CN108276501B

CN108276501B - 一种富硒蝉虫草多糖的制备方法和应用

Info

Publication number: CN108276501B
Application number: CN201711406884.0A
Authority: CN
Inventors: 黄锡山; 潘亚宏; 佘志刚; 李闯彪; 梅秀丽
Original assignee: Guangzhou Jinchanhua Technology Co ltd; Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou Jinchanhua Technology Co ltd; Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108276501A

Abstract

本发明公开了一种富硒蝉虫草多糖的制备方法和应用。该制备方法，包括如下步骤：S1.将富硒虫草干燥后，超微粉碎，过80～120目筛，得到富硒虫草粉末；S2.将所述富硒虫草粉末进行二氧化碳超临界萃取，获得富硒虫草多糖。本发明经过适当的干燥和粉碎，能够有效提取有效活性成分，使其流失少，操作简单易行，效果好、效率高，污染小，成本低廉，有利于规模化生产；另外，本发明通过选择合理的萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂，提高了提取效率的同时还有助于提高富硒蝉虫草多糖的产量和硒的含量；制得的富硒蝉虫草多糖，具有增强机体免疫调节功能的作用，产品不仅更有利于吸收，而且稳定性好。

Description

一种富硒蝉虫草多糖的制备方法和应用

技术领域

本发明属于保健食品加工技术领域。更具体地，涉及一种富硒蝉虫草多糖的制备方法和应用。

背景技术

目前提取各种多糖的传统方法主要有热水浸提醇沉法、酸提法、醇提取法、水浴回流法以及超声波提取法等。酸提法的提取时间和温度控制较严格，提取条件不易掌控；热水浸提、水浴回流等提取法容易导致多糖物质产生氧化、分解等反应，极大地影响多糖类物质的生物活性；这些方法都存在溶剂消耗大、环境污染、操作繁琐、提取率不高等缺点。

据世卫组织统计，中国的大部分地区共有超过10亿的人群严重缺乏硒元素，随意社会飞速发展以及生活节奏的加快，城市上班族超过5亿人群均处于免疫力低下等亚健康状态。在食品中适当添加含有一定量的硒元素食品，有助于人体吸收，并促进肌体调节和人体健康的有效途径。而硒制剂中以有机硒为佳，与无机硒相比有机硒具有吸收率高、无毒性等优点，因此，开发富含硒的食品，使硒元素被生物体吸收，经过生物作用转化为有机硒，再供人们食用是补硒的最好方法。

蝉花虫草里的多糖组份含量显著高于冬虫夏草，现代药理活性实验证实其虫草多糖是免疫调节主要成分。但是，目前常用的蝉虫草多糖提取工艺较复杂，而且经过上述提取方法进行处理后，蝉虫草中硒元素的含量大量下降，因此需要寻找更好的提取率高、成本低和易于工艺化生产的能同时兼得硒元素和蝉虫草多糖的工艺。有关富硒蝉虫草多糖的提取研究至今未见国内外文献报道，也未见相应专利公开。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种富硒蝉虫草多糖的制备方法和应用。本发明针对富硒蝉虫草的多糖的特性提供了一种合适产业化的超临界萃取富硒蝉虫草多糖的工艺。该工艺具有简单、高效、成本低、产率高等特点。

本发明的第一个目的是提供一种富硒蝉虫草多糖的制备方法。

本发明的第二个目的是提供由上述制备方法制得的富硒蝉虫草多糖。

本发明的第三个目的是提供由上述富硒蝉虫草多糖在制备增强人体免疫力药物、食品或保健品中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种富硒虫草多糖的制备方法，主要包括如下步骤：

