CN103483460B - 一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法：将裂片石莼粉碎后用水超声提取，醇沉制得粗多糖，用装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱进行脱色素脱蛋白，洗脱后按分子量进行超滤分离，取分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分加入装填有DEAE琼脂糖凝胶的径向流色谱柱进行富集提纯，制备的平均分子量为20KD多糖具有显著的抗肿瘤活性。

Description

一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及海洋藻类多糖的研究与开发，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法及其应用，属于海洋生物技术领域。

背景技术

海洋面积辽阔，海洋藻类植物来源丰富，海藻多糖正逐步成为生物多糖的主要来源之一。海藻多糖具有很高的药用价值，在提高人体非特异性免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂方面具有显著的作用。海藻多糖中的活性物质多为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸等单糖组成的水溶性酸性、中性多糖。

目前多糖提取采用了不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、微波法等。提取后粗多糖中蛋白质和色素的脱除同样是其分离工程中的重要步骤之一。目前多糖脱除蛋白质和色素往往采用化学法，继而采用轴向色谱DEAE层析进行分级纯化，但存在产品产量低、耗时长、分离效率低、压降大等缺点，特别对于海藻粘性多糖，轴向色谱分离易造成压降大，效率低下。径向流色谱是一种新型色谱分离纯化技术，独特的径向流动设计，使其相对于传统的轴向色谱，具有流速高、操作压力低、线性放大等优势。

裂片石莼属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属。石莼是重要的大型经济藻类，广泛分布于西太平洋沿海地区，在我国沿海均有分布，市场上价格便宜，其中含有的多糖多为粘性多糖，粘性系数高。

肿瘤严重威胁人类健康，临床上治疗该疾病的药物，一般都是化学合成的抗肿瘤药，通常具有一定的毒副作用。从植物、微生物及海洋生物中提取的天然药物具有安全低毒副作用、生物相容性好、可生物降解的优点。近年来抗癌上市的新药中，60%来自天然产物。多糖类化合物的活性存在一种间接的抗肿瘤活性，即由免疫体系传递的活性，因此毒性极小，不会对人体造成伤害。采用化学方法分离纯化多糖往往反应条件剧烈，会导致多糖构象发生变化，活性基团易受破坏，产物质量不稳定等缺点，进而严重影响多糖生物活性。

公开号为CN200610026830.7公开了一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤及其它药物中的应用，但该方法只涉及蜈蚣藻粗多糖的提取，并没有将其进行进一步的纯化分离。公开号为CN101921346A公开了一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，该方法提供了一种将径向流色谱应用于粗多糖分离的方法。公开号为CN101709094A公开了一种超滤膜分离甜茶多糖的方法，该方法前期预处理需进行脱色素等步骤，且经过两次不同规格的超滤膜超滤，才能获得不同分子量多糖。

发明内容

本发明的内容在于提供一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法，并提出所制得的石莼硫酸多糖可作为抗肿瘤药物的新用途。

本发明的提取分离方法主要是超声波水提醇沉获得裂片石莼粘性粗多糖；径向流色谱技术脱盐脱蛋白；按照分子量大小超滤处理，分离出10KD至30KD裂片石莼多糖组分；再继续经过径向流离子交换分离多糖组分，获得目的多糖产物。其中多糖目的产物具有明显抗肿瘤活性。

本发明采用的技术方案是：

一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将裂片石莼洗净、干燥后粉碎，过100目筛，得颗粒均匀的粉碎物；

(2)称取步骤(1)得到的粉碎物，加入质量为粉碎物60～70倍的蒸馏水，在400-500W的超声条件下提取30～40分钟，然后冷却静置（通常静置1～2h），离心分离，取上清液a；

(3)将步骤(2)得到的上清液a旋转蒸发浓缩至体积为原体积的10%～15%，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，静置10～20小时，离心分离，所得沉淀冷冻干燥，得粗多糖a；

(4)将步骤(3)得到的粗多糖a加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取上清液b过0.45μm微孔滤膜，得滤液b；

(5)将步骤(4)得到的滤液b加入装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/（min·cm），洗脱速度/柱高为8-12ml/（min·cm），洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥得粗多糖b；

(6)将步骤(5)得到的粗多糖b加水配制成质量浓度3～10mg/ml（优选5mg/ml）的溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片石莼多糖组分A，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至100KD的裂片石莼多糖组分B，将滤过液B再通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液C，浓缩、冷冻干燥得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C，滤过液C浓缩、冷冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D；

(7)称取步骤(6)所得的分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取上清液c过0.45μm微孔滤膜，得滤液c；将滤液c加入装填有DEAE琼脂糖凝胶（英文DEAE-SepharoseFastFlow）的径向流色谱柱中，上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/（min·cm），洗脱速度/柱高为8-12ml/（min·cm），洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为18～22KD（优选分子量范围为20KD）的洗脱液，浓缩、冷冻干燥得到平均分子量为20KD的多糖组分，即为裂片石莼硫酸多糖。

