KR20110137792A - 신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20110137792A
KR20110137792A KR1020117023717A KR20117023717A KR20110137792A KR 20110137792 A KR20110137792 A KR 20110137792A KR 1020117023717 A KR1020117023717 A KR 1020117023717A KR 20117023717 A KR20117023717 A KR 20117023717A KR 20110137792 A KR20110137792 A KR 20110137792A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cbs
biomass
extract
glucan
composition
Prior art date
Application number
KR1020117023717A
Other languages
English (en)
Inventor
솔로몬 피. 와설
Original Assignee
팔메드 테바 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 팔메드 테바 엘티디 filed Critical 팔메드 테바 엘티디
Publication of KR20110137792A publication Critical patent/KR20110137792A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/269—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of microbial origin, e.g. xanthan or dextran
    • A23L29/271—Curdlan; beta-1-3 glucan; Polysaccharides produced by agrobacterium or alcaligenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)

Abstract

부다페스트협약에 의한 CBS (the Centralbureau voor Schimmelcultures)에 수탁번호 CBS 123401로 기탁된 코프리누스 코마투스 HAI-1237 및 부다페스트협약에 의한 CBS에 수탁번호 CBS 123296로 기탁된 트레멜라 메센테리 카 HAI-17 중에서 선택되는 신규하고 탁월한 고등 담자균류 변종 버섯, 그 바이오매스 및 추출물, 및 β-글루칸, 후코갈락탄 및 글루쿠로노자일로만난과 같은 분리된 성분 및, 천연 식품 보충제, 기능성 식품, 프리비오틱, 음료, 화장품, 애완동물사료 및 농학적 살충제 및 항식물바이러스 조성물로서의 그 용도가 개시된다.

