CN104672339B - 一种蝉花菌素及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝉花菌素及其制备和用途。所述的蝉花菌素，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其物质的量之比为45.20‑50.20:5.50‑8.30:2.10‑2.60:0.80‑1.30。所述的蝉花菌素的制备方法，包括：水提醇沉提取蝉拟青霉菌丝体粗多糖，经酶‑Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分即为蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及免疫功能研究，发现本发明蝉拟青霉菌丝体多糖有较强的抗氧化活性，可以作为抗氧化剂或者用于制备抗氧化剂，可广泛用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
Description
技术领域
本发明涉及真菌胞内多糖领域，具体涉及一种蝉花菌素及其制备和用途，属于高分子和分子生物学领域。
背景技术
蝉花(Cordyceps cicadae)为麦角菌科真菌寄生在蝉类若虫上的子座及若虫尸体的复合物，为传统名贵中药，蝉花和冬虫夏草、蛹虫草同属虫草属，是一类珍贵的药用虫草，同时也是滋补食品，具有很高的经济应用价值(Zhang S.W.,Xuan L.J.Five aromaticsbearing a 4-O-methylglucose unit from Cordyceps cicadae.Helvetica chimicaacta,2007,90:404-410.)。蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae Miq.Samson)又名雌蝉花，是从蝉花子实体中有丝分裂出的孢子真菌，被视为“中药八珍”之一。我国把蝉花等药用菌作为药材使用的历史已很久远，早在明代的《本草纲目》就已记载了包括冬虫夏草、蝉花、灵芝等40多种药用菌。现代研究报道蝉拟青霉多糖具有较高的免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂等生物功效(Takano P.,Yahagi N.,Yahagi R.,Takada S.,Yamaguchi M.,Shoda S.,etal.The liquid culture filtrates of Paecilomyces tenuipes(Peck)Samson(＝Isariajaponica Yasuda)and Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson(＝Isaria sinclairii(Berk.)Llond)regulate Th1and Th2cytokine response in murine Peyer’s patchcells in vitro and ex vivo.International Immunopharmocology,2005,5:903-916.)。
蝉花生长需要特定的生态环境和昆虫寄主，因而蝉花野生资源有限，人工采集困难，因此人们大多采用固体或液体深层发酵的方法获得蝉花的替代品。中国专利ZL201110120360.1(授权公告号CN102242154A)中公开了一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用，该培养方法能生产出大量蝉拟青霉菌丝体，工艺周期短、产量高，且产物具有抗肿瘤、免疫调节、降脂等功效。中国专利ZL201110122002.4(授权公告号CN 102242079A)中公开了生产蝉拟青霉分生孢子的培养基，包括固相培养基和液体培养基；该方法能够产生大量蝉拟青霉分生孢子，且其培养产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、三萜类、多种氨基酸等成分，具有免疫调节等功能。中国专利ZL201110174054.6(授权公告号CN102835245A)中公开了一种蝉花的仿生培养方法，包括菌种分离、筛选、孢子培养、浸染感染体、介质培养、采收等步骤及其培养条件，易于规模化培养，腺苷含量高。Ukai研究组从蝉花子实体中分离得到3种水溶性半乳甘露聚糖C-3、CI-P和CI-A。C-3的相对分子质量为2.7×104Da，由D-甘露糖和D-半乳糖组成，摩尔比是4:3，主链由α-D-(1→2)和α-D-(1→6)吡喃甘露糖残基构成，支链为β-D-(1→2)-呋喃半乳糖残基。CI-P和CI-A均由D-甘露糖和D-半乳糖组成，摩尔比分别为1.0:0.85和1.0:0.57，相对分子质量均为2.5×104Da，两种半乳甘露聚糖具有相似的结构，主链由α-D-(1→6)吡喃甘露糖残基构成，支链为β-D-(1→2)-呋喃半乳糖残基(Ukai S,Matsuura S,Hara C,et al.Structure of a new galactomannan fromthe ascocarps of Cordyceps cicadae shing[J].Carbohydrate Research,1982,101(1):109-116；Kiho,T.,Miyamoto,I.,Nagai,K.,et al.Minor,protein-containinggalactomannans from the insect-body portion of the fungal preparation Chán huā(Cordyceps cicadae)[J].Carbohydrate Research,1988,181,207-215.)。Chyau等从蝉花菌丝中得到3种糖蛋白，平均分子量分别为543、31和6.3kDa(Chyau C C,Chen C C,ChenJ C,et al.Mycelia glycoproteins from Cordyceps sobolifera amelioratecyclosporine-induced renal tubule dysfunction in rats[J].Journal ofEthnopharmacology,2014,153(3):650-658.)。