CN104403016A

CN104403016A - 一种桑叶多糖及其分离纯化制备方法和应用

Info

Publication number: CN104403016A
Application number: CN201410653066.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡为荣; 张入飞
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Anhui Polytechnic University
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-11-17
Also published as: CN104403016B

Abstract

本发明涉及一种桑叶多糖及其分离纯化制备方法和其在制备抗凝血保健品和药物中的应用。其制备方法是桑叶经粉碎、水提、醇沉、过聚酰胺柱去蛋白、H₂O₂脱色、后经DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱和sepharose CL-6B凝胶柱分离纯化得桑叶多糖。本发明实现了对桑叶多糖的进一步分级分离纯化，获得平均分子量为4.5～8.0×10⁴Da桑叶多糖纯品，实验证明，该桑叶多糖具有高的凝血活性，而且安全无毒，可与保健品、药品工艺上可接受的其它原料及辅料开发成具有良好的抗凝血功能的保健品和药品，因而，具有着良好的开发应用前景。

Description

一种桑叶多糖及其分离纯化制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种桑叶多糖的分离纯化制备方法及该桑叶多糖在药物和保健品中的应用。

背景技术

随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，血栓性疾病是最常见的心脑血管疾病，严重威胁人们的健康。据WHO报道，每年心脑血管疾病所致死大约1700万例，占各种死亡原因的1/3。自1958年以来，我国心脑血管病发病率上升了4倍，占全年死亡人口的1/3，而目前的发病趋势升高更快，每15秒就有一位中国人被心脑血管病夺取生命，每22秒就有一位中国人因此丧失工作能力，预计到2020年，心脑血管疾病将成为致残和致死的首位因素(杜昱光等.硫酸化多糖在制备抗凝血活性药物中的应用：中国,200610155813.3[P].2008-7-2.)。因此，作为心脑血管病中最常见的血栓性疾病已日益成为现代都市人的一大健康杀手，应引起我们足够的重视。目前，肝素已在血栓性疾病治疗中发挥相当重要的作用，但易诱发血小板减少等副作用。因此，从天然产物中寻找抗凝血活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势。

桑叶(FOLIUM MORI)，又名“铁扇子”，是桑科(Moraceae)桑属(Morus)植物桑(Morusalba L.)的干燥叶。桑叶最早记载于《神农本草经》，具有祛风清热、凉血明目、补益之功效，主治风热感冒、肺热燥咳、头晕头疼、目赤晕花、风温发热、口渴、肺热咳嗽等症。桑叶不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和钙、铁、锰、锌等元素，且富含人体所必需的氨基酸和多种生物活性成分。桑叶中多糖含量丰富，为桑叶的主要功能性成分之一(丁锐.桑叶多糖的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39(35):21650－21652)。

目前有关桑叶多糖降血糖作用及机理方面的报道较多，但对桑叶多糖抗凝血活性的研究较少，章华伟“一种高纯度桑叶多糖的制备方法”(申请号CN200910153701.8),牟志美”一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法”(申请号CN201110382630.6),励建荣”一种从桑叶中提取黄酮、多糖的方法”(申请号CN200810059049.9)和李淑芬“从桑叶中连续提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方法”(申请号CN200710060127.2)；彭延古等观察桑叶提取物对凝血机制的影响,结果发现桑叶提取物具有明显的抗凝作用(彭延古，葛金文.桑叶提取液对凝血机制的影响[J].湖南中医学院学报，2002，22(4)：21-23)；包立军等对桑叶中的抗凝血活性成分研究显示,水提物经30％乙醇沉淀所得物与Sephadex G-100柱分离所得到组分，使体外APTT显著性延长；经醋酸纤维素薄膜电泳证明两组分均为多糖。但其并没有对抗凝血多糖组分纯度及分子量属性进行表征。(包立军，张剑韵，黄龙全.桑叶中抗凝血活性成分的初步分离与纯化[J].蚕业科学，2006，2(3)：418-421)。这些报道极大的丰富了桑叶多糖的提取、纯化及其生物活性，但目前没有对桑叶多糖进一步分级分离纯化及属性研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，实现了对桑叶多糖的进一步分级分离纯化，获得具有高抗凝血活性的桑叶多糖的纯品。

为了实现上述目的，本发明的采用的技术方案是这样的，一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，具体包括以下步骤：

