC）进行分析。该方法给出了提高的葡萄糖和葡糖胺从不溶性聚合物的回收率，但是戊糖和6-脱氧己糖部分地降解。为了得到它们的正确定量，使用3M TFA (120°, 3 h)进行水解。

使用Megazyme试剂盒进行β-葡聚糖测定。一般描述：将所有葡聚糖溶解在浓(37%; 10N) 盐酸中，然后在100℃用1.3 N HCl充分水解2 h。通过用高度纯化的外切 -1,3-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的混合物温育，完成向D-葡萄糖的水解。相对于生产商的说明书，将该方法缩小10倍。

寡糖、蔗糖和游离D-葡萄糖中的总葡聚糖(α-葡聚糖+ β-葡聚糖) + D-葡萄糖的测量。在偶尔涡旋搅拌下，在30℃使用浓盐酸 (0.2 ml)从样品 (~10 mg) 提取葡聚糖45 min。用水稀释酸5次，并在100 ℃水解2 h。用1 ml 2 M KOH中和酸，用200 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)将混合物稀释至10 ml，并通过在1,500 g离心10 min，进行澄清。向0.01 mL提取物中，加入0.1 ml 水和0.1 ml 外切 -1,3-β-葡聚糖酶(20 U/mL) + β-葡萄糖苷酶(4 U/ml)在200 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中的混合物，将混合物在40℃温育60 min。加入3.0 mL 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶混合物(GOPOD)，并在40℃温育20 min。相对于试剂空白，测量在510 nm的吸光度。

蔗糖和游离d-葡萄糖中α-葡聚糖(植物糖原和淀粉) + 葡萄糖的测量。在搅拌下，用0.2 ml 2 M KOH提取样品(10 mg) 20 min。加入0.8 mL 1.2 M醋酸钠缓冲液(pH 3.8)，随后加入0.02 mL淀粉葡糖苷酶(1630 U/ml) + 转化酶 (500 U/mL)，并在间歇混合下在40℃温育30 min。用水稀释样品至10 ml，通过离心进行澄清，将0.01 ml样品与0.01 ml醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0)和0.3 mL GOPOD试剂相混合，并在40℃温育20 min，相对于试剂空白，在510 nm 测量吸光度。试剂空白由0.2 mL醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0) + 3.0 mL 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂组成。D-葡萄糖标准品由0.1 mL D-葡萄糖标准品(1 mg/mL) + 0.1 mL醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0) + 3.0 mL 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂组成。

从浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401菌丝体提取凝集素级分。

在含有1 mM 苯甲基磺酰氟化物的PBS (40 mM KH₂PO₄, 150 mM NaCl; pH 7.4)下，匀浆化(1/6 w/v) 湿重为50 g的毛头鬼伞菌丝生物质。将匀浆物在4℃保持2 h，然后在8000 g离心20 min。使用在80%饱和度的(NH₄)SO₄，沉淀蛋白级分。使混合物在4℃静置过夜。 通过在12000 g离心20 min，收集沉淀物，溶解在最小体积的PBS中，并在蒸馏水、然后在PBS中连续透析。分析得到的提取物的蛋白量、凝集素活性和糖特异性。

凝集素的血凝集活性试验。为了测量凝集素血凝集活性，使用胰蛋白酶化的红细胞悬浮液。将兔血收集在含有150 mM NaCl 的150 mM柠檬酸三钠缓冲液中。通过用10体积的洗涤缓冲液(PBS)洗涤红细胞3次，新鲜制备红细胞悬浮液。接着，在37℃胰蛋白酶化4%红细胞悬浮液1 h；然后，洗涤红细胞，并悬浮于相同的缓冲液中，成为2%悬浮液 (v/v)。

在凝集素(血凝集)活性试验中，将凝集素溶液在微量滴定U-平板中的一系列2-倍稀释液(50 μl)与20℃的50 μl兔红血细胞在PBS中的2%悬浮液 (pH 7.4)相混合。在1 h以后，记录结果。血凝集效价（定义为表现出血凝集的最高稀释度的倒数）等于1个血凝集单位。比活是每mg蛋白的血凝集单位的数目。

凝集素的糖结合特异性。以与血凝集试验类似的方式，研究不同的碳水化合物对凝集素-诱导的血凝集的抑制。在磷酸盐缓冲的盐水中，制备糖样品(0.3 M)。将所有稀释液与等体积的(25 μL) 凝集素溶液相混合。使混合物在室温静置30 min，然后与50 μL 2%兔红细胞悬浮液相混合。将糖结合特异性表示为抑制凝集素的血凝集效价4所需的每种糖的最小浓度。测试了N-乙酰基-D-半乳糖胺 (GalNAc); N-乙酰基-D-葡糖胺 (GlcNAc)、D(+)半乳糖(Gal); D(+)葡萄糖、D(+)乳糖(Lac); D(+)甘露糖、木糖、纤维二糖和卫矛醇，用于检测凝集素的糖结合特异性。

5. 品种黄金银耳CBS 123296的特征；单细胞生物质在锥形瓶和发酵罐中的浸没培养。

黄金银耳培养物的制备。在以色列，在栎树属（Quercus sp）的死木上，收集黄金银耳的子实体。从位于无菌培养皿（在具有缓慢降低湿度的保湿室中）下的新鲜子实体，得到担孢子印迹。从担孢子印迹形成单孢子培养物，将在无菌水中的孢子悬浮液散播在培养皿中的麦芽琼脂表面上。在立体显微镜下，研究发芽的担孢子，并将来自酵母-样芽殖细胞的年轻菌落转移到麦芽琼脂(MA)斜面上。

将用于第一步浸没培养的黄金银耳菌株的酵母-样单倍体细胞的接种物制成在MA斜面上的8-天龄培养细胞在无菌水中的悬浮液。给发酵培养基接种浸没培养物，在冷却的定轨摇床中，在220 rpm、27℃进行多糖生产工艺。

在通过离心分离菌株生产者细胞以后，通过用2体积的乙醇对培养液上清液进行乙醇沉淀，估测多糖生产。在发酵结束时从培养液得到的粗沉淀物含有胞外多糖和菌株生产者细胞。

分别制备由(g/l) 5.0 g/l FeSO₄•7H₂O、0.625 g/l MnSO₄•H₂O、0.435 g/l ZnSO₄•7H₂O和0.2 g/l CuSO₄•5H₂O组成的痕量元素混合物(微量营养物)，并加入无菌的培养基中。以1:100稀释度，将痕量元素混合物加入培养基中，得到最终的阳离子浓度(mg/l)：Fe⁺⁺- 10.0；Mn⁺⁺- 2.0；Zn⁺⁺- 1.0；Cu⁺⁺- 0.5。

为了防止痕量元素氢氧化物沉淀形成，在高压灭菌之前，用50%H₂SO₄调节痕量元素溶液的pH至1.6-1.8。

从蛋白胨和酵母浸出物(Pronadisa)和矿物盐 (Sigma)，形成确定组成的培养基。

6. 黄金银耳的内容物和化学组成

黄金银耳CBS 123296的酸性葡糖醛酸木甘聚糖(glucuronoxylomannan)的测定。在去离子水中稀释在发酵培养基中培养结束时的培养液 3次。通过在Eppendorf 5403 离心管中在4℃在5000 rpm离心10 min，分离菌株生产者细胞。将上清液与2体积的乙醇相混合，并沉淀粗多糖。将从培养液沉淀出的多糖的混合物溶解于水中，穿过填充了Amberlite IR-120 (H⁺ -形式)的色谱玻璃柱。如下从收集的级分沉淀出酸性葡糖醛酸木甘聚糖：通过逐渐加入10%氯化鲸蜡基吡啶