Ren等从固体发酵的蝉花菌丝中获得多糖FPCPS，由甘露糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为43.2:32.1:14.5:10.2，Mw为3.754×106Da，Rg＝41.1nm，在溶液中呈无规线团链构象(Ren X,He L,Cheng J,etal.Optimization of the solid-state fermentation and properties of apolysaccharide from Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson and its antioxidantactivities in vitro[J].PloS One,2014,9(2):e87578.)。蝉拟青霉多糖具有免疫调节功能，PCP可以提高RAW 264.7细胞中NO的含量和促进细胞因子IL-1b、IL-6、TNF-a基因的表达(Cheng J W,Wang Y B,He L,et al.Optimization of fermentation process for theproduction of intracellular polysaccharide from Paecilomyces cicadae and theimmuno-stimulating activity of intracellular polysaccharide[J].World Journalof Microbiology and Biotechnology,2012,28(12):3293-3299.)。上述报道大多是关于蝉拟青霉发酵培养方法及生物活性、蝉花子实体多糖及固体培养基多糖的结构研究，未涉及蝉拟青霉液体深层发酵获得的菌丝体多糖的高级结构分析，比如对其单糖组成、糖苷键连接方式等未见报道；而且越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新药是具有非常重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从蝉拟青霉深层发酵所得菌丝体中分离确定出化学结构特征的蝉拟青霉菌丝体多糖，即蝉花菌素。
本发明的另一目的是提供所述蝉花菌素的制备和用途，该蝉花菌素的制备方法，具有操作简单、易于控制的优点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种蝉花菌素，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其中，甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖的物质的量之比为45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30。
所述的甘露糖为α-甘露糖，优选为α-D-甘露糖；所述的半乳糖为α-半乳糖，优选为α-D-半乳糖；所述的鼠李糖为β-鼠李糖，优选为β-L-鼠李糖；所述的葡萄糖为α-葡萄糖，优选为α-D-葡萄糖。
所述的多糖的结构单元中优选主链结构为(1→4)连接β-L-鼠李糖(β-L-Rhap)残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖(α-D-Manp)残基，支链为(1→4)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)，支链连接在α-D-甘露糖残基的O-3位。
所述的蝉花菌素的侧链有多种不同的变化组合，如可具有如式Ⅰ所示 的结构单元：
式Ⅰ中，Rhap为吡喃型鼠李糖，Manp为吡喃型甘露糖，Galp为吡喃型半乳糖，Glcp为吡喃型葡萄糖。
所述的蝉花菌素的重均分子量为25KDa-40KDa，进一步优选为29.4KDa-30.9KDa，KDa为千道尔顿。
所述的蝉花菌素由蝉拟青霉菌液体深层发酵、提取分离得到。具体技术方案如下：
一种蝉花菌素的制备方法，包括步骤：
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量5％-10％(重量百分比)，在18℃-26℃条件下，静置培养6天-12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中所用的培养基包含(重量百分比)：葡萄糖10％-20％、酵母粉5％-10％、蛋白胨3％-9％、蝉蛹粉0.2％-1.0％、KH2PO40.5％-1.2％和MgSO4.7H2O 0.1％-0.8％；
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏水形成料液，70℃-90℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入乙醇水溶液，搅拌混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青 霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖(DEAE纤维素-Sepharose)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状蝉拟青霉菌丝体多糖(即蝉花菌素)，命名为PCIPS2。
所述的蝉拟青霉菌种可采用任意一种蝉拟青霉菌种，可采用市售产品。例如蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏。
所述的接种量指接入的菌种体积与培养基体积之比的百分数。
为了达到更好的发明效果，优选：
步骤(2)中，所述的乙醇水溶液的用量优选为浓缩液体积的4倍-5倍；所述的乙醇水溶液的体积百分浓度优选为90％-96％；所述的沉淀过夜的温度优选为2℃-5℃。
步骤(3)中，所述的蛋白酶为胰蛋白酶；所述的蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的1％-2％。
所述的用蛋白酶酶解的条件优选为：50℃-55℃水浴2h-2.5h。
本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下灭酶15min-20min。
所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。
步骤(4)中，在去离子水中透析的时间优选为60h-120h。
步骤(5)中，所述的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液的浓度为5mg/mL-20mg/mL，流速为0.5ml/min-1.2ml/min。
步骤(5)中，所述的二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/L的NaCl水溶液，流速0.5ml/min-1.2ml/min。