Description

신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물 {Novel COPRINUS COMATUS and TREMELLA MESENTERICA Muschroom Strains, Products and Extracts thereof and Compositions comprising them}
본 발명은 약용 버섯에 관한 것이며, 상세하게는 코프리누스 및 트레멜라 버섯 속의 종에 관한 것이며, 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296로 표기되는 고등 담자균류의 신규하고, 탁월한 균주에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 다양한 생물학적 활성 물질을 함유하는, 상기 신규 버섯 균주에서 얻은 자실체, 심부배양된(submerged cultivated) 균사 또는 단일 세포 바이오매스(biomass) 및 추출물과, 항피토바이러스제(anti phytoviral agents)로서 또한 인간과 동물의 식이보충제, 프리바이오틱스(prebiotics), 기능성 화장품(cosmeceuticals)으로서의 이들의 용도, 다양한 질병과 증상 치료요법에 관한 것이다.
버섯의 생명공학적 생산물은 인간복지에 다수의 유용한 효과를 주는데, 예를 들면 식품, 건강 음료 및 의약품, 음식 및 비료로 유용하며, 환경을 보호하고 재건한다. 강력하고 독특하며 건강을 증진시키는 특성을 가진 제약학적 물질이 최근 약용 버섯에서 분리되었고 세계적으로 배급되었다. 이중 대다수는 약학적 물질이지만, 이외에 식이보충제 또는 버섯 기능성식품(nutraceutical) 또는 기능성 식품과 미코케미컬, 피토케미컬, 신기능성식품(desinger food)이라는 새로운 분류에 해당한다. 식이섬유와 렉틴, 트리테르페노이드 뿐만 아니라, 헤테로-β-글루칸과 그들의 단백질 복합체(예를 들어, 자일로글루칸, 우론산을 포함한 산성 β-글루칸)과 같은 많은 항암 폴리사카라이드가 약용 버섯으로부터 분리되었다.
고등 담자균류는 많은 양의 폴리사카라이드, 특히 상이한 형태 β-글루칸을 함유한다. β-글루칸의 항종양 효능은 이들의 분자량 및 용해도와 관계있는 것으로 보여진다. 예를 들어, 저분자량 레티난(letinan)만이 높은 항종양 활성을 가진다. 당연하게도 용해성 β-글루칸이 비용해성인 것보다 강한 면역자극제인 것으로 나타났다.
트레멜라 속의 특정 종, 특히 T. 메센테리카 균주의, 심부배양된 단일 세포 바이오매스 및 자실체는 글루쿠로노자일로만난 및 β-글루칸을 고용량으로 함유하고 있으며, 상기 바이오매스 및 정제된 폴리사카라이드 둘 다 저혈당 활성 및 저트리글리세리드 활성을 가지는 것으로 보고되었다(US 6,383,799; US 6,362,397).
고등 담자균류 버섯은 많은 양의 폴리사카라이드, 단백질, 균형잡힌 필수 아미노산, 멜라닌, 필수 지방산을 포함한 지질류, 트리테르페노이드, 항산화제 비타민 및 다른 생리 활성 물질들을 함유한다. 또한, 글루칸이 속하는 식이 섬유, 키틴, 및 펙틴성 물질, 헤미-셀룰로즈 또는 폴리우로니드를 포함하는 헤테로폴리사카라이드가 모든 버섯 조직에 풍부하게 존재하는데, 이들은 장에서 담즙이나 해로운 물질들을 흡수할 수 있고 이에 따라 제암제(carcinostatics)로 작용할 수 있고 다양한 독성을 감소시킬 수 있다.
게다가, 균류 물질(fungal substances)에 대해 하기와 같이 알려져 있다: (i) 다양한 생리적 병리적 과정에서 중요한 역할을 하는 NF-κB 활성화 경로의 조절자; (ii) 산화성 스트레스 반응에 의해 야기되는 산화 손상을 억제하거나 감소시키기 위한 사람 식이요법의 식이 보충제로서의 항산화제; (iii) 면역조절제; 그리고 면역반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
발명의 요약
본 발명은 부다페스트협약에 의한 CBS (the Centralbureau voor Schimmelcultures)에 수탁번호 CBS 123401로 기탁된 코프리누스 코마투스 HAI-1237 (이하, 코프리누스 코마투스 CBS 123401) 및 부다페스트협약에 의한 CBS에 수탁번호 CBS 123296로 기탁된 트레멜라 메센테리카 HAI-17 (이하, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296) 로부터 선택되는 신규하고 탁월한 고등 담자균류 버섯의 변종에 관한 것이다.
한편으로는, 본 발명은 탄수화물, 필수 아미노산이 풍부한 단백질, 비타민, 필수 지방산이 풍부한 지질, 항산화제 및 미네랄을 함유하는 생물학적 활성물질 및 기능성 식품 물질이 풍부한 본 발명의 버섯 바이오매스에 관한 것이다. 상기 바이오매스는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사체 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사체 또는 자실체로부터 얻을 수 있다. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사 배양은 단일 세포 바이오매스 형태이다.
다른 한편으로는, 본 발명은 기능성 식품 활성 및 생리적 활성을 가진 본 발명의 버섯 추출물에 관한 것이다. 상기 추출물은 상기 버섯의 자실체 또는 균사체로부터 얻을 수 있다.
또 다른 한편으로는, 본 발명은 상기 추출물에서 분리된 신규한 탄수화물, 본 발명의 버섯에서 얻은 추출물 또는 바이오매스 또는 추출물에서 분리한 신규한 탄수화물을 함유하는 조성물, 상기 발명의 조성물의 함유하는 천연 식품 보충제, 약제, 프리바이오틱, 기능성 식품, 음료 또는 화장품 제품, 약학적으로 허용되는 담체와 본 발명의 조성물 및 하나의 신규한 탄수화물에서 선택되는 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물, 및 상기 바이오매스와 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 발효기 또는 생물반응기(bioreactor) 기술로 코프리누스 코마투스 또는 트레멜라 메센테리카의 심부배양 균사체 생산에 대한 일반적인 방법에 관한 스킴을 나타낸다: a- 패트리 디쉬에 표준 한천 배지 제조; b- 배양물의 제조에 사용되는 자실체의 부분 또는 포자; c- 패트리 디쉬에서 배양; d- 튜브 내 한천 슬랜트에서 뮤지움 배양; e- 뮤지움 배양체의 현미경 관찰; f- 250 mL 삼각플라스크 내의 전(pre)-접종 배양; g- 전-접종의 균질화; h- 2 L 삼각플라스크 내 균질화된 균사체 바이오매스의 재배; i- 발효기 배지 접종을 위한 균사체 바이오매스의 균질화; j- 발효기용 생장 배지; k- 발효기내 균사 바이오매스의 배양; l- 균사체 바이오매스의 수확; m- 식이보충제(DS), 약제 및 다른 제품용 건조 바이오매스 제형; 수확된 균사체(HM, Harvest Mycelia).
도 2는 웨스턴 이뮤노블랏에 의해 결정된 pIκBα 농도에 미치는 E1 및 E2 추출물의 효과를 나타낸다. 도면은 유사한 결과를 갖는 두 개의 독립된 실험 중 하나를 나타낸다. E1- 배양액(물) 추출물; E2- 에틸아세테이트 추출물.
도 3은 100 μM H2O2 효과와 비교하여 pIκBα에 대한 E1 및 E2 추출물의 효과를 보여주는 도2의 웨스턴블랏의 덴시토메트리 분석을 나타낸다(결과는 H2O2-처리±표준편차의 평균에 대한 두 개의 독립된 실험결과의 배수로 나타내었다)
도 4는 코프리누스 코마투스 E1 및 E2 추출물의 IKK 억제활성을 나타낸다. E1 및 E2 추출물(100 및 200 μg/ml)과 600nM IKK-억제제 Fuct (1 μM)를 100 ng의 GST-IκBα 기질 및 5 ng의 IKK- 효소와 같이 배양하였고, 물질 및 방법부분에 기술된 바와 같이 ELISA에 기초한 키나아제 활성 분석법을 이용하여 IKK- 활성을 억제하는 능력을 측정하였다. E1- 정제되지 않은 배양액(물-water) 추출물; E2-정제되지 않은 에틸아세테이트 추출물.
도 5는 코프리누스 물추출물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 6A-D는 전 세포(whole cell), 추출물 및 추출 후 잔류물의 모노사카라이드 함량에 대한 가스크로마토그래피 분석을 나타낸다. (A) 물추출물; (B) 전세포; (C) 물 추출 후의 세포; 그리고 (D) NaOH 추출 후의 세포.
도 7은 코프리누스 코마투스 물 및 NaOH 추출물에서 얻은, 특히 세파덱스 G-50을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 분리된 폴리사카라이드의 크기 분리 크로마토그램을 나타낸다.
도 8A-B는 가노데르마 종(Ganoderma sp.) (A) 및 코프리누스 코마투스 CBS 123401 (B)에서 추출된 β-글루칸의 메틸화 분석을 나타낸다.
도 9는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296으로부터 분리한 β-글루칸에서 얻은 메틸화된 당의 GC 트레이스를 나타낸다.
도 10은 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 (A)의 신규 분리 균주에서 얻은 메틸화된 당 및 순수 글루쿠로노자일로만난(B)의 GC 트레이스를 나타낸다.
도 11은 담배 모자이크 바이러스(TMV)와 비교하여, 담배 식물의 면역 580 변종의 민감도(perceptivity)에 대한 GXM (1000μg/mL)의 효과를 나타낸다. 가로축: GXM 도입 및 TMV 접종 사이의 기간(일). 세로축:실험군(짙고 두꺼운 막대)과 대조군(얇은 실선 막대)의 국소 손상 수의 비율(%)
도 12는 TMV와 비교하여 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 식물의 면역 580 변종의 민감도에 대한 GXM (2500 μg/mL)의 영향을 나타낸다. 가로축: GXM 도입 및 TMV 접종 사이의 기간(일). 세로축:실험군(짙고 두꺼운 막대)과 대조군(얇은 실선 막대)의 국소 손상 수의 비율(%)
도 13은 니코티아나 타바쿰 식물의 면역 580 변종에서 TMV에 의해 유도된 국소 손상의 성장에 대한 GXM (2500 μg/ml)의 영향을 나타낸다. 가로축:GXM 도입 및 TMV 접종 사이의 기간(일). 세로축: 실험군(짙고 두꺼운 막대)과 대조군(얇은 실선 막대)의 국소 손상의 크기
도 14는 TMV로 접종된 니코티아나 타바쿰 식물의 면역 580 변종에서의 유도된 GXM 내성에 대한 악티노마이신 D (AMD)의 영향을 나타낸다. 가로축: 실험의 변수: 1 GXM; 2 - GXM 및 AMD (10 μg/mL) 혼합물; 3 GXM 2일 후에 도입된 AMD (10 μg/mL) ; 4 GXM 2일 후에 도입된 AMD (20 μg/mL) ; 5 AMD (10 μg/mL). 세로축: 실험군(짙고 두꺼운 막대)과 대조군(얇은 실선 막대)의 국소 손상된 양의 비율(%)
한 양태에서, 본 발명은 탄수화물, 필수 아미노산이 풍부한 단백질, 비타민, 필수 지방산이 풍부한 지질, 항산화제 및 미네랄을 포함하는 생물학적 활성물질 및 기능성 식품 물질이 풍부한 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 담자균류 버섯 바이오매스에 관한 것이다.
한 구현예에서, 상기 바이오매스는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사체 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사체 또는 자실체로부터, 예를 들면 영양배지에서 심부배양으로 균주를 재배함으로써 단일 세포 바이오매스 형태로 얻을 수 있다.
본 발명은 나아가 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 순수 심부 균사체 배양물에 관한 것으로, 상기에서 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 균사체 배양물은 단일 세포 바이오매스의 형태이다. 트레멜라 메센테리카 균사체 배양이 이스트처럼 단세포 생물로서 성장한다는 것은, 매우 높은 성장률 및 배지 리터당 27g의 건조 바이오매스에 달하는 모든 담자균류 버섯 중에서 가장 높은 생산성을 가능하게 한다.
본 발명의 두 종류 버섯의 균사체의 화학적 조성은 실시예 4 및 7에 나타난 바와 같이 결정되었다. 본 발명의 버섯에 존재하는 것으로 여기에 나타난 구성성분 대다수는 항암활성, 면역 조절 활성, 항혈당, 항당뇨 및 항균활성과 같은 많은 유익한 성질을 지닌다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401 균사체 바이오매스는 균사체 건조 중량 중 약 39% 탄수화물과 약 37% 단백질을 가지고 있으며, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296은 약 54% 탄수화물과 약 20% 단백질을 가지고 있다. 버섯 폴리사카라이드 생산자의 심부배양으로 일정한 조성을 가진 배양 배지를 이용하여 단기간내에 조절된 조건하에서 일정한 조성물을 생산하는 것을 가능하게 하였다.
상기 바이오매스의 탄수화물은 폴리사카라이드와 디- 및 모노-사카라이드 모두를 함유한다. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 바이오매스의 폴리사카라이드의 예로는 β-글루칸을 함유하며, 바람직하게는 저분자 수용성 β-글루칸 및 갈락탄을, 더욱 바람직하게는 중성 후코갈락탄(fucogalactan)을 함유한다.
따라서 본 발명은, 실시예 4.2에 나타난 바와 같이 일부 6번 위치에 곁사슬로 β-1-6-D-글루코스 잔기를 갖는 β-1-3-연결 D-글루코스 잔기의 골격 구조로 구성된 신규한 저분자량 수용성 β-글루칸에 관한 것이다. 상기 β-글루칸은 코프리누스 코마투스, 바람직하게는 코프리누스 코마투스 CBS 123401로부터 얻고, 10,000Da 미만의 저분자량, 바람직하게는 약 1000 내지 약 10,000 Da의 분자량을 가진다.
트레멜라 메센테리카 CBS 123296 바이오매스 폴리사카라이드의 예는 β-글루칸을 함유하며, 바람직하게는 선형 3,4 β-글루칸 및 글루쿠로노자일로만난을 함유한다. 따라서 본 발명은 나아가, 실시예 7.4에 나타난 바와 같이, 트레멜라 메센테 리카 CBS 123296으로부터 얻은 신규한 수불용성 선형 3,4 β-글루칸과 글루쿠로노자일로만난에 관한 것이다. 상기 글루쿠로노자일로만난은, 자일로스와 글루쿠론산의 β-(1→2)(1→4)-연결 올리고사카라이드에 의해 글리콜화된 α-(1→3)-연결 만난이라는 선형 기본골격을 가지며, 이로 인해 다가음이온(polyanion) 성질을 가지고 있으며, 항혈당 및 항당뇨제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 β-글루칸은 항종양 및 면역조절 활성, 특히 면역자극 활성을 가지고 있으며, 본 발명의 클루쿠로노자일로만난은 저혈당 완화 활성, 면역자극 활성 및 저콜레스테롤 활성을 지니고 있어, 면역 시스템의 강화가 중요한 질환 및 증상의 예방 및 치료, 예컨대 당뇨, 암, AIDS와 같은 바이러스 질병, 혈압의 예방 및 치료 생약과 고콜레스테롤 상태를 치료하는 콜레스테롤 저하제로서 유망하다. 상기 두 가지 종류의 폴리사카라이드는 신규한 프리비오틱제의 원료가 될 수 있다. 여기에서 프리비오틱제는 숙주의 웰빙과 건강에 유익함을 주는 위장관 세균총(microflora) 조성 및/또는 활성에 특정 변화를 가능하게 하는 선택적으로 발효된 성분으로 정의된다. 또한, 상기 바이오매스에 존재하는 키틴은 식이 섬유의 주요한 구성성분이다.
균사체 바이오매스에 존재하는 모노- 및 디-사카라이드는 글루코스 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 글루코사민 및 트레할로스를 포함한다. 이들 모든 모노- 및 디-사카라이드는 건강에 중요하다. 게다가 만노스는 박테리아가 요로와 방광 조직에 부착하는 것을 방해하는 것으로 알려져 있으며, 글루코사민은 골다공증 치료와 연골 재생에 유용한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 버섯의 균사체 바이오매스 단백질은 글루탐산 아스파르트산, 류신, 시스테인, 메티오닌, 트레오닌, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 리신 및 히스티딘이 풍부하다. 나아가 C. 코마투스는 γ-아미노부티르산을 함유한다. 따라서 균사체의 단백질은 11개 필수아미노산 중 10개의 필수 아미노산을 함유한다; 트레오닌, 발린, 이소류신, 류신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 그러므로 본 발명의 바이오매스는 필수 아미노산이 풍부한 단백질이 존재함으로 인해 주요한 식이 보충제가 된다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401의 바이오매스는 비타민을 함유한다: A, B1, B2, B3, C, 및 E; 그리고 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 바이오매스는 비타민을 함유한다: A, B1, B2, B3, B6, B7, C, 및 E. 따라서, 고용량의 주요 비타민을 함유하는 본 발명의 버섯 바이오매스 및 추출물은 비타민의 훌륭한 원천이 될 수 있고, 기능성 식품으로 사용될 수 있으며/있거나 식이 보충제로서 음식 또는 음료 제품에 첨가될 수 있다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사 바이오매스는 나아가 지방산인 펜타데카노산, 팔미트산, 팔미톨레산, 헵타데카노산, 스테아르산, 올레산, 리놀레(C18:2n6)산, α-리놀렌(C18:3n3)산, γ-리놀렌(C18:3n6)산, 아라키드산, 헤네이코사노산, 베헨산, 리그노세르산을 포함하는 지질을 힘유한다; 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 바이오매스는 지방산인 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2n6), 팔미트산(C16:0), 팔미톨레산(C16:1), 스테아르산(C18:0) 및 미리스트산을 함유한다. 상기 지방산은 버섯에서 글리세롤을 가진 에스테르 형태로 발견된다. 필수 불포화 지방산인 α-리놀렌산(C18:3n3)과 리놀레산(C18:2n6)이 존재하므로서 상기 버섯의 고영양 품질은 자명하다. 후자는 다가불포화지방산인 오메가-6 시리즈를 생기게 하는데, 이는 인지질에 포함되어 유동성, 유연성, 투과성과 막결합효소의 활성과 같은 세포막 성질에 영향을 미친다.
본 발명의 버섯 균사 바이오매스는 또한 미네랄을 대량원소 및 미량원소로 포함하는데, 상기에는 알루미늄, 구리, 철, 칼륨, 마그네슘, 망간, 인 실리콘, 소디움, 티타늄, 및 아연이 포함된다. 본 발명의 두 종류 버섯의 바이오매스 중 어떤 것이든지 그의 일일 용량은 철 및 다른 미네랄의 훌륭한 원천이 된다.
본원에서 본 발명의 코프리누스 코마투스 CBS 123401 균주 바이오매스와 균사체는 항산화제, 프리라디칼 소거제, 멜라닌(피부의 광-노화에 대해 보호해주며, 특히 햇빛 UV 조사로부터 피부를 보호하며, 또한 이온화 방사선에 의해 야기되는 기관 손상을 보호하고, 그 카르복실기와 페놀성 히드록시기를 통해 독성 금속 이온을 강력하게 격리시킬 수 있다), 렉틴(실시예 4.3 참조), 특히 락토스, 갈락토스 및 글루코사민 결합 렉틴을 포함하는 것으로 나타났는데, 이는 당단백질 및 폴리사카라이드의 당 부분 식별 분석에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 버섯 바이오매스는 나아가 프리비오틱 또는 기능성 식품 조성물에 사용될 수 있다. 버섯 기능성 식품은 상기 버섯 자실체 또는 균사체의 정제된 또는 부분적으로 정제된 또는 건조된 바이오매스로 규정되는데, 이들은 식품 보충제로서 정제 또는 캡슐의 형태로 사용되며, 치료적으로 사용될 가능성이 있다. 규칙적 섭취는 인간 인체의 면역 반응을 향상시킬 수 있으며, 그럼으로써 질병에 대해 저항력을 증가시키며, 어떤 경우에는 질병 상태를 호전시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 기능성 식품 활성 및 생리적 활성을 지닌 버섯 추출물을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 추출물은 코프리누스 코마투스 CBS 123401로부터 얻는다. 또 다른 구현예에서, 추출물은 트레멜라 메센테리카 CBS 123296으로부터 얻는다. 상기 추출물은 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사체 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사체 또는 자실체로부터 얻을 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 버섯 추출물은 순수한 심부 균사체 배양으로부터 얻는다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401 배양에서 얻은 추출물은 저분자량 수용성 β-글루칸 및/또는 갈락탄, 바람직하게는 중성 후코갈락탄이 풍부하며, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 배양에서 얻은 추출물은 선형 3,4 -갈락탄 및/또는 글루쿠로노자일로만난이 풍부하며, 항혈당 및 항당뇨 활성을 가지고 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 버섯 추출물에 존재하는 생물학적 활성은 NF-κB 경로 조절 활성, 항산화 활성, 프리라디칼 소거활성, 항-방사(radiation) 활성, 금속이온 소거활성, 인터페론성(interferogenous) 활성, 면역조절활성, 항혈당활성, 항당뇨활성, 저콜레스테롤 활성, 항알러지활성, 구충활성, 살충활성, 및/또는 항식물바이러스 활성이다.
여기에서 사용된 인터페론성 활성 또는 인터페론성 물질이란 용어는 포유동물 혈장 내의 인터페론의 농도를 증가시키는 활성 또는 물질은 말한다.
여기에서 사용된 면역조절 활성 또는 면역조절 물질이란 용어는, 이에 제한되지는 않으나, TH 세포, Tc 세포, B 세포, 마크로파아지, 수상돌기 세포 및 NK세포와 같은 면역 세포의 활성 및 다른 대체 보체 경로의 활성, 조혈 줄기세포의 자극, 분열촉진성(mitogenicity)을 말한다.
항혈당 활성 및 항혈당 물질이란 용어는 혈당 농도를 감소시키는 활성 또는 물질을 말하며, 항당뇨 활성 및 항당뇨 물질이란 용어는 혈액내 혈당 농도를 낮춤으로써 당뇨병을 치료하는 활성 또는 물질을 말한다.
구충활성은 목수개미, 불개미, 흰개미(coptoterms), 대만 흰개미(formosan termites) 및 일본 흰개미(reticulitermes termites)와 같은 집단 해충돌을 유인하고, 이들 해충을 감염시켜 살충하는 활성을 포함한다.
특히, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 코프리누스 코마투스 CBS 123401 에틸아세테이트 추출물은 NF-κB 경로 조절 활성(실시예 3), 항산화활성 및/또는 프리라디칼 소거활성(실시예 2)을 가지고 있다. 이러한 추출물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 암, 면역이상 질환, 패혈 쇽크, 이식거부, 방사선에 의한 손상, 허혈 후 재관류(reperfusion) 손상, 동맥경화증 및 신경퇴행성 질환과 같은 NF-κB-의존 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
트레멜라 메센테리카 CBS 123296 배양에서 얻은 추출물은 글루쿠로노자일로만난을 함유하고 있으며, 그래서 항당뇨활성을 가지고 있으며 나아가 면역조절활성을 가지고 있는데, 예를 들면 마크로파아지의 예비능(functional reserve) 증가와 인터페론성 활성을 야기하는 활성(실시예 8 참조) 및/또는 항식물바이러스 활성(실시예 9 참조)을 가지고 있다. 여기에서 사용된 예비능이라는 용어는 자발적 활성과 자극 활성(NBT 시험) 지수간의 차이를 말하는데, 즉 마크로파아지와 같은 식세포(phagocytotic cell)의 휴지기에서의 활성을 예를 들면 병원성 박테리아에 의해 활성화된 후의 그 활성과 비교한 차이를 말한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 추출물 또는 바이오매스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서는, 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296에서 얻은 바이오매스의 혼합물, 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296에서 얻은 추출물 혼합물이 조성물에 포함된다. 한 구현예에서는, 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 자실체 또는 균사체에서 얻은 기능성 식품 물질 및 생리적 활성물질이 풍부한 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 추출물이 조성물에 포함된다. 또다른 구현예에서, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 자실체에서 얻은 기능성 식품 물질 및 생리적 활성물질이 풍부한 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 추출물이 조성물에 포함된다.
다른 양태에서, 본 조성물은 상기에서 그리고 하기 실시예에서 언급된 모든 저분자량 수용성 β-글루칸, 수불용성 선형 3,4 β-글루칸, 글루쿠로노자일로만난, 또는 이들 탄수화물의 적어도 둘 이상의 조합으로부터 선택되는 탄수화물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이에 비추어보면 본 발명은, 또다른 한편으로, 본 발명의 조성물을 함유하는 천연 식품 보충제, 프리비오틱, 기능성식품, 음료 및 화장품을 제공한다. 본 발명은 나아가 본 발명의 조성물을 함유하는 애완동물식품, 구충, 항기생충 및 항식물바이러스 제품을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와, 상기에서 그리고 하기 실시예에서 언급된 모든 (a) 본 발명의 조성물; (b) 저분자량 수용성 β-글루칸; (c) 수불용성 선형 3,4 β-글루칸; (d) 글루쿠로노자일로만난; 또는 (b) 내지 (d)의 활성 성분 중 적어도 두 개의 조합에서 선택되는 활성성분을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명의 천연 식품 보충제, 프리비오틱 또는 기능성 제품 및 약학적 조성물은 (a) 혈당 농도를 감소하거나 당뇨를 치료하고; (b) 면역조절반응을 유도하며; 또는 (c) 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키거나 콜레스테롤 축적을 감소시키는데 사용된다.