(CPC)水溶液，直到不再形成更多的沉淀。通过离心，收集不溶性的CPC复合物，并溶解在10%氯化钠中。通过离心分离不溶性的颗粒以后，通过加入2体积的乙醇，沉淀出酸性多糖。

通过将沉淀物溶解在水中，然后用醇重复沉淀，得到纯化的多糖。

7. 黄金银耳制品的产干扰素性质和免疫调控性质。

血浆中IFN水平和吞噬细胞的机能活性的测定。通过试验病毒 (水疱性口腔炎病毒, 印第安纳菌株 – VSV) 在小鼠成纤维细胞L-929培养物中的细胞病变影响的抑制，估测血浆中的IFN水平。给96-孔培养板的孔，填充100 μl细胞悬浮液(1x10⁶细胞/mL)，并在5%CO₂气氛下在37℃温育18小时，然后加入100 μL双倍稀释的试验样品。18小时后，加入50 μL以前滴定的VSV工作稀释液。在相同条件下，温育该板。在显微镜下，评价结果。最终的IFN稀释物的倒数（其提供对试验病毒的细胞病变影响的50%细胞保护）被假定为IFN活性单位。以单位/ml，表达IFN滴度。

通过对小鼠成纤维细胞L-929的细胞裂解作用，评价血浆中TNF的生物活性。以100 μl份，将指示细胞悬浮液 (5x10⁶细胞/ml)导入平底 96-孔-培养板，并在37℃在5%CO₂气氛中培养24小时。然后，从孔取出培养基，将100μl试验样品和100μl含有放线菌素D (终浓度 1μg/ml)的培养基加给细胞单层。在没有试验样品存在下培养的细胞用作对照。温育24小时以后，取出培养基，用0.2%结晶紫溶液在室温对细胞染色10 min，用水洗涤3次，并在37℃干燥。

在550nm的波长，使用Multi-scan DYNARECH (Swiss)，评价结果。

评价TNF活性超过细胞毒性指数(CI)，这使用下式计算：CI = (K-D)/K x100%，其中K是对照孔中的光密度，D是试验孔中的光密度。

将由“VECTOR” (Ukraine)生产的TNF重组制剂“Rifnamen”用于TNF测试。

通过细胞化学方法，在硝基蓝四唑回收 (NBT试验)中研究吞噬系统的机能活性。

8. 银耳属提取物和植物对植物病毒的抗性

病毒：烟草花叶病毒 (TMV)，菌株 U1；

植物：在天然的光照、湿度和温度条件下，在温室中栽培的烟草(Nicotiana tabacum L.) 品种免疫580和曼陀罗(Datura stramonium L. )。将处于4-6叶阶段的植物用于实验中。

使用Kovalenko的方法，经过一些修改，在该研究中采用从黄金银耳培养液提取的多糖。为了从中性多糖中分离出酸性葡糖醛酸木甘聚糖(GXM)，在有0.05 M CaCl₂存在下，使用含有丙酮的水溶液(1:1)使它沉淀出来。在吡啶

-乙酸盐缓冲液pH 4.5 (4 mL 吡啶和10 mL AcOH在1 L水中)中，在Sephadex G-50 (2.5x80 cm)上进行气相色谱法，并通过折射率检测器，监测洗脱液。

在体外实验中，将总制品、中性多糖制品和浓度为10、100、500和1000 µg/mL的纯GXM的水溶液加入TMV的悬浮液 (10 µg/mL) 中。温育30 min后，用该混合物接种曼陀罗的叶子的左一半。用不含有多糖的相同浓度的TMV，接种叶子的右一半。通过下式，根据叶子的实验半和对照半上的局部病变的数目，计数病毒感染的抑制程度或VIR(按百分比计算)：І = ((K-D)/К) 100%，其中I – 是病毒抑制程度或AVR水平，%；K – 是对照中局部病变的数目 (大小)；D – 是实验中局部病变的数目 (大小)。

在烟草和曼陀罗植物上，研究了GXM的诱导的性质。为此目的，使用1 mL (胰岛素)注射器，将浓度为1000-2500 µg/mL的多糖氢溶液注射进叶子的左一半的细胞间隙中。用TMV (1-5 µg/mL) 接种叶子的两半。通过上述的公式，计算AVR程度。

当研究GXM-诱导的植物抗性机理时，我们使用放线菌素D (AMD)，其通过阻断RNA-聚合酶，抑制DNA-依赖性的mRNA合成。同时地，或经由GXM以后的确定时间段，皮下地导入浓度为10和20 μg/mL的AMD溶液和鼠李糖脂 (RL) – 1 mg/mL。通过Student (t)检验的标准，评估局部病变的数目和大小的差异；用下面的符号在表中显示得到的α-值：+++p≤.01%；++0.1≤p≤1%；+ 1%≤p≤5%；0p>5%。

实施例1. 品种毛头鬼伞 CBS 123401的特征

纯培养物中的营养菌丝体。白色的、棉状的菌丝体菌落在成熟后经常形成“丛” (菌丝聚集体)。不对称形状的菌落通常沿着外缘形成菌丝垫。锁状联合、菌丝联结和毛发-样晶体经常存在于菌丝上。

菌盖3-15 cm；在嫩时是椭圆形至圆柱形，扩展成具有上升边缘的钟形；在老时变成黑色“墨点”；干燥；具有褐色中心的白色；具有大的、长满粗毛鳞屑；在成熟时具有边界线。薄片从茎脱离；白色，变成粉红色，然后变成黑色；变成黑色“墨点”；非常稠密。菌柄5-20 cm长；1-2 cm厚；经常向顶点逐渐变细；光滑；白色；可从帽容易地分离；中空，具有悬在内侧的绳-样纤维条。菌肉通体白色，柔软。孢子印迹黑色。担孢子 9-13 x 7-9 µm；椭圆形；光滑；具有中央至轻微偏心的孔。担子4-孢子，28-43 x 10-13 µm，周围是5-8个小担子。没有侧生囊状体。褶缘囊状体具有不同形状；最大60 x 40 µm。菌盖皮层由7-30 µ宽的圆筒状元件组成。仅存在假锁状联合。

产地。它成群生长在经常料想不到的地方，诸如城镇的绿地。它广泛存在于草地和草原中。

实施例2. 毛头鬼伞抗氧化剂活性的评价

2.1 来自干燥的浸没培养的蘑菇菌丝体的生物质和提取物的产量

在筛选程序中为高等担子菌蘑菇的浸没培养选出的营养培养基，会确保所有选择的物种的生长。但是，在相同培养条件下培养毛头鬼伞 CBS 123401蘑菇8-11天后，菌丝生物质的产量是6.8 g/l (表1)。