本发明方法中所述的离心分离，通常是在10000r/min转速下，0～10℃温度下离心10～15分钟。

本发明所述步骤（1）中，所述干燥是在55～65℃温度下烘干。

所述步骤（5）中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100，优选A103S。

本发明还提供按照本发明上述方法制备得到的平均分子量为20KD的多糖组分，即裂片石莼硫酸多糖。所述裂片石莼硫酸多糖具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。本发明实施例数据表明，制得的裂片石莼硫酸多糖对胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系，当裂片石莼硫酸多糖浓度为800μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑制率为72.3％，对结肠腺癌DLD细胞最大抑制率达47.5%。因此，本发明提供的裂片石莼硫酸多糖可用于制备抗胃癌或抗结肠腺癌的药物。

与已有的技术相比较，本发明的有益效果如下：

1、建立了一套从原料到产品的裂片石莼硫酸多糖物理分离工艺，有利于最大限度保存多糖活性，该工艺具有分离纯化条件温和、不破坏多糖结构、成本低、对环境友好、适于工业化生产等优点，并且适用于大规模生产，可大幅度降低精制海藻多糖的工艺成本。

2、彻底摆脱了传统海藻多糖的生产工艺，完全不涉及有机溶剂脱蛋白、单元脱色等高耗能、耗材料的过程，在降低成本的同时快速高效地制备裂片石莼硫酸多糖。

3、采用径向流色谱脱蛋白脱色—按分子量超滤分离—径向流色谱富集三步串联耦和分离过程，第一次径向流色谱采用弱碱性阴离子交换树脂填料，用于脱蛋白脱色，第二次径向流色谱采用DEAE-琼脂糖凝胶填料，进行富集提纯，这两次径向流色谱的目的不同，所采用的填料不同，产生不同的分离效果，并首次将DEAE-琼脂糖凝胶填料用于径向流色谱中，可进行大批量制备生产。本发明方法具有不损害活性、分离效率高、设备简单、可连续生产、无污染等优点，可以实现蛋白脱除率达95%，色素脱除率92%。制备的平均分子量为20KD多糖具有显著的抗肿瘤活性，其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品或保健品等。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

（1）将裂片石莼洗净、60℃下烘干、粉碎得粉末，过100目筛，得颗粒均匀的粉碎物。

（2）称取步骤(1)中粉碎物60g，以料液比1:60加入3600ml、pH7.0的蒸馏水，以超声功率480W进行超声波辅助提取30min。冷却静置1h，以转速10000r/min、温度4℃离心10min，得上清液和沉淀。

(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，放置15小时，1000r/min，4℃离心10min，所得沉淀冷冻干燥，得该乙醇浓度下粗多糖12.0g。

(4)称取步骤(3)所得粗多糖加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。

(5)将步骤(4)得到的滤过液加入装填有A103S填料的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样流速5ml/min，用蒸馏水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥后可得10.0g的粗多糖备存，检测蛋白脱除率达95%，色素脱除率达92%。所用径向流色谱为美国Sepragen公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm。

(6)将步骤(5)得到的10g粗多糖加入2000ml的蒸馏水配置成5mg/ml的粗多糖溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片石莼多糖组分A3.2g，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至100KD的裂片石莼多糖组分B2.3g，将滤过液B再通过10KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液C，浓缩冷冻干燥得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C3.7g，滤过液C浓缩、冷冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D0.8g。

(7)称取步骤(6)超滤所得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。将滤过液加入装填有DEAE-琼脂糖凝胶的径向流色谱柱中，上样流速为5ml/min，用蒸馏水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为18～22KD的洗脱液，检测其中硫酸根含量为11.23%，将洗脱液浓缩、冷冻干燥，可得平均分子量为20KD的多糖组分，即裂片石莼硫酸多糖目标产物，得到0.48g。

步骤(7)所得裂片石莼硫酸多糖为浅褐色粉末，用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，MTT法测定其对人胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞体外增殖的抑制能力。结果表明，该多糖对胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系，当多糖浓度为800μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑制率为72.3％，对结肠腺癌DLD细胞最大抑制率达47.5%。

实施例2

（1）将裂片石莼洗净、60℃下烘干、粉碎得粉末，过100目筛，得颗粒均匀的粉碎物。

（2）称取步骤(1)中粉碎物60g，以料液比1:70加入4200ml、pH7.0的蒸馏水，以超声功率500W进行超声波辅助提取40min。冷却静置1h，以转速10000r/min、温度4℃离心10min，得上清液和沉淀。

(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10，加入体积分数95%的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80%，放置20小时，1000r/min，4℃离心10min，所得沉淀冷冻干燥，得该乙醇浓度下粗多糖12.8g。