본 발명의 천연 식이 보충제, 프리비오틱 또는 기능성 식품 제품, 또는 약학적 조성물은 단독으로 또는 항암제와 조합하여 암환자에게 암치료를 위한 면역 자극 반응을 유도하기 위하여 투여될 수 있다.
여기에서 "치료하는"이란 용어는 질병 또는 질환의 완전한 치료 또는 진행의 감소, 경감을 말하거나, 또는 질병 또는 질환에 의해 야기되거나 이와 관련된 증상을 감소시키는 것을 말한다.
본 발명에 따라 사용되는 약학적 조성물은 부형제와 보조제를 포함한 약학적으로 허용되는 하나 이상의 담체를 사용하는 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 약물의 제형 및 투여 기술은, 예를 들어, 레밍톤(Remington)의 약제학(Mack Publishing Co., Easton, PA, 최근판)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 적절한 경로, 예를 들어 경구투여, 근육주사, 정맥 주사, 피하내 주사, 뇌척수강내 주사, 복강내 주사를 포함하는 비경구 투여에 의한 전신 투여용 또는 외용 약물 전달에 의한 국소투여용으로 제형화된다.
본 발명의 방법에 사용되는 임의의 조성물의 경우, 치료적으로 유효한 양 또는 투여량은 처음에는 인비트로(in-vitro) 그리고 세포배양 분석에 의해 추정될 수 있다. 예를 들어 만족할 만한 농도 또는 역가를 얻기 위하여 동물 모델에서 투여량이 정해질 수 있다. 이러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 농학적 담체 및 본원에서 정의된 바와 같은 글루쿠로노자일로만난 또는 본 발명의 조성물에서 선택되는 활성 성분을 포함하는 농학적 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 농학적 조성물은 식물에서 식물 바이러스와 같은 식물 병원균에 대한 저항을 유도해내기 위해 사용된다.
한 구현예에서, 식물 바이러스는 감염된 식물에서 과민성 반응을 유도할 수 있는 식물 바이러스로, 예를 들면 토마토 모자이크 바이러스, 기타 고추녹반바이러스 및 오돈토글로썸 링스팟(odontoglossum ringspot) 바이러스와 같은 토바모바이러스(Tobamovirus) 담배 모자이크 바이러스가 포함된다. 한 구현예에서 바이러스는 담배 모자이크 바이러스이다.
본 발명의 농학적 조성물은 나아가 불활성 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 첨가제에는 증점제(thickener), 유동성 향상제(flow enhancer), 습윤제, 소포제, 버퍼, 활택제, 충진제, 드리프트(drift) 조절제, 데포지션(deposition) 향상제, 아주번트(adjuvant), 증발 지연제, 서리방지제(frost protecting agent), 곤충유인방향제, UV 보호제, 향수 등이 포함된다. 증점제는 수용성이거나 물에서 팽창할 수 있는 것으로, 예를 들면 잔탄의 폴리사카라이드(예를 들어, 음이온성 헤테로폴리사카라이드), 알리그네이트(alignate), 구아(guar) 또는 셀룰로즈; 합성 고분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피놀리돈, 폴리비닐 알코올, 발열성 또는 침전성 규산과 같은 팽창가능한 구조를 형성하는 실리케이트의 폴리카르복실레이트, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트(montmorillonite), 헥토나이트, 또는 아타풀지트(attapulgite); 또는 규산알루미늄의 유기 유도체 등이 있다. 서리방지제는, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 우레아 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 소포제는, 예를 들어 폴리디메틸실록산일 수 있다. 농학적 조성물은 또한 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 수용성 또는 지용성 제품에 적합한 계면활성 시스템을 포함할 수 있다.
본 발명은 나아가 생물학적 활성을 지닌 본 발명의 버섯 추출물을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 생물학적 활성은 NF-κB 경로 조절활성, 항산화활성, 프리 라디칼 소거 활성, 항방사능 활성, 금속이온 소거활성, 인터페론성, 면역조절, 항혈당, 항당뇨, 저콜레스테롤 활성, 항알러지 활성, 항기생충 활성, 또는 항식물바이러스활성이며, 상기 제조방법은 하기를 포함한다: 균류 코프리누스 코마투스 CBS 123401 또는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296을 영양배지에서 심부배양하여 재배하고, 상기 배양 브로스로부터 식용 균류에서 생긴 바이오매스를 분리하고, 상기 바이오매스를 건조하고 용매추출이 가능한 미세한 분말로 분쇄하고, 동결건조하는 것. 특히 트레멜라 메센테리카의 추출물, 바람직하게는 글루쿠로노자일로만난이 풍부한 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
나아가 폴리사카라이드, 모노사카라이드, 단백질, 필수 아미노산, 비타민, 필수 지방산 미네랄 및 미량원소가 풍부한 본 발명의 버섯에서 얻은 바이오매스를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 제조방법은 하기를 포함한다: 상기 버섯을 영양배지에서 심부배양하여 재배하고, 상기 배양 브로스로부터 식용 균류에서 생긴 바이오매스를 분리하고, 상기 바이오매스를 건조하고 미세한 분말로 분쇄하는 것.
나아가 본 발명이 제공하는 제조방법에서 트레멜라 메센테리카 , 트레멜라 후시포르미스( fuciformis ), 및 트레멜라 아우란티아(aurantia)에서 선택되는 트레멜라 속, 바람직하게는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296을 포함하는 버섯의 단일 세포 심부 배양을 영양배지에서 수행하는 제조방법이 특히 중요하다.
본원에서 상술한 방법의 목적 달성을 위하여 코프리누스 코마투스를 재배하는데 사용되는 영양배지는 하기 조성이어야 하는 것으로 나타났다 (g/L 증류수): 글루코스, 15; 펩톤, 3; 이스트 추출물, 5; KH2PO4, 0.8; K2HPO4, 0.2; MgSO4
Figure pct00001
7H2O, 0.5; 그리고 상술한 방법의 목적 달성을 위해 트레멜라 메센테리카를 재배하는데 사용된 영양배지는 하기의 조성이다(g/L 증류수): 수크로즈, 50; 이스트 추출물, 0.5; KCl, 1; Mg 아세테이트
Figure pct00002
4H2O, 1.0; NaH2PO4
Figure pct00003
H2O, 0.5; Na2HPO4
Figure pct00004
7H2O, 1.0.
본 발명은 하기 실시예로 설명되어지나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
물질 및 방법
1. 삼각플라스크 및 발효기에서 코프리누스 코마투스 균사체 바이오매스의 심부배양
도1은 발효기 또는 생물반응기(bioreactor) 기술을 이용한 코프리누스 코마투스 CBS 123401 및 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 심부배양된 균사체를 생산하는 일반적인 방법을 나타낸다.
버섯 심부배양 균사체(SCM, submerged culture mycelium) 생산의 일반적인 스킴은 5단계의 배양 성장 단계를 포함한다:
뮤지움 배양 (I) -> 중간체 배양 (II) -> 전(Pre)-접종 배양 (III) -> 접종 배양 (IV) -> 발효 배양 (V).
세 가지 형태의 배양 배지가 SCM생산에 사용된다: 표준 한천 배지(I 및 II 단계), 액체 표준 접종 배지(III 및 IV 단계), 및 발효 배양기(V 단계). 뮤지움 배양은 튜브내 한천 슬랜트에서 수행된다; 중간체 배양은 튜브 아가 슬랜트 또는 패트리 디쉬에 수행된다. 전 접종 및 접종 배양은 회전 교반기를 사용하여 삼각플라스크에서 수행된다. 발효배양은 발효기 Bioflo 2000(New Brunswick Scientific, USA)에서 수행되는데, 상기 발효기에는 교반, 온도, pH, 용존산소농도(pO2) 및 기포(foam)의 조절 및/또는 측정하는 장치가 장착되어있다.
첫 전접종배양에서, 패트리디쉬에서 얻은 1 내지 3주 동안 성장한 버섯 균사체를 250ml 삼각플라스크에 접종한다. 한천 플레이트 가장자리에서 성장한 균사체 5-6 피스(직경 5-7mm)를 삼각플라스크로 옮기고 플라스크 벽에서 작은 조각으로 잘라서 균사체의 성장점 수를 증가시켰다. 규정된 합성 배지 100ml로 채워진 250ml 삼각플라스크에 균사체를 접종시켰다. 균(fungal) 접종물은 하기 성분으로 이루어진 합성 배지에서 성장하였다(g/L 증류수): (g l-1): 글루코스, 15; 펩톤, 3.0; 이스트 추출물, 5.0; KH2PO4, 0.8; K2HPO4, 0.2; MgSO4 .7H2O, 0.5. 배지의 초기 pH는 6.0이었다. 인산염은 별도로 멸균되었다(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). 접종된 플라스크의 배양은 회전교반기를 이용하여 100rpm, 27℃에서 6-7일동안 수행된다. 배양 마지막에 배양물에서 1 ml 샘플을 취하여 현미경으로 재배 순도를 측정한다.
두 번째 접종 배양을 위하여, 처음의 전-접종 배양에서 얻은 바이오매스(펠렛)를 와링 실험실 블렌더(Waring, USA)를 사용하여 2 x 30초 동안 균질화하여 동일 배지 700 mL를 함유하는 2L플라스크에 접종하였다.
배양 5-7일 후, 균사체 바이오매스(펠렛)를 균질화하여, 10 L 워킹 볼륨을 가진 발효기(Bioflo 2000 10 L, New Brunswick Scientific, USA)에서, 상기에서 언급된 동일한 합성 배지를 사용하여 성장시키는 접종원으로 사용하였다. 배양의 초기 매개변수는 하기와 같았다: 온도 27℃; pH - 6.1; 교반 - 100 rpm, 에어레이션 - 0.2 v/v/min. 폴리프로필렌 글리콜 2000이 소포제로 사용되었고; 4% NaOH 및 4% HCl 이 pH를 조절하는데 사용되었다.
Figure pct00005
초기에는 배지의 pH는 조절되지 않았다. 하지만 5.2까지 감소한 다음엔 pH는 6.0 수준까지 자동적으로 일정하게 유지되어 균성장이 순조로웠다. 24시간 이후 교반속도를 200rpm까지 증가시켰으며, 48시간 후에는 300rpm까지 증가시켰다. 48시간 후 배지의 에어레이션 속도는 0.4까지 증가하였고, 그 후(72시간 이후) 0.5 v/v/min까지 증가하였다.
균사체 바이오매스의 최대 수율은 균 재배 7일째 얻은 젖은 바이오매스 93g/L 또는 건조 바이오매스의 경우 9.3g이다. 재배 조건은 표1에 나타나있다. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 균사체 바이오매스의 클램프 연결체를 지니고 액포가 있는 균사는 균배양 7일 후에 관찰할 수 있었다(나타내지 않음).
2. 코프리누스 코마투스 항산화활성의 평가
바이오매스 추정.
C. 코마투스 심부배양 8-11일 후 균사체 바이오매스를 여과하여 수득하고, 일정한 무게를 나타낼 때까지 50℃에서 건조하였다. 추출을 위해, 건조 균사체를 파우더 형태로 분쇄하였다.
C. 코마투스 바이오매스에서 항산화제 추출.
수확된 버섯 균사체를 50℃에서 건조하여 파우더로 분쇄하였다(4-10g). 버섯 균사체로부터 항산화 물질을 추출하기 위하여 세 개의 다른 용매(물 대용의 배양 액체, 에탄올 및 에틸아세테이트)가 극성이 증가하는 순으로 차례로 사용되었다. 담자균을 배양하는 동안 배양 액체에 항산화제가 존재한다고 보고된 바는 없지만, 이들 버섯들이 이들 화합물을 세포밖에서 축적할 수 있다고 가정하였다. 이에 따라 스크리닝된 버섯의 총 항산화활성을 정확하게 측정하기 위하여 균사체 바이오매스의 항산화 물질 추출에 물 대신 적절한 배양 액체를 사용하기로 하였다.
처음 단계에서 균사체를 3시간 동안 80℃(수조사용)에서 배양 액체(1g/10ml)로 추출하였다. 추출 후, 6000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 불용성 화합물을 분리하였고 왓트만 여과지 N4를 사용하여 여과하였다. 여과액을 증발시켰다. 계속하여 원심분리후 남은 잔류물을 회전 교반기를 이용하여 150rpm, 27℃에서 3시간 동안 에탄올(80%)로 추출하였다. 추출 후 용액은 원심분리, 여과하였고 추출물에서 유기 용매는 증발시켰다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401 배양 액체에서의 항산화제 추출 .
바이오매스 여과 후, 배양 성장배지의 pH는 96% 황산을 이용하여 2.0으로 감소시켰다. 균주당 1리터의 성장배지를 500ml 에틸아세테이트로 3번 분리하였고, 추출물-용매 혼합물을 유리화학분리기를 사용하여 0.5 리터 증류수로 한 번 세척하였다. 상기 추출물용매 혼합물을 레진(또는 파우더)가 형성될 때까지 용매 증발이 되도록 케미컬 후드에 방치하였는데 이는 실제의 조(정제되지 않은) 균추출물이며, 미리 무게가 측정된 4ml 플라스틱 튜브에 모았다. 모든 추출물은 99.9% 디메틸 설폭시드(DMSO)로 희석하여 최종 농도 50mg/ml되게 하였고, 에펜도르프 튜브로 옮겨, 사용할때까지 -70℃에 보관하였다.
항산화 활성 분석
β-카로틴 블리칭 방법. C. 코마투스 추출물의 항산화 활성은 β-카로틴 블리칭 방법에 따라 측정되었다. 1ml의 β-카로틴(Sigma) 용액(클로로포름 중 0.2 mg/ml), 0.02 ml 리놀레산(Sigma) 및 0.2 ml 트윈 80(Sigma)을 함유하는 시약혼합물을 질소 기류하에서 증발시켜 건조하였다. 50밀리리터의 산소화 증류수와 0.2ml의 상이한 농도(2-8 mg/ml)의 조 버섯 추출물(에탄올 또는 배양 액체)을 첨가하였다. 순수 메탄올 또는 물(0.2ml)이 대조군으로 사용되었고, 블랭크는 β-카로틴을 제외한 앞의 모든 화합물을 함유하고 있다. 이들 모든 혼합물을 쉐이크하여 리포좀 용액을 형성하도록 하였고 이어 50℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이들 리포좀 용액 분주물 (1 ml)의 470 nm에서의 흡광도를 20분 간격으로 분광광도계로 측정하였다. 부틸화 히드록시아니솔(BHA)(Sigma)(메탄올 중 2mg/ml)이 표준으로 사용되었다. β-카로틴의 블리치 속도(R)는 하기 식 (1)에 의해 계산되었다.
R=ln (a/b)/t 식 (1)
여기에서: ln - 자연로그, a - 0 시간에서의 흡광도, b - t 시간에서의 흡광도, 그리고 t - 20, 40, 60, 80, 100, 또는 120분의 배양 간격.
항산화활성(AOA)은 하기 식 (2)를 이용하여 대조군에 대한 억제 퍼센트로 계산되었다.
AOA= [(R대조군-R샘플)/R대조군] x 100 식 (2)
1,1- 디페닐 -2- 피크릴히드라질에 대한 소거 활성. C. 코마투스 추출물의 소거활성은 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼을 사용하여 측정되었다. 0.5ml의 0.1 mM DPPH 라디칼 메탄올 용액(Sigma) 분주물을, 상이한 농도의 (0.5 내지 9 mg/ml) 버섯 에탄올 추출물 또는 물추출물 1 ml가 들어 있는 테스트 튜브에 첨가하였다. 대조군으로는, 버섯 샘플 대신 메탄올 또는 물을 사용하였다. 반응 혼합물은 실온에서 볼텍스 혼합하였고 혼합 후 즉시 분광광도계를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH에 의한 프리 라디칼 억제는 하기와 같이 계산되었다: I (%) = (A블랭크- A샘플/ A블랭크) x 100, 여기에서 I 는 억제(%), A블랭크는 대조군 반응의 흡광도(시험화합물을 제외한 모든 시약을 함유하는), 그리고 A샘플은 시험 화합물의 흡광도이다. 50% 억제율(EC50)을 나타내는 추출물의 농도는 추출물 농도에 대한 라디칼 소거 활성 퍼센트 그래프로부터 계산되었다. 1 mg/ml의 부틸화 히드록시아니솔 메탄올용액이 표준으로 사용되었다. 각각의 값은 평균±표준편차로 나타낸다(n=3).
3. 심부배양된 코프리누스 코마투스 추출물의 생물학적 활성에 대한 연구
실험을 위한 세포 배양 준비. 암 세포를 배양하는 모든 실험은 멸균된 생화학 후드에서 수행되었다. 각 실험에 앞서, 실험에서 필요한 대로, 적정 세포수를 씨딩하기위해. 세포를 트립신으로 처리한 후 수집하고 카운트하였다.
MCF7 유방암 세포 배양은 통상 플라스크 바닥에 부착하여 성장한다. 실험에 사용하기 위해 이들 세포를 준비하기 위해서는, 일회용 파이펫을 사용하여 배지를 제거하였고 이어 1-2 ml의 트립신을 첨가하여 2-3분 동안 두었다. 트립신화 하는 동안, 세포는 37℃의 습한(humidified) 배양기에 배양하였다. 플라스크 바닥에서 세포들을 탈착시킨 후, 트립신화를 중단하기 위하여, 사용되는 플라스크의 크기에 따라 5- 10 ml의 신선한 배지를 첨가하였다. 수회의 파이펫팅을 통하여 세포를 잘 혼합하였고, 100㎕의 세포 현탁액을 100㎕의 0.4% 트리판 블루 용액으로 염색하였고, 잘 혼합한 후 하기 트리판 블루 배제 방법에 따라 혈구계(hemacytometer)를 사용하여 현미경하에서 세포 수를 세었다.
유효 세포수가 측정된 후, 세포 현탁액은 추가로 희석되었고, 각 실험의 조건에 따라 일정수의 세포가 씨딩되었다. 추가의 실험 작업을 위하여 일부 세포는 재-성장용으로 항상 보존되었고, 유효 세포주는 계속 유지되었다. 모든 세포주의 스톡 현탁액은 액체 질소하에서 보존되었고, 실험용 세포 배양은 2-3달에 한번씩 리프레쉬되었다.
세포 융해( Lysis ), 총 세포 융해물의 준비. 정제되지 않은 균류 추출물로의 처리에 반응한 특정 단백질의 세포내 농도를 측정하기 위하여, 세포가 수집될 때마다, 총 세포 융해실험이 수행되었다. 총 세포 융해의 정확한 실험절차는 하기에 나타나있다.
세포를 수집한 후, 3000rpm에서 원심분리를 통하여 4℃에서 5분 동안 차가운 인산완충식염수(PBS)로 3번 세척하였다. 최종 세포 양은 에펜도르프 튜브에 모았고 마지막 PBS 세척 후 남은 것은 버려, 각 튜브에는 세포 펠렛만이 남도록 하였다. 매번 하기 함량을 가진 융해 완충액을 새로 준비하여 사용하였다: 샘플의 수에 따라 500-1000㎕ 의 세포융해 시약, 프로테아제 억제제 칵테일, 및 최종 농도 1%의 포스파타제 억제제 칵테일 1 및 2, 및 0.3M 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF). 융해 완충액 50㎕가 첨가되었고 샘플은 얼음상에서 10분마다 격렬하게 볼텍싱하면서 30분간 배양되었고, 최종적으로 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리되었다. 총 세포 융해물인 상층액은 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겨져 -70℃에서 유지되었고, 반면 세포 펠렛은 폐기되었다.
H 2 O 2 -자극에 의한 PI κBα-반응속도론. 25ml 플라스틱 플라스크를 사용하여 RPMI 1640 배지 5ml에 MCF7 유방암세포 (2x105)를 씨딩하여 37℃로 유지하였다. 24시간 후, 혈청내 존재하는 성장인자에 의한 신호전달 캐스캐이드 활성화를 최소화하기 위하여, 0.5% FCS를 함유하는 배지로 상기 성장 배지를 대체하였다. MCF7 유방암 세포주에서의 H2O2 자극 후 억제단백질 카파 B(IkBα) 인산화를 측정하기 위하여, 24시간 후, 5, 10, 20, 30, 40, 및 60분 동안 50 또는 100 μM H2O2가 세포에 보충되었다.
대조군에는 pIκBα반응속도를 측정하는 H2O2 를 추가하지 않았다. 전술한 바와 같이 세포를 수집, 세척 및 융해하였다. 실험은 중복으로 수행되었다.
IKK 키나아제 분석. IκBα 키나제 복합체(IKK-β) 활성은 ELISA에 근거한 IKK-β-억제제 스크리닝 키트 (Calbiochem, USA) 분석법을 사용하여 측정되었는데, 이는 Ser32 및 Ser36 IKK-β 인산화 사이트를 함유하는 50-아미노산 GST-IκBα 융합 폴리펩티드 기질을 사용한다. 600 nM의 IKK-β 억제제 5-(p-플루오로페닐)-2-우레이도] 티오펜-3-카르복시미드(Fuct) 및 100 또는 200μg/ml의 코프리누스 코마투스 추출물 존재하에서, 100 ng의 GST-IκBα 기질과 5ng의 재조합 IKK-β를 배양하였다. 반응혼합물을 글루타치온으로 프리코팅된 웰에 첨가하여 GST-IκBα를 포획할 수 있도록 하였다. 인산화된 GST-IκBα 기질은 항-포스포-IκBα (Ser32/Ser36) 항체를 사용하여 측정하였고, 이어 HRP-접합하고 TMB 기질로 발색하였다. 흡광도는 450 nm에서 모니터링 되었으며, 이는 IKK-β 활성 수준과 직접적으로 관련이 되어있다.
덴시토미터 분석. 웨스턴 블랏으로 측정된 단백질 밴드의 덴시토미터를 이용한 정량 분석은 토탈랩(TotalLab) 소프트웨어를 사용하여 수행되었고, 단백질 밴드 부피의 배수로 나타낸다. 균 추출물의 효능에 반응한 pIκBα 농도에 대한 웨스턴 블랏의 덴시토미터를 이용한 정량 분석은 대조군 수치± SD의 평균치로 나타낸다.
4. 코프리누스 코마투스 함량 및 화학적 조성
코프리누스 코마투스 의 폴리사카라이드 조성 분석. 끓는 96% 에탄올 300ml로 CBS 123401 심부배양 바이오매스(10 g)를 2시간 동안 세척하였다. 불용성 잔류물(8.2 g, 82%)을 120℃ 오토클레이브에서 물 300ml로 1시간 동안 두 번 추출하였다. 추출물 소량을 건조하여 NMR로 분석하였고, 나머지는 투석하고, 100ml로 농축하여, 120000g에서 3시간 동안 초원심분리하였고, 용액은 탈색하기 위하여 브로민 몇 방울로 처리하였고(이 처리 후 일부 단백질이 침전되어 이를 원심분리로 제거하였다), 세파덱스 G-50을 이용한 겔 크로마토그래피로 분리하여 3개 분획(150, 220, 및 130 mg)을 얻었는데, 이에는 전분, β-글루칸 및 갈락탄이 다양한 비율로 함유되어 있다. 끓는 5% KOH로 3시간 동안 불용성 잔류물(5.8g)을 추출하여, 상기와 같이 용액을 투석하고 처리하여 단백질 β-글루칸 혼합물(300mg)을 얻었다.
메틸화 분석. 샘플(1-3mg)을 100℃에서 1ml의 건조 DMSO로 용해시켰다. 불용성 글루칸은 밤새 방치하였으나 완전히 용해되지는 않았다. 실온으로 식힌 후 NaOH 파우더 (~30 mg)를 첨가하여 30분간 교반한 후, 0.5 ml의 MeI를 첨가하고 30분간 계속 교반하고 과잉의 MeI는 기류로 제거하고 물(5mL)을 첨가하였다. 용해성 샘플을 얻기 위해, 생성물을 CH2Cl2로 추출, 물로 세척 후, 3 M TFA로 가수분해(120℃, 3시간), NaBD4로 환원, 아세틸화하여, GC-MS로 분석하였다. 불용성 화합물은 투석하여 회수하고 한번 더 메틸화하였다.
NMR 실험은 배리안(Varian) Z 구배 프로브를 가진 Varian INOVA 500 MHz 분광계를 이용하여 25℃에서 수행되었는데, 이는 표준 펄스 시퀸스 DQCOSY, TOCSY(120ms 믹싱 타임), NOESY (200 ms 믹싱 타입), HSQC 및 HMBC (100 ms long range transfer delay)를 사용하고 아세톤 내부 기준(2.225 ppm for 1H 및 31.5 ppm for 13C)을 가지고 있다. 데이터처리는 브루커 톱스핀(Bruker Topspin) 프로그램을 이용하였다.
모노사카라이드 분석. 샘플(1-5 mg)을 농축 HCl(0.2ml)로 40℃에서 1시간 동안 용해시키고, 표준 이노시톨(0.5mg)을 첨가하고, 물(0.4ml)로 상기 혼합물을 희석하고 2시간 동안 100℃로 가열하였다. 산은 기류로 제거하고, 당은 NaBH4 (10 mg, 30분)로 환원시키고, AcOH (0.5 ml)를 첨가하고, 샘플을 건조한 후 MeOH (1 ml)로 2번 건조하고, 0.5 ml의 Ac2O로 아세틸화, 건조한 후, GC로 분석하였다. 이러한 절차에 의하여 불용성 폴리머로부터 글루코스 및 글루코사민을 회수하는 것이 향상되었으나, 펜토즈 및 6-데옥시헥소스는 부분적으로 분해되었다. 이들을 정확하게 정량하기 위하여 가수분해는 3M TFA를 사용하여 수행하였다(120℃, 3 h).
메가자임 키트(Megazyme kit)를 이용한 β-글루칸 결정. 일반적인 기술: 모든 글루칸은 농축(37%; 10N) 염화수소산에 용해하고, 이어 1.3 N HCl로 100℃에서 2시간 동안 충분히 가수분해된다. 고순도 exo-1,3-β-글루카나제와 β-글루코시다아제 혼합물과 함께 배양하여 D-글루코스의 가수분해가 완결된다. 상기 공정은 제조자가 제시한 방법과 비교하여 10배로 규모를 축소하였다.
올리고사카라이드 내의 D- 글루코스 플러스 총 글루칸 (α- 글루칸 + β- 글루 칸), 수크로즈 및 프리 D- 글루코스의 측정. 농축 염화수소산(0.2ml)을 첨가한 후 30℃에서 45분간 가끔 볼텍스 교반하여 샘플(~10mg)에서 글루칸을 추출하였다. 산을 물로 5배 희석하여 100℃에서 2시간 동안 가수분해를 수행하였다. 산을 1ml의 2M KOH로 중성화한 후, 혼합물을 200mM 소디움아세테이트 완충액(pH 5.0)으로 10ml로 희석하고 1,500g에서 10분간 원심분리하여 제거하였다. 200mM 소디움아세테이트 완충용액 (pH 5.0)에 있는 exo-1,3-β-글루카나제(20 U/mL) 및 β-글루코시다제 (4 U/ml) 혼합물 0.1 ml 및 물 0.1ml를 0.01 mL의 상기 추출물에 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 60분간 배양하였다. 3.0 mL의 글루코스 옥시다제/퍼옥시다제 혼합물(GOPOD)을 첨가하고, 40℃에서 20분간 배양하였다. 블랭크 시약에 대하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