使用培养液 (替代水)和乙醇，从干燥的且磨碎的蘑菇菌丝体提取可溶的化合物。从不同菌株得到的提取物的产量存在显著差异。此外，从蘑菇生物质得到的提取物的产量明显依赖于使用的溶剂。用培养液提取毛头鬼伞 CBS 123401生物质，得到23.2%的提取物。

乙醇提取的效率更低，在研究的菌株上使用的弱增溶剂仅得到8.5%。

2.2 来自浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401蘑菇菌丝体的水(培养液)和乙醇提取物的抗氧化剂活性

在表2中显示的数据表明了从毛头鬼伞 CBS 123401得到的水(培养液)提取物的抗氧化剂活性 (AOA)。当使用2 mg/mL浓度的毛头鬼伞CBS 123401水提取物时，显示出非常高的AOA。在来自毛头鬼伞 CBS 123401菌丝生物质的水提取物中，观察到稍微更低的AOA。所有这些提取物的抑制值实际上不会随着它们在试剂混合物中的浓度的增加而变化。

来自蘑菇生物质的乙醇提取物的AOA不仅在很大程度上依赖于高等担子菌物种，而且依赖于试剂混合物中提取物浓度的变化。当乙醇提取物的浓度从2 mg/ml增加至4-8 mg/ml时，来自毛头鬼伞 CBS 123401的提取物的AOA从74.4增加至 86.4%(表3)。

表2. 来自干燥的浸没的蘑菇菌丝体的水提取物的抗氧化剂活性 (%)。

表3. 来自干燥的蘑菇菌丝体的乙醇提取物的抗氧化剂活性 (%)。

2.3 来自浸没培养的蘑菇菌丝体的水(培养液)和乙醇提取物的自由基清除活性

自由基清除是抗氧化剂抑制脂质氧化的已知机制之一。使用清除1,1-二苯基苦基偕腙肼基(DPPH)自由基的方法，评价抗氧化剂活性。使用DPPH（一种稳定的自由基产生物质，具有在520 nm的特征吸收），研究提取物的自由基清除作用。将吸光度的减低，作为自由基清除程度的量度。

在0.5 mg/ml的样品浓度，测量了水和乙醇提取物的最高自由基-清除活性(分别是27.0%和22.0%)，但是所述值远远低于标准品的值(92.0%) (表4和5)。

随着样品浓度从0.5增加至9 mg/ml%，毛头鬼伞 CBS 123401的乙醇提取物的自由基-清除能力从22下降至1 (表5)。

表4. 来自毛头鬼伞 CBS 123401的浸没的蘑菇菌丝体的水(培养液)提取物的清除能力 (抑制百分比)和EC50值。

在表5和6中给出的DPPH清除作用的有效浓度值，证实了水和乙醇提取物的EC₅₀ 似乎在1 mg/mL附近。

表5. 来自毛头鬼伞 CBS 123401的浸没的蘑菇菌丝体的乙醇提取物的清除能力 (抑制百分比)和EC50值。

实施例3. 来自浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401菌丝体的水(培养液)和乙酸乙酯提取物的生物活性研究

3.1 H₂O₂对MCF7细胞进行NF-κB 刺激后的pIκBα水平

许多对药用蘑菇的研究，证实了它们不仅作为饮食添加物和免疫增强剂、而且作为不同细胞应答的调节剂的来源的特殊潜力。尽管观察到大多数化疗方案的成功，细胞适应已经能够使肿瘤细胞变得对许多化疗药具有抗性。这些细胞化学抗性因子之一是细胞核因子κ B (NF-κB)，经证实它会促进肿瘤增殖。NF-κB的活性受到与IκB蛋白的相互作用的紧密调节。象NF-κB蛋白一样，存在对各个NF-κB复合物具有不同亲和力的几种IκB蛋白，但是轻微不同地受调节，并以组织-特异性的方式表达。

胞外刺激会导致IκB 激酶(IKK)的活化，所述IκB 激酶会磷酸化2个保守丝氨酸(IkBα中的Ser32和Ser36)上的IκB。该磷酸化会标记用于蛋白酶体降解的IκB，导致NF-κB的核转位和活化。这被视作NF-κB 活化的经典途径。已经描述了NF-kB活化的几个替代途径。在当前的NF-κB活化研究中，使用过氧化氢，它是一种众所周知的NF-κB 活化剂和一种强氧化剂。初步的数据证实，用100 μM H₂O₂ 处理10-min，会造成最高水平的pIkBα，用10 μM姜黄素（它是一种已知的抗氧化剂和抗癌剂）处理，会显著抑制pIκBα水平。用50和100 µM H₂O₂刺激MCF7细胞递增的时间段。对于20和40 min，与对照（DMSO (二甲基亚砜)-处理的细胞，其中没有加入H₂O₂）相比，50µM H₂O₂ 刺激表现出高水平的pIκBα。在10-min 刺激时，100µM H₂O₂-处理的细胞表现出最高水平的pIκBα (未显示)。因此，用于检查提取物对pIkBα水平的潜在作用的最好条件被确认为，与选择的真菌提取物一起，用H₂O₂-刺激10 min。

(用50和100 µM H₂O₂ 刺激MCF7细胞递增的时间段。在10 min间隔用100µM H₂O₂刺激，表现出与对照（使用DMSO-处理的细胞，其中没有加入H₂O₂）相比最高水平的pIκBα。数据代表2个类似实验之一的结果)。

3.2 毛头鬼伞 CBS 123401 粗提取物对细胞生存的作用

在本实验中，研究了毛头鬼伞 CBS 123401。测试了毛头鬼伞培养液 (水) (E1)和乙酸乙酯 (E2) 粗提取物的影响MCF7细胞系的细胞生存的能力，并计算了IC₅₀。提取物E2似乎是最有效的，具有32 μg/ml的IC₅₀，其次是具有76 μg/ml的IC₅₀的E1 (表6)。这些结果表明，在提取物E2中，浓缩了毛头鬼伞CBS 123401提取物的活性部分。提取物E1不会以显著方式影响细胞生存，但是，该试验揭示，提取物E2表现出比E1更高的生长抑制活性，表明E2可能拥有某些具有可能的抗癌活性的生物活性化合物。

表6. 毛头鬼伞 CBS 123401提取物的细胞毒性。

用递增浓度的毛头鬼伞提取物，处理细胞。48 h后，收集细胞，用0.4%锥虫蓝溶液(1:1)染色，并使用血球计数器计数。相对于DMSO-处理的对照，计算细胞生存力的抑制百分比。将值(μg/ml)表示为重复实验的平均IC₅₀ ± 标准差。

3.3 毛头鬼伞 CBS 123401粗提取物对IκBα磷酸化的作用

NF-κB途径已经作为癌症药物开发中最有前途的靶标之一而出现。发现毛头鬼伞 CBS 123401提取物会调控NF-κB活化途径。为了证实毛头鬼伞的两种提取物E1和E2对pIkBα水平的作用，如上所述，用100 μM H₂O₂刺激MCF7细胞10 min。初步的数据表明，用100 μM H₂O₂处理10-min会造成最高水平的pIκBα (未显示)。测定了毛头鬼伞提取物在H₂O₂刺激10-min的细胞中影响IκBα磷酸化的能力。结果表明，两种提取物以剂量-依赖性的方式显著影响IkBα磷酸化。在使用的两种浓度(100和200 μg/mL)，有机提取物E2似乎是最有活性的IκBα磷酸化抑制剂。如图2所示，提取物E2在浓度 200 μg/mL几乎完全抑制IκBα磷酸化，并在浓度100 μg/mL造成磷酸-IκBα水平的部分抑制。提取物的作用与姜黄素的作用相当，所述姜黄素也表现出高磷酸-IkBα抑制作用 (图2)。