S1.将富硒虫草干燥后，超微粉碎，过80～120目(优选100目)筛，得到富硒虫草粉末；

S2.将所述富硒虫草粉末进行二氧化碳超临界萃取，获得富硒虫草多糖。

优选地，所述虫草为蝉虫草。更优选地，为富硒蝉虫草子实体或培养基座。

优选地，步骤S2中二氧化碳超临界萃取所用的夹带剂为35％～95％的乙醇水溶液。

优选地，所述夹带剂的流量为2.5～5mL/min。

更优选地，所述夹带剂的流量为2.5～3.5mL/min。

最优选地，所述夹带剂的流量为3.5mL/min。

优选地，步骤S2中的萃取压力优选为10～40MPa。

更优选地，步骤S2中的萃取压力为28～35MPa。

最优选地，步骤S2中的萃取压力30MPa。

优选地，步骤S2中的萃取温度为35～70℃。

更优选地，步骤S2中的萃取温度为35～45℃。

最优选地，步骤S2中的萃取温度为40℃。

优选地，步骤S2中的萃取时间为50～150min。

更优选地，步骤S2中的萃取时间为60～120min。

最优选地，步骤S2中的萃取时间为120min。

即最优选地，步骤S2所述采用超临界萃取获得富硒蝉虫草多糖的条件：超临界CO₂萃取过程采取的压力为30MPa，夹带剂为95％乙醇水溶液，夹带剂流量为3.5mL/min，萃取温度为40℃，萃取时间为120min。

另外，步骤S1所述干燥的条件是：35～55℃干燥6～10h。

本发明方法获取富硒虫草多糖的总提取率为71.3％～75.1％。

本发明还涉及了上述任一所述的制备方法得到的富硒虫草多糖；所述富硒虫草多糖的硒含量为100～120mg/Kg。

本发明还涉及了所述的富硒虫草多糖在制备增强人体免疫力药品或食品中的应用。所述食品包括保健食品。

优选地，增强免疫力是指增强单核巨噬细胞的吞噬功能、增加血清中溶血素的含量。

本发明通过人工培养蝉虫草的方法，让蝉虫草在生长过程中吸收硒肥中的硒元素，从而使硒元素转化成为更容易为人体吸收的有机硒，进一步提取其具有显著免疫调节功能的多糖成份，从而使得人们在通过含硒元素的蝉虫草多糖产品，而吸收硒元素以及蝉虫草的多糖组份，起到增强人体免疫力的保健作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的富硒蝉虫草多糖的提取方法，经过适当的干燥和粉碎，能够有效提取原料的有效活性成分，产品的有效活性成分流失少，操作简单易行，产率高、效果好、效率高，污染小，成本低廉，具有显著的综合经济效益，有利于实现工厂化的规模生产。

2、尤为突出的是，本发明通过选择合理的萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂，一方面极大的提高了提取效率，缩短了提取时间，另一方面降低了提取温度，避免了高温对于有效成分的破坏，对于原料中遇热不稳定等有效成分起到了保护作用，还节省了能耗；同时还有助于提高富硒蝉虫草多糖的产量和多糖中硒的含量，保证产品的质量。

3、通过本发明提供的富硒蝉虫草多糖的制备方法制得的富硒蝉虫草多糖，可应用在制备具有增强机体免疫调节功能的保健药品或食品添加剂中，不仅更有利于吸收，而且产品稳定性好。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种富硒蝉虫草多糖的提取方法

1、本发明的提取方法

一种富硒蝉虫草多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)将8Kg的富硒蝉虫草于鼓风烘箱中，50℃干燥10h后，超微粉碎，过100目筛；

(2)采用超临界CO₂萃取法提取富硒蝉虫草多糖：萃取压力为30MPa，夹带剂为95％乙醇水溶液，夹带剂流量为3.5mL/min，萃取温度为40℃，萃取时间为120min。

本实施例中，最终得到的富硒蝉虫草多糖的质量为6.008Kg，总提取率为75.1％，其中，硒含量为120mg/Kg。

2、对比试验1

现有的富硒蝉虫草多糖的制备方法：步骤如下：

(1)将8Kg的富硒蝉虫草干燥，粉碎至100目，加入蒸馏水，搅拌均匀，然后超声处理1min；蝉虫草与蒸馏水的质量体积比为1：18，单位为g/mL；

(2)将步骤(1)超声处理后的蝉虫草水溶液加热至90℃，搅拌反应20min，然后过滤收集滤饼和滤液，滤液加入乙醇，静置，析出富硒蝉虫草多糖。

结果经过测试，最终得到的富硒蝉虫草多糖的质量为4.8Kg，总提取率为60％，其中，硒含量为40mg/Kg。

3、对比试验2

(1)将8Kg的富硒蝉虫草干燥后，超微粉碎，加入PDA液体培养基，得到含有富硒的溶液；

(2)超滤与浓缩：将步骤(1)得到的溶液利用超滤膜进行超滤处理，超滤处理的压力为0.2Mpa，超滤处理的温度为40℃，之后，将超滤后将被截留的截留液置于70℃下，将其浓缩为原体积的1/8；

(3)富硒粗多糖粉末提取：将所述步骤(2)的浓缩液置于超声波中，进行超声处理30min，然后将超声波处理液置于85℃热水中浸提，浸提时间为4h，之后将浸提液置于高速离心机中进行离心，离心速度为4500rpm，离心时间为20min，收集上清液，加入4倍体积的96％的乙醇，静置16h，再置于5000rpm的离心速度下离心15min，去沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤3次，离心，沉淀真空干燥，得到富硒粗多糖粉末；

(6)脱蛋白处理：将所述步骤(5)得到的富硒粗多糖粉末溶解于15倍体积的蒸馏水中，用碳酸钠调节PH至7.8，之后加入质量为1/25粗多糖粉末的胰蛋白酶，60℃水解2h，用草酸调节pH为5.2，加入质量为1/20粗多糖粉末的木瓜蛋白酶，在75℃下水解3h，之后再利用碳酸钠调节pH至7，加入Sevag试剂，并充分振荡混合，静置3h，取上清液，之后置于离心机中离心3min，重复操作，直到不出现蛋白沉淀；

(7)脱蛋白富硒多糖提取：将所述步骤(6)得到的上清液中加入4倍体积的96％的乙醇醇析，得到沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤后，真空干燥，得到脱蛋白富硒多糖。

结果经过测试，最终得到的富硒蝉虫草多糖的质量为3.44Kg，总提取率为43％。其中，硒含量为50mg/Kg。

4、经过上述对比可知，本发明的方法更加简单易行，更重要的是，得率显著提升，且产品的有效活性成分流失少，硒含量更高。

实施例2一种富硒蝉虫草多糖的提取方法

一种富硒蝉虫草多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)将8Kg的富硒蝉虫草干燥后，超微粉碎，过80目筛；

(2)采用超临界CO₂萃取法提取富硒蝉虫草多糖：萃取压力为40MPa，夹带剂为35％乙醇水溶液，夹带剂流量为5mL/min，萃取温度为70℃，萃取时间为50min。

本实施例中，最终得到的富硒蝉虫草多糖的质量为5.704Kg，总提取率为71.3％。其中，硒含量为100mg/Kg。

实施例3一种富硒蝉虫草多糖的提取方法

一种富硒蝉虫草多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)将8Kg的富硒蝉虫草干燥后，超微粉碎，过120目筛；

(2)采用超临界CO₂萃取法提取富硒蝉虫草多糖：萃取压力为10MPa，夹带剂为75％乙醇水溶液，夹带剂流量为2.5mL/min，萃取温度为40℃，萃取时间为150min。

本实施例中，最终得到的富硒蝉虫草多糖的质量为5.792Kg，总提取率为72.4％。其中，硒含量为110mg/Kg。

实施例4提取方法的工艺优化

1、实验方法

(1)正交实验设计

正交实验设计以考察富硒蝉虫草多糖得率及富硒含量为指标，实验中选择萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂流量等四个因素三个水平的考察。得到的富硒蝉虫草多糖通过硫酸-苯酚法测定含量，同时测定富硒含量。

表1富硒蝉虫草多糖超临界萃取的正交实验因素表

(2)萃取压力的选取

根据方差分析，萃取率在低于或高于30MPa时具有显著差异(p＜0.05)。因此，本实验选取萃取压力为25、30、35MPa进行正交实验。

(3)萃取温度的选取

选取压力30MPa，萃取时间60min，夹带剂3.0mL/min，考察不同萃取温度时，萃取温度为40℃处于最佳溶解状态，提取率及富硒含量较高，因此，萃取温度考察35、40、45℃。

(4)萃取时间的选取

萃取压力30MPa，萃取温度40℃，夹带剂3.0mL/min，考察不同萃取时间时，萃取时间为60min萃取率处于平稳，富硒含量适中，但萃取时间为90min富硒含量达稳定，因此，萃取时间考察60、90、120min。

(5)糖类化合物的羟基较多、分子量较大且极性较大，为了提高提取率可在萃取过程中加入极性较高、选择性好、安全的夹带剂对多糖进行提取。本发明选择95％乙醇、无水乙醇、50％乙醇作为夹带剂，考察夹带剂在萃取过程中对多糖提取率。