수크로즈 중의 글루코스 플러스 β- 글루칸 ( 피토글리코겐 및 전분) 및 프리 d-글루코스의 측정. 샘플(10 mg)을 0.2 ml의 2M KOH로 20분간 교반하면서 추출하였다. 0.8 mL의 1.2 M 소디움아세테이트 완충액(pH 3.8)을 첨가하고 이어 0.02 ml의 아밀로글루코시다아제(1630 U/ml) 플러스 인버타아제(invertase)를 첨가하고 40℃에서 30분간 간헐적으로 교반하면서 배양하였다. 샘플을 물로 희석하여 10ml로 하여 원심분리로 제거하고 0.01ml의 샘플을 0.01ml의 소디움아세테이트 완충액(200 mM, pH 5.0) 및 0.3 ml의 GOPOD 시약과 혼합하여 40℃에서 20분간 배양하여, 블랭크 시약에 대하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크 시약은 0.2 ml의 소디움 아세테이트 완충액(200 mM, pH 5.0) + 3.0 mL의 글루코스 옥시다아제/퍼옥시다아제 시약으로 이루어져 있다. 표준 D-글루코스는 0.1 mL의 표준 D-글루코스(1 mg/mL) + 0.1 mL의 소디움 아세테이트 완충액(200 mM, pH 5.0) + 3.0 mL 글루코스 옥시다아제/퍼옥시다아제시약으로 이루어져 있다.
코프리누스 코마투스 CBS 123401 심부배양 균사체로부터 렉틴 분획의 추출. 코프리누스 코마투스 균사체 바이오매스 젖은 중량 50g을, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 PBS (40 mM KH2PO4, 150 mM NaCl; pH 7.4)하에서 균질화하였다(1/6 w/v). 균질물을 4℃에서 2시간 동안 방치한 후 8000g에서 20분 동안 원심분리하였다. (NH4)SO4 80% 포화액을 사용하여 단백질 부분을 침전시켰다. 혼합물을 4℃에서 밤새 방치하였다. 12000g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 모아, PBS 최소량으로 용해하고, 증류수로 투석한 후 이어 PBS로 투석하였다. 얻어진 추출물로 단백질 정량, 렉틴 활성 및 당 특이성을 분석하였다.
렉틴의 적혈구 응집활성( hemagglutinating ) 분석. 렉틴의 적혈구 응집 활성을 측정하기 위하여 트립신화된 적혈구 현탁액이 사용되었다. 150 mM NaCl을 함유하는 150mM 트리-소디움 시트레이트 완충액에 토끼 혈액을 모았다. 적혈구 현탁액은 10배 분량의 세척 완충액(PBS)으로 적혈구를 3번 세척하여 새로 준비하였다. 다음으로, 4% 적혈구 현탁액의 트립신화는 37℃에서 1시간 동안 수행되었다; 이어, 적혈구를 세척하고 동일 완충액에 2% 현탁액으로 현탁하였다(v/v).
렉틴(적혈구 응집)활성 분석에서, 마이크로타이터 (50㎕) 플레이트에 순차적으로 2배씩 희석된 렉틴 용액을 50㎕의 PBS (pH 7.4) 중의 2% 토끼 적혈구 현탁핵과 20℃에서 혼합하였다. 결과는 1시간 후에 측정되었다. 적혈구 응집 역가는, 적혈구 응집을 보이는 최고 농도의 역수로 나타내는데, 이것을 일 적혈구 응집 단위(유니트)로 하였다. 특이적 활성도(specific activity)는 단백질 1mg당 적혈구 응집 유니트 수이다.
렉틴의 당 결합 특이성. 다양한 탄수화물에 의한 렉틴-유도 적혈구 응집의 억제에 대한 연구가 적혈구 응집 테스트와 유사한 방법으로 수행되었다. 당 샘플(0.3 M)이 인산완충식염수로 준비되었다. 희석액 전부를 동등한 부피(25 ㎕)의 렉틴 용액과 혼합하였다. 혼합물은 실온에서 30분간 방치하였고 그 후 50 ㎕의 2% 토끼 적혈구 현탁액과 혼합하였다. 당 결합 특이성은 렉틴 역가 4의 적혈구 응집 억제에 필요한 각 당의 최소 농도로 표현되었다. N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc); N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), D(+)갈락토스 (Gal); D(+)글루코스, D(+)락토스 (Lac); D(+)만노스, 자일로스, 셀로비오스, 및 둘시톨이 렉틴의 당 결합 특이성을 측정하는데 사용되었다.
5. 변종 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 특징; 삼각플라스크와 발효기에서의 단일 세포 바이오매스 심부배양 .
트레멜라 메센테리카의 배양 준비. 트레멜라 메센테리카 자실체가 이스라엘의 퀘르쿠스 종(Quercus sp) 사목에서 수집되었다. 서서히 습도가 감소하는 습윤 챔버 내의 멸균 패트리 디쉬에 놓인 새로운 자실체에서 담자포자 프린트를 얻었다. 패트리 디쉬내 몰트 한천 표면에 포자 멸균수 현탁액을 얇게 깔아서 담자포자 프린트로부터 홑홀씨 배양(monosporous culture)을 하였다. 발아되는 담자포자는 입체현미경으로 관찰하였고, 자라나는 이스트-유사 발아 세포의 신생 콜로니는 몰트한천(MA) 슬랜트로 옮겨졌다.
심부배양 첫 단계의 트레멜라 메센테리카 균주의 이스트 유사 반수 세포 접종물은 MA 슬랜트 상에 8일 배양된 세포의 멸균수 현탁액으로 준비되었다. 발효 배지는 심부배양으로 접종하였고, 폴리사카라이드 생산 공정은 220rpm, 27℃에서 냉장된 오비탈 쉐이커(orbital shaker)내에서 수행되었다.
폴리사카라이드 생산은, 원심분리로 균주 생산자 세포를 분리한 후 2배의 에틸알코올로 배양 브로스 상층액을 알코올 침전하여 수행되었다. 발효 종료시 상기 배양 브로스에서 얻은 정제되지 않은 침전물은 세포외 폴리사카라이드 및 균주 생산자의 세포를 모두 포함한다.
5.0 g/l FeSO4
Figure pct00006
7H2O; 0.625 g/l MnSO4
Figure pct00007
H2O; 0.435 g/l ZnSO4
Figure pct00008
7H2O 및 0.2 g/l CuSO4
Figure pct00009
5H2O로 구성된 미량 원소 혼합물(미량 영양소)(g/l)을 별도로 준비하여, 멸균 배양 배지에 첨가되었다. 최종 양이온 농도(mg/l): Fe++- 10.0; Mn++- 2.0; Zn++- 1.0; Cu++- 0.5를 얻기 위하여 미량 원소 혼합물을 배양 배지에 1:100로 희석첨가하였다.
미량 원소 하이드록사이드가 침전 형성하는 것을 방지하기 위하여, 오토클래브로 멸균하기에 앞서, 50% H2SO4를 사용하여 미량 원소 용액 pH를 1.6-1.8로 조정하였다.
조성이 정해진 배양배지를 펩톤 및 이스트 추출물(Pronadisa), 및 무기염(Sigma)을 사용하여 개발하였다.
6. 트레멜라 메센테리카 의 함량 및 화학 조성
트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 산성 글루쿠로노자일로만난의 결정. 발효배지에서의 재배 마지막에 배양 브로스는 탈이온수로 3배 희석되었다. 에펜도르프 5403 원심분리기를 사용하여 4℃, 5000rpm에서 10분간 원심분리함으로써 균주 생산자 세포를 분리하였다. 상층액을 에틸알코올 2배 부피와 혼합하여, 정제되지 않은 폴리사카라이드를 침전시켰다. 배양 브로스에서 침전된 폴리사카라이드 혼합물을 물에 용해시키고, 앰버라이트 IR-120 (H+ -form)으로 충진된 유리 컬럼 크로마토그래피에 통과시켰다. 침전이 더 이상 형성되지 않을 때까지 10% 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC) 수용액을 점진적으로 첨가함으로써, 산성 글루쿠로노자일로만난을 수집한 분획으로부터 침전시켜 얻었다. 불용성 CPC 복합물을 원심분리로 모아, 10% 염화나트륨으로 용해시켰다. 원심분리로 불용성 입자를 분리한 후, 산성 폴리사카라이드는 에탄올 2배 부피를 첨가하여 침전시켰다.
침전물을 물에 용해시킨 후 알코올 침전을 되풀이함으로써 정제된 폴리사카라이드를 얻었다.
7. 트레멜라 메센테리카 제제의 인터페론성 및 면역 조절 성질.
식세포의 기능적 활성 및 혈장 내 IFN 레벨 측정 쥐 섬유아세포 L-929 배양에서 테스트 바이러스(수포성 구내염 바이러스, 인디아나 균주-VSV)의 세포 변성(cytopathic) 영향에 대한 억제여부 측정으로 혈장 내 IFN 농도를 측정하였다. 96-페포 배양 패널의 페포를 100㎕의 세포 현탁액(1x106 cells/mL)으로 채우고, 5% CO2 대기, 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 그 후 100㎕의 두 배 희석된 테스트 샘플을 첨가하였다. 18시간 후, 앞서 적정된 희석물 VSV 50㎕를 첨가하였다. 패널을 동일한 조건에서 배양하였다. 결과는 현미경으로 측정하였다. 테스트 바이러스의 세포 변성 영향에 대하여 세포를 50% 보호하는 것인, 최종 IFN 희석액의 역수를 IFN 활성 단위로서 추정하였다. IFN 측정은 units/ml단위로 표현되었다.
혈장내 TNF의 생물학적 활성은 쥐 섬유아세포 L-929에 대한 세포 융해작용에 의해 평가되었다. 지시 세포 현탁액 (5x106cells/ml)를 100 ㎕씩 평면바닥 96-페포-배양 패널에 넣고, 5% CO2 대기, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어 배양 배지를 폐포에서 제거하고, 100㎕ 테스트 샘플 및 악티노마이신 D를 함유하는 배양 배지 100㎕ (최종 농도 1μg/ml)를 세포 단층(mono-layer)에 첨가하였다. 테스트 샘플없이 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다. 24시간 동안 배양한 후, 배양 배지는 제거하고, 실온에서 10분간 크리스탈 바이올렛 0.2% 용액으로 세포를 염색하고, 물로 3번 세척하고, 37℃에서 건조하였다.
멀티-스캔 DYNARECH (Swiss)를 사용하여 550nm 파장에서 결과를 측정하였다.
TNF활성은 세포독성 지수(CI)로 측정되었는데, 이는 하기 공식을 사용하여 계산하였다: CI = (K-D)/K x100%, 여기에서 K는 대조군 페포에서의 광학밀도이고, D는 테스트 페포에서의 광학밀도이다.
벡토르(VECTOR)(Ukraine)에서 만든 재조합 TNF 제제 "리프나멘(Rifnamen)"이 TNF 시험에 사용되었다.
식세포 시스템의 기능적 활성은 세포화학적 방법에 의한 니트로 블루 테트라졸리움 회복 (NBT테스트)을 통해 조사되었다.
8. 트레멜라 추출물 및 식물 바이러스에 대한 식물 저항
바이러스: 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 균주 U1;
식물: 담배 (Nicotiana tabacum L.) 변종 임뮨 580 및 다투라 스트라모니움( Datura stramonium L.)를 자연 채광, 습도 및 온도 하에서 온실에서 재배하였다. 4-6개 잎사귀 단계의 식물이 실험에 사용되었다.
트레멜라 메센테리카 배양액에서 추출된 폴리사카라이드를, 다소 변형된 코바렌코(Kovalenko) 방법을 사용한 본 연구에 사용하였다. 산 글루쿠로노자일로만난 (GXM)을 중성 폴리사카라이드에서 분리하기 위하여, 수용액 유래의 그 침전물을 0.05 M CaCl2 존재하에서 아세톤 1:1 용액에 적용하였다. 피리디늄-아세테이트 완충액 pH 4.5 (1 L 물 중 4 mL 피리딘 및 10 mL AcOH)을 사용하여 세파덱스 G-50 (2.5x80 cm)로 가스 크로마토그래피를 수행하였고, 용출액은 굴절률 검출기(refractive index detector)로 모니터링 되었다.
인비트로 실험에서, 총 제제, 중성 폴리사카라이드 제제 및 순수 GXM 수용액은 10, 100, 500, 및 1000 μg/mL농도로 TMV 현탁액(10 μg/mL)에 첨가되었다. 30분간 배양한 뒤, 다투라 잎의 왼쪽 절반을 이 혼합물로 접종하였다. 상기 잎의 오른쪽 절반은 같은 농도로 폴리사카라이드없이 TMV로 접종하였다. 바이러스 감염 억제의 정도, 또는 VIR은, 잎 절반의 실험군 및 절반의 대조군에서의 국소 손상 수에 따라 (퍼센트로) 다음 식을 이용하여 카운트하였다: I = ((K-D)/K)100%, 여기에서 I는 바이러스 억제 정도 또는 AVR 레벨(%)이고; K는 대조군에서의 국소 손상수(크기)이고; D는 실험군에서의 국소 손상수(크기)이다.
GXM의 유도 성질에 대한 연구는 담배 및 다투라 식물에서 수행되었다. 이 목적을 위하여, 1000-2500 μg/mL 농도의 폴리사카라이드 수소용액을 잎의 왼쪽 절반 세포간극에 1ml (인슐린) 주사기로 주입하였다. 잎의 양 절반을 TMV(1-5 μg/mL)로 접종하였다. AVR정도는 상기에서 언급된 공식에 의해 정해졌다.
식물 저항에 대한 GXM 유도 메카니즘을 연구할 때, RNA 폴리머라아제를 블락함으로써 mRNA의 DNA 의존 합성을 억제하는 악티노마이신 D(AMD)를 사용하였다. 10 및 20 μg/mL 농도의 AMD 용액 및 1 mg/ml의 람노리피드(rhamnolipide, RL) 용액을 동시에 또는 GXM 후 특정 기간에 표피하에 주입하였다. 국소 손상의 수 및 크기에서의 차이는 독립표본 t-검정(student t-test) 기준에 의해 평가되었다; 얻어진 α-수치는 하기 기호로 표에 나타나있다: +++p≤.01%; ++0.1≤p≤1%; + 1%≤p≤5%; 0p>5%
실시예 1 변종 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 특징
순수 배지의 영양생식 균사체. 흰색의 면화 균사 콜로니는 종종 성숙된 다발(tufts)(균사체 집단)로 성장한다. 통상 균사 매트가 가장자리를 따라 비대칭적 모양으로 형성되어 있다. 클램프 연결체, 문합(anastomose) 및 털 모양의 크리스탈이 종종 균사(Hypha)에 존재한다.
필루스 ( Pileus ) 3-15 cm; 신생일 땐 타원형 내지 위로 올려진 가장자리를 가진 벨 모양의 둥근 원통형으로 퍼지고; 시간이 지날수록 검은 "잉크"색으로 변하고; 건조해지고; 중앙이 갈색을 띤 희끄무레한 것으로 변하고; 많은 수가 덥수룩해지고(shaggy scales); 성숙되면 가장자리에 줄을 만든다. 라멜라(Lamellae)는 줄기가 없다; 희고, 핑크빛이 되고, 그 후 검은색이 되고; 검은 잉크로 변하고; 매우 많아진다. 스타이 프(Stipe ) 5-20 cm 길이; 1-2 cm 두께; 빈번하게 끝이 점점 가늘어지고; 부드럽고; 희고; 캡에서 쉽게 분리되고; 안에 실 같은 섬유 가닥이 달려있고, 속이 빔. 육질 ( Context ) 전부 희고, 부드러움. 검은 포자( spore ) 프린트. 담자포자 9-13 x 7-9 μm; 타원형; 부드러움; 중심 또는 약간 중심 쪽에 구멍; 담자기 포자 5-8 거짓축사(pseudoparaphyse)로 둘러싸진, 4-포자, 28-43 x 10-13 μm. 측시스티디아( Pleurocystidia ) 존재하지 않음. 체일로시스티디아 ( Cheilocystidia ) 다양한 모양; 60 x 40 μm 이하. 표피( Pileipellis ) 7-30μm 폭의 실린더형 성분으로 만들어짐. 단지 유사 클램프만 존재한다.
서식지( Habitat ). 종종, 도심지의 녹지같은 예상 밖의 장소에서 무리를 지어 자란다. 초지와 목초지에 널리 존재한다.
실시예 2. 코프리누스 코마투스 항산화활성 평가
2.1 심부배양된 건조 버섯 균사체에서 얻은 추출물 및 바이오매스의 수득률
스크리닝 프로그램 기간 동안 고등 담자균류 버섯의 심부배양을 위해 선택된 영양 배지는 모든 선택된 종의 성장을 보장하였다. 동일 배양조건에서 코프리누스 코마투스 CBS 123401 버섯을 8-11일 동안 경작하여 얻은 균사 바이오매스의 수득률은 6.8 g/l이다 (표 1).
버섯균사체를 건조하고 분쇄하여 얻은 용해성 화합물 추출은 (물 대신) 배양액 및 에탄올을 사용하여 이루어졌다. 다른 균주에서 얻은 추출물들의 수득률은 서로 달랐다. 게다가, 버섯 바이오매스에서 얻는 추출물의 수율은 사용된 용매에 상당히 좌우되었다. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 바이오매스 배양액으로 추출하면 수율이 23.2% 이었다.
에탄올 추출은 덜 효율적이었으며, 연구하는 균주에 약한 가용화제를 사용하면 수율이 단지 8.5%이었다.
2.2 심부배양된 코프리누스 코마투스 CBS 123401 버섯 균사체의 물(배양액) 및 에탄올 추출물의 항산화활성
코프리누스 코마투스 CBS 123401에서 얻은 물(배양액) 추출물의 항산화 활성(AOA) 데이터는 표2에 나타나 있다. C. 코마투스 CBS 123401 물 추출물을 2 mg/mL 농도로 사용하였을 때 매우 높은 AOA를 나타내었다. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 균사체 바이오매스의 물 추출물은 다소 낮은 AOA를 보였다. 시약 혼합물 내 추출물의 농도를 증가시켜도 이들 모든 추출물의 억제 수치가 실질적으로 변하지는 않았다.
버섯 바이오매스 에탄올 추출물의 AOA는 대체로 고등 담자균류 종에 좌우될 뿐만 아니라, 반응 혼합물 내의 추출물 농도 변화에도 좌우된다. 에탄올 추출물의 농도를 2 mg/ml에서 4-8 mg/ml로 증가시켰을 때, 코프리누스 코마투스 CBS 123401 추출물의 AOA는 74.4에서 86.4%로 증가하였다(표 3)
Figure pct00010
Figure pct00011
2.3 심부배양 버섯 균사체의 물(배양액) 및 에탄올 추출물의 프리 라디칼 소거 활성
프리 라디칼 소거는 항산화제가 지질 산화를 억제하는 알려진 메카니즘의 하나이다. 1,1-디페닐 피크릴히드라질(DPPH) 프리 라디칼을 소거하는 방법이 항산화활성을 측정하는데 사용되었다. DPPH는 520nm에서 특징적 흡광도를 갖는 안정된 프리라디칼 생성 물질인데, 추출물의 라디칼 소거효과를 연구하는데 사용되었다. 흡광도의 감소로 라디칼 소거 정도를 측정한다.
물 및 에탄올 추출물의 가장 높은 프리 라디칼 소거 활성은 둘 다 0.5mg/ml 의 동일 농도에서 측정되었는데(각각 27.0% 및 22.0%), 이 수치는 표준물질의 경우보다 많이 낮은 것이었다(92.0%) (표 4 및 5).
샘플 농도를 0.5에서 9 mg/ml로 증가시켰을 때 코프리누스 코마투스 CBS 123401 에탄올 추출물의 프리 라디칼 소거 능력은 각각 22에서 1로 감소되었다 (표 5).
Figure pct00012
표5 및 6에 나타나 있는 DPPH소거 효과에 대한 유효 농도 수치를 보면, 물 및 에탄올 추출물의 EC50은 모두 약 1 mg/mL인 것으로 나타났다.
Figure pct00013
실시예 3. 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 심부배양 균사체의 물(배양액) 및 에틸아세테이트 추출물의 생물학적 활성에 대한 연구
3.1 MCF7 세포에서 H 2 O 2 에 의한 NF -κB 자극 후의 pI κBα 농도
약용 버섯에 대한 수많은 연구결과, 이들은 식이 보충제 및 면역 증강제로서 뿐만 아니라 다양한 세포반응의 조절자원으로도 독자적 잠재력을 지닌 것으로 알려졌다. 대다수의 화합요법이 성공적인 것으로 보이지만, 세포적응으로 인해 종양 세포가 많은 화학요법 약제에 내성을 지니게 되었다. 이러한 세포내 화학-내성 인자 중 하나가 핵내 인자 카파 B(NF-κB)인데, 이는 종양 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다. NF-κB의 활성은 IκBα 단백질과의 상호작용에 의해 엄격히 조절된다. NF-κB 단백질과 마찬가지로, 각각의 NF-κB 복합체에 다른 친화도를 가진 IκBα 단백질이 다수 있는데, 조직-특이적 방식으로 다소 다르게 조절되고 발현된다.
세포외 자극은 IκBα 키나아제 (IKK) 활성화를 이끌어 IκBα에 있는 2개의 보존 세린(IκBα의 Ser32 및 Ser36 )을 인산화시킨다. 이러한 인산화로 IκBα가 프로테아좀 분해용으로 표식되어, NF-κB가 핵전이되고 활성화되게 된다. 이것이 NF-κB 활성화의 전통적인 경로인 것으로 여겨진다. NF-κB 활성화의 몇몇 다른 경로도 보고되었다. NF-κB 활성화에 대한 최근 연구에 의하면, 과산화수소수가 사용되는데 이는 잘 알려진 NF-κB 활성화제이고 강력한 산화제이다. 예비 데이터에 의하면, 100 μM의 H2O2로 10분간 처리했을 때 pIκBα가 가장 높은 레벨로 되었으며, 알려진 항산화제이자 항암제인 커쿠민(curcumin) 10 μM로 처리하였을 때 pIκBα 레벨이 상당히 억제되었다. 시간을 증가시키면서 50 및 100 μM H2O2로 MCF7 세포를 자극하였다. H2O2가 전혀 처리되지 않은 DMSO(디메틸 설폭사이드)-처리된 대조군에 비해, 50μM H2O2로 20분 및 40분 동안 자극하였을 때 pIκBα가 높은 레벨을 보여주었다. 100μM H2O2로 10분간 자극했을 때 pIκBα가 가장 높은 레벨을 보여주었다(나타내지 않음). 이에 따라, pIκBα 레벨에 대한 추출물의 잠재적 효능을 알아내는 가장 좋은 조건은 H2O2 자극을 10분간 선택된 균 추출물에 하는 것으로 확립되었다.
시간을 증가시키면서 50 및 100μM H2O2로 MCF7 세포를 자극하였다. H2O2가 전혀 처리되지 않은 DMSO(디메틸 설폭사이드)-처리된 대조군에 비해, 100μM의 H2O2로 10분 간격으로 자극하였을 때 pIκBα레벨이 가장 높았다. 데이터는 두 개의 유사한 실험 중 하나의 결과를 나타내었다.
3.2 코프리누스 코마투스 CBS 123401 정제되지 않은 추출물의 세포 생존능력에 대한 영향
현 실험에서 코프리누스 코마투스 CBS 123401가 연구되었다. C. 코마투스 배양액(물)(E1) 및 에틸아세테이트(E2)의 정제되지 않은 추출물에 있어서 MCF7 세포주의 세포 생존능력에 작용하는 이들의 효능을 시험하였고, IC50이 계산되었다. 추출물 E2의 IC50이 32 μg/ml로 가장 강력하였고, 다음으로 E1은 IC50이 76 μg/ml인 것으로 나타났다(표 6). 이러한 결과는 C. 코마투스 CBS 123401 추출물의 활성 부분이 E2 추출물에 농축되어 있다는 것을 의미한다. E1 추출물은 세포 생존 능력에 중대한 영향을 미치는 것은 아니며, 하지만 본 분석은 E2 추출물이 E1보다 높은 성장 억제 활성을 보여준다는 것을 나타내며, 이는 E2가 항암 활성이 있을 수 있는 생리활성 물질을 가졌을 것이라는 것을 입증하는 것이다.
Figure pct00014
코프리누스 코마투스 추출물의 농도를 증가시키면서 세포를 처리하였다. 48시간 후, 세포를 수집하여, 0.4% 트립판 블루 용액(1:1)으로 염색하고, 혈구계측기로 측정하였다. 세포 생존력의 억제율은 DMSO 처리된 대조군과 비교하여 계산되었다. 수치(μg/ml)는 중복 실험의 평균 IC50 ± 표준편차로 나타내었다.
3.3 코프리누스 코마투스 CBS 123401 정제되지 않은 추출물의 IκBα 인산화에 대한 효능
NF -κB 경로는 항암제 개발에 있어 가장 유망한 타겟의 하나로 대두되었다. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 추출물이 NF-κB 활성화 경로를 조절하는 것으로 발견되었다. C. 코마투스의 두 개의 추출물 E1 및 E2의 pIκBα 농도 수준에 대한 효과를 알기 위하여, MCF7 세포를 상기에서 언급한 바와 같이 100μM H2O2로 10분 동안 자극하였다. 예비 데이터에는 100 μM H2O2로 10분 동안 자극했을 때 pIκBα가 가장 높은 레벨인 것으로 나타났다(데이터 나타내지 않음). H2O2 10분 세포 자극시 IκBα 인산화에 미치는 C. 코마투스 추출물의 효능을 테스트하였다. 두 추출물 모두 IκBα 인산화에 용량 의존적 방식으로 의미있게 영향을 미치는 결과가 나타났다. 사용된 두 농도(100 및 200 μg/mL)에서, 유기 추출물 E2가 IκBα 인산화에 있어 가장 유효한 억제제인 것으로 나타났다. 도2에 나타난 바와 같이, E2 추출물은 200 μg/mL 농도에서 IκBα 인산화를 거의 모두 억제하였고, 100 μg/mL 농도에서 인-IκBα 농도를 부분적으로 억제하였다. 추출물의 효능을 커큐민의 효능과 비교하였는데, 이는 또한 높은 인-IκBα 억제효능이 입증되었다(도2)
이들 결과와는 반대로, 100 및 200 μg/ml 농도의 E1추출물은 IκBα인산화를 단지 부분적으로만 억제하였다(도3).
E2추출물이 E1추출물보다 보다 더 강력한 억제제라는 사실은, 지질 용해성 물질이 NF-κB 경로에서 상당히 강력한 억제제라는 것을 나타낸다.
3.4 코프리누스 코마투스 E1 및 E2 추출물의 IKK 활성에 대한 효과
NF-κB의 주요 활성제는 IκBα 키나아제 복합체(IKK)이다. 이 복합체는 두 개의 촉매 서브유닛인 IKK-α 및 IKK-β, 그리고 조절 서브유닛인 IKK-c(또한, NEMO로 알려져 있음)를 함유한다. NF-κB 경로는 박테리아 또는 바이러스 감염에 의해 촉발될 뿐만 아니라, 향(pro) 염증성 시토카인 및 케모카인(예를 들어, 종양 괴사 인자 a (TNF-α), 리포폴리사카리드(LPS), 인터루킨 (IL-1, IL-6) 등)이기도 한데, 이들은 모두 IκBα N 말단 부근의 두 개의 특이적 세린의 IKK-β에 의한 IKK 복합체 인산화를 야기시켜, IκBα를 표적으로 하여 유비퀴틴화하고 프로테오좀에 의해 분해되게 한다. NF-κB의 활성화로 이어지는 모든 신호는 세린-특이적 IKK를 함유하는 고분자량 복합체의 활성화로 집중된다. IKK 복합체의 활성화로 인해 IκBα의 N 말단의 두 개의 특이적 세린이 IKK-β에 의해 인산화가 되는데, 이에 IκBα가 유비퀴틴화 및 프로테오좀에 의해 분해 되도록 표적화 된다.
상기에서 언급된 결과에 의하면, 활성 추출물의 NF-κB 억제효과는 IκBα 인산화의 업스트림인 NF-κB 경로의 조절에 기인한 것으로 추정된다. IKK 복합체는 IκBα를 세린 32 및 36 위치에서 인산화시켜, 유비퀴틴화를 유도하여 26S 프로테오좀에 의해 IκBα가 분해되게 한다. E1 및 E2가 IKK 활성에 영향을 미치는지 알기 위하여, ELISA-기초한 IKK활성 검사방법을 사용하였다. E1 및 E2 추출물의 IKK 활성에 대한 효능은 도4에 나타나있다. 얻어진 데이터에 의하면 처리되지 않은 대조군에 비해 E2 추출물만이 IKK 복합체의 활성을 억제하였다. 게다가, E2는 양성대조군 5-(p-플루오로페닐)-2-우레이도]티오펜-3 카르복사미드 (Fuct) 및 MO04- 마라 스미우스 오레아데스 ( Marasmius oreades ) 정제되지 않은 에틸아세테이트 추출물과 비교하여 강한 효과를 나타내었다. .
실시예 4. 코프리누스 코마투스 CBS 123401 심부배양 균사체의 화학적 조성 및 함량
코프리누스 코마투스 심부배양 균사체의 화학적 조성은 당해 기술 분야에 자명한 통상적인 방법으로 수립되었으며 도7 및 도8에 나타나 있다.
4.1 화학적 함량
표 7에 기재되어 있다.
Figure pct00015
[표 7] 계속
Figure pct00016
[표 7] 계속
Figure pct00017