步骤(5)中，所述的凝胶过滤层析的条件为：流速0.5ml/min，洗脱 液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。所述的凝胶选用葡聚糖凝胶，如市售的Sephacryl S100等。
所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。
所述的培养基中一般还含有余量的无菌水。
所述的蝉拟青霉菌丝体中蝉花菌素具有较强的氧自由基清除作用，其中在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml)与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2(IC5047.7μg/ml)也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明蝉花菌素具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可广泛用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次通过对蝉拟青霉菌液体深层发酵，提取分离获得一种具有生物活性的大分子蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2，经单糖组成鉴定发现该多糖是由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30；FTIR证明PCIPS2是杂多糖类，含有α与β构型；激光光散射法证明它是单一组分且分子量为25KDa-40KDa，核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，主链结构为(1→4)连接β-L-Rhap残基和(1→6)连接的α-D-Manp残基，支链为(1→4)连接的α-D-Galp残基和端基α-D-Glcp，支链连接在α-D-Manp残基的O-3位。原子力显微镜观测出该多糖链直径在0.6nm-1.0nm。
本发明方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明方法制备蝉花菌素，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。
本发明蝉拟青霉菌丝体中蝉花菌素具有较强的氧自由基清除作用，其中在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml)与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2(IC5047.7μg/ml)也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明蝉花菌素具有较 强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面，有利于进一步高效开发该真菌资源。
附图说明
图1A为蝉拟青霉菌丝体多糖DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度曲线，Tube number为管数；图1B为蝉拟青霉菌丝体多糖丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S100纯化洗脱液在490nm的吸光度曲线，Tube number为管数，纵坐标Absorbance at 490nm为在490nm吸光度；
图2为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后PCIPS2溶液的HPLC图谱；A为对照图谱，B为样品图谱，其中，纵坐标mAU为响应值，横坐标Retention time为保留时间，Man为甘露糖，Rib为核糖，Rham为鼠李糖，GlcUA为葡萄糖醛酸，GalUA为半乳糖醛酸，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖，Xyl为木糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖；
图3为PCIPS2的红外光谱，其中，纵坐标Transmittance为透光率，横坐标Wavenumbers为波数；
图4为PCIPS2的激光光散射图；其中，纵坐标relative scale为相对比例，横坐标time为时间
图5为PCIPS2的1H-NMR图谱(A)与13C-NMR图谱(B)；
图6为PCIPS2的1H/13C HMQC图谱(A)与1H/13C HMBC图谱(B)；
图7为PCIPS2原子力显微镜测试图，其中，Line profile：Red-240为红色240的谱线轮廓，cursor为光标，Angle(deg)为角，Power Spectrum：Red-240为红色240的能谱。
具体实施方式
蝉拟青霉菌种，购自金寨嘉德中药材有限公司。
实施例1
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量8％(重量百分比)，在24℃条件下，静置培养8天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖14％，酵母粉8％，蛋白胨5％，蝉蛹粉0.6％，KH2PO40.8％，MgSO4.7H2O 0.4％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏水形成料液，85℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积4倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为92％)，搅拌混匀，3℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水，得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟 青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的1.3％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析袋在去离子水中透析100h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到6mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速1.0ml/min；洗脱液为0.8mol/L-1.0mol/LNaCl水溶液，流速1.0ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