1)粉碎：桑叶经粉碎得桑叶粗粉；

2)水提：取桑叶粗粉用热蒸馏水浸泡去杂质后得滤液A；

3)醇沉：将步骤2)滤液A浓缩后加入乙醇至乙醇的体积分数达75％-80％，醇沉12-24h，离心去除上清液，取其沉淀进行真空冷冻干燥得桑叶粗多糖A；

4)过聚酰胺柱去蛋白：将步骤3)得到桑叶粗多糖A用蒸馏水溶解后，离心去除沉淀，经聚酰胺柱层析去蛋白，收集桑叶多糖溶液；

5)H₂O₂脱色：将步骤4)收集的多糖溶液经H₂O₂去除色素浓缩后，再次加入乙醇至乙醇的体积分数达75％-80％，醇沉12-24h，离心去除上清液，取其沉淀真空冷冻干燥得桑叶粗多糖B；

6)DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱的分离纯化：将步骤5)所得的桑叶粗多糖B溶于蒸馏水中，离心去除沉淀后上DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱，第一阶段用蒸馏水洗脱，第二阶段用线形梯度为0-2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.5mL/min，10mL/管，分步收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液浓缩、透析、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2；

7)sepharose CL-6B凝胶柱的分离纯化：将步骤6)所得桑叶多糖MPS-2溶解，离心去滤沉淀后上sepharose CL-6B凝胶柱，采用0.2mol/LNaCl溶液进行洗脱，分步收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液透析、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2b。

其中，步骤1)中桑叶经粉碎后过60-100目筛得桑叶粗粉。

步骤2)中，用热蒸馏水浸泡桑叶粗粉的时间为90-150min，温度为60-90℃，所加入热蒸馏水与桑叶粗粉的质量比为1:10-40。

步骤4)中，过聚酰胺柱时所用的流动相为蒸馏水，流速为1.0-2.0mL/min。

步骤5)H₂O₂脱色的具体过程是将所得的桑叶多糖浓缩液pH调至8.0-9.0，以滴加的方式加入H₂O₂至浅黄色，然后在50-80℃水浴条件下保温直至溶液接近无色，过滤除去不溶物。

步骤4)中桑叶粗多糖A用蒸馏水溶解上聚酰胺柱前离心去沉淀的时间为10-20min，转速为3600-4000r/min，步骤6)桑叶粗多糖B用蒸馏水溶解上DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱前离心去除沉淀时间均为10-20min，转速为8000-10000r/min，步骤7)桑叶多糖MPS-2用蒸馏水溶解上sepharose CL-6B凝胶柱前离心去除沉淀时间均为10-20min，转速为8000-10000r/min。

本发明的另一目的是提供根据上述方法制得的桑叶多糖，其平均分子量为4.5～8.0×10⁴Da。

本发明另一目的在于提供根据上述方法制得桑叶多糖在制备抗凝血保健品和药物中的应用。

采用本发明制备的桑叶多糖抗凝血活性的实验方法：

样本收集和处理

新鲜静脉血与3.2％的柠檬酸钠按9:1混合均匀，以2500g离心15min(低温离心机)，收集上层液体在2小时内进行实验。

观察指标

活化部分凝血活酶时间(APTT)，凝血酶原时间(PT)，凝血酶时间(TT)。

数据处理

Minitab 15统计分析软件对结果进行数学统计分析，并与对照组进行配对t检验。

桑叶多糖MPS-2b对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响

桑叶多糖MPS-2b 10μL与血浆40μL混合均匀，添加50μL的APTT试剂，37℃温育5min，加入50μl已经温育的0.025mol/L的CaCl2溶液，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明桑叶多糖MPS-2b和APTT存在一定剂量依赖关系，当多糖的浓度达到0.5mg/mL，其对活化部分凝血活酶时间具有影响作用，当多糖的浓度达到0.75mg/mL，对活化部分凝血活酶时间有极显著性的影响,当桑叶多糖的浓度达到1.0mg/mL，延长了16.0％。

表1桑叶多糖MPS-2b对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响

注：***表示与生理盐水组相比P＜0.01；**表示与生理盐水相比P＜0.05；*表示与生理盐水相比P＜0.10，表中数据为平均值±标准差，n＝6

桑叶多糖MPS-2b对凝血酶原时间(PT)的影响：

桑叶多糖MPS-2b 10μL与血浆40μL混合均匀，37℃温育3min，加入100μLPT试剂(37℃温育10min)，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明桑叶多糖MPS-2b对凝血酶原时间(PT)没有明显的影响，即桑叶多糖MPS-2b不是通过外源性途径来发挥凝血作用的。

表2桑叶多糖MPS-2b对凝血酶原时间(PT)的影响

桑叶多糖MPS-2b对凝血酶时间(TT)的影响：

桑叶多糖MPS-2b 20μl与血浆80μL混合均匀，37℃温育3min，加入100μL TT试剂(常温)，生理盐水和肝素钠分别做阴性和阳性对照，用血凝仪记录时间，实验重复6次。结果表明桑叶多糖MPS-2b在浓度达到1mg/mL时能显著的影响TT时间，延长了3.39％。

表3桑叶多糖MPS-2b对凝血酶时间(TT)的影响

结果表明，本发明分离纯化制备的桑叶多糖MPS-2b具有高的凝血活性，可以显著的增加活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)。

有益效果

1、本发明实现了对桑叶多糖的进一步分级分离纯化，获得平均分子量为4.5～8.0×10⁴Da桑叶多糖纯品，该桑叶多糖具有高的凝血活性，1.0mg/mL桑叶多糖能使活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)分别延长了16.0％和3.39％。

2、本发明操作简单可行、能耗小、有效的去除了桑叶粗多糖中的色素与蛋白质，并有效的保存了桑叶多糖的生物活性，避免了大量有毒有机溶剂的使用对环境和人体的伤害。分离纯化获得的桑叶多糖与食品药物工艺上可接受的其它原料及辅料开发成相宜的具有抗凝血功能的保健品和药物，如胶囊剂、片剂、口服液等。该多糖安全无毒，在制备抗凝血保健品和药物中具有良好的抗凝血功能，有着良好的开发应用前景。

附图说明

图1为实施例1桑叶多糖B经DEAE-sepharose CL-6B的洗脱曲线图。

图2为实施例1桑叶多糖MPS-2经sepharose CL-6B的洗脱曲线图

图3为实施例1桑叶多糖MPS-2b高效凝胶渗透色谱图。

具体实施方式

通过以下实施例可进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

桑叶经粉碎机粉碎后过100目筛得桑叶粗粉，将桑叶粗粉与蒸馏水按1:10的重量比在60℃下浸提90min，去杂质后得滤液A，将滤液A浓缩到原体积的1/5，后缓缓加入浓缩后滤液A 4倍体积的无水乙醇至乙醇的体积浓度达80％，醇沉12h后离心去除上清液，真空冷冻干燥得到桑叶粗多糖A。

将制备的桑叶粗多糖A溶于蒸馏水中，经时间为10min，转速为4000r/min离心后上聚酰胺柱，以蒸馏水为流动相，流速为1.0mL/min，收集多糖溶液，将收集多糖溶液调节pH至8.0左右，滴加H₂O₂至浅黄色，在50℃水浴条件下保温，直至溶液变为无色，过滤除去杂质后得脱色多糖溶液，将脱色多糖溶液浓缩到原体积的1/5，后缓缓加入浓缩后脱色多糖溶液4倍体积的无水乙醇至乙醇的体积浓度达80％，静置24h，离心取其沉淀冷冻干燥得到桑叶多糖B。

将桑叶多糖B溶于蒸馏水，经时间为10min，转速为10000r/min离心除去不溶物后上DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为2.5mL/min进行梯度洗脱，第一阶段用蒸馏水洗脱，第二阶段用线形梯度为0-2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.5mL/min，10ml/管，分部收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液浓缩、透析(截留分子量：14000Da)72h、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2。

将桑叶多糖MPS-2溶解，离心滤去不溶物，用10000r/min离心10min，上sepharoseCL-6B凝胶柱，采用0.2mol/LNaCl溶液进行洗脱，分步收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液浓缩、透析(截留分子量：14000Da)、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2b。采用的高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定桑叶多糖MPS-2b的平均分子量为58520Da。

实施2

桑叶经粉碎机粉碎后过60目筛得桑叶粗粉，将桑叶粗粉与蒸馏水按1:40的重量比在90℃下浸提150min，去杂质后得滤液A，将滤液A浓缩到原体积的1/5，后缓缓加入浓缩后滤液A 4倍体积的无水乙醇至乙醇的体积浓度达80％，醇沉24h后离心去除上清液，真空冷冻干燥得到桑叶粗多糖A。

将制备的桑叶粗多糖A溶于蒸馏水中，经时间为20min，转速为3600r/min离心后上聚酰胺柱，以蒸馏水为流动相，流速为2.0ml/min，收集多糖溶液，将收集多糖溶液调节pH至9.0左右，滴加H₂O₂至浅黄色，在80℃水浴条件下保温，直至溶液变为无色，过滤除去杂质后得脱色多糖溶液，将脱色多糖溶液浓缩到原体积的1/5，后缓缓加入浓缩后脱色多糖溶液4倍体积的无水乙醇至乙醇的体积浓度达80％，静置24h，离心取其沉淀，用蒸馏水复溶，过滤去沉淀，浓缩后，透析72h，冷冻干燥得到桑叶多糖B。