코프리누스 코마투스 CBS 123401 균사체는 17개의 자유 아미노산을 함유하고 있고, 이중 10개는 필수 아미노산이다(*): γ-아미노부티르산*, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 글리신, 히스티딘*, 이소류신*, 류신*, 리신*, 메티오닌*, 페닐알라닌*, 세린, 트레오닌*, 트립토판*, 티로신 및 발린*.
Figure pct00018
4.2 코프리누스 코마투스 CBS 123401 심부배양 바이오매스의 폴리사카라이드 조성분석.
세척된 세포를 오토클래이브 120℃에서 1시간동안 뜨거운 물로 추출하였다; 침전물은 원심분리로 제거되었다. 용액 소량을 건조하여 NMR로 분석하였다. 스펙트럼(도 5)에는 저분자량 성분에 강한 선명한 시그널이 있고 전형적인 단백질-폴리사카라이드 백그라운드가 나타나있다. 이 결과물의 2D 스펙트럼을 기록하였고, 저분자량 성분은 트레할로스(α-Glc-1-1-α-Glc, 표고버섯(shiitake) (Lentinus edodes), 잎새버섯(maitake) (Grifola fondosa), 나메코(nameko) (Pholiota nameko), 및 목이버섯(Judas's ear) (Auricularia auricula - judae)과 같은 버섯의 전형적인 구성성분, 건조중량 형태에서 1% 내지 17%의 트레할로스를 함유할 수 있다) 및 만니톨이 대략 1:1 몰비로 있는 것으로 확인되었다. 만니톨 함량은 GC 분석으로 측정되었다: 1% w/w의 이노시톨(내부 표준)을 신선한 세포에 첨가하였고, 혼합물은 아세틱 안하이드라이드-피리딘을 100℃에서 1시간 동안 반응시켜 아세틸화하였다. GC 분석에서 세포의 만니톨 함량은 3 중량%이고, 따라서 트레할로스 함량은 6%인 것이 나타났다(트레할로스는 만니톨의 2배 분자량을 가진다).
물 추출 후 잔류물을 5% NaOH로 처리하고(100℃, 3 h);침전물은 원심분리로 제거하였고; 용액은 투석하고 건조하였고; 수득률은 400mg 이었고; 단백질 함량은 30%이고 탄수화물 함량은 55%이었다.
전세포, 추출물, 추출 후 잔류물에 대한 모노사카라이드분석을 수행하였다; 결과는 표9 및 도6에 나타나 있다. 세포 및 고형 잔류물은 40℃에서 1시간동안 농축 HCl에 용해시키고 그 후 물로 희석하여 최종 산농도가 2M이 되도록 하였다. 다른 샘플은 직접 2M HCl에 용해하였다. 100℃에서 2시간동안 가수분해를 수행하고, 생성물을 건조하고, 당은 알디톨 아세테이트로 전환시켰고(NaBH4 환원 및 Ac2O로 아세틸화), GC로 분석하였다. 추출 후 고형 잔류물의 글루코스 함량이 증가하였는데, 이는 불용성 β-글루칸이 잔류물에 남아있기 때문이고, 용해성 성분은 추출에 의해 점진적으로 제거되었기 때문이다.
Figure pct00019
물추출물에서 투석에 의해 저분자량 성분을 제거하고 얻은 물질은 25% 탄수화물과 40% 단백질을 함유하는데 이는 비색 테스트(폴리사카라이드에는 페놀-황산, 그리고 단백질에는 라우리 법)에 의해 결정되었다. 폴리사카라이드는 NMR 스펙트럼상으로 전분, β-글루칸 및 후코갈락탄인 것으로 확인되었다. 전분 아밀로스(세포 유래 2% w/w)는 CaCl2 침전을 이용하여 순수한 형태로 분리하였다. 갈락탄 함량은 모노사카라이드 분석을 통해 3%인 것으로 측정되었다. 전 추출물 및 세포의 후코스 함량은 정량하기에는 너무 낮았다. 갈락탄의 구조는 NMR 및 메틸화에 의해 결정되었고, 하기와 같이 나타내어진다:
Figure pct00020
물 및 NaOH 추출물에서 얻은 폴리사카라이드는 세파덱스 G-50의 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 부분적으로 분리되었다(도7). 전분이 처음으로 용출되어 1H NMR 스펙트럼으로 식별되었다. 갈락탄 역시 공극부피와 가깝게 용출되었는데, 이는 보고된 분자량과 일치하는데, 10,000Da로 측정되었다. 세파덱스 G-50의 공극부피(배제 부피)는 덱스트란에 대해 10,000Da이었다. 갈락탄은 타원형에 가깝게 용출되는데, 그러나 약간 남아있어(따라서 분자량은 배제 질량보다 크지 않다), 10,000 Da의 최대 분자량을 가졌다. 또한 더 낮은 질량 분획(mass fraction)에서도 발견되었다.
용해성 β-글루칸은 뚜렷하게 우세한 질량은 없고 10,000에서 <1000의 광범위한 분자량을 가진다. 크로마토그램(도7)에서 볼 수 있듯이 β-글루칸은 공극부피에서 염까지 매우 광범위한 피크로 나타나, 세파덱스 G-50의 전 분획범위(500-10,000 Da)에 퍼져 있었다. 순수 β-글루칸을 얻는 것이 가능하지 않았다; 전분, 갈락탄 및 단백질이 다소 함유되어 있었다. 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하면 단백질 일부를 제거할 수 있기 때문에 스펙트럼의 질을 향상시킬 수 있으나, 폴리사카라이드가 완전히 분리되지는 않았다. 저분자량의 글루칸 때문에 투석 및 겔 크로마토그래피과정에서 글루칸이 다소 손실되었다.
β-갈락탄의 메틸화 분석을 통해 말단 3-, 4-, 6-, 및 3,6-치환된 글루코스 잔기가 2:1:0.3:3:1 비율로 존재한다는 것이 나타냈다. 메틸화분석을 통해, 주가지(main chain)의 글루코스 3개 간격으로 곁사슬이 부착되어 있으며 곁사슬의 평균길이는 3개 당(t-Glc:6-Glc ~ 1:2, 3-Glc:3,6-Glc ~2:1)이다. 4- 및 4,6-치환 Glc는 전분으로부터 유래되었다. 2- 및 2,6-치환 Gal 피크는 갈락탄에 속하였다.
NMR 분석은 β-글루칸 부분이 가노데마(Ganoderma) 글루칸과 유사하다는 것을 나타낸다(도8 및 표10). 구조식은 하기에 나타나있다:
Figure pct00021
여기에서 m은 1 내지 약 10 사이의 정수이고, n은 약 3인 정수이다.
전분 및 불용성 β-글루칸 함량의 정량화에 있어서, 메가자임 분석법 "버섯 및 베타-글루칸"이 사용되었다. 제조자의 사용설명서에 따라 측정하였다. 세포, 물 추출된 세포, 물 및 NaOH 추출세포, 물추출물 및 NaOH 추출물 샘플이 분석되었다. 결과는 표11에 나타나있다. 메가자임 분석법 "버섯 및 베타-글루칸"은, 가수분해 및 효소적 처리에 의해 유리된 총 글루코스의 측정 및 전분 함량의 독립된 측정에 근거하고 있다. β-글루칸 함량은 처음 두 개의 수치의 차이로 계산되었다. β-글루칸을 직접 측정하지는 않았다.
Figure pct00022
Figure pct00023
결론
본 연구결과, 코프리누스 코마투스는 β-1-3-글루코스 주가지에 1,6-연결 곁사슬을 가진 β-글루칸을 생산한다는 것을 알 수 있으며, 이는 가모데르마 루시덤 버섯(Ganoderma lucidum mushroom)에서 추출된 β-글루칸과 유사하다. C. 코마투스는 또한 후코갈락탄, 전분, 트레할로스 및 만니톨을 생산하며; 이들 성분 모두는 이전에 버섯에서 발견되었다. 용해성 β-글루칸은 저분자량을 가지고 있으며, 온수에 쉽게 추출된다.
4.3 렉틴 함량.
시험된 Corpinus 코마투스 CBS 123401 바이오매스는 적혈구응집활성을 가지고 있다(표12). 매우 높은 렉틴 적혈구응집 역가(18585)가 C. 코마투스에서 얻은 바이오매스 추출물에서 나타났다. C. 코마투스의 특이적 적혈구응집활성은 62700 Umg-1에 달한다.
Figure pct00024
데이터에 의하면, GalNAc 후 락토스 및 갈락토스가 테스트된 버섯 렉틴의 가장 광범위한 적혈구응집활성 억제제이다. 락토스는 균류(fungi)의 가장 강력한 억제제이다. 락토스는 0.78mM 농도에서 C. 코마투스의 렉틴 활성을 억제하였다. 동시에, 자일로스, 셀로비오스 및 둘시톨은 코프리누스 코마투스 바이오매스의 렉틴 적혈구응집활성을 억제하지 않았다.
얻어진 결과에 의하면 C. 코마투스는 바이오매스 및 자실체에 렉틴을 축적할 수 있는 역량을 가지는 것으로 나타났다. 특히 고 적혈구응집활성이 C. 코마투스에서 나타났다. 버섯 렉틴에 대한 당 특이성의 측정에 의하면, 렉틴 결합 락토스가 테스트된 균주 중 가장 흔한 것으로 나타났다.
실시예 5. 변종 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 특징.
순수 배양액에서의 영양생식 균사체. 흰색의 면화 균사 콜로니는 종종 성숙된 다발(tufts)(균사체 집단)로 성장한다. 통상 균사 매트가 가장자리를 따라 비대칭적 모양으로 형성되어 있다. 클램프 연결체, 문합(anastomose) 및 털 모양의 크리스탈이 종종 균사에 존재한다.
담자과는 대개 많고 눈에 잘 띄며, 2-10cm 폭에 5cm이하의 길이, 대부분 단생(solitary)이고, 교상(gelatinous)이며, 신생일때는 대뇌모양이고 습하며, 후에 불규칙 군집무리를 이루는 잎을 가지며, 다수의 파도 주름모양 엽으로 구성되어 있고, 신선 표본은 습하고 어두운 환경에서는 노란색 내지 누르스름한 오렌지색으로, 가끔 자라면서 색이 옅어지거나 색이 없어지고 희게되며, 건조할 때는 누르스름한 오렌지색 내지 이보다 더 어두워진 색이 된다. 부드럽고, 다소 반짝거리는 자실층 표면( Hymenial surface ). 교상의 부드러운 엽육 ( flesh ). 1차 균사 균사시스템( Hyphal system ). 풍부한 클램프 연결체, 유리질(hyaline), 얇은 내지 두꺼운 벽, 대부분 1.5 - 3 μm 폭, 담자과의 내부 부분이 다소 넓은 교상의 균사( Hyphae ). 구형에서 직사각형의, 3-6 X 2-4 넓이로, 종종 신생 표본 이외에 존재하며, 대부분 부착점 가까이에 존재하는 기생세포( Haustorial cell ). 2개 형태의 담자기( Basidia ): 1) 넓게 타원체 내지 유구형으로, 10-25 X 10-22 μm; 2) 타원형 내지 방망이 모양으로, 20-30(-35) X 12-20 μm; 세로로 또는 비스듬한 격막, 4개 포자, 100-150 X 2-3 μm 넓이의 담자뿔(sterigmata)을 가지고, 정점이 7까지 부어올라있음. 넓게 타원체 내지 직사각형의, (8-)10-16(-18) X (5-) 7-10(-12) μm, 부드럽고, 유리질, 얇은 벽, 선명한 포자돌기, 멀저(Melzer)시약에 음성인 담자포자( Basidiospores ). 가지가 밀집되어 있고, 종종 자실층에 풍부하고, 신생 표본에 특히 존재하는 분생포자경 ( Conidiophores ). 담자뿔 내지 타원형 및, 3-5 X 2.5 -3.5 μm, 또는 타원체 내지 원통형 3-5 X (1-)2 μm 직경, 부드럽고, 유리질, 종종 다수인 분생포자( Conidia ). 통상 존재하지 않으나 성장 초기에 때때로 존재하는, 얇은 내지 다소 두꺼운 벽이 있고, 3.5(-4) 이하의 폭이 있는 히피디아( Hyphidia ). 모양과 크기가 다양하고, 구형 내지 타원체형의, 대개 20-30 X 5-10 μm 폭, 두꺼운 벽의 소낭 ( Vesicles ). 희거나 엷은 노란색의 포자 프린트( spore print ).
서식지: 부패된 가지, 통나무 및 나무토막의 단단한 목재.
트레멜라 메센테리카 CBS 123296는 특수한 생활주기를 가진다. 다른 고등 담자균류 버섯과 대비하여, 단일 담자포자가 영양배지 브로스에서 균사로 그리고 이스트 유사 버딩세포로 발아된다. 단일 담자포자 배양은 반수체, 즉 각 세포에 하나의 핵만을 함유하고 있다. 다른 담자포자에서 유래된, 두 개의 양립가능한 반수세포가 접촉하게 되면, 원형질 및 핵융합이 일어나고, 디카리오틱(dycariotic) 균사체가 성장한다. 디카리오틱(dycariotic) 균사체는 어떠한 재배조건하에서도 발아세포의 형태로 성장할 수 없고 따라서 이스트 유사 성장 타입은 버섯배양의 반수체 상태에 의해 유전적으로 정해진다. 반수체 배양은 더 변형가능(plastic)한데, 빈약한 배지 또는 고갈 조건하에서 이스트 유사 세포는 반수체 균사가 형성될 수 있기 때문이다. 다른 미생물처럼, 단일 세포 균류 배양이 균사체 배양에 비해 생명공학 공정에 더 적합하다. 이는 특히 담자균류 디카리오틱 배양에 중요한데, 이는 멸균 균사체 형태로 성장하고, 담자균류 접종물을 준비하는 특별한 절차가 필요하기 때문으로, 이에는 디카리오틱 균사체 균질화가 포함된다. 본 발명의 반수체 이스트 유사 버딩 배양은, 생명공학적 관점으로도 최적의 성장 형태일 뿐만 아니라, 기술된 바와 같이 그 생물학적 속성으로 인해 균사체 형태보다도 많은 양의 폴리사카라이드를 생산할 수 있는 최적의 성장 형태이다.
실시예 6. 약용 젤리 버섯 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 순수배양의 생화학활성 및 성장 조절
트레멜라 메센테리카의 자실체를 담자포자 프린트 개발을 위해 수확하였다. 자실체는 퀘르쿠스 종의 죽은 잔가지에 있는 페니오포라(Peniophora sp)종과 연관이 있었다. 이들 시료에서 얻은 반수체 이스트 유사 배양은 한천 배지에서 빠른 성장을 보였으며, 이들 중 14개가 심부 배양 조건을 초기 스크리닝하는데 사용되었다. 선택된 균주는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296이라는 이름으로 하이파 대학 균주 보관 센터(Haifa University Culture Collection (HAI))에 기탁되었다.
심부배양 조건에서 선택된 균주 바이오매스 성장에 적합한 pH는 5.5에서 중성의 범위내 인 것으로 결정되었다. pH 6.35에서 액체 몰트 추출 배지일 때 바이오매스의 최고 수득률이 얻어졌다.
바이오매스 축척에 적합한 배양 배지 조성물의 최적화에서, 수크로즈가 탄소원으로서 글루코스만큼 적합한 것으로 밝혀졌다.
펩톤 및 이스트 추출물 혼합물은 좋은 질소원이며, 반면 암모니아염은 배지의 pH를 매우 빨리 저하시키는 것으로 조사되었다. 이들은 또한 세포 성장에 충분한 만큼의 인을 함유하고 있어, 인삼염을 첨가한다고 하여 바이오매스의 수득률이 증가하지는 않았다. 마그네슘 아세테이트는 MgSO4보다 더 생리학적으로 알칼리인 것으로 여겨지며, 실지로 배양 배지가 빠르게 산성화되는 것을 방지해준다.
나아가 다소 변형된 하기 조성(g/l)의 배양 배지를 표준 "접종 배지"로 사용하였다: 수크로즈 - 20.0; 펩톤- 2.0; 이스트 추출물- 2.25; Mg 아세테이트- 1.0; KCl - 1.0. 120℃에서 30분간 멸균한 뒤의 배지의 pH는 6.5에 가깝다.
"발효 배지"의 적합한 조성은 하기와 같다: 수크로즈, 50.0; 이스트 추출물 0.5; KCl, 1.0; Mg 아세테이트
Figure pct00025
4H2O, 1.0로 이루어진 A 파트 (g/L)와, NaH2PO4
Figure pct00026
H2O, 0.5 및 Na2HPO4
Figure pct00027
7H2O, 1.0로 이루어진 B 파트(g/L)를 혼합하여 준비한 배지에서 트 레멜라 메센테리카를 배양하였다.
용액을 멸균하고 실온으로 식힌 후 B 파트를 A 파트가 들어있는 플라스크에 첨가하였다.
T. 메센테리카의 배양은, 배양액 내 TMP가 27.0g/L에 이를 때까지인 72시간동안 계속되었다(표 13). 침전 후 분리 건조하여 TMP 170g가 얻어졌다.
Figure pct00028
실시예 7. 트레멜라 메센테리카 의 화학적 조성 및 함량.
7.1 일반적 조성. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 심부배양된 정제되지 않은 생성물은 균주 생산자인 세포 바이오매스 및 세포 외부에 부착된 (exocellular) 폴리사카라이드 글루코로노자일로만난이 동등 비율로 이루어져 있다. 이때의 일반적 조성이 표 14에 나타나 있다.
Figure pct00029
화학적 조성은 서로 다른 독립적인 이스라엘의 두 개의 기관(Bactchem Co. and Aminolabs Co.)에서 결정되었으며, 표 15 내지 표 17에 기재되어 있다.
Figure pct00030
Figure pct00031
7.2 정제되지 않은 식이섬유에는 헤미셀룰로즈, 덱스트린과 같은 저분자 폴리사카라이드 및 β-(1-3)-글루칸과 같은 세포벽 구성성분이 포함되어 있다.
7.3 비타민. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 바이오매스에서 비타민A(레티놀), C(아스코르브산), E-(α-토코페롤) 및 비타민 B군을 발견하였다.
Figure pct00032
민감한 영양요구체 미생물의 성장 특징 측정에 근거하고, 미생물학적 방법에 의해 알려진 바에 의하면, T. 메센테리카 바이오매스는 비타민 B군 중에서 니아신이 특히 풍부하며, 비타민 A가 풍부하다.
7.4 트레멜라 메센테리카 (CBS 123296)에 있는 글루쿠로노자일로만난 및 글루칸
전(whole) 트레멜라 메센테리카 심부배양 바이오매스 및 초원심분리후 얻은 분획의 조성을 GC 분석에 의해 결정하였다(글루코스, 만노스 및 자일로스 함량). 글루칸은 120,000g에서 전부 침전되고, 글루쿠로노자일로만난(GXM)은 대부분 용액 속에 남아있고 일부분만이 침전되었다. GXM은 폴리사카라이드 바이오매스 건조중량의 약 70%를 차지하고 글루칸은 약 30%를 차지한다.
GXM이 없는 순수 글루칸은 트레멜라 메센테리카를 고성능 초음파로 처리하여 분리함으로써 얻었다. 초음파처리된 GXM은 물에 더 잘 용해되며, 초원심분리로 침전되지 않아, 2번의 재침전과정을 거치면 순수한 β-글루칸을 분리할 수 있다. 1.2g의 트레멜라 메센테리카를 분리하여 400mg의 침전물(약 10% GXM을 가진 글루칸) 및 800mg의 용해성 물질(GXM)을 얻었다.
GC 분석결과 GXM함량은 (Man+Xyl)*1.3 이었다(1.3은 GlcA 및 아세테이트 손실을 보충하려고 사용되었다). 최근 분리된 트레멜라 메센테리카 (CBS 123296)의 글루쿠로노자일로만난 구조는 다른 트레멜라 메센테리카 균주에서 분리한 글루쿠로노자일로만난과 다소 다른 것으로 밝혀졌다(나타내지 않음). 글루칸은 글루코스 함량으로부터 추정되었다. 글루쿠로노락톤이 Glc로 환원되는 것을 방지하기 위하여, NaBH4환원에 앞서 24% NH3로 가수분해물을 처리하였다. 가수분해에 사용되는 3M TFA에 글루칸이 잘 용해되지 않기 때문에 다른 세트의 샘플을 가수분해 전에 농축 HCl로 처리(40℃, 1h)하였다. 이러한 절차에 따라 Glc회수율이 증가하였으나, 자일로스는 부분적으로 분해되었다.
β-글루칸의 메틸화를 통해 β-글루칸이 주요 구성성분으로서 3- 및 4-치환 글루코스를 가진 선형구조를 가진 것으로 나타났다(도9 및 도10). 따라서 글루칸은 3,4-β-글루칸이다. 이 글루칸은 DMSO에 잘 용해되지 않아, 두 번 메틸화하였다; 여전히 잘 녹지 않는 부분이 있었으며, 이는 결과에 영향을 미칠 수 있다. 이 글루칸은 물에는 녹지 않는다.
실시예 8. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 제제의 인터페론성 및 면역조절 성질.
18-20g 무게의 잡종 쥐가 연구에 사용되었다. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 심부배양 단일 세포 바이오매스를 경구로 쥐에게 먹였다.
제제를 먹인 후 6, 24 및 48시간 후 쥐를 죽여 혈장을 모아 그 안의 인터페론(IFN) 및 종양 괴사 인자(TNF) 레벨을 측정하였고, 복막 삼출액의 마크로파아지를 이용하여 제제에 반응하는 식균 작용시스템의 기능적 활성을 연구하였다.
8.1 플라즈마 IFN 레벨.
인터페론성 특징은 표18에 나타나있는데, 이에 의하면 4mg/동물의 바이오매스 단일 투여량이 쥐에게 경구로 투여된 경우 24시간 후 낮은 역가(80 units/ml)의 내인성 IFN 합성이 유도되었다. 트레멜라 메센테리카 바이오매스를 상기 투여량으로 처리한 동물의 혈청내 IFN 레벨은 48시간 후에 80 units/ml 까지 증가되어 유지되었다.
트레멜라 메센테리카 바이오매스 투여량을 10mg/동물로 한 경우 더욱 활성이 좋았으며 투여 후 6시간에 80 units/ml의 내인성 IFN 생성을 유도하였다. 제제투여 24시간 후 동물 혈청내 IFN 역가는 최대 160-320 units/ml까지 달하였다. 나아가 (48시간 내에) 혈청 IFN레벨은 감소하였으나 그러나 대조군과 비교하면 여전히 상승된 수치(80 units/ml)를 유지하였다.
Figure pct00033
본 연구에서 정해진 혈장내 종양 괴사 인자(TNF) 레벨에 의하면, 트레멜라 메센테리카 바이오매스는 이 사이토카인을 인 비보에서 합성하지 않는다(나타내지 않음). 동시에 이들 제제는 내인성 신체 독성을 감소시키는데 도움이 될 수 있다. 이것은 대조군 쥐의 혈장에서 검출된 TNF에 의해 증명된다(생물학적 용액의 도입시). 상기 제제를 사용함으로써 대조군 동물의 혈장내 TNF양이 감소된다.
8.2 트레멜라 메센테리카 바이오매스에 대한 복강 삼출물 마크로파지의 기능적 활성 반응
복강 삼출물 마크로파지의 기능적 활성은 니트로 블루 테트라졸리움(NBT)-테스트(니트로 블루 테트라졸리움의 비기질적 환원 반응)에 의해 평가되었다. NBT-테스트는 마크로파지의 기능적 활성을 연구하는데 통상 사용되는데, 이는 마크로파지의 NBT 환원능력이 감소되는 것이 그들의 산소 의존성 생물 살생의 병리학적 성질과 일치하기 때문이다. NBT-테스트에서 마크로파지의 활성은 인비트로에서 부가적인 세포자극없이(자발적 테스트) 그리고 인비트로에서 St. 아우레아스(St . aureas) 세포로 자극을 주어(자극 테스트) 조사하였다. 자극 NBT-테스트는 식세포작용을 완성시킬 준비되어있다는 세포화학적 기준으로 여겨진다. 자발적 NBT-테스트와 자극 테스 지표간의 차이를 세포 예비능(fuctional reserve, FR)으로 간주하는데, 이는 일반적 면역 예비능에 대한 개념에 잘 맞는 식세포 시스템의 잠재적 효과기로서의 성능을 나타낸다.
4 및 10 mg/동물의 트레멜라 메센테리카 바이오매스 단일 경구투여량에서, 자극 및 자발적 NBT-테스트에서 복강 삼출물 마크로파지의 산소 의존적 생물 살생지수가 조절되는 것을 발견하였다(도 19). 트레멜라스틴에 대한 식세포 활성 반응은 용량 및 관찰시간에 의해 좌우되었다. 예를 들어 4mg/동물 용량의 트레멜라 메센테리카 바이오매스를 투여한 6시간 뒤, 자발 및 자극 NBT-테스트 둘 다에서 마크로파지의 FR과 산소의존적 생물 살생 활성이 약간 떨어졌다. 표19에 나타난 데이터를 보면, 24 및 48시간 후에 자발 NBT 테스트의 지수가, 4mg/동물 용량의 트레멜라 메센테리카 바이오매스에 대한 반응으로 증가하여 대조군의 수치에 도달하였다. 그러나 주어진 관찰시간 동안(24 및 48시간 후) 자극 NBT-테스트에서, 대조군과 비교하여 마크로파지의 산소의존적 생물 살생 활성이 매우 증가하였는데, 이는 그 FR의 현격한 증가를 초래하였다.
Figure pct00034
트레멜라 메센테리카 바이오매스의 10 mg/동물 단일 투여량에 반응하여, 자발 NBT 테스트의 수치가 6시간 후 다소 증가한 것으로 관찰되었는데, 그러나 24 및 48시간 후에는 대조군 레벨까지 수치가 감소하였다. 동시에 자극 NBT 테스트에서 6, 24 및 48시간의 전 관찰기간 동안 마크로파지의 활성이 의미있게 증가하였다. 10 mg/동물의 트레멜라 메센테리카 바이오매스로 처리된 쥐 마크로파지의 자극 NBT-테스트 수치가 증가함에 따라 FR 세포도 매우 증가하였다. 표19에 나타난 바와 같이 FR증가는 6시간 후에 일어났으며 48시간일 때 최고였다.
본 연구에서 알 수 있는 바와 같이, 트레멜라 메센테리카 바이오매스는 자발적 NBT-테스트 수치에는 영향을 별로 미치지 않으나, 자극 NBT-테스트에서는 마크로파지의 활성을 상당히 증가시켰는데, 이를 통해 식세포시스템의 잠재 예비능을 증가시킨다.
본 연구에서 알 수 있는 바와 같이, 자발 NBT-테스트에서 마크로파지의 산소의존적 살균(bactericidal)활성은, 대조군에 비해 6시간 후에도 변하지 않고 유지되었다. 동시에, 자극 NBT-테스트 수치는 6시간 후 증가하였으며, 이에 따라 FR세포가 의미있게 증가하였다. 24시간 후, 자발 NBT-테스트 수치는 대조군에 비해 변하지 않고 유지되었고, 자극 테스트의 수치는 증가하는 경향이 있고 세포의 FR은 역시 변하지 않고 유지되었다.
8.3 요약. 본 연구결과 분석에 의하면, 트레멜라 메센테리카 바이오매스 제제 4 및 10 mg/동물 단독투여로는 인터페론성 활성이 적으며, "후에" 내인성 인터페론의 생성을 유도한다. 트레멜라 메센테리카 바이오매스 제제는 투여량이 10mg/동물일 경우에 더 활성적인 인터페로노젠인 것으로 보인다. 트레멜라 메센테리카 바이오매스 제제 10 mg/동물 투여에 반응하여 혈액내 인터페론 역가의 피크치(160-320 units/ml)는 24시간 후에 도달하며, 그 후 감소하였으나 전 관찰 시간 동안 여전히 높게 유지되었다. 트레멜라 메센테리카 바이오매스는 동물체내에서 소량의 인터페론 생성을 촉발하고 개시시키는데, 즉 다른 인터페로노겐과 같이 주입되었을 때 인터페론 합성을 강화시킬 것이다.
트레멜라 메센테리카 바이오매스에 반응하여, NBT 테스트에서 복강 삼출액 마크로파지의 기능적 활성이 강화되는 것으로 관찰되었다. 트레멜라 메센테리카 바이오매스는 농도가 10mg/동물일 때 마크로파지의 산소의존적 생물 살생 능력이 가장 유효하게 활성화되었다. 상기 제제는 자극-NBT 테스트 지수의 증가를 야기시켰고(자발 NBT-테스트의 수치는 변하지 않음), 이로 인해 식세포시스템의 예비능을 현저히 증가시키게 되었다. 식세포시스템의 잠재 예비능의 증가는 기회감염적 박테리아 또는 바이러스로 인한 감염 발생을 예방하는데 중요하다. 또한 부가적으로 신체의 병원균에 의한 감염을 예방할 수 있게 된다. 마크로파지의 높은 예비능뿐만 아니라 높은 살충효과(자발 및 자극 NBT-테스트 수치의 차이)가 트레멜라 메센테리카 바이오매스 제제가 인체내 인터페론 생성과 관련되어 있음을 설명한다. 이와 관련하여 산소의존적 마크로파지의 생물살생효과의 활성화는, 트레멜라 메센테리카 바이오매스에 의한 내인성 IFN 유도와 연관되며(다른 사이토카인도 가능하며, 이에 대해 연구가 더 필요함), 이에 식세포가 인체내 IFN 작용의 주요한 타겟이 된다. 게다가, 본 제제에 의해 활성화된 식세포가, 오토크린 및 파라크린 활성화 기술에 의해 내인성 IFN의 생성에 중요한 역할을 한다는 것이 불가능하지는 않다.
실시예 9. 피토바이러스에 대한 식물 저항에 대한 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 추출물 및 글루쿠로노자일로만난의 효과
담자균류 자실체 및 배양액에서 분리된 폴리사카라이드의 화학적 성질을 연구하면서, 중성 및 산 폴리사카라이드를 발견하였다. 특히, 트레멜라 메센테리카에서 얻은 글루쿠로노자일로만난(GXM)의 산 폴리사카라이드는, 자일로스와 글루쿠론산의 β-(1→2)(1→4)-연결 올리고사카라이드에 의해 글리콜화된 α-(1→3)-연결 만난이라는 선형 기본골격을 가지며, 이에 다중 음이온성질을 가진다. 알려진 데이터에 근거하여, 중성 및 산 글루칸은 상이한 특징의 항-피토비랄 활성을 가진다.
실지로, 연구된 폴리사카라이드는 다투라 식물에서 TMV에 의해 유도된 국소 손상의 발생을 다르게 억제하였다(표 20)
중성 폴리사카라이드는 가장 활성이 좋은 것으로 나타났다. 국소 손상 형성이 80 및 99.4%까지 감소되었다(100-1000 μg/mL농도에서). GXM은 활성이 다소 적고, 그리고 이 경우, 토탈 제제는 중간정도의 활성을 보이는데, 이는 TMV 전염성에 대한 토탈 제제의 활성은 대부분 중성 폴리사타라이드에서 기인된 것이라는 것을 보여준다. 후자는 문헌 데이터에서 확인할 수 있는데 이는 중성폴리사카라이드가 그의 황산유도체보다 고감도 식물에서의 바이러스 감염력에 대해 더욱 활성이 있다는 것이며, 이는 대개 식물의 바이러스 저항을 새로이(de novo) 유도한다. 얻어진 결과에 근거하여, 황산화 만난과 유사한 GXM이 바이러스에 대한 식물의 저항성을 유전자 의존적으로 유도할 수 있는지 연구하는 것이 중요했다. 1000-2500μg/mL 농도의 GXM은 TMV에 대한 담배 및 다투라 식물의 저항을 유도할 수 있다(표21). 이 경우 AVR은 다투라 식물에서보다 담배 식물에서 더 높은 것으로 나타났다. 다시 말해서, 이 폴리사카라이드에 의한 AVR의 활성화는 고감도의 숙주 식물의 유전자형에 좌우되고, 따라서 적절한 저항 유전자의 활성에 좌우된다.
Figure pct00035
저항성 발생에 대한 연구는, 1000 및 2500μg/mL농도에서 GXM이, 유도 인자와 같이 접종한 첫날부터 이미 담배 식물에서 TMV에 대하여 AVR의 발생을 유도한다는 것을 보여준다(도 11 및 12). 식물 조직에 폴리사카라이드가 지속적으로 존재할 때와 같이 GXM의 농도가 1000μg/mL일 때, 저항 레벨은 점차적으로 감소하였다: 5일째 30%에서 7일째 20%(도11). GXM의 농도가, 2500μg/mL일 때, 이러한 경향은 관찰되지 않는다(도12). 반대로, 이러한 사실은 유전자 레벨에서 AVR의 폴리사카라이드 유도가 농도 의존적이라는 것뿐만 아니라, GXM의 높거나 또는 낮은 농도에 적응하는 식물의 또다른 능력이 있다는 증거를 제공할 수 있다.
Figure pct00036
잎의 실험군 반쪽 및 대조군 반쪽에의 TMV 국소손상 크기를 측정함에 있어, 2500 μg/mL농도의 GXM이 바이러스성 손상 성장을 강화시킨다는 것이 나타났다(도13). 상기 GXM 농도에서 유도인자를 식물 조직에 접종한 후 7일 후에 괴사 성장의 신뢰성 있는 자극이 관찰되었는데, 폴리사카라이드가 도입된 다른 기간 내에서도 이러한 경향이 관찰되었다. 1000μg/mL의 GXM으로 처리된 잎의 반반에서 실험군 및 대조군 사이에 국소 손상 크기에 있어 신뢰할 만한 차이점이 관찰되지 않았다.
국소 괴사 성장에 대한 유사한 영향은 이스트 RNA에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은, 식물에서 유도 인자의 영향하에서 저항의 고감도 메카니즘의 활성화로 설명되어질 수 있다.
식물에서 GXM-유도 바이러스 저항의 발달을 억제하는 항생제인 악티노마이신 D(AMD)에 대한 연구도 수립되었다(도14). AMD는, 사용방법과는 상관없이(GXM 도입 즉시 또는 2일 후), 다가음이온과 함께 도입되어 AVR의 성장을 부분적(20 μg/mL) 또는 완전히(10 μg/mL) 억제하였다. 20 μg/mL의 AMD 농도에서 AVR을 불완전하게 억제하는 것은 식물 조직과 관련된 항생제 독성 때문일 수 있다. 후자는, GXM없이 AMD를 잎에 주입한 대조군에서 괴사 수의 감소로 확인된다.
전체적으로, 얻어진 결과에 의하면 GXM에 고감도인 식물에 접종된 AVR은, 세포 DNA의 매트릭스에서 새로운 RNA 합성에 의존한다고 결론지을 수 있다. 다시 말해서 바이러스에 대한 저항성을 새로이 활성화시키는 유도인자들이 DNA때문이라고 할 수 있다.
따라서, GXM은 새로이 바이러스 감염 작용에 대해 고감도 담배 식물의 저항을 유도하는데, 이 저항은 악티노마이신 D의 작용에 민감하기 때문이라는 것이 확인되었다. 한편으로, 그 활성은 전에 연구된 황산화 폴리사카라이드 및 이스트 RNA의 작용과 유사하며; 또다른 한편으로는 그 활성은 단백질-탄수화물 상호작용에 근거한 고감도 메카니즘을 활성화시키는 중성의 폴리사카라이드와 유사하다.
식물에서의 자연발생적 및 유도된 저항 메카니즘이, 대체로, 종합적으로 연구된 것이 아니라는 것을 고려하면, 자연발생적인 바이러스 저항을 증가시킬 수 있는 물질에 대한 연구는 유망하다. 우리의 견해로는, 폴리사카라이드 뿐만 아니라 당단백질도, 장래에, 고감도 식물에서 AVR의 활성화에 관여하는 내인성 트리거의 모델로 사용될 수 있기 때문에 그러한 연구결과는 중요하다. 이러한 물질들은 또한 농업상 그리고 관상식물 재배에서 바이러스 감염에 의한 손상을 감소시키려는 목적에 실질적으로 사용될 수 있다는 점에서 매우 흥미로울 것이다.
the Centralbureau voor Schimmelcultures) CBS123401 20080916 the Centralbureau voor Schimmelcultures) CBS123296 20080716