实施例2
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量5％(重量百分比)，在18℃条件下，静置培养6天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖10％，酵母粉5％，蛋白胨3％，蝉蛹粉0.2％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O 0.1％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏水形成料液，70℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积5倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为90％)，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水，得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的1％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析袋在去离子水透析60h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到5mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速1.2ml/min；洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/LNaCl水溶液，流速1.2ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(和图1一样)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
实施例3
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量10％(重量百分比)，在26℃条件下，静置培养12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中所用的培养基重量百分比组成为：葡萄糖20％，酵母粉10％，蛋白胨9％，蝉蛹粉1.0％，KH2PO41.2％，MgSO4.7H2O 0.8％，余量为无菌水。
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏水形成料液，90℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积5倍量的乙醇水溶液(体积百分浓度为96％)，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖溶于水，得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液，将胰蛋白酶溶液加到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液中，胰蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的2％，然后在50℃水浴2h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析袋在去离子水透析120h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到20mg/mL的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速0.5ml/min；洗脱液为0.1mol/L-1.0mol/L NaCl水溶液，流速0.5ml/min，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(和图1一样)，收集第二洗脱峰的洗脱液；
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephacryl S100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl 水溶液的体积比为3:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为3000Da-6000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素，命名为PCIPS2。
下面是对PCIPS2结构鉴定或性能分析的实施例：
实施例4：理化性质组分及分子量检测
将实施例1制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.3％。从图4看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的比值为1.044，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝3.09×104Da。
将实施例2制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.1％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的比值为1.025，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝3.02×104Da。
将实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖即蝉花菌素PCIPS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖含量为99.5％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相 似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCIPS2的保留时间主要分布在10min-19min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCIPS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。蝉花菌素Mw/Mn的比值为1.016，比较接近1，表明PCIPS2是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝2.94×104Da。