与这些结果相比，在100和200 μg/ml浓度的提取物E1仅部分地抑制IkBα的磷酸化 (图3)。

E2提取物是比E1提取物远远更有效的抑制剂的事实表明，脂溶性的物质是NF-κB途径的非常有效的抑制剂。

3.4 毛头鬼伞 E1和E2提取物对IKK活性的作用

NF-κB的主要活化剂是IkB激酶复合物(IKK)。该复合物包括2个催化亚基IKK-α和IKK-β和一个调节亚基IKK-c (也称作NEMO)。NF-κB途径由细菌和病毒感染以及促炎细胞因子和趋化因子(例如，肿瘤坏死因子 a (TNF-a)、脂多糖(LPS)、白介素 (IL-1、IL-6)等)所触发，它们都活化在IκBα的N端附近的2个特异性的丝氨酸的IKK β的IKK复合物磷酸化，这靶向IκBα进行蛋白酶体的遍在蛋白化和降解。导致NF-κB活化的几乎所有信号都集中在高分子量复合物的活化上，所述高分子量复合物含有丝氨酸-特异性的IKK。IKK复合物的活化会导致在IκBα的N端附近的2个特异性的丝氨酸的IKK β的磷酸化，靶向IκBα进行蛋白酶体的遍在蛋白化和降解。

基于上述结果，假定活性提取物的NF-κB抑制作用是由于在IkBα磷酸化上游的NF-κB途径的调控。IKK复合物会在丝氨酸32和36处磷酸化IκBα，这导致26S 蛋白酶体对IκBα的遍在蛋白化和降解。为了确定E1和E2是否影响IKK活性，应用基于ELISA的IKK活性试验。E1和E2提取物对IKK活性的作用如图4所示。得到的数据表明，与未处理的样品对照相比，仅E2提取物抑制IKK复合物的活性。此外，E2表现出与使用的阳性对照5-(对-氟苯基)-2-脲基]噻吩-3 羧酰胺 (Fuct) 和MO04-Marasmius oreades 粗乙酸乙酯提取物的作用相当的强作用。

实施例4. 浸没培养的毛头鬼伞 CBS 123401菌丝体的内容物和化学组成

通过本领域众所周知的常规方法，确定了浸没培养的毛头鬼伞菌丝体的化学组成，并公开在表7和表8中。

4.1 化学组成

表7. 毛头鬼伞 CBS 123401的内容物和化学组成。

表7. 毛头鬼伞 CBS 123401的内容物和化学组成。

(-) = 没有注解。

1. 能量 – 从样品中的蛋白、脂肪和碳水化合物的含量计算。

2. 蛋白 – 蛋白换算因子6.25。

3. 碳水化合物– 根据样品中水、灰分、脂肪和蛋白的含量，计算结果。

4. 以来自油的相对百分比，给出试验结果。

5. 金属筛选 – 具有'<'的结果 – 在所述的灵敏度限度没有发现踪迹。

毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝体含有17种游离氨基酸，其中的10种是必需氨基酸(具有星号): γ-氨基丁酸*、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸*、异亮氨酸*、亮氨酸*、赖氨酸*、甲硫氨酸*、苯丙氨酸*、丝氨酸、苏氨酸*、色氨酸*、酪氨酸和缬氨酸*。

表8. 毛头鬼伞 CBS 123401的维生素含量。

4.2 毛头鬼伞 CBS 123401浸没培养的生物质的多糖组成分析

在高压釜中在120℃用热水提取洗过的细胞1 h；通过离心，去除沉淀物。干燥小量溶液，并通过NMR进行分析。波谱(图5)显示出低分子量组分的强烈的尖锐的信号和典型的蛋白-多糖背景。记录该产物的2D波谱，并将低分子量组分鉴别为海藻糖(α-Glc-1-1-α-Glc，即诸如shiitake(Lentinus edodes)、maitake (Grifola fondosa)、nameko (Pholiota nameko)和木耳 (Auricularia auricula-judae)等蘑菇的特征组分，它们可以含有1%至17%的干重形式的海藻糖)和甘露醇，摩尔比为~1:1。通过气相色谱法分析，估测甘露醇含量：将1%w/w的肌醇 (内部标准品)加给新鲜细胞，在100℃，用醋酸酐-吡啶乙酰化混合物1 h。气相色谱法分析表明，所述细胞的甘露醇含量是3%（按重量计算），因此海藻糖含量是6%(它的分子量是甘露醇的2倍)。

用5%NaOH处理水提取后的残余物 (100℃, 3 h)；通过离心，去除沉淀物；透析溶液，并干燥；产量是400 mg；蛋白含量是30%，碳水化合物含量是55%。

进行完整细胞、提取物和提取后的残余物的单糖分析；结果如表9和图6所示。将细胞和固体残余物溶解于40℃的浓HCl中1h，然后用水稀释至最终的酸浓度2M。将其它样品直接溶解于2M HCl中。在100℃进行水解2 h，干燥产物，将糖类转化成糖醇乙酸盐(NaBH₄ 还原和Ac₂O乙酰化)，并通过气相色谱法进行分析。提取后的固体残余物的葡萄糖含量增加，因为不溶性的β-葡聚糖保留在残余物中，且提取逐渐去除了可溶性的组分。

表9. 毛头鬼伞和提取物的单糖组分。

相对于内部肌醇，通过气相色谱法测得的细胞和提取物的单糖组分(%w/w)。将样品溶解于浓HCl (37℃, 1 h)中，用5体积的水稀释至2M HCl，在100°加热2 h，还原，并乙酰化。“没有水解的细胞”刚刚被乙酰化，以测量游离甘露醇的含量。

通过色度法实验 (酚硫酸用于多糖测定，Lowry用于蛋白测定)测得，通过透析从水提取物去除低分子量组分所剩下的产物含有25%碳水化合物和40%蛋白。基于NMR谱，将多糖鉴别为淀粉、β-葡聚糖和岩藻半乳聚糖。通过CaCl₂沉淀，已经分离出纯的形式的淀粉直链淀粉 (2%w/w来自细胞)。通过单糖分析，估测半乳聚糖含量是3%。全提取物和细胞的岩藻糖含量太低，难以定量。通过NMR和甲基化，分析半乳聚糖的结构，并显示如下：

通过Sephadex G-50上的尺寸排阻色谱法，从水和NaOH提取物部分地分离了多糖 (图7)。首先洗脱淀粉，并通过¹H NMR谱进行鉴别。半乳聚糖也在空体积附近洗脱，这与公开的它的分子量数据相一致，估测为10,000 Da。对于葡聚糖而言，Sephadex G-50的空体积 (排除体积) 是10,000 Da。半乳聚糖在空体积附近洗脱，但是略有保留(因而它的分子量不会大于排除质量)，所以它具有10,000 Da的最大质量。它也出现在更低质量的级分中。

