CN104673859B - 一种酶解修饰的铜藻多糖及其应用 - Google Patents

Abstract

一种酶解修饰的铜藻多糖及其应用，所述酶解修饰的铜藻多糖的制备方法包括：(1)铜藻多糖微波提取，得到多糖粗提液；(2)分级醇沉：取多糖粗提液，先后在最终乙醇体积分数为30～40％和55～65％的条件下进行沉淀操作，得到SHP60粗多糖组分；(3)SHP60粗多糖组分经脱色、脱蛋白得到SHPA多糖；(4)SHPA多糖用葡聚糖酶酶解，得到酶解产物；(5)酶解产物用DEAE‑Sepharose Fast Flow离子柱层析系统进行离子柱层析，洗脱液经浓缩、过滤得到滤液；(6)步骤(5)所得滤液用Sephadex G‑25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到酶解修饰的铜藻多糖。所述酶解修饰的铜藻多糖可用于制备抗氧化剂、吸湿剂和保湿剂。

Description

一种酶解修饰的铜藻多糖及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种酶解修饰的铜藻多糖及其在制备抗氧化剂、吸湿剂和保湿剂中的应用。

(二)背景技术

多糖(polysaccharide)是一类结构及其复杂、分子量巨大的碳水化合物，通常由多个单糖经脱水、缩合而形成。自然界中的多糖类化合物广泛地分布于生物体内中，是生命有机体的重要组成成分。海藻多糖结构复杂，生物活性显著且多样：其抗氧化、抗衰老的作用，是利用了海藻多糖能够抑制自由基的活性；促进免疫、抗肿瘤的作用，主要是通过提高巨噬细胞的吞噬能力来实现；降血糖、降血脂的作用，是利用了多糖的吸附性；而抗凝血作用，是因为海藻多糖大部分是硫酸酯多糖，它抗凝血作用机理同肝素作用机理相似。另外海藻多糖还具有很好的吸湿保湿性和美白抗辐射作用。

据《中华海洋本草》记载，自古以来铜藻作为中药“海菌”使用。其性咸、味寒，归肝、胃、肾经，有消痰软坚、清热利水的功效，可以又来治疗水肿或脚气浮肿、甲状腺肿、颈淋巴结肿、瘿瘤、瘰痛、等疾病。《神农本草经》中对其也有记录，如：“主瘿瘤气，颈下核，破散结气，痈肿，瘕坚气腹中上下鸣，下十二水肿”。通过野外实地调查和民间访问考察发现，我国广东、海南沿海等地的居民多将其作为“海藻”药材全藻入药使用，是一种重要的海藻资源。但目前的研究表明天然铜藻多糖的结构并不均一、活性基团含量相对有限。通过有目的地修饰多糖能有效提高多糖的溶解性和生物活性。

生物酶法修饰多糖主要指酶法降解多糖，是利用专一性酶或非专一性酶对多糖进行生物降解而得到低分子量多糖或寡糖的一种降解手段。由于化学和物理降解方法存在反应条件不易控制、降解产物分子量分布宽、不均一等、副产物多缺点，因此很难应用到工业生产中。而酶降解法可特异性地、选择性地切断糖苷键，得到均一降解产物，并且在反应过程中底物的有效功能基团和寡糖的自身结构不会遭到破坏，因此产物的活性较高。另外与化学降解相比，酶降解反应条件温和、易控制，不需要加入大量的化学试剂，减少对环境的污染，并且降解速度快，是一种较为理想的降解方法。

(三)发明内容

本发明目的是针对上述天然铜藻多糖存在的问题，提供一种分子片段均一、抗氧化性和吸湿保湿性能明显提高的酶解修饰的铜藻多糖以及该多糖在制备抗氧化剂、吸湿剂和保湿剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种酶解修饰的铜藻多糖，其制备方法包括：