实施例5：单糖组成
实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS23mg，加入1mL4mol/L TFA溶液，置于具塞试管中、氮气封口，121℃水解6h，冷却至室温，加入200μL甲醇，60℃真空离心浓缩，去除残留的三氟乙酸，反复3次，待衍生化。将各种单糖和糖醛酸标准品溶在0.3M(mol/L)氢氧化钠水溶液中配制每种单糖和糖醛酸浓度为5mmol/L(mM)的单糖和糖醛酸标准品溶液，将多糖PCIPS2水解样品溶在0.3M氢氧化钠水溶液中配制蛋白多糖PCIPS2水解样品浓度为5mmol/L的PCIPS2溶液，然后分别取50μl单糖和糖醛酸标准品溶液、取50μlPCIPS2溶液，各加入50μl 0.5M PMP甲醇液，混匀，70℃水浴100min，冷却至室温，加入50μl、0.3M HCl水溶液中和，10000rpm离心3min，将上清液转移至另一干净离心管，加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层后收集水相，为了除去PMP、过剩反应试剂等杂质，收集的水相，重复“加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层”的步骤三次，过0.22μm膜，分别得到PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液和PMP衍生化后PCIPS2溶液，待HPLC检测。
HPLC条件:柱子APS-2HYPERSIL(5μm，4.6×250mm)，检测波长245nm，流速1.0ml/min，柱温：室温，注入体积：10μl PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液或10μl PMP衍生化后PCIPS2溶液，流动相A(乙腈):流动相B(0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8))＝16:84(体积比)。
如图2，对应单糖和糖醛酸标准品，实施例1PCIPS2多糖部分的单糖组成为由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为47.2: 6.5:2.3:1.0；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
对应单糖和糖醛酸标准品，实施例2PCIPS2多糖部分的单糖组成为由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为50.2:8.3:2.1:0.8；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
对应单糖和糖醛酸标准品，实施例3PCIPS2多糖部分的单糖组成为由甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖组成，其物质的量之比为45.2:5.5:2.6:1.3；说明PCIPS2是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
实施例6：FITR
取5mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2，用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-600cm-1红外扫描。
如图3，IR谱图在3049cm-1，出现一强宽吸收峰，为多糖上O-H伸缩振动的强吸收峰，表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。2929cm-1为C-H伸缩振动，1400-1200cm-1处的吸收峰为C-H的变形振动，表明该组分为多聚糖。1615cm-1和1401cm-1为-CH2的变形振动吸收峰。此外，在1041cm-1存在多糖结构中吡喃环的特征吸收峰，即糖苷键C-O-C的非对称振动吸收峰。在896cm-1和860cm-1处的吸收峰分别表征多糖中同时存在β-型糖苷键和α-型糖苷键，而且810cm-1为甘露糖的特征吸收峰，说明PCIPS2中含有甘露糖。350-660cm-1处存在的吸收峰，表明该多糖为吡喃型。
实施例7：甲基化分析
取2mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2样品溶于1ml DMSO中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylation ofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。
PCIPS2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表可知： 鼠李糖和半乳糖均存在端基，(1→4)键两种连接方式，甘露糖以1,6-link ed Manp和1,3,6-linked Manp两种方式连接，而且PCIPS2的分支点主要位于甘露糖上。上述结果表明PCIPS2由L-Rhap-(1→，→4)-L-Rhap-(1→，D-Glcp-(1→，D-Galp-(1→，→4)-D-Galp-(1→，→1)-D-Manp-(6→，→1)-D-Manp-(3,6→组成，摩尔比为0.226:2.559:1.00:0.778:6.625:47.040:1.407。
通过比较PCIPS2的甲基化结果发现，多糖中(1→6)糖苷键连接的甘露糖含量最高，其次是(1→4)糖苷键连接的鼠李糖，而(1→3,6)糖苷键连接的甘露糖含量较少，另外还有少量的葡萄糖、鼠李糖和半乳糖的端基，表明多糖的主链是以(1→6)糖苷键连接的甘露糖，支链由D-Glcp-(1→和→4)-D-Galp-(1→组成。此外，经NMR分析得到证明，→4)-L-Rhap-(1→连接在半乳糖主链的首端。糖残基的摩尔比与上述单糖组成的摩尔比基本一致。
表1PCIPS2甲基化分析
实施例8：核磁共振
取60mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多 糖PCIPS2溶于1ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。