可溶性的β-葡聚糖具有从10,000至<1000的宽分子量分布，没有可见的优势质量。从色谱图 (图7)可以看出，β-葡聚糖作为从空体积到盐的非常宽的峰洗脱，跨Sephafex G-50的整个分离范围 (500-10,000 Da)。不可能制备出纯的β-葡聚糖；它含有特定量的淀粉、半乳聚糖和蛋白。由于蛋白部分的去除，阴离子交换色谱法会提高波谱质量，但是多糖没有彻底分离。因为葡聚糖的低分子量，在透析和凝胶色谱法过程中，损失特定量的葡聚糖。

β-葡聚糖的甲基化分析表明末端、3-、4-、6-和3,6-取代的葡萄糖残基的存在，比例为2:1:0.3:3:1。甲基化分析提示，侧链被连接在主链的每第3个葡萄糖上，侧链的平均长度是3个糖 (t-Glc:6-Glc ~ 1:2, 3-Glc:3,6-Glc ~2:1)。4-和4,6-取代的Glc的存在可以源于淀粉。2-和2,6-取代的Gal的峰属于半乳聚糖。

β-葡聚糖级分的NMR分析表明它与灵芝葡聚糖的相似性 (图8和表10)。结构如下所示：

其中m是1至约10的整数，且n是等于约3的整数。

为了定量淀粉和不可溶的β-葡聚糖含量，使用Megazyme试验 “蘑菇和β-葡聚糖”。 根据生产商的说明书，进行测量。分析细胞、水-提取的细胞、水和NaOH-提取的细胞、水提取物和NaOH提取物的样品。结果如表11所示。Megazyme试验 “蘑菇和β-葡聚糖”是基于通过水解和酶处理的组合释放出的总葡萄糖的测量和淀粉含量的单独测量。将β-葡聚糖含量计算为前2个数字的差异。没有使用β-葡聚糖的直接测量。

表10. 毛头鬼伞 β-葡聚糖的NMR数据(ppm; D2O, 25℃)。

表11. 毛头鬼伞样品的总葡聚糖、α-葡聚糖和β-葡聚糖含量。

结论

该研究的结果表明，毛头鬼伞会产生具有β-1-3-葡萄糖主链和1-6连接的侧链的β-葡聚糖，类似于从灵芝蘑菇提取的可溶性的β-葡聚糖。毛头鬼伞也产生岩藻半乳聚糖、淀粉、海藻糖和甘露醇；所有这些组分以前在蘑菇中发现。可溶性的β-葡聚糖具有低分子量，且可以使用热水容易地提取。

4.3 凝集素含量。测定的物种毛头鬼伞CBS 123401生物质具有血凝集活性 (表12)。在来自毛头鬼伞的生物质提取物中，揭示出非常高的凝集素血凝集效价 (18585)。毛头鬼伞的比血凝集活性达到62700 U/mg^-1。

表12. 毛头鬼伞CBS 123401生物质蛋白含量、血凝集活性和糖特异性

MIC= 最小抑制浓度

HA= 血凝集活性。

数据表明，乳糖是测定的蘑菇凝集素的血凝集活性的最广泛的抑制剂，其次是GalNAc和半乳糖。乳糖是真菌的最有效的抑制剂。在0.78 mM的浓度，乳糖会抑制毛头鬼伞的凝集素活性。同时，木糖、纤维二糖和卫矛醇没有抑制毛头鬼伞生物质的凝集素血凝集活性。

得到的结果表明，毛头鬼伞具有在生物质和子实体中积累凝集素的能力。在毛头鬼伞中揭示出特别高的血凝集活性。针对蘑菇凝集素的糖特异性测定表明，结合乳糖的凝集素在测定的菌株中最广泛地分布。

实施例5. 品种黄金银耳CBS 123296的特征

纯培养物中的营养菌丝体。白色的、棉状的丝状菌落在成熟后经常形成“丛” (菌丝聚集体)。不对称形状的菌落通常沿着外缘形成菌丝垫。锁状联合、菌丝联结和毛发-样晶体经常存在于菌丝上。

担子果经常较大，且是突出的， 2—10 cm宽，最大5 cm高，通常是单个的、凝胶状的、脑回状的（在嫩时）和潮湿的，以后是具有不规则的簇生褶皱的叶状（由几个波状-具褶的叶片组成），在新鲜样本中是黄色至黄橙色，偶见更淡的或完全无色素的和白色（在老时），在湿的或黑暗的环境中，黄橙色至更深色（在干燥时）。子实层表面光滑，或多或少具有光泽。果肉是凝胶状，且柔软。菌丝系统是单系菌丝的。菌丝富含锁状联合，透明的、薄壁至厚壁，通常1.5—3 µm宽，在凝胶化的担子果的内部部分稍微更宽。Haustorial细胞是球形至椭圆形，通常以3—6 × 2—4 µm宽度存在（嫩样本除外），大多数非常接近附着点。两类担子：1) 大多数是椭圆体至近球形，10—25 × 10—22 µm；2) 椭圆形至球棒状，20—30(—35) × 12—20 µm；纵向或斜向分隔成4个孢子，小梗宽度100—150 × 2—3 µm，尖端膨大至7 µm。担孢子大多数是椭圆体至长方形，(8—)10—16(—18) × (5—) 7—10(—12) µm，光滑，透明，薄壁，具有明显的细尖，在Melzer氏试剂中是阴性的。分生孢子梗具有稠密的分支，经常具有丰富的子实层，特别存在于嫩样本中。分生孢子是近球形至椭圆形，3—5 × 2.5—3.5 µm，或椭圆体至圆柱形，3—5 × (1—)2 µm直径，光滑，透明，经常为数众多。层丝通常不存在，有时存在于发育早期，薄至稍厚的壁，宽度最大3.5(—4) µm。泡囊的形状和大小可以变化，从球形至椭圆体，大多数20—30 × 5—10 µm，厚壁。孢子印迹发白或淡黄色。

产地: 在阔叶树材腐烂的分支、木和枝条上。

黄金银耳CBS 123296具有特殊的生命周期。不同于其它的高等担子菌蘑菇，单个担孢子在营养培养基汤上通过菌丝和通过酵母-样芽殖细胞发芽。单担孢子培养物是单倍体，即在每个细胞中仅含有一个细胞核。当2个源自不同担孢子的相容的单倍体细胞相接触时，发生胞质融合和核配合，并形成dycariotic菌丝体。在任何培养条件下，dycariotic菌丝体不能以芽殖细胞的形式生长，所以酵母-样生长类型在遗传上由蘑菇培养物的单倍体状态决定。单倍体培养物是更塑性的，因为在差的培养基上，或在耗竭条件下，酵母-样细胞可以形成单倍体菌丝。象其它微生物一样，单细胞真菌培养物比菌丝体更易被生物技术过程所接受。对于以无菌菌丝体形式生长的担子菌dycariotic培养物而言，这是特别重要的，需要特殊的制备担子菌接种物的程序，其包含dycariotic菌丝体匀浆化。本发明的单倍体酵母-样芽殖培养物是最佳的生长形式，这不仅从生物技术方面考虑，而且由它的比菌丝体形式生产更大量多糖的生理学特性决定。

