CN102649823B

CN102649823B - 一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法

Info

Publication number: CN102649823B
Application number: CN201210133553.5A
Authority: CN
Inventors: 邵平; 杨君; 叶超凡; 孙培龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-04-28
Also published as: CN102649823A

Abstract

本发明公开了一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法，利用径向流色谱去除蛋白质纯化铜藻粗多糖，然后利用超滤将纯化得到铜藻多糖分离得到三个组分，分别为10KD以下、10KD到100KD和100KD以上，并且通过超滤步骤进一步脱除蛋白质。将分离纯化得到的铜藻多糖提取液作为烟用料液加入到卷烟烟丝上，在燃吸卷烟时可产生特有的化学成分，明显改善或提高卷烟的质量品质，相比粗提取液添加到烟丝上减少一定的吸食时的刺激性，生津感、口感改善更加明显。本发明生产成本低，无污染，分离纯化速度快，效果好，适合工厂化生产，并且在一定程度上改善了我国卷烟产品烟气干燥的缺点，具有实际生产意义和价值。

Description

一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法

一、技术领域

本发明涉及一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法及其应用。

二、背景技术

铜藻俗称“丁香屋”(中国南麂岛)，隶属于马尾藻属。铜藻是北太平洋西部特有的暖温带性海藻，不连续分布在我国沿海，是提取褐藻胶的重要原料，因富含有益的生源要素而被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料方面。研究表明：铜藻藻体含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇及多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素等。铜藻具有消痰软坚、清热利水的功效。近年来，国内外专家对于铜藻的研究主要集中在铜藻养殖和生物学研究，对于铜藻多糖的研究较少，有研究表明：铜藻多糖添加到烟丝中后能够使烟气柔和、细腻和生津感，烟气干燥感下降，并且对卷烟风格特征无影响，因此铜藻多糖的开发和用途是一个有待于进一步研究的新课题。

多糖的分离纯化的研究使得多糖这一高分子聚合物在生命科学领域的研究有重大发展，传统的多糖分离纯化采用轴向流色谱分离，该技术的不足之处在于分离纯化步骤复杂，所需时间较长；而用径向流纯化多糖虽然处理量大，处理时间短，但是纯化效果较低，如蛋白质的一般脱除率在80％左右；利用超滤技术纯化多糖，不同的超滤膜的纯化效率不同，但纯化效率较高的蛋白质脱除率也仅80％左右，达不到烟草添加剂所需要求。而利用径向流耦合超滤的方法不仅在分离纯化效果上与轴向相当，可达到95％以上甚至99％，且该方法又继承了处理速度快、处理量大优点，是一种新型的适用于工厂化的多糖分离纯化方法。

三、发明内容

发明的目的旨在提供一种铜藻多糖分离纯化的方法，即采用径向流色谱和超滤的分离纯化方法，该方法相比传统轴向的分离柱具有分离速度快、处理量的优势，相比单独利用径向流或超滤在分离效果上有一定提高，并且从铜藻中分离得到铜藻多糖的三个组分：分子量10KD以下，分子量10KD到100KD，分子量100KD以上，其中分子量10KD以下、分子量10KD到100KD的组分在提高卷烟的质量、保润性，降低吸食刺激性方面相比另一个组分和粗提液有一定的提高。

本发明采用的技术方案是：

一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将铜藻洗净、干燥粉碎得铜藻粉末，加入质量为铜藻粉末质量50-60倍的水，在400-500W的超声条件下提取20-30min，提取液经离心分离和抽滤后，取滤液浓缩并冷冻干燥，得铜藻粗多糖；

(2)将步骤(1)得到的铜藻粗多糖加水配制得到5～10mg/ml浓度的铜藻粗提液，加入装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱中，用纯水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/(min·cm)，洗脱速度/柱高为8-12ml/(min·cm)，柱体积/上样量为2-5mL/mL，洗脱30min-40min，收集得到洗脱液；

(3)将步骤(2)得到的洗脱液通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液A，浓缩、冷冻干燥得到分子量10KD以下的铜藻多糖组分A，将截留液A再通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液B，浓缩、冷冻干燥得到分子量为10KD到100KD的铜藻多糖组分B，将截留液B浓缩、冷冻干燥得到100KD以上的铜藻多糖组分C。