根据PCIPS2的1H-NMR(见图5A)、13C-NMR(见图5B)结合HMQC谱(见图6A)，检测到11个峰，然而只有7个峰较为显著可用于分析。在1H-NMR谱中，PCIPS2的异头质子区(δ4.42-5.18ppm)主要有7个异头氢信号(见图5A)，按低场道高场分别为δ5.18、δ5.13、δ5.13、δ5.11、δ5.03、δ4.88和δ4.42ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E、F、G，分别与13C-NMR谱中异头碳区的碳信号(图5B)，δ107.16、δ109.12、δ103.67、δ108.74、δ110.68、δ104.51和δ106.28ppm逐一对应。其中A、E归属于半乳糖(Galp)残基，B归属于葡萄糖(Glcp)残基，C、D归属于甘露糖(Manp)残基，F、G归属于鼠李糖(Rhap)残基。从各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型(δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型)，除Rhap异头氢的化学位移处于相对高场(δ<5.00)，为β-吡喃鼠李糖构型，Galp、Glcp、Manp的异头氢的化学位移均处于相对低场(δ>5.00)，为α-构型。糖残基A-G的1H-NMR、13C-NMR谱化学位移经结合1H-1H COSY、TCOSY、HMQC和HMBC谱归属完毕(表2)。
通过NMR数据比对发现(见表2)，残基A归属于(1→4)-α-D-Galp残基，C-1/H-1(δ107.16/5.18ppm)，C-4/H-4(δ78.47/4.05ppm)发生取代，化学位移向低场移动。残基E，B分别为(1→)-α-D-Galp和(1→)-α-D-Glcp残基，因为它们的仅有C-1位发生取代，向低场移动δ110.68ppm(E)，δ109.12ppm(B)。残基C，D的C-6化学位移为δ69.91-69.34ppm，表明其C-6位被取代，此外D残基的C-3(δ84.62ppm)化学位移向低场移动，表明D为(1→3,6)-α-D-Manp残基，C为(1→6)-α-D-Manp残基。同理F残基，δ104.51ppm(C-1)和G残基δ106.28ppm(C-1)，δ71.30ppm(C-4)分别是(1→)-β-L-Rhap残基和(1→4)-β-L-Rhap残基。
表2PCIPS2糖残基的化学位移全归属
通过HMBC谱(图6B)可以推断出多糖PCIPS2糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基C的H-1(δ5.13ppm)与残基C的C-6(δ69.91ppm)存在交叉峰，表明残基C的自身连接为→6)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→。残基D的H-1(δ5.11ppm)与残基D的C-6(δ69.34ppm)存在交叉峰，表明残基D的自身连接为→3,6)-α-D-Manp-(1→3,6)-α-D-Manp-(1→。残基C的H-1(δ5.13ppm)与残基D的C-6(δ69.34ppm)有相关点，残基D的H-1(δ5.11ppm)与残基C的C-6(δ69.91ppm)有相关点，则表明残基C与残基D的连接为→6)-α-D-Manp-(1→3,6)-α-D-Manp-(1→，→3,6)-α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→，而且其摩尔比远大于其他残基，是残基C、D组成主链。残基A的H-1(δ5.18ppm) 与残基A的C-4(δ65.65ppm)存在交叉峰，表明残基A的自身连接为→4)-α-D-Galp-(1→4)-α-D-Galp-(1→。残基A的H-1(δ5.18ppm)与残基D的C-3(δ84.62ppm)关联，表明残基A的C-1与主链的C-3连接。残基E的H-1(δ5.03ppm)与残基A的C-4(δ78.47ppm)有相关点，表明残基E连接在由(1→4)-α-D-Galp残基组成的支链的末端。残基B的H-1(δ5.13ppm)与残基D的C-3(δ84.62ppm)相关，表明(1→)-α-D-Glcp残基与主链的C-3连接。残基G的H-1(δ4.42ppm)与残基G的C-4(δ71.30ppm)存在交叉峰，表明残基G的自身连接为→4)-β-L-Rhap-(1→4)-β-L-Rhap-(1→。残基G的H-1(δ4.42ppm)与残基C的C-6(δ69.91ppm)关联，表明残基G以O-6连接在主链上，而残基F连接在残基G的末端。上述结果与甲基化分析的结果相符。
实施例9：原子力显微镜测试
将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2水溶液涂抹在云母片上测试，获得该多糖的原子力图，如图7，其中图7A为2维原子力形貌图，图7B为3维立体形貌图，图7C为各形貌测量值，从结果中可以看出样品轮廓长度约为80nm-100nm，高度为0.6nm-1.0nm，从而可以判断大多数由多个分子聚集而成的，进一步证实PCIPS2是具有一定分支的柔顺链。
本发明建立了蝉拟青霉菌丝体多糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。
综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了PCIPS2由重量百分含量为99％以上的多糖组成；多糖的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其中，甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖的物质的量之比为45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30。甘露糖为α-D-甘露糖，半乳糖为α-D-半乳糖，鼠李糖为β-L-鼠李糖，葡萄糖为α-D-葡萄糖。多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接β-L-Rhap残基和(1→6)连接的α-D-Manp残基，支链为(1→4)连接的α-D-Galp残基和端基α-D-Glcp，支链连接在α-D-Manp残基的O-3位；具体结构单元如结构式Ⅰ所示。
实施例10：ABTS·+自由基清除活性
本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2的ABTS·+自由基清除能力。