实施例6. 药用果子冻（jelly）蘑菇黄金银耳CBS 123296 纯培养物的生长调节和生物合成活性

收集黄金银耳的子实体，用于担孢子印迹显影。子实体与在栎树属的死小枝上的Peniophora 物种有关。从该样本得到的单倍体酵母-样培养物在琼脂培养基上表现出快速的生长，它们中的14个用于浸没培养条件的初步筛选。在名称黄金银耳CBS 123296下，将选择的菌株保藏在Haifa University Culture Collection (HAI)。

测得选择的菌株生物质在浸没培养条件中生长的最适pH值是在5.5至中性范围内。在具有pH 6.35的液体麦芽膏培养基上，得到最高生物质产量。

适合生物质积累的培养基组成的优化已经证实，蔗糖是象葡萄糖一样适合的碳源。

蛋白胨和酵母浸出物的混合物是好的氮源，而以前研究的氨盐会非常迅速地降低培养基的pH。它们还含有足够细胞生长的磷，因为磷盐的添加不会导致增加的生物质产量。认为醋酸镁在生理学上比MgSO₄更碱性，且实际上会阻止培养基的快速酸化。

轻微改进的培养基另外用作具有下述组成的标准“接种物培养基” (g/l)：蔗糖- 20.0；蛋白胨 - 2.0；酵母浸出物- 2.25；乙酸镁 - 1.0；KCl - 1.0。在120℃灭菌30 min以后，培养基的pH接近6.5。

发现“发酵培养基”的最佳组成如下：在如下制备的培养基中，培养黄金银耳：混合由50.0 g/L蔗糖、 0.5 g/L酵母浸出物、1.0 g/L KCl、1.0 g/L乙酸镁•4H₂O组成的部分A和由0.5 g/L NaH₂PO₄•H₂O和1.0 g/L Na₂HPO₄•7H₂O组成的部分B。

当溶液在灭菌后冷却至室温时，将部分B加入装有部分A的烧瓶中。

连续培养黄金银耳72 h，在该时刻，培养液中的TMP达到27.0 g/l (表13)。沉淀、分离和干燥后，得到170 g TMP制品。

表13. 在发酵罐中培养黄金银耳CBS 123296期间的培养参数变化

DO, 溶解氧; TMP, 粗黄金银耳制品

实施例7. 黄金银耳的内容物和化学组成

7.1 一般组成。黄金银耳CBS 123296 浸没培养粗产物由相等比例的菌株生产者细胞生物质和胞外多糖葡糖醛酸木甘聚糖组成。在该情况下的一般组成如表14所示。

表14. 黄金银耳CBS 123296的一般组成

在以色列的2个不同的且独立的场所(Bactchem Co.和Aminolabs Co.)，测定了化学组成，并公开在表15-17中。

表15. 浸没的黄金银耳CBS生物质的化学组成

表16. 浸没的黄金银耳CBS 123296生物质的氨基酸组成

注释 :

(-) = 无注释

1. 没有报告色氨酸，因为它在水解过程中被完全破坏。

2. 磺基丙氨酸和甲硫氨酸 sulfon: 分子量分别代表半胱氨酸和甲硫氨酸。

7.2 粗膳食纤维包括半纤维素、低分子多糖诸如糊精和细胞壁组分诸如β-(1-3)-葡聚糖。

7.3 维生素。在黄金银耳CBS 123296的生物质中，发现了维生素 A (视黄醇)、C (抗坏血酸)、E (α-生育酚)和B族维生素。

在B族维生素中，通过微生物学方法测得，基于敏感的营养缺陷型微生物的生长特征的评估，黄金银耳生物质特别富含尼克酸，且富含维生素A。

7.4 黄金银耳(CBS 123296)中的葡聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖

通过整个浸没的黄金银耳生物质和超速离心后得到的级分的气相色谱法分析 (葡萄糖、甘露糖和木糖含量)，测定组成。葡聚糖在120 000 g完全沉淀，葡糖醛酸木甘聚糖(GXM)大部分保留在溶液中，尽管也部分地沉淀。经发现，GXM占多糖生物质干重的约70%，葡聚糖占约30%。

通过分离大功率超声处理过的黄金银耳，得到不含有GXM的纯葡聚糖。超声处理过的GXM更易溶于水，且在超速离心中不会沉淀出来，因而在2次重复沉淀以后，可以分离出纯的β-葡聚糖。分离1.2 g 黄金银耳，得到400 mg沉淀物(含有~10%GXM的葡聚糖)和800 mg 可溶性的产物(GXM)。

在气相色谱法分析中，按照(Man+Xyl)*1.3计算GXM含量 (使用1.3来补偿GlcA和乙酸盐)。发现新分离的黄金银耳(CBS 123296)中葡糖醛酸木甘聚糖的结构稍微不同于从其它黄金银耳菌株分离出的葡糖醛酸木甘聚糖(未显示)。从葡萄糖含量，估测葡聚糖。为了避免葡糖醛酸内酯还原成Glc，在NaBH₄还原之前，用24%NH₃处理水解物。由于葡聚糖不易溶于用于水解的3M TFA中，在水解之前，用浓HCl处理其它样品集合(40℃, 1h)。该方法导致增加的Glc回收率，但是木糖部分地降解。

β-葡聚糖的甲基化表明，它具有以3-和4-取代的葡萄糖作为主要组分的直链结构 (图9和图10)。因而，所述葡聚糖是3,4-β-葡聚糖。所述葡聚糖不易溶于DMSO中，因而它被甲基化2次；仍然有一部分没有溶解，这可能影响结果。葡聚糖不溶于水中。

实施例8. 黄金银耳CBS 123296制品的产干扰素性质和免疫调控性质

在该研究中使用重量为18-20 g的杂种小鼠。给小鼠口服饲喂浸没的黄金银耳CBS 123296单细胞生物质。

在用所述制品处理后6、24和48小时后，杀死小鼠，然后收集血浆，测定其中的干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)水平，并将腹膜渗出液的巨噬细胞用于检查吞噬系统的机能活性对制品的响应。

8.1 血浆 IFN水平.

产干扰素性质如表18所示，并证实，给小鼠口服施用4 mg/动物的单次剂量的生物质，会在24小时后诱导低滴度(80 单位/ml)的内源IFN的合成。在48小时以后，用上述黄金银耳生物质剂量处理的动物的血清中的IFN水平保持增加至80 单位/ml。

在10 mg/动物的剂量的黄金银耳生物质似乎更有活性，在给药后6小时，造成产生80 单位/ml滴度的内源IFN。在制品给药后24小时，动物血清中的IFN滴度达到最大值160-320 单位/ml。更远的(在48小时)血清IFN水平降低，但是与对照指数相比，仍然保持升高 (80 单位/ml)。

表18. 黄金银耳CBS 123296生物质制品的产干扰素活性体内测定

根据在研究中测得的血浆中的肿瘤坏死因子(TNF)水平，黄金银耳生物质没有导致该细胞因子的体内合成(未显示)。同时，这些制品可能辅助减轻内源性身体中毒。这得到在对照小鼠的血浆中检测出的TNF的证实(在导入生理溶液时)。制品的应用，导致对照动物血浆中减少量的TNF。