(1)铜藻多糖微波提取：铜藻粉末用95％乙醇进行微波提取，提取结束后经冷冻离心分离得到多糖粗提液；

(2)分级醇沉：取多糖粗提液，在最终乙醇体积分数为30～40％的条件下进行沉淀操作，冷冻离心得到沉淀a和上清液a；

取上清液a在最终乙醇体积分数为55～65％的条件下进行沉淀操作，沉淀完全后经冷冻离心得到沉淀b和上清液b，沉淀b经水溶、蒸发、冷冻干燥得到SHP60粗多糖组分；

(3)SHP60粗多糖组分经脱色、脱蛋白得到SHPA多糖；

(4)在pH4.5～5.5的HAc-NaAc缓冲液体系中，SHPA多糖和葡聚糖酶于45～55℃进行酶解反应0.5～4h，终止反应后酶解反应液采用孔径大小为500Da规格的透析袋进行流水透析，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；

(5)酶解产物配成水溶液用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-Sepharose FastFlow离子柱层析系统进行离子柱层析，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/L NaCl水溶液进行洗脱，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；

(6)步骤(5)所得滤液用Sephadex G-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，以蒸馏水进行洗脱，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到酶解修饰的铜藻多糖。

本发明中，铜藻粉末在微波提取之前可先用95％乙醇浸泡脱脂。

所述步骤(1)中，95％乙醇的加入体积以铜藻粉末的质量计为10～20mL/g，微波处理条件优选为：微波功率400～600W，温度为50～90℃，微波时间为10～30min。

所述步骤(2)中，取多糖粗提液，优选在最终乙醇体积分数为30％的条件下进行沉淀操作，得到冷冻离心得到沉淀a和上清液a。

所述步骤(2)中，取上清液a，优选在最终乙醇体积分数为60％的条件下进行沉淀操作，沉淀完全后经冷冻离心得到沉淀b和上清液b。

所述步骤(3)中，SHP60粗多糖组分的脱色、脱蛋白可采用常规的多糖脱色、脱蛋白操作，例如采用大孔树脂脱色，Sevage试剂脱蛋白，其中大孔树脂可使用国产大孔树脂1180、DM130、或SD300。

进一步，本发明具体推荐的脱色方法为：取SHP60粗多糖组分溶于蒸馏水配成多糖溶液，加入大孔树脂混匀，搅拌脱色8～16h，取混合液真空抽滤得到脱色样品液。

进一步，本发明具体推荐的脱蛋白方法为：取脱色样品液与Sevage试剂混匀(优选混合体积比为3～6:1)，充分搅拌(优选搅拌时间20～40min)后冷冻离心，取上清液，沉淀重复上述操作多次(优选3～6次)，所得上清液经浓缩、冷冻干燥得SHPA多糖。

所述步骤(4)中，SHPA多糖与葡聚糖酶的投料质量比为1：0.5～2，优选为1:1～2，所述葡聚糖酶在所述缓冲液体系中的质量浓度为0.3-0.4％。

所述步骤(4)中，酶解时间优选为1～3小时，更优选2小时。

所述步骤(5)中，离子柱层析中，上样流速优选为1～2mL/min，洗脱流速优选为2～4mL/min。

所述步骤(6)中，凝胶柱层析中，上样流速为1～3mL/min，洗脱流速为2～4mL/min。

本发明中，冷冻离心在转速8000～10000rpm、温度4～15℃条件下进行，离心时间优选5～15min。

本发明提供了所述酶解修饰的铜藻多糖在制备抗氧化剂中的应用。

本发明还提供了所述酶解修饰的铜藻多糖在制备吸湿剂中的应用。

本发明还提供了所述酶解修饰的铜藻多糖在制备保湿剂中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明中微波提取的应用能够降低提取温度，缩短提取时间，避免了长时间高温加热对铜藻多糖生物活性的破坏，同时微波作用能够有效破碎铜藻细胞壁释放多糖，提高多糖的提取率，并且一定程度上降低多糖的分子量。另外微波法提取铜藻多糖节能减耗，作用均匀，适合放大规模化生产。

(2)本发明对铜藻粗多糖进行分级醇沉，能够有效提高多糖的纯度和控制分子量分布。通过分级醇沉，粗多糖的总糖含量达到50％以上，分子量分布为986.3～1790.8KDa。

(3)本发明对铜藻多糖SHPA进行不同程度酶解、透析、层析柱纯化，实现铜藻多糖分子量的可控降解，体外抗氧化试验、保湿试验、吸湿试验结果证明通过酶解可有效提高多糖的抗氧化性、保湿性和吸湿性。

