CN102887962A

CN102887962A - 一种分离纯化制备绿茶多糖的方法及其应用

Info

Publication number: CN102887962A
Application number: CN2012103821345A
Authority: CN
Inventors: 蔡为荣; 谢亮亮
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Anhui Polytechnic University
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2013-01-23

Abstract

本发明涉及一种分离纯化制备绿茶多糖的方法及其在制备抗凝血保健品和药物中的应用。其制备方法是绿茶经粉碎、浸提、醇沉、冷冻真空干燥得粗多糖；过聚酰胺柱动态脱色和去蛋白；后经DEAE sepharose CL-6B离子交换柱进一步纯化得绿茶多糖。本发明的技术效果是：有效的去除了绿茶粗多糖中的色素与蛋白质，分离纯化获得的组分与食品药物工艺上可接受的其它原料及辅料开发成相宜的具有抗凝血功能的保健食品制剂和药物制品，如胶囊剂、片剂、口服液等。实验证明，该多糖安全无毒，在制备抗凝血保健品和药物中具有良好的抗凝血功能，有着良好的开发应用前景。

Description

一种分离纯化制备绿茶多糖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种分离纯化制备绿茶多糖的方法及其应用，尤其是涉及一种从粗老绿茶中分离纯化制备绿茶多糖的方法及其应用。

背景技术

随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，高血脂及其引发的血栓性疾病已日益危害人们健康。肝素多糖已在血栓性疾病治疗中发挥相当重要的作用，但易诱发血小板减少等副作用，从天然产物中寻找抗凝血活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势。在我国和日本民间有常饮用粗老茶来治疗糖尿病的经验。而我国茶叶年产量60万吨左右，其中粗老茶约10万吨，在市场上中低档茶叶严重滞销，在茶叶生产过程中产生的大量低质茶叶，由于丧失饮用价值而被废弃，茶叶功能活性的开发研究已受人们关注。

关于茶多糖的专利报道近年来主要有：谢明勇“一种茶多糖的分离纯化制备方法及降血糖活性”(申请号200810106963.X)和“一种茶多糖的分离纯化制备方法及抗肿瘤活性”(申请号200810106963.4)，陈海霞“一种从粗老绿茶中提取茶多糖和茶多酚的方法”(申请号200910068225.0)，余芳“一种绿茶多糖的纯化方法”(申请号201110045110.6)和“一种绿茶多糖的提取分离方法”(申请号201110045130.3)，这些报道极大的丰富了茶多糖的提取、纯化及其生物活性。其他作者也做了类似的观察（梁进等人，茶叶科学，2008，28（3）：166-171），这些作者证实乌龙茶具有抗凝血活性，但并没有涉及一种绿茶多糖摩尔质量均匀一性及在制备抗凝血保健品和药物中的应用。目前公开了的专利对多糖分离纯化中蛋白质的去除主要采用Sevag法和三氯乙酸法，Sevag法常经5次以上脱除处理才能将游离蛋白质基本除尽，需要使用大量的有机溶剂，易造成人体伤害和环境污染。三氯乙酸法则反应较剧烈，容易引起多糖的降解，影响多糖的生物活性。本发明的技术效果是：采用聚酰胺吸附柱脱色与除蛋白，DEAE sepharose CL-6B离子交换柱纯化，克服传统分离有毒的有机溶剂对多糖的损伤及抗凝血活性不清的不足，有效保存茶叶多糖的生理活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化制备绿茶多糖的方法及所制备的绿茶多糖在制备抗凝血保健品和药物中的应用。

本发明采用由粗老绿茶提取粗多糖，再经分离纯化得到一种茶多糖组分（简称TPS-4），即绿茶多糖，具体步骤如下：

1）提取：茶叶经粉碎机粉碎后过60-100目筛，将粉碎后的茶叶末与蒸馏水按1:10-40的重量比在30-70℃下浸提30-150min，提取液过滤除去杂质后浓缩到除杂后提取液体积的1/5到1/4，后缓缓加入浓缩后提取液3-4倍体积的无水乙醇，醇沉12-24h后离心去除上清液，于-40到-80℃下冷冻干燥得粗多糖；

2）脱色、去蛋白：将步骤1）制备的粗多糖溶于蒸馏水中，经时间为10-20min，转速为3600-4000r/min离心后上聚酰胺柱，以蒸馏水为流动相，流速为1.0-2.0ml/min，收集多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩到原体积的1/5到1/4，后缓缓加入体积为浓缩后多糖溶液3-4倍体积的无水乙醇，醇沉12-24h后离心去除上清液，于-40到-80℃下冷冻干燥得到初步纯化的绿茶多糖；