8.2 腹膜渗出液的巨噬细胞的机能活性对黄金银耳生物质的响应

在硝基蓝四唑(NBT)试验（硝基蓝四唑的非底物还原反应）中，评价了腹膜渗出液的巨噬细胞的机能活性。NBT试验通常用于研究巨噬细胞的机能活性，因为巨噬细胞的受损的NBT还原能力与它们的氧-依赖性的杀生物剂性质的病理学同时发生。在没有额外的体外细胞刺激(自发试验)下，并使用St. aureas 细胞进行它们的体外刺激(刺激试验)，检查了巨噬细胞在NBT-试验中的活性。刺激的NBT-试验视作对完全吞噬准备就绪的细胞化学标准。自发的和刺激的NBT-实验指数之间的差异视作细胞机能储备(FR)，其反映了比较符合关于一般免疫储备的概念的吞噬系统的作用潜力。

发现在4和10 mg/动物口服施用的单次剂量的黄金银耳生物质会在自发的和刺激的NBT –试验中调节腹膜渗出液巨噬细胞的氧-依赖性的杀生物剂活性指数 (表19)。应当说明，吞噬细胞活性对tremellastin的响应取决于剂量和观察时间。例如在施用4 mg/动物剂量的黄金银耳生物质以后6小时，在自发的和刺激的NBT-试验中发生氧-依赖性的杀生物剂活性和巨噬细胞FR的轻微下降。显示在表19 中的数据表明，在24和48小时以后，响应于4 mg/动物的黄金银耳生物质，自发的 NBT试验的指数增加，达到对照指数值。但是，与对照相比，在给出的观察期内(在24和48小时)，在刺激的NBT-试验中，发生巨噬细胞活性的氧-依赖性的杀生物剂活性的急剧增加，这导致它们的FR的显著增加。

表19. 巨噬细胞的氧-依赖性的杀菌活性对黄金银耳CBS 123296生物质制品的体内响应

响应于单次剂量的10 mg/动物的黄金银耳生物质，在6小时以后，观察到自发的 NBT-试验的指数的轻微增加，但是在24和48小时以后，该值降低至对照指数水平。同时，在整个观察期内（在6、24和48小时），在刺激的NBT-试验中，观察到巨噬细胞活性的显著增加。用10 mg/动物的黄金银耳生物质处理过的小鼠巨噬细胞的增加的刺激的NBT-试验指数，导致FR细胞的急剧增加。从表19可以看出，在6小时后，发生FR增加，且在48小时时，达到最大值。

从我们的研究可以看出，黄金银耳生物质对自发的 NBT-试验的指数具有微小的影响，但是，它会在刺激的NBT-试验中造成巨噬细胞活性的显著增加，从而增加吞噬细胞系统的储备潜力。

从我们的研究结果可以看出，在6小时以后，在自发的 NBT-试验中巨噬细胞的氧-依赖性的杀菌活性与对照相比保持不变。同时，在6小时以后，刺激的NBT-试验指数增加，其导致细胞 FR显著增加。24小时以后，自发的 NBT-试验指数相对于对照保持不变，刺激试验的指数倾向于增加，细胞的FR也保持不变。

8.3 总结。 根据研究结果分析，单次剂量的4和10 mg/动物的黄金银耳生物质制品产生微小的产干扰素活性，诱导“晚期”内源干扰素的产生。黄金银耳生物质制品似乎是更有活性的干扰素原，此外，当加浓至10 mg/动物时，它是最有效的。响应于10 mg/动物的黄金银耳生物质制品，在24小时达到血清中干扰素滴度的峰值(160-320 单位/ml)，其随后降低，在整个观察期中仍保持较高。预期当与其它干扰素原一起注射时，黄金银耳生物质会激发，开始在动物体内产生小量干扰素，即强化干扰素合成。

在NBT-试验中，观察到腹膜渗出液巨噬细胞响应于黄金银耳生物质的强化的机能活性。加浓至10 mg/动物的黄金银耳生物质似乎是最有效的巨噬细胞的氧-依赖性的杀生物剂活性活化剂。所述制品造成刺激的NBT-试验指数的增加 (在自发的 NT-试验的不变的指数)，这导致吞噬细胞系统的机能储备的急剧增加。应当说明，吞噬细胞系统的储备潜力的增加对于防止机会性的细菌或病毒诱导的感染的发展而言是重要的。还可能防止身体的其它病原体-诱导的污染。更高的巨噬细胞杀菌活性以及更高的机能储备(自发的和刺激的NBT-试验指数之间存在差异)的原因是与体内干扰素产生有关的黄金银耳生物质制品。在这方面，氧依赖性的巨噬细胞杀生物剂活性的活化与黄金银耳生物质 (和可能的其它细胞因子，其需要进一步检查)对内源IFN的诱导有关，因为吞噬细胞是体内IFN作用的主要靶物。此外，可能发生的是，所述制品活化的吞噬细胞能够通过自分泌和旁分泌活化技术参与产生内源IFN。

实施例9. 黄金银耳CBS 123296提取物和葡糖醛酸木甘聚糖对植物的植物病毒抗性的作用

当研究从担子菌的培养液和子实体分离出的多糖的化学性质时，我们发现了中性的和酸性的多糖。具体地，由黄金银耳生产的葡糖醛酸木甘聚糖(GXM)酸性多糖由α-(1→3)-连接的甘露聚糖的线性主链组成，所述甘露聚糖被β-(1→2)(1→4)-连接的木糖和葡糖醛酸的寡糖二醇化，并产生聚阴离子性质。基于已知的数据，可能假定中性和酸性聚糖具有不同的抗植物病毒活性特征。

实际上，研究的多糖不同程度地抑制TMV 在曼陀罗植物上诱导的局部病变的发展 (表20)。

经证实中性多糖是最有活性的。局部病变形成的抑制最高达80和99.4% (在100-1000 μg/mL的浓度)。GXM的活性明显更低，且在该情况下，总制品占据中间位置，这提供了证据来证实，相对于TMV感染性的总制品活性被中性多糖诱导至更大的程度。后者证实了来自文献的数据，其中中性多糖相对于病毒在超敏感的植物中的感染性的活性比它们的硫酸盐衍生物更高，所述硫酸盐衍生物主要从新诱导植物的病毒抗性。基于得到的结果，重要的是，研究GXM（其类似于硫酸化的甘露聚糖）是否可以诱导植物对病毒的遗传依赖性的抗性。经发现，在1000-2500 μg/mL浓度的GXM可以诱导烟草和曼陀罗植物对TMV的抗性 (表21)。在该情况下，在烟草植物中的AVR似乎比在曼陀罗植物中更高。换而言之，该多糖对AVR的活化依赖于超敏感的宿主植物的基因型，因此又依赖于适当的抗性基因的活性。

表20. 黄金银耳CBS 123296 GXM和中性多糖对 TMV在曼陀罗植物中的感染性的影响

注：Р0 >5%；*) 1%<Р≤5%；**) 0.1%<Р≤1%；***) Р≤0.1%。

抗性发展的研究已经证实，在1000和2500 μg/mL浓度的GXM会诱导在接种诱导物后第1天已经在烟草植物中的TMV相关的AVR的发展(图11和12)。关于GXM的浓度（在植物组织中存在的连续的多糖下，其等于1000 μg/mL），抗性水平逐渐降低：至30%（在第5天）和至20%（在第7天） (图11)。关于GXM的浓度（其等于2500 μg/mL），没有观察到这样的趋势 (图12)。相反，该事实可以提供证据，不仅证明AVR的多糖诱导在基因水平的浓度依赖性，而且证明植物适应更低和更高GXM浓度的不同能力。