Claims (21)

  1. 부다페스트협약에 의해 CBS (the Centralbureau voor Schimmelcultures)에 수탁번호 CBS 123401로 기탁된 코프리누스 코마투스 HAI-1237 (이하, 코프리누스 코마투스 CBS 123401), 및 부다페스트협약에 의해 CBS에 수탁번호 CBS 123296로 기탁된 트레멜라 메센테리카 HAI-17 (이하, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296) 중에서 선택되는 신규하고 탁월한 고등 담자균류 변종 버섯.
  2. 제 1 항에 따른 변종 버섯의 바이오매스로, 상기 바이오매스는 탄수화물, 필수 아미노산이 풍부한 단백질, 비타민, 필수 지방산이 풍부한 지질, 항산화제 및 미네랄을 포함하는 생물학적 활성 물질 및 기능성 식품 물질이 풍부하고, 상기 바이오매스는 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사체 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사체 또는 자실체로부터, 바람직하게는 영양배지에서 심부배양으로 버섯을 재배하여 수득한 변종 버섯 바이오매스.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 바이오매스는 균사체 바이오매스이고, 상기 코프리 누스 코마투스 CBS 123401의 상기 탄수화물은 트레할로스, β-글루칸, 바람직하게는 저분자량 수용성 β-글루칸, 및 갈락탄, 바람직하게는 중성 후코갈락탄을 포함하고, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 상기 탄수화물은 β-글루칸, 바람직하게는 선형 3,4 β-글루칸, 및 글루쿠로노자일로만난을 포함하는 변종 버섯 바이오매스.
  4. 제 1 항에 따른 버섯의 추출물로, 상기 추출물은 기능성 식품 활성 및 생물학적 활성을 가지며, 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 균사체 또는 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 균사체 또는 자실체로부터, 바람직하게는 영양배지에서 심부배양된 순수한 균사체 유래인, 버섯 추출물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 추출물은 코프리누스 코마투스 CBS 123401 배양물로부터 수득되며, 저분자량 수용성 β-글루칸 및/또는 갈락탄, 바람직하게는 중성 후코갈락탄이 풍부하며, 또는 상기 추출물은 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 배양으로부터 수득하고 선형 3,4 β-글루칸, 및/또는 글루쿠로노자일로만난이 풍부한, 버섯 추출물.
  6. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 바이오매스, 또는 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 추출물, 또는 상기 바이오매스 또는 추출물의 혼합물을 함유하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 자실체 또는 균사체로부터 얻은 기능성 식품 물질 및 생물학적 활성 물질이 풍부한 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 추출물을 포함하는 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 트레멜라 메센테리카 CBS 123296 균사체로부터 얻은 기능성 식품 물질 및 생물학적 활성 물질이 풍부한 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 추출물을 포함하는 조성물.
  9. 심부배양된 코프리누스 코마투스 CBS 123401의 순수한 균사체 배양물.
  10. 심부배양된 트레멜라 메센테리카 CBS 123296의 순수한 균사체 배양물로, 상기 균사체 배양물은 단일 세포 바이오매스의 형태인, 균사체 배양물.
  11. 하기 구조의, 일부 6번 위치에 β-1-6-D-글루코스 잔기 곁사슬을 갖는, β-1-3-연결된 D-글루코스 잔기의 기본골격을 갖는 저분자량 수용성 β-글루칸:
    Figure pct00037