所述步骤(2)中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100，优选A103S。

所述步骤(1)中，所述铜藻粉末的目数为20-100目。

所述步骤(1)中，所述干燥是在55～65℃下烘干。

所述步骤(1)中，提取液经离心分离和抽滤，是将提取液在10000r/min高速离心，所得上清液经抽滤，得到滤液。

本发明还提供按上述方法制备得到的分子量10KD以下的铜藻多糖组分A或分子量10KD到100KD的铜藻多糖组分B。

所述的铜藻多糖组分A或铜藻多糖组分B可应用在卷烟中，在提高卷烟的质量、保润性，降低吸食刺激性方面相比另一个组分分子量100KD以上和粗提液以及经过径向流色谱纯化的洗脱液都有一定的提高。

具体的，所述应用的方法为：将铜藻多糖组分A或铜藻多糖组分B按保润有效成分(即其中含有的多糖类成分含量)为烟丝质量的万分之二，溶解在蒸馏水中喷洒到烟丝上，然后制备成卷烟，其中每25g烟丝所喷洒的溶液体积保持在3-5ml之间。

本发明利用径向流色谱去除蛋白质纯化铜藻粗多糖，然后利用超滤将纯化得到铜藻多糖分离得到三个组分，分别为10KD以下、10KD到100KD和100KD以上，并且通过超滤步骤进一步脱除蛋白质。将分离纯化得到的铜藻多糖提取液作为烟用料液加入到卷烟烟丝上，在燃吸卷烟时可产生特有的化学成分，明显改善或提高卷烟的质量品质，相比粗提取液添加到烟丝上减少一定的吸食时的刺激性，生津感、口感改善更加明显。本发明生产成本低，无污染，分离纯化速度快，效果好，适合工厂化生产，并且在一定程度上改善了我国卷烟产品烟气干燥的缺点，具有实际生产意义和价值。

本发明的优点和产生的有益效果：

本发明的特点是分离纯化步骤相对传统轴向柱，分离时间短，处理量大，相比单独使用径向流或超滤在分离效果上有提高，且所需分离介质成本低，并且适用于大规模工业化生产；分子量10KD以下和分子量10KD到100KD在提高卷烟的质量、保润性，降低吸食刺激性方面有一定作用，具有良好的应用前景。

四、附图说明

图1实施例1制得的多糖组分A、多糖组分B、多糖组分C、洗脱液、铜藻粗提液的蛋白质含量对比图，以铜藻粗提液中的蛋白质含量为100％。

图2实施例2制得的多糖组分A、多糖组分B、多糖组分C、洗脱液、铜藻粗提液的蛋白质含量对比图，以铜藻粗提液中的蛋白质含量为100％。

五、具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明方法做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

取新鲜的铜藻，洗净后阴干，随后放入烘箱中60℃下烘干，粉碎至20-100目，在400W的超声条件下加50g的铜藻粉末和3L蒸馏水提取30min，提取液经10000r/min高速离心，上清液抽滤后，取滤液浓缩并冷冻干燥得到7.12g铜藻粗多糖。取铜藻粗多糖0.5g配制得到浓度为5mg/ml铜藻粗提液100ml，利用径向流色谱法脱除粗提液中的蛋白质，所用径向流色谱为美国Sepragen公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm，装填有A103S填料。径向流色谱的条件为：上样流速5ml/min，上样浓度为5mg/ml，纯水洗脱，洗脱速度40ml/min，上样量为100ml，洗脱30min，收集得到洗脱液2600ml。将上述洗脱液通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液并浓缩冷冻干燥得到分子量10KD以下的多糖组分A152mg，将截留液再通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液并浓缩冷冻干燥得到分子量为10KD到100KD的多糖组分B14mg，所得截留液浓缩并冷冻干燥得到100KD以上的多糖组分C156mg。

分子量10KD以下的多糖组分A：淡黄色组分，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为淡黄色透明粘稠状液体，茚三酮反应颜色无明显变化，紫外光谱分析在260nm处无吸收，说明几乎无蛋白质。

分子量10KD到100KD的多糖组分B：淡紫色组分，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为淡无色透明粘稠状液体，茚三酮反应颜色无明显变化，紫外光谱分析在260nm处无吸收，说明几乎无蛋白质。

分子量100KD以上的多糖组分C：淡紫色组分，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶液为淡紫色透明粘稠状液体，茚三酮反应颜色呈现蓝紫色，紫外光谱分析在260nm处有吸收，说明存在少量蛋白质。