(4)称取步骤(3)所得粗多糖加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。

(5)将步骤(4)得到的滤过液加入装填有A103S填料的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样流速5ml/min，用蒸馏水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥后可得10.6g的粗多糖备存，检测蛋白脱除率达92%，色素脱除率达92%。所用径向流色谱为美国Sepragen公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱，其柱体积为250ml、内径1.5cm和外径7.8cm，柱高5cm。

(6)将步骤(5)得到的10.6g粗多糖加入2000ml的蒸馏水配置成5mg/ml的粗多糖溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片石莼多糖组分A3.3g，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至100KD的裂片石莼多糖组分B2.5g，将滤过液B再通过10KD的超滤膜，膜压力控制在30psi以下，收集截留液C，浓缩冷冻干燥得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C3.9g，滤过液C浓缩、冷冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D0.9g。

(7)称取步骤(6)超滤所得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C加水配制成10mg/ml的溶液，10000r/min，4℃离心15min后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得滤过液。将滤过液加入装填有DEAE-琼脂糖凝胶的径向流色谱柱中，上样流速为5ml/min，用蒸馏水以40ml/min的流速对样品进行洗脱，采用自动部分收集器进行收集，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，证明多糖已全部洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为18～22KD（优选分子量范围为20KD）的洗脱液，检测其中硫酸根含量为11.29%，将洗脱液浓缩、冷冻干燥，可得平均分子量为20KD的多糖组分，即裂片石莼硫酸多糖目标产物，得到0.50g。

步骤(7)所得裂片石莼硫酸多糖为浅褐色粉末，用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，MTT法测定其对人胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞体外增殖的抑制能力。结果表明，该多糖对胃癌MKN45细胞和结肠腺癌DLD细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系，当多糖浓度为800μg/ml与作用72h时，对MKN45最大抑制率为71.7％，对结肠腺癌DLD细胞最大抑制率达48.2%。

本发明的工艺方法具有分离纯化条件温和、不破坏多糖结构、成本低、对环境友好、适于工业化生产等优点，制备的平均分子量为20KD的裂片石莼多糖具有显著的抗肿瘤活性，因此具有广阔的应用前景，其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品或保健品等。

Claims (7)

1.一种裂片石莼硫酸多糖在制备抗肿瘤药物上的应用，其特征在于所述裂片石莼硫酸多糖按以下方法制备得到：

(1)将裂片石莼洗净、干燥后粉碎，过100目筛，得粉碎物；

(2)称取步骤(1)得到的粉碎物，加入质量为粉碎物60～70倍的蒸馏水，在400-500W的超声条件下提取30～40分钟，然后冷却静置，离心分离，取上清液a；

(3)将步骤(2)得到的上清液a旋转蒸发浓缩至体积为原体积的10％～15％，加入体积分数95％的乙醇溶液使乙醇的终体积浓度为80％，静置10～20小时，离心分离，所得沉淀冷冻干燥，得粗多糖a；

(4)将步骤(3)得到的粗多糖a加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取上清液b过0.45μm微孔滤膜，得滤液b；

(5)将步骤(4)得到的滤液b加入装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱中进行脱色素脱蛋白，上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/(min·cm)，洗脱速度/柱高为8-12ml/(min·cm)，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，收集所有洗脱液，浓缩、冷冻干燥得粗多糖b；

(6)将步骤(5)得到的粗多糖b加水配制成质量浓度3～10mg/ml的溶液，通过100KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液A，浓缩、冷冻干燥得分子量100KD以上的裂片石莼多糖组分A，将滤过液A再通过30KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液B，浓缩、冷冻干燥得分子量30KD至100KD的裂片石莼多糖组分B，将滤过液B再通过10KD的超滤膜，膜压力控制在0～30psi，收集截留液C，浓缩、冷冻干燥得分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C，滤过液C浓缩、冷冻干燥得分子量10KD以下的裂片石莼多糖组分D；

(7)称取步骤(6)所得的分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分C加水配制成质量浓度5～10mg/ml的溶液，离心分离后，取上清液c过0.45μm微孔滤膜，得滤液c；将滤液c加入装填有DEAE琼脂糖凝胶的径向流色谱柱中，上样后用蒸馏水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为1-2ml/(min·cm)，洗脱速度/柱高为8-12ml/(min·cm)，洗脱至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应，表示洗脱完毕，检测洗脱液中多糖成分的分子量，收集分子量范围为18～22KD的洗脱液，浓缩、冷冻干燥得到平均分子量为20KD的多糖组分，即为裂片石莼硫酸多糖。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述步骤(5)中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述步骤(1)中，所述干燥是在55～65℃温度下烘干。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述离心分离是在10000r/min转速下，0～10℃温度下离心10～15分钟。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述裂片石莼硫酸多糖在制备抗胃癌药物上的应用。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述裂片石莼硫酸多糖在制备抗结肠腺癌药物上的应用。