    여기에서 m은 1에서 약 10 사이의 정수이고, n은 약 3과 같은(equal to) 정수이며, 바람직하게는 10,000 Da 미만, 바람직하게는 약 1000 내지 약 10,000 Da의 분자량을 가짐.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 β-글루칸은 코프리누스 코마투스, 바람직하게는 코프리누스 코마투스 CBS 123401에서 수득한 β-글루칸.
  13. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296에서 얻은 수불용성 선형 3,4 β-글루칸.
  14. 트레멜라 메센테리카 CBS 123296에서 얻은 글루쿠로노자일로만난.
  15. 하기로부터 선택되는 탄수화물을 포함하는 조성물:
    (a) 제11항 또는 제12항의 저분자량 수용성 β-글루칸
    (b) 제13항의 수불용성 선형 3,4 β-글루칸
    (c) 제14항의 글루쿠로노자일로만난; 또는
    (d) (a)-(c) 탄수화물 중 2 이상의 조합.
  16. 제6항 내지 제8항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식이 보충제, 약물, 프리비오틱, 기능성 식품, 음료 또는 화장품.
  17. 제6항 내지 제8항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 애완동물용 사료, 살충, 구충 또는 항-식물 바이러스 제품.
  18. 약학적으로 허용되는 담체 및 하기로부터 선택되는 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물:
    (a) 제6항 내지 제8항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물
    (b) 제11항 또는 제12항의 저분자량 수용성 β-글루칸
    (c) 제13항의 수불용성 선형 3,4 β-글루칸
    (d) 제14항의 글루쿠로노자일로만난; 또는
    (e) (b)-(d)의 활성 성분 중 2 이상의 조합
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨 치료; 혈당 농도 감소; 면역조절반응의 유도; 혈중 콜레스테롤 농도 감소; 또는 콜레스테롤 축적 감소용인, 조성물.
  20. 제6항 내지 제8항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제14항의 글루쿠로노자일로만난으로부터 선택되는 활성 성분 및 담체를 포함하는 농학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 조성물은 식물 바이러스에 대한 식물의 저항성 유도용인, 조성물.