表21 葡糖醛酸木甘聚糖对烟草和曼陀罗植物中TMV-感染抗性的诱导的影响

注：参见表20。

在测量叶子的实验半和对照半上的TMV 局部病变的大小以后，证实了在2500 μg/mL的浓度，GXM会强化病毒病变的生长 (图13)。在该GXM浓度，仅在将诱导物接种进植物组织后7天，观察到坏死的生长的可靠刺激，尽管在多糖施用的其它阶段，也观察到这样的趋势。在用1000 μg/mL浓度的GXM处理的一半叶子上，在实验和对照之间，没有观察到局部病变大小的可靠差别。

已知，对局部坏死生长的类似影响由酵母RNA产生。通过在诱导物影响下植物中抗性的超敏感机理的活化，可能解释该现象。

在使用放线菌素D (AMD)的实验中证实，该抗生素会抑制植物的GXM-诱导的病毒抗性的发展 (图14)。无论它的施用方法（同时地，或在导入GXM以后2天），AMD会部分地(20 μg/mL)或完全地 (10 μg/mL)抑制用聚阴离子诱导的AVR的发展。在20 μg/mL浓度的放线菌素D对AVR的不完全抑制，可能由抗生素对植物组织的毒性造成。通过对照（其中在没有GXM存在下，将AMD注射进叶子中）中坏死数目的减少，证实后者。

总体上，得到的结果引出的结论是，由GXM接种进超敏感的植物中的AVR 取决于新RNA的合成（在细胞DNA基质上）。换而言之，可能把DNA归因于从新活化植物对病毒的抗性的那些诱导物。

因而，已经证实，GXM会从新诱导超敏感的烟草植物对病毒感染作用的抗性，因为该抗性对放线菌素D的作用是敏感的。一方面，它的活性类似于以前研究的硫酸化的多糖和酵母 RNA的作用；另一方面，该活性类似于活化超敏感的机理（在蛋白-碳水化合物相互作用的基础上）的中性多糖。

考虑到总体上尚未深入研究植物中天然的和诱导的抗性的机理，能够增加天然的病毒抗性的物质的搜索是有前途的。在我们的选择中，这样的研究的结果具有重要性，因为多糖和糖蛋白可以在将来用作内源触发物的模型，所述内源触发物参与超敏感的植物中AVR的活化。在农业和装饰植物培养中，对于目的在于减少病毒感染损害的实际应用而言，这样的物质也是令人感兴趣的。

Claims (21)

1.新的且独特的高等担子菌蘑菇品种，其选自：在布达佩斯条约下在登记号CBS 123401下保藏在荷兰真菌培养中心(CBS)的毛头鬼伞 HAI-1237(在下文中称作毛头鬼伞 CBS 123401)，和在布达佩斯条约下在登记号CBS 123296下保藏在荷兰真菌培养中心(CBS)的黄金银耳HAI-17(在下文中称作黄金银耳CBS 123296)。

2.如权利要求1所述的蘑菇的生物质，其富含营养制品因子和生物活性化合物，包括碳水化合物、富含必需氨基酸的蛋白、维生素、富含必需脂肪酸的脂质、抗氧化剂和矿物质，其中所述生物质从毛头鬼伞CBS 123401的子实体或菌丝体或黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到，优选通过在营养培养基上以浸没培养方式培养所述蘑菇。

3.如权利要求2所述的菌丝生物质，其中所述毛头鬼伞 CBS 123401的碳水化合物包括海藻糖、β-葡聚糖，优选低分子量水溶性的β-葡聚糖和半乳聚糖，优选中性岩藻半乳聚糖，且所述黄金银耳CBS 123296的碳水化合物包括β-葡聚糖，优选直链的3,4 β-葡聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖。

4.具有营养制品和生物活性的如权利要求1所述的蘑菇的提取物，其从毛头鬼伞CBS 123401的子实体或菌丝体或黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到，优选从纯的浸没的蘑菇菌丝体培养物得到。

5.如权利要求4所述的提取物，其中所述提取物从毛头鬼伞 CBS 123401培养物得到，且富含低分子量水溶性的β-葡聚糖和/或半乳聚糖，优选中性岩藻半乳聚糖，或所述提取物从黄金银耳CBS 123296培养物得到，且富含直链的3,4 β-葡聚糖和/或葡糖醛酸木甘聚糖。

6.一种组合物，其包含：根据权利要求2或3的生物质、或根据权利要求4或5的提取物、或所述生物质或提取物的混合物。

7.如权利要求6所述的组合物，其包含：从毛头鬼伞 CBS 123401的菌丝体或子实体得到的富含营养制品因子和生物活性物质的生物质，或所述生物质的提取物。

8.如权利要求6所述的组合物，其包含从黄金银耳CBS 123296的菌丝体得到的富含营养制品因子和生物活性物质的生物质，或所述生物质的提取物。

9.一种纯的浸没的毛头鬼伞 CBS 123401菌丝体培养物。

10.一种纯的浸没的黄金银耳CBS 123296菌丝体培养物，其中所述菌丝体培养物是单细胞生物质的形式。

11.一种低分子量水溶性的β-葡聚糖，其由在某些6-位携带下述结构的β-1-6-D-葡萄糖残基侧链的β-1-3-连接的D-葡萄糖残基的主链结构组成：

其中m是1至约10的整数，且n是等于约3的整数，优选具有小于10,000 Da、优选约1000至约10,000 Da的分子量。

12.如权利要求11所述的β-葡聚糖，其从毛头鬼伞、优选毛头鬼伞 CBS 123401得到。

13.从黄金银耳CBS 123296得到的一种水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖。

14.从黄金银耳CBS 123296得到的一种葡糖醛酸木甘聚糖。

15.一种组合物，其包含：选自下述的碳水化合物:

(a) 如权利要求11或12所述的低分子量水溶性的β-葡聚糖；

(b) 如权利要求13所述的水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖；

(c) 如权利要求14所述的葡糖醛酸木甘聚糖；或

(d) (a)-(c)的至少2种碳水化合物的组合。

16.一种食品添加物、药物、益生元、营养制品、饮料或化妆品，其包含如权利要求6-8或15中任一项所述的组合物。

17.一种宠物食品、杀昆虫、抗寄生虫药或抗植物病毒产品，其包含如权利要求6-8或15中任一项所述的组合物。

18.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下述的活性成分：

(a) 如权利要求6-8或15中任一项所述的组合物；

(b) 如权利要求11或12所述的低分子量水溶性的β-葡聚糖；

(c) 如权利要求13所述的水不溶性的直链的3,4 β-葡聚糖；

(d) 如权利要求14所述的葡糖醛酸木甘聚糖；或

(e) (b)-(d)的至少2种活性成分的组合。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗糖尿病、降低血糖水平、诱导免疫调节应答、降低血液胆固醇水平、或减少胆固醇积累。

20.一种农业组合物，其包含载体和选自下述的活性成分：如权利要求6-8或15中任一项所述的组合物，或如权利要求15所述的葡糖醛酸木甘聚糖。

21.用于诱导植物对植物病毒的抗性的如权利要求20所述的农业组合物。

Images