3）茶多糖纯化：将步骤2）制备的初步纯化多糖溶于pH5.9-7.9，0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液中（PBS），经时间为10-20min，转速为8000-10000r/min离心除去不溶物后上DEAE sepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为1.0-2.0ml/min进行梯度洗脱，第一阶段用PBS洗脱，第二阶段用含0.1mol/L NaCl的PBS洗脱，第三阶段用含0.2mol/LNaCl的PBS洗脱，第四阶段用含0.5mol/LNaCl的PBS洗脱，只收集第四阶段洗脱的多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩至浓缩原体积的1/5到1/4，透析48-72h后于-40到-80℃下冷冻干燥得绿茶多糖。采用本发明所制备的绿茶多糖紫外可见分光光度计显示其在260-280nm处有显著的紫外吸收峰，高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定其平均分子量为6.89×105Da。

采用本发明制备的绿茶多糖抗凝血活性的实验方法：

样本收集和处理

新鲜静脉血与3.2%的柠檬酸钠按9:1混合均匀，以2500g离心15min(低温离心机)，收集上层液体在2小时内进行实验。

观察指标

活化部分凝血活酶时间(APTT)，凝血酶原时间(PT)，凝血酶时间(TT)。

数据处理

Minitab 15统计分析软件对结果进行数学统计分析，并与对照组进行配对t检验。

绿茶多糖TPS-4对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响

绿茶多糖样品10μl与血浆40μl混合均匀，添加50μl的APTT试剂，37℃温育5min，加入50μl已经温育的0.025mol/l的CaCl2溶液，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明绿茶多糖TPS-4能显著的抑制APTT时间，延长了29.5%。

表1绿茶多糖TPS-4对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响

注：**表示与生理盐水对照p<0.05，表中数据为平均值±标准差，n=6

绿茶多糖对凝血酶原时间(PT)的影响：

绿茶多糖样品10μl与血浆40μl混合均匀，37℃温育3min，加入100μl PT试剂(37℃温育10min)，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明绿茶多糖TPS-4对凝血酶原时间(PT)没有明显的影响，即绿茶多糖TPS-4不是通过外源性途径来发挥凝血作用的。

表2绿茶多糖TPS-4对凝血酶原时间(PT)的影响

绿茶多糖TPS-4对凝血酶时间(TT)的影响：

绿茶多糖样品20μl与血浆80μl混合均匀，37℃温育3min，加入100μl TT试剂(常温)，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明绿茶多糖TPS-4能显著的抑制TT时间，延长了23.5%。

表3绿茶多糖TPS-4对凝血酶时间(TT)的影响

结果表明，茶叶末经水提、醇沉、过聚酰胺柱脱色去蛋白、后经DEAEsepharose CL-6B离子交换柱分离纯化，透析、冻干、获得分子量为6.89×105Da的绿茶多糖，绿茶多糖TPS-4可以显著的增加活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)。

本发明的特点在于操作简单可行、能耗小、有效的去除了绿茶粗多糖中的色素与蛋白质，并有效的保存了绿茶多糖的生物活性，避免了大量有机溶剂的使用对环境和人体的伤害。分离纯化获得的绿茶多糖与食品药物工艺上可接受的其它原料及辅料开发成相宜的具有抗凝血功能的保健食品制剂和药物制品，如胶囊剂、片剂、口服液等。实验证明，该多糖安全无毒，在制备抗凝血保健品和药物中具有良好的抗凝血功能，有着良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明所述绿茶多糖经DEAE sepharose CL-6B的洗脱曲线图。

图2为本发明所述绿茶多糖高效凝胶渗透色谱图。

图3为本发明所述多糖分子量的标准曲线。

图4为绿茶多糖TPS-4的全波长扫描图。

具体实施方式

通过以下实施例可进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

茶叶经粉碎机粉碎后过60目筛，将粉碎后的茶叶末与蒸馏水按1:10的重量比在30℃下浸提30min，提取液过滤除去杂质后浓缩到除杂后提取液体积的1/5，后缓缓加入浓缩后提取

液3倍体积的无水乙醇，醇沉12h后离心去除上清液，于-40℃下冷冻干燥得粗多糖。

将制备的粗多糖溶于蒸馏水中，经时间为10min，转速为3600r/min离心后上聚酰胺柱，以蒸馏水为流动相，流速为1.0ml/min，收集多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩到原体积的1/5，后缓缓加入体积为浓缩后多糖溶液3倍体积的无水乙醇，醇沉12h后离心去除上清液，于-40℃下冷冻干燥得到初步纯化的绿茶多糖。