将上述三种组分、铜藻粗提液以及经过径向流色谱柱的洗脱液用Folin-酚法检测其中蛋白质含量，其中以铜藻粗提液中的蛋白质含量为100％，其他各组分和洗脱液中所含蛋白质与铜藻粗提液的比值所得结果如图1所示。

将上述三种组分、铜藻粗提液以及经过径向流色谱柱的洗脱液加入卷烟中进行评定，具体采用以下方法：将各铜藻提取液按保润有效成分(即其中多糖类含量)为烟丝质量的万分之二溶解在蒸馏水中喷洒到烟丝上，每25g烟丝所喷洒的溶液体积保持在3-5ml之间。在温度22℃±1℃、相对湿度60％±2％的恒温恒湿箱中平衡48h，经专业人员进行感官评定得出结果。

所得结果如下表1。

表1：

实施例2

取新鲜的铜藻，洗净后阴干，随后放入烘箱中65℃下烘干，粉碎至20-100目，在500W的超声条件下加50g的铜藻粉末和2.5L蒸馏水提取20min，提取液经10000r/min高速离心，上清液抽滤后，取滤液浓缩并冷冻干燥得到7.28g铜藻粗多糖。取铜藻粗多糖0.3g配制得到浓度为6mg/ml铜藻粗提液50ml，利用径向流色谱法脱除粗提液中的蛋白质，所用径向流色谱为美国Sepragen公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm，装填有A103S填料(填料是什么？)。径向流色谱的条件为：上样流速6ml/min，上样浓度为6mg/ml，纯水洗脱，洗脱速度50ml/min，上样量为50ml，洗脱40min，收集得到洗脱液。将上述洗脱液通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液并浓缩冷冻干燥得到分子量10KD以下的多糖组分A85mg，将截留液再通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液并浓缩冷冻干燥得到分子量为10KD到100KD的多糖组分B9mg，所得截留液浓缩并冷冻干燥得到100KD以上的多糖组分C89mg。

将上述三种组分、铜藻粗提液以及经过径向流色谱柱的洗脱液用Folin-酚法检测其中蛋白质含量，其中以铜藻粗提液中的蛋白质含量为100％，其他各组分和洗脱液中所含蛋白质与铜藻粗提液的比值所得结果如图2所示。

将上述三种组分、铜藻粗提液以及经过径向流色谱柱的洗脱液加入卷烟中进行评定，所用方法如实施例1，所得结果如下表2。

表2：

Claims

1.一种径向流耦合超滤分离制备铜藻多糖的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）将铜藻洗净、干燥粉碎得铜藻粉末，加入质量为铜藻粉末质量50-60倍的水，在400-500W的超声条件下提取20-30min，提取液经离心分离和抽滤后，取滤液浓缩并冷冻干燥，得铜藻粗多糖；

（2）将步骤（1）得到的铜藻粗多糖加水配制得到5～10mg/ml浓度的铜藻粗提液，加入装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱中，用纯水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/（min·cm），洗脱速度/柱高为8-12ml/（min·cm），柱体积/上样量为2-5mL/mL，洗脱30min-40min，收集得到洗脱液；

（3）将步骤（2）得到的洗脱液通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液A，浓缩、冷冻干燥得到分子量10KD以下的铜藻多糖组分A，将截留液A再通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集滤过液B，浓缩、冷冻干燥得到分子量为10KD～100KD的铜藻多糖组分B，将截留液B浓缩、冷冻干燥得到分子量为100KD以上的铜藻多糖组分C。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述铜藻粉末的细度为20-100目。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述铜藻洗净后干燥是在55～65℃下烘干。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，提取液经离心分离和抽滤，是将提取液在10000r/min高速离心，所得上清液经抽滤，得到滤液。

7.如权利要求1～6之一的方法制备得到的铜藻多糖组分A或铜藻多糖组分B。

8.如权利要求6所述的铜藻多糖组分A或铜藻多糖组分B在卷烟中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用的方法为:取铜藻多糖组分A或铜藻多糖组分B，按其中含有的多糖类成分含量为烟丝质量的万分之二，溶解在蒸馏水中喷洒到烟丝上，然后制备成卷烟，其中每25g烟丝所喷洒的溶液体积保持在3-5ml之间。