将桑叶多糖B溶于蒸馏水，经时间为20min，转速为8000r/min离心除去不溶物后上DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱，控制洗脱速度为2.5mL/min进行梯度洗脱，第一阶段用蒸馏水洗脱，第二阶段用线形梯度为0-2mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.5mL/min，10ml/管，分部收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液浓缩、透析(截留分子量：14000Da)72h、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2。

将桑叶多糖MPS-2溶解，离心滤去不溶物，用8000r/min离心20min，上sepharose CL-6B凝胶柱，采用0.2mol/LNaCl溶液进行洗脱，分步收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液浓缩、透析(截留分子量：14000Da)、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2b。采用的高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定桑叶多糖MPS-2b的平均分子量为58000Da。

实施例3抗凝血保健品—桑叶饮料的制备：

按重量份计，水与粗桑叶的比例为1～20∶100，萃取温度为75～95℃，时间5～30分钟，浸提后用250目尼龙布过滤除渣，迅速冷却至5℃，放置24h澄清，0.5μm精滤获得澄清桑叶汁。将0.04-0.2％MPS-2b，3-6％蔗糖，0.03-0.07％抗坏血酸等公知辅料先用部分温水溶化、过滤。与上述精滤桑叶汁混合，135℃灭菌5-7秒，装瓶制得抗凝血保健桑叶饮料。

实施例4抗凝血药物的制备：

普通片剂：取MPS-2b 4g，微晶纤维素500g，糊精450g，低取代羟丙甲纤维素75，75％乙醇75mL，硬脂酸镁5g，用湿法制粒压片法压2000片。

颗粒剂：取MPS-2b 4g，糊精1400g，糖粉100g，酒石酸50g，50％乙醇适量，用湿法制粒经过筛、混合制软材、挤压成粒，60℃干燥，整粒后包装，每袋2-5g。

Claims

1.一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1)粉碎：桑叶经粉碎得桑叶粗粉；

2)水提：取桑叶粗粉用热蒸馏水浸泡去杂质后得滤液A；

7)sepharose CL-6B凝胶柱的分离纯化：将步骤6)所得桑叶多糖MPS-2溶解，离心去滤沉淀后上sepharose CL-6B凝胶柱，采用0.2mol/L NaCl溶液进行洗脱，分步收集，洗脱液用苯酚-硫酸法检测绘制洗脱曲线，洗脱得三个洗脱峰，按洗脱出来的先后顺序，将第二个洗脱峰的洗脱液透析、真空冷冻干燥后，得到桑叶多糖MPS-2b。

2.根据权利要求1所述一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于步骤1)桑叶经粉碎后过60-100目筛得桑叶粗粉。

3.根据权利要求1所述一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于步骤2)中，用热蒸馏水浸泡桑叶粗粉的时间为90-150min，温度为60-90℃，所加入热蒸馏水与桑叶粗粉的质量比为1:10-40。

4.根据权利要求1所述一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于步骤4)中，过聚酰胺柱时所用的流动相为蒸馏水，流速为1.0-2.0mL/min。

5.根据权利要求1所述一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于步骤5)H₂O₂脱色的具体过程是将所得的桑叶多糖浓缩液pH调至8.0-9.0，以滴加的方式加入H₂O₂至浅黄色，然后在50-80℃水浴条件下保温，直至溶液接近无色，过滤除去不溶物。

6.根据权利要求1所述一种桑叶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于步骤4)中桑叶粗多糖A用蒸馏水溶解上聚酰胺柱前离心去沉淀的时间为10-20min，转速为3600-4000r/min，步骤6)桑叶粗多糖B用蒸馏水溶解上DEAE-sepharose CL-6B离子交换柱前离心去除沉淀时间均为10-20min，转速为8000-10000r/min，步骤7)桑叶多糖MPS-2用蒸馏水溶解上sepharose CL-6B凝胶柱前离心去除沉淀时间均为10-20min，转速为8000-10000r/min。

7.根据权利要求1-6任一权利要求所述的方法制得的桑叶多糖，其特征在于其平均分子量为4.5～8.0×10⁴Da。

8.根据权利要求7所述的桑叶多糖在制备抗凝血保健品中的应用。

9.根据权利要求7所述的桑叶多糖在制备抗凝血药物中的应用。