KR1020117023717A 2009-03-10 2010-03-10 신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물 KR20110137792A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15883709P 2009-03-10 2009-03-10
US61/158,837 2009-03-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110137792A true KR20110137792A (ko) 2011-12-23

Family

ID=42237343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117023717A KR20110137792A (ko) 2009-03-10 2010-03-10 신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20120124703A1 (ko)
EP (1) EP2405923A1 (ko)
JP (1) JP2012520289A (ko)
KR (1) KR20110137792A (ko)
CN (1) CN102438632A (ko)
AU (1) AU2010222267A1 (ko)
BR (1) BRPI1008984A2 (ko)
CA (1) CA2754790A1 (ko)
CL (1) CL2011002247A1 (ko)
MX (1) MX2011009579A (ko)
WO (1) WO2010103519A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112299A (zh) * 2015-08-27 2015-12-02 马鞍山市安康菌业有限公司 一种负离子粉毛头鬼伞高生物值转换培养基及其制备方法
CN109652471A (zh) * 2018-12-07 2019-04-19 山东中医药大学 一种提高鸡腿菇菌丝体中不饱和脂肪酸含量的方法
CN112646853A (zh) * 2019-12-17 2021-04-13 山东中医药大学 一种用于调节肠道菌群的经鸡腿蘑菌发酵组装的糖蛋白
KR102275715B1 (ko) * 2020-12-17 2021-07-08 조항희 먹물버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물 및 이의 제조방법
CN112494522B (zh) * 2020-12-21 2022-02-22 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 内生真菌a871提取物在制备抗细菌药物中的应用
CN116694721B (zh) * 2023-08-09 2023-10-20 长春中医药大学 灵芝糖肽及其制备方法、应用以及灵芝糖肽微乳和面霜

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1143110A (zh) * 1995-08-17 1997-02-19 上海市农业科学院食用菌研究所 一种毛头鬼伞多糖的制备方法
GB0211118D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Polonelli Luciano Vaccines
US7018986B2 (en) * 2002-09-20 2006-03-28 Immudyne Use of beta glucans for the treatment of osteoporosis and other diseases of bone resorption
WO2008130719A1 (en) * 2007-04-24 2008-10-30 University Of Louisville Therapeutic beta-glucan combinations

Also Published As

Publication number Publication date
US20120124703A1 (en) 2012-05-17
CA2754790A1 (en) 2010-09-16
AU2010222267A1 (en) 2011-10-27
EP2405923A1 (en) 2012-01-18
JP2012520289A (ja) 2012-09-06
MX2011009579A (es) 2012-02-08
CL2011002247A1 (es) 2012-07-06
CN102438632A (zh) 2012-05-02
BRPI1008984A2 (pt) 2016-07-05
WO2010103519A1 (en) 2010-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sarangi et al. Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans
Kim et al. Anti-cancer effect and structural characterization of endo-polysaccharide from cultivated mycelia of Inonotus obliquus
Israilides et al. In vitro cytostatic and immunomodulatory properties of the medicinal mushroom Lentinula edodes
KR101467903B1 (ko) 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 면역증강제
Gao et al. Antioxidant and immunological activity in vitro of polysaccharides from Gomphidius rutilus mycelium
US6383799B1 (en) Process for producing, methods and compositions of glucuronoxylomannan as nutriceutical agent from higher basidiomycetes mushroom
Xu et al. Polysaccharides from Inonotus obliquus sclerotia and cultured mycelia stimulate cytokine production of human peripheral blood mononuclear cells in vitro and their chemical characterization
KR20110137792A (ko) 신규한 버섯 균주 코프리누스 코마투스 및 트레멜라 메센테리카 그 생산물 및 추출물 및 이를 포함하는 조성물
Reshetnikov et al. Medicinal value of the genus Tremella Pers.(Heterobasidiomycetes)
Wang et al. Polysaccharides purified from the submerged culture of Ganoderma formosanum stimulate macrophage activation and protect mice against Listeria monocytogenes infection
CN104672339B (zh) 一种蝉花菌素及其制备和用途
KR20130031704A (ko) 버섯배지를 이용한 차가버섯, 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초의 복합배양방법
Chandrasekaran et al. Properties and potential applications of the culinary-medicinal cauliflower mushroom, Sparassis crispa Wulf.: Fr.(Aphyllophoromycetideae): a review
US20060078971A1 (en) Isoflavone-beta-D-glucan produced by Agaricus blazei in the submerged liquid culture and method of producing same
US11130976B2 (en) Method for preparing high productivity mushroom beta-glucan and products thereof
KR20060116463A (ko) 인삼박을 배지로 한 버섯 균사체 및 그 생산방법
US20200030402A1 (en) Pharmaceutical compositions having antibacterial, antiviral, and other immunostimulatory activities
Hamza et al. Efficient production of biomass and exopolysaccharide from P. ostreatus and physio-chemical characterization of biomass powder
Miletić et al. Turkey tail medicinal mushroom, Trametes versicolor (Agaricomycetes), crude exopolysaccharides with antioxidative activity
Wu et al. Bioactive ingredients and medicinal values of Grifola frondosa (Maitake). Foods 2021; 10: 95
KR101434741B1 (ko) 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 ｇｐｐ１１０１ｂ 균주 및 이를 이용한 제제
Karnchanatat et al. Antioxidation and antiproliferation properties of polysaccharide-protein complex extracted from Phaeogyroporus portentosus (Berk. Broome) McNabb
WO2009017463A2 (en) NOVEL β-GLUCANS ISOLATED FROM HIGHER BASIDIOMYCETES MUSHROOM GANODERMA TSUGAE VAR. JANNIEAE
TW591105B (en) Novel immuno-stimulating polysaccharide substance from Phellinus spp. strain and use thereof
JP4422404B2 (ja) 感染予防・治療剤および食品

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid