CN101003578A

CN101003578A - 一种蝉拟青霉多糖分离纯化的方法

Info

Publication number: CN101003578A
Application number: CN 200610006571
Authority: CN
Inventors: 金丽琴; 吕建新
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2007-07-25

Abstract

本发明公开一种蝉拟青霉多糖分离纯化的方法，主要由下述步骤组成：水提醇沉淀法提取蝉拟青霉多糖成分，阴离子交换层析和凝胶过滤层析反复色谱纯化，真空冷冻干燥蝉拟青霉多糖的提取物，即得蝉拟青霉多糖。利用本发明制备的蝉拟青霉多糖能够最大限度分离纯化蝉拟青霉多糖，既不影响多糖天然的结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低、方法简便、成本低、灵活实用，利于推广、开发和应用。

Description

一种蝉拟青霉多糖分离纯化的方法

技术领域

本发明涉及一种应用生物工程技术从蝉拟青霉菌丝体中分离纯化蝉拟青霉多糖的方法。

背景技术

蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miquel.)Samson]，为麦角菌科真菌大蝉草(Cordycepscicadae shing)的分生孢子阶段，即蝉棒束孢菌及其寄主蝉科昆虫山蝉幼虫的干燥复合体，即我国传统中药材蝉花(P.cicadae)。蝉拟青霉与名贵中药材冬虫夏草在起源上有很近的亲缘关系，即与冬虫夏草的无性型—中国拟青霉为同属真菌(虫草属)。《证类本草》谓其性味甘寒无毒，《本草纲目》记载蝉花功同蝉蜕。蝉拟青毒菌丝体具有镇静、镇痛、抗辐射、抗惊厥和解热作用，而且蝉拟青霉对机体的毒性甚微。而多糖不但能治疗癌症和多种免疫缺损疾病，还能治疗诸如风湿病之类的自身免疫病。蝉拟青霉总多糖能影响造血功能，激活巨噬细胞增强非特异免疫功能，拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用，减少老龄鼠体内的脂质过氧化物，与抗衰老有关。

经检索，关于蝉拟青霉多糖的分离纯化方法目前尚无报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种蝉拟青霉多糖的分离纯化的方法。

本发明提供蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，不影响多糖天然的结构，保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。

本方法的具体步骤是从蝉拟青霉菌丝体中通过热水提取有生物活性的粗多糖、去蛋白、除盐、柱层析纯化和冷冻干燥。本发明具体工艺步骤如下：

1、脱脂：取蝉拟青霉菌丝体粉末到1000ml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂24h。黄褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。

2、水提：步骤1所得的脱脂后蝉拟青霉菌丝体粉末按1∶6(W/V)的料液比加入蒸馏水，室温下、pH＝7条件下提取2.5h。混合物用50ml塑料离心管，以5000rpm，15min离心，上清45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1.5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱过夜。收集沉淀，即得蝉拟青霉粗多糖。

3、去蛋白：步骤2所得的蝉拟青霉多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；

4、透析：步骤3所得的水提物浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48小时，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集蝉拟青霉多糖的提取液。

5、纯化：将经步骤4透析后的液体浓缩，以DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。

a)离子交换色谱柱(DEAE纤维素-52)：蒸馏水平衡DEAE纤维素-52(3.5×40cm)，上样量30ml，以0～0.5mol/L的NaHCO₃梯度洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出5个组分，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。

b)凝胶过滤层析初次纯化(Sephadex G-100)：将第1、2组分分别上凝胶柱(3.5×100cm)纯化，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。第1组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第2峰为所需；第2组分经Sephadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第1峰为所需。收集所需峰，浓缩后4℃保存。

c)凝胶柱再次纯化(Sephadex G-75和Sephadex G-100)：第1组分第2峰选择SephadexG-75凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，第2组分第1峰选择Sephadex G-100凝胶柱(1.6×100cm)再次纯化，均以0.1mol/L NaCl洗脱，流速为0.3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。此两个峰纯化后，都经高效液相检测为单一峰。

6、冷冻干燥：将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45℃条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm，30min离心，上清经0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得白色粉末的蝉拟青霉多糖纯品，经高效液相检测纯度为100％，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95％以上。

本发明建立蝉拟青霉多糖的分离纯化工艺，获取均一分子量的多糖，成分为甘露糖和半乳糖，具有免疫调节和抗肿瘤活性。对进一步研究其化学结构和阐明其免疫药理活性机制有重要意义。

附图说明：

图1：多糖经DEAE-纤维素52柱层析分离出5个组分

图2：第1峰的凝胶过滤层析图谱

图3：第1峰经凝胶纯化后的HPLC图谱

具体实施方式

实施例1：

3、去蛋白：步骤2所得的蝉拟青霉多糖水提物溶液溶解于双蒸水，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，随之加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物经剧烈振摇搅拌后，以5000rpm，30min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白7～10次。

a)阴离子交换色谱柱(DEAE纤维素-52)：蒸馏水平衡DEAE纤维素-52(3.5×40cm)，上样量30ml，以0～0.5mol/L的NaHCO₃梯度洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出5个组分(见图1)，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。

b)凝胶过滤层析纯化(Sephadex G-100)：将第1组分分别上凝胶柱(3.5×100cm)纯化，以蒸馏水洗脱，流速为0.5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线(见图2)。然后再将上述纯化的多糖经Sephadex G-100凝胶柱(1.6×100cm)纯化，以蒸馏水洗脱，流速为0.3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。

6、冷冻干燥：将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45℃条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm，30min离心，上清经0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得白色粉末的蝉拟青霉多糖纯品，经高效液相检测纯度为100％(见图3)，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95％以上。

Claims

1.一种蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，由下列步骤实现：

(1)脱脂：将蝉拟青霉菌丝体粉碎，用有机溶剂以常规方式脱脂；

(2)水提：步骤(1)所得的脱脂后蝉拟青霉菌丝体粉末按1∶6(W/V)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20～25小时；以3000～5000rpm离心15～30min，取上清液，得蝉拟青霉多糖水提物溶液；

(3)去蛋白：步骤(2)所得的蝉拟青霉多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；

(4)透析：步骤(3)所得的水提物浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48小时，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集蝉拟青霉多糖的提取液；

(5)纯化：将经步骤(4)透析后的液体浓缩，以DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析，收集液用苯酚硫-酸法检测，合并多糖峰的收集液，真空冷冻干燥，得层析纯细脚拟青霉多糖。

2.如权利要求1说述的蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)所述有机溶剂是甲醇。

3.如权利要求1说述的蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述离心速度是5000rpm，离心时间是15min。

4.如权利要求1说述的蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(3)所述有机溶剂是氯仿和正丁醇。

5.如权利要求1说述的蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述DEAE纤维素-52层析柱(3.5×40cm)，上样量30ml，洗脱液是0～0.5mol/L的NaHCO₃。

6.如权利要求1说述的蝉拟青霉多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述葡聚糖凝胶(SephadexG-100和SephadexG-75)层析柱为3.5×100cm和1.6×100cm两种规格，洗脱液是蒸馏水。