综上，本发明方法充分利用丰富的铜藻海洋资源，通过微波提取，提高多糖提取率，并且通过酶法修饰改善其抗氧化活性和保湿性；同时实现分子量可控降解，分子量分布均一，条件温和，节能减耗，可规模化、机械化生产，操作简单高效。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)铜藻多糖微波提取：将铜藻洗净，控水，置于烘箱内60℃烘干，粉碎。取藻粉加95％乙醇溶液浸泡脱脂，静置过夜。取200g铜藻粉末，料液比为1:20，微波时间为20min，微波功率500W，温度为65℃，进行微波提取。提取结束冷却静置1h，冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃)。取上清液即多糖粗提液旋转蒸发浓缩至1～3L，加入95％乙醇溶液至最终乙醇体积分数为30％，静置过夜。样液冷冻离心10min(转速810000rpm，温度4℃)，取沉淀，加入少量蒸馏水将沉淀完全溶解，减压蒸发并将残留酒精完全蒸发，并浓缩至20mL，经冷冻干燥得SHP30粗多糖组分。上清液逐级加入95％乙醇溶液，重复上述操作，分别得SHP60和SHP80两个粗多糖组分。

(2)SHP60脱色、脱蛋白：取SHP60溶于蒸馏水配成2％多糖溶液，加入大孔树脂500g，混匀。于磁力搅拌器搅拌脱色12h。取混合液真空抽滤，得到脱色后样品液。

取脱色样品液与Sevage试剂以4:1比例混匀，用桨式搅拌机搅拌30min，冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃).取上清液。重复上述操作4次，旋转蒸发将上清液浓缩至10mL，经冷冻干燥得SHPA多糖样品。

(3)SHPA酶解及纯化：取0.4g SHPA溶于100mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)配制成4mg/mL样液，取葡聚糖酶(购自Sigma公司)加入缓冲液(pH 5.0)配制成质量浓度4％酶溶液。将样液10mL、酶液1mL各自保温10min，混匀，于50℃反应4h，沸水浴加热5min钝化酶活性终止反应。静置冷却，减压蒸发浓缩至4％待用。

选取孔径大小为500Da规格的透析袋，装入可溶性固形物4％的15mL酶解反应液分别流水透析24h，静置过夜。重复多次，并将透析液减压浓缩至10mL，冷冻干燥，储备待用。

将SHPA及酶解产物组分配制成10～20mg/mL的水溶液，过孔径为0.45μm微孔滤膜()，所得滤液进行离子柱上样。

离子柱层析：DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(XK 26×100cm)层析系统，上样量15mL，上样流速为2mL/min；分别以蒸馏水、0.1mol/L NaCl水溶液进行洗脱，洗脱流速为3.5mL/min，自动分部收集器收集洗脱液，每管8mL。绘制洗脱曲线，并分别收集各洗脱峰所对应的组分。

选定最大洗脱峰对应洗脱液浓缩5mg/mL左右浓度，用孔径为0.45μm微孔滤膜()过滤，待凝胶柱层析。

凝胶柱层析：Sephadex G-25凝胶(XK 16×100cm)层析系统，上样量1mL，上样流速为1mL/min；以蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，自动分部收集器收集洗脱液，每管10mL。以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥。经上述操作分别得到SHPAP、及酶解产物SHPHX，其平均分子量分别为1.79×103KDa、10.31KDa。

(4)体外抗氧化及保湿实验：对比测定SHPAP、及酶解产物SHPHX对DPPH自由基、ABTS自由基和O^2-自由基的清除能力来考察酶法降解对铜藻多糖活性影响。结果证明：酶解后多糖抗氧化性明显提高，在浓度为2.5mg/mL，SHPAP的DPPH自由基清除率为38.4％，SHPHX的DPPH自由基清除率可达到97.3％，SHPAP的ABTS自由基清除率为83％，SHPHX的ABTS自由基清除率可达100％，SHPHX的还原力比SHPAP提高3.5倍。