2、结果

由正交实验的分析结果显示，影响富硒蝉虫草多糖的提取得率及富硒含量最显著的因素是萃取温度，其次为萃取时间、萃取压力、夹带剂流量，根据极差分析得到的最优萃取条件组合A2B2C3D2，即萃取温度为40℃、萃取压力为30MPa，夹带剂流量为3.0mL/min、萃取时间为120min。在最佳工艺条件下对富硒蝉虫草的多糖提取进行3次萃取平行试验，平均萃取得率为75.1％，硒含量为120mg/Kg。

实施例5富硒蝉虫草多糖对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

1、实验方法

(1)材料：健康NIH小鼠60只，雄性，体重20～22g左右，富硒蝉虫草多糖由上述实施例1制备得到，临用前用0.5％CMC钠溶液配制。

(2)动物分组与给药：NIH小鼠适应性饲养1周，体重达到22g左右后，使用动物分组软件随机分为2组，即空白对照组、富硒蝉虫草多糖组，每组15只，空白对照组灌胃给予0.5％CMC钠溶液，富硒蝉虫草多糖组灌胃给予受试药物富硒蝉虫草多糖，给药剂量为0.048g生药/Kg，连续给药15天，1次/天，给药容量为20mL/Kg。

(3)动物处理：参照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》中的方法，末次给药1h后尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10体质量注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血加入到0.1％Na₂CO₃溶液中，摇匀；以0.1％Na₂CO₃溶液作空白对照，用酶标仪在600nm波长处比色测光密度值(OD)。

(4)取样：将小鼠处死，取肝、脾，称质量，计算吞噬指数(a)，其中，吞噬指数计算方法为：K＝(lgOD₁-lgOD₂)/(t₂-t₁)，a＝体质量×K^1/3(肝质量+脾质量)。

2、统计学处理

数据采用X±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，统计分析应用SPSS17.0统计软件处理。

3、结果

如表2所示，与生理盐水组比较，各受试物给药组的吞噬指数均明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)。表明富硒蝉虫草多糖能够提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能。

表2富硒蝉虫草多糖对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响(X±s，n＝15)

注：与生理盐水组比较，**P<0.01。

实施例6富硒蝉虫草多糖对小鼠血清溶血素的影响

1、实验方法

(1)受试动物与药物：健康NIH小鼠60只，雄性，体重20～22g左右，购于广东省医学实验动物中心(合格证号：SYXK(粤)2013-0002)。受试药物富硒蝉虫草多糖由上述实施例1制备得到，临用前用0.5％CMC钠溶液配制。

(2)动物分组与给药：NIH小鼠适应性饲养1周，体重达到22g左右后，使用动物分组软件随机分为2组，即空白对照组、富硒蝉虫草多糖组，每组15只，空白对照组灌胃给予0.5％CMC钠溶液，富硒蝉虫草多糖组灌胃给予受试药物富硒蝉虫草多糖，连续给药15天，1次/天，给药容量为20mL/Kg。

(3)动物处理：参照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》中的方法，小鼠预先用5％鸡红细胞免疫，给药15天后，摘眼球取血，分离血清，用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1mL与5％鸡红细胞悬液0.5mL混合，加入10％补体0.5mL，37℃温浴30min后，离心，取上清液在酶标仪上540nm处比色测光密度值(OD)；另设不加血清的空白对照组，并取上清液为比色时调零。

2、统计学处理

3、结果

如表3所示，与生理盐水组比较，各受试物给药组的溶血样品的上清液光密度值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。表明富硒蝉虫草多糖能够提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能。

表3富硒蝉虫草多糖对小鼠血清溶血素含量的影响(X±s，n＝15)

注：与生理盐水组比较，**P<0.01。

由此可以看出，本发明的提取方法在提高富硒蝉虫草多糖的产量和含量方面具有显著的效果，市场前景广阔；制得的富硒蝉虫草多糖，稳定性好，可应用在制备具有增强机体免疫调节功能的保健药品或食品添加剂中。本领域的技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种富硒虫草多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将富硒虫草干燥后，超微粉碎，过80～120目筛，得到富硒虫草粉末；

S2.将所述富硒虫草粉末在萃取压力为30MPa、萃取温度为40℃、萃取时间为120min条件下进行二氧化碳超临界萃取，获得富硒虫草多糖；

所述虫草为蝉虫草；

步骤S2中所用的夹带剂为95％的乙醇水溶液；所述夹带剂的流量为3.5mL/min。

2.权利要求1所述的制备方法得到的富硒虫草多糖，其特征在于，硒含量为120mg/Kg。

3.权利要求2所述的富硒虫草多糖在制备增强机体免疫力药品或食品中的应用。