参考Re等的方法(Re,Pellegrini,Proteggente,Pannala,Yang,&Rice-Evans,1999)。ABTS·+由7mmol/L ABTS溶液和2.45mmol/L K2S2O8水溶液室温避光反应16h后生成，该溶液提前1天配制，并且必须当天使用。使用前用0.1M PBS(pH7.4)稀释到吸光值在734nm处为0.70±0.02。0.1mL样品(50-500μg/ml)溶液加到3.9mL ABTS·+溶液中，充分混合，避光反应6min进行吸光值测定，Vc作为对照。按照下列公式计算待测样品对ABTS自由基的清除率:
清除率(％)＝(1-A/A0)×100％
式中A0为3.9mL ABTS溶液加0.1mL蒸馏水的吸光值；A为3.9mLABTS溶液加0.1mL待测样品的吸光值。检测结果见表3。
实施例11：DPPH自由基清除活性
本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体多糖PCIPS2的DPPH自由基清除能力。
参考Cheng等的方法并作适当修改(Cheng,Feng,Jia,Li,Zhou,&Ding,2013)。取0.5mL不同浓度的多糖待测样品(15μg/mL-250μg/mL)于试管中，加入1.5mL去离子水，2.0mL0.1mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均匀，室温避光反应30min，在517nm波长处测吸光度，Vc作为对照。按照下列公式计算待测样品对DPPH自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中A0为2mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL蒸馏水的吸光值；A1为2mL0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液加2mL待测样品的吸光值。检测结果见表3。
表3PCIPS2与对照组Vc的抗氧化活性比较
| 样品 | ABTS·+(IC50μg/ml) | DPPH(IC50μg/ml) |
| Vc | 158.2±0.03 | 36.4±0.06 |
| PCIPS2 | 206.8±0.12 | 47.7±0.07 |
从表3中看出，在ABTS·+清除率模型当中，PCIPS2(IC50206.8μg/ml)与对照组Vc(IC50158.2μg/ml)比较接近；在DPPH清除率模型中，PCIPS2(IC5047.7μg/ml)也与对照组Vc(IC5036.4μg/ml)非常接近；表明本发明蝉花菌素具有较强的抗氧自由基活性，可以作为抗氧化剂使用或者用于制备抗氧化剂，可用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
Claims (6)
1.一种蝉花菌素，其特征在于，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述的多糖的组成为甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其中，甘露糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖的物质的量之比为45.20-50.20:5.50-8.30:2.10-2.60:0.80-1.30；
所述的甘露糖为α-D-甘露糖；所述的半乳糖为α-D-半乳糖；所述的鼠李糖为β-L-鼠李糖；所述的葡萄糖为α-D-葡萄糖；
所述的多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接β-L-鼠李糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基，支链为(1→4)连接的α-D-半乳糖残基和端基α-D-葡萄糖，支链连接在α-D-甘露糖残基的O-3位；
所述的蝉花菌素的重均分子量为25KDa-40KDa。
2.根据权利要求1所述的蝉花菌素，其特征在于，所述的蝉花菌素的重均分子量为29.4KDa-30.9KDa。
3.根据权利要求1-2任一项所述的蝉花菌素的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)深层发酵：在培养基中接入蝉拟青霉菌种，接种量5％-10％，在18℃-26℃条件下，静置培养6天-12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；其中所用的培养基包含：葡萄糖10％-20％、酵母粉5％-10％、蛋白胨3％-9％、蝉蛹粉0.2％-1.0％、KH2PO4 0.5％-1.2％和MgSO4.7H2O0.1％-0.8％；
(2)提取：将步骤(1)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎后，加入蒸馏水形成料液，70℃-90℃提取、离心，所得提取液浓缩，得到浓缩液，再加入乙醇水溶液，搅拌混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为3000Da-6000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到二次蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状蝉拟青霉菌丝体多糖，即蝉花菌素。
4.根据权利要求3所述的蝉花菌素的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。
5.根据权利要求3或4所述的蝉花菌素的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶的重量为一次蝉拟青霉菌丝体粗多糖重量的1％-2％。
6.根据权利要求1-2任一项所述的蝉花菌素在作为抗氧化剂或者制备抗氧化剂中的应用。
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2015
- 2015-02-03 CN CN201510055520.7A patent/CN104672339B/zh active Active
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| CN110279724A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-09-27 | 兰溪市立顺生物有限公司 | 蝉花活性物质及其用于预防、延缓或治疗白内障的用途 |
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