将SHPAP及酶解产物SHPHX分别于100℃烘干2h，于硅胶干燥器冷却待用。配制饱和硫酸铵溶液(RH81％)和饱和碳酸钾溶液(RH43％)置于干燥器中，环境温度25℃。取甘油、丙二醇及各样品100mg分别置于相对湿度为81％和43％的干燥器中，放置2、4、6、8、10、12、14、16、18、24、30、36、42h，称其质量计算吸湿率。结果表明在饱和K2CO3干燥器(RH43％)和饱和(NH4)2SO4干燥器(RH81％)中，酶解后多糖吸湿能力明显提高。18h后，多糖吸湿水分含量基本保持恒定达，酶解后多糖吸湿率为6.36％，酶解前多糖吸湿率为0.99％。

将甘油、丙二醇、SHPAP及酶解产物SHPHX分别加蒸馏水溶解，配制成5％溶液。将样液分别置于硅胶干燥器和饱和碳酸钾溶液(RH43％)干燥器中，环境温度为25℃。放置4、8、12、16、20、24、28、32、40、44、48h，称其质量计算保湿率。结果表明铜藻多糖经酶解后可有效提高保湿性，24h后多糖的水分含量基本保持恒定，酶解后多糖保湿率为10.23％，酶解前多糖保湿率为7.3％。

实施例2：

步骤与实施例1相同，所不同的是，实施例1中步骤(3)中酶解的时间可以进行微调，以获得不同分子量范围的多糖。

表1不同酶解时间所得多糖在2.5mg/mL浓度下抗氧化能力

Claims (6)

1.一种酶解修饰的铜藻多糖，其制备方法包括：

(1)铜藻多糖微波提取：铜藻粉末用95％乙醇进行微波提取，95％乙醇的加入体积以铜藻粉末的质量计为10～20mL/g，微波处理条件为：微波功率400～600W，温度为50～90℃，微波时间为10～30min，提取结束后经冷冻离心分离得到多糖粗提液；

(2)分级醇沉：取多糖粗提液，在最终乙醇体积分数为30～40％的条件下进行沉淀操作，冷冻离心得到沉淀a和上清液a；

取上清液a在最终乙醇体积分数为55～65％的条件下进行沉淀操作，沉淀完全后经冷冻离心得到沉淀b和上清液b，沉淀b经水溶、蒸发、冷冻干燥得到SHP60粗多糖组分；

(3)SHP60粗多糖组分经大孔树脂脱色、Sevage试剂脱蛋白得到SHPA多糖；

(4)在pH4.5～5.5的HAc-NaAc缓冲液体系中，SHPA多糖和葡聚糖酶于45～55℃进行酶解反应0.5～4h，终止反应后酶解反应液采用孔径大小为500Da规格的透析袋进行流水透析，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；其中，SHPA多糖与葡聚糖酶的投料质量比为1：0.5～2，所述葡聚糖酶在所述缓冲液体系中的质量浓度为0.3-0.4％；

(5)酶解产物配成水溶液用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-Sepharose FastFlow离子柱层析系统进行离子柱层析，上样流速为1～2mL/min，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/L NaCl水溶液进行洗脱，洗脱流速为2～4mL/min，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；

(6)步骤(5)所得滤液用Sephadex G-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，上样流速为1～3mL/min，以蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为2～4mL/min，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到酶解修饰的铜藻多糖。

2.如权利要求1所述的酶解修饰的铜藻多糖，其特征在于：所述步骤(2)中，取多糖粗提液，在最终乙醇体积分数为30％的条件下进行沉淀操作，得到冷冻离心得到沉淀a和上清液a；取上清液a，在最终乙醇体积分数为60％的条件下进行沉淀操作，沉淀完全后经冷冻离心得到沉淀b和上清液b。

3.如权利要求1所述的酶解修饰的铜藻多糖，其特征在于：所述大孔树脂使用大孔树脂1180、DM130、或SD300。

4.如权利要求1所述的酶解修饰的铜藻多糖，其特征在于：所述步骤(4)中，酶解时间为1～3小时。

5.如权利要求4所述的酶解修饰的铜藻多糖，其特征在于：所述步骤(4)中，酶解时间为2小时。

6.如权利要求1所述的酶解修饰的铜藻多糖在制备抗氧化剂、或吸湿剂、或保湿剂中的应用。