将制备的初步纯化多糖溶于pH5.9，0.02mol/L磷酸盐缓冲液中（PBS），经时间为10min，转速为8000r/min离心除去不溶物后上DEAE sepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为1.0ml/min进行梯度洗脱，第一阶段用PBS洗脱，第二阶段用含0.1mol/L NaCl的PBS洗脱，第三阶段用含0.2mol/L NaCl的PBS洗脱，第四阶段用含0.5mol/LNaCl的PBS洗脱，只收集第四阶段洗脱的多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩至浓缩原体积的1/5，透析48h后于-40℃下冷冻干燥得绿茶多糖TPS-4。

抗凝血保健品—茶饮料的制备：

按重量份计，水与粗茶叶的比例为1～15∶100，萃取温度为75～95℃，时间5～30分钟，浸提后用250目尼龙布过滤除渣，迅速冷却至5℃，放置24h澄清，0.5μm精滤获得澄清茶汁。将0.04-0.2%TPS-4，3-6%蔗糖，0.03-0.07%抗坏血酸等公知辅料先用部分温水溶化、过滤。与上述精滤茶汁混合，135℃灭菌5-7秒，装瓶制得抗凝血保健茶饮料。

抗凝血药物的制备：

普通片剂：取TPS-4 4g，微晶纤维素500g，糊精450g，低取代羟丙甲纤维素75g，75%乙醇75mL，硬脂酸镁5g，用湿法制粒压片法压2000片。

颗粒剂：取TPS-4 4g，糊精1400g，糖粉100g，酒石酸50g，50%乙醇适量，用湿法制粒经过筛、混合制软材、挤压成粒，60℃干燥，整粒后包装，每袋2-5g。

实施例2

茶叶经粉碎机粉碎后过100目筛，将粉碎后的茶叶末与蒸馏水按1:40的重量比在70℃下浸提150min，提取液过滤除去杂质后浓缩到除杂后提取液体积的1/4，后缓缓加入浓缩后提取液4倍体积的无水乙醇，醇沉24h后离心去除上清液，于-80℃下冷冻干燥得粗多糖。

将制备的粗多糖溶于蒸馏水中，经时间为20min，转速为4000r/min离心后上聚酰胺柱，以蒸馏水为流动相，流速为2.0ml/min，收集多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩到原体积的1/4，后缓缓加入体积为浓缩后多糖溶液4倍体积的无水乙醇，醇沉24h后离心去除上清液，于-80℃下冷冻干燥得到初步纯化的绿茶多糖。

将制备的初步纯化多糖溶于pH7.9，0.05mol/L磷酸盐缓冲液中（PBS），经时间为20min，

转速为10000r/min离心除去不溶物后上DEAE sepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为2.0ml/min进行梯度洗脱，第一阶段用PBS洗脱，第二阶段用含0.1mol/L NaCl的PBS洗脱，第三阶段用含0.2mol/L NaCl的PBS洗脱，第四阶段用含0.5mol/LNaCl的PBS洗脱，只收集第四阶段洗脱的多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩至浓缩原体积的1/4，透析72h后于-80℃下冷冻干燥得绿茶多糖TPS-4。

抗凝血保健品—茶饮料：按重量份计，水与粗茶叶的比例为1～15∶100，萃取温度为75～95℃，时间5～30分钟，浸提后用250目尼龙布过滤除渣，迅速冷却至5℃，放置24h澄清，0.5μm精滤获得澄清茶汁。将0.04-0.2%TPS-4，3-6%蔗糖，0.03-0.07%抗坏血酸等公知辅料先用部分温水溶化、过滤。与上述精滤茶汁混合，135℃灭菌5-7秒，装瓶制得抗凝血保健茶饮料。

抗凝血药物的制备：

Claims

1.一种分离纯化制备绿茶多糖的方法，特征在于其具体步骤为

3）茶多糖纯化：将步骤2）制备的初步纯化多糖溶于pH5.9-7.9，0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，经时间为10-20min，转速为8000-10000r/min离心除去不溶物后上DEAEsepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为1.0-2.0ml/min进行梯度洗脱，第一阶段用PBS洗脱，第二阶段用含0.1mol/LNaCl的PBS洗脱，第三阶段用含0.2mol/LNaCl的PBS洗脱，第四阶段用含0.5mol/LNaCl的PBS洗脱，只收集第四阶段洗脱的多糖溶液，将收集的多糖溶液浓缩至浓缩原体积的1/5到1/4，透析48-72h后于-40到-80℃下冷冻干燥得绿茶多糖。

2.采用权利要求1所述的方法制得的绿茶多糖，其特征在于其平均分子量为6.89×10⁵Da，在260-280nm处有显著的紫外吸收峰。

3.采用权利要求1所述方法制得的绿茶多糖在制备抗凝血保健品中的应用。

4.采用权利要求1所述方法制得的绿茶多糖在制备抗凝血药物中的应用。