CN115710321B

CN115710321B - 一种桑黄多糖及其制备方法与应用

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Publication number: CN115710321B
Application number: CN202211478501.1A
Authority: CN
Inventors: 陈晓华; 张安强; 李彦颖; 林庚兰
Original assignee: Zhejiang Qianjifang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Qianjifang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-23
Filing date: 2022-11-23
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2042-11-23
Also published as: CN115710321A

Abstract

本发明公开了一种桑黄多糖及其制备方法与应用，包括将桑黄子实体进行热水浸提法提取，得到桑黄水溶性粗多糖，对获得的桑黄水溶性粗多糖进行初步纯化，将经初步纯化后得到的多糖组分进行精氨酸酶活性的筛选，并对抑制效果较好的多糖组分SSP‑1进行均一多糖组分SSP‑1‑A的制备及纯度鉴定，并进一步研究桑黄水溶性均一多糖组分SSP‑1‑A对精氨酸酶的抑制活性。本发明实现了桑黄多糖对精氨酸酶的抑制活性，为桑黄和其他天然产物筛选精氨酸酶抑制剂和药物开发新靶点提供了新的思路，从而促进了桑黄等食药用菌在食品及医药领域的应用。

Description

一种桑黄多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于食药用菌多糖技术领域，具体涉及一种桑黄多糖及其制备方法与应用。

背景技术

桑黄，又被称为桑耳、桑臣、胡孙眼等，是一种珍贵的药食两用菌，其营养丰富且具有抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性，而这些功效主要由桑黄所含有的活性成分在起作用。研究表明在桑黄子实体和菌丝体中发现多种生物活性物质包括多糖、黄酮类和有机酸等，多糖是其研究的主要活性成分。

先前的研究证明多糖具有良好的抗肿瘤与免疫调节效果。桑黄多糖主要来源于其子实体、菌丝体和发酵液。热水浸提法是从真菌中提取多糖最常用的方法，操作简单且成本低。

然而，桑黄多糖成分较为复杂，对其成分组成及功效仍有待进一步研究。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种一种桑黄多糖的制备方法，其由以下步骤组成，

(1)桑黄水溶性粗多糖的制备：将桑黄子实体粉碎后，脱脂，采用水提醇沉法提取粗多糖，得到桑黄水溶性粗多糖SSP；

(2)将步骤(1)得到的桑黄水溶性粗多糖SSP加入水配制成粗多糖溶液，通过离子交换柱层析，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，透析，浓缩，冷冻干燥得到桑黄多糖SSP-1；

(3)将步骤(2)得到的桑黄多糖SSP-1使用凝胶柱层析纯化，用去离子水洗脱，浓缩，冷冻干燥，得到桑黄多糖SSP-1-A。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：步骤(1)中，所述脱脂，是将桑黄子实体粉碎后，按料液比1∶3～6g/mL加入到乙醇溶液中，混合均匀后浸泡12～24h，过滤，收集残渣，将残渣风干，去除乙醇，得到脱脂后的粉末。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：步骤(1)中，所述采用水提醇沉法提取粗多糖，是将脱脂后的桑黄子实体粉末按照料液比1∶30～50g/mL加入水，加热提取1～3h，离心收集上清液，减压浓缩得到多糖浓缩液，向所述多糖浓缩液中加入乙醇溶液，静置12～24h，离心收集沉淀，将沉淀加水溶解后旋蒸除去乙醇，冷冻干燥，得到桑黄水溶性粗多糖SSP。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：所述乙醇溶液的体积浓度为95％；所述离心收集上清液，是8000rpm离心15min。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：步骤(2)中，所述粗多糖溶液浓度为10.0mg/mL；所述透析，截流分子量为10000Da，透析时间为48h；步骤(2)中，采用DEAE离子交换柱层析。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：步骤(3)中，所述使用凝胶柱层析纯化，是将步骤(2)得到的桑黄多糖SSP-1加入水配制成5.0mg/mL的粗多糖溶液，使用Sephacryl S-300凝胶填料。

作为本发明所述的桑黄多糖的制备方法的一种优选方案：步骤(3)得到的桑黄多糖SSP-1-A，由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖组成，葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.360∶0.305∶0.130∶0.168∶0.034∶0.004，所述桑黄多糖重均分子量为2.700×10⁴Da，数均分子量为2.356×10⁴Da。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种桑黄多糖：所述桑黄多糖由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖组成，葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.360∶0.305∶0.130∶O.168∶0.034∶0.004，所述桑黄多糖重均分子量为2.700×10⁴Da，数均分子量为2.356×10⁴Da。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的方法得到的桑黄多糖在制备精氨酸酶抑制剂中的应用。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的方法得到的桑黄多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的制备方法获得的桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A分子量小、分布宽度较窄，且对精氨酸酶活性具有良好的抑制效果，在天然药物精氨酸酶抑制剂和开发桑黄多糖新型药物方面提供了方向和参考依据，有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，其中：

图1为桑黄水溶性粗多糖SSP的离子交换柱洗脱曲线。

图2为SSP-1的激光光散射图。

图3为桑黄水溶性多糖组分SSP-1的Sephacryl S-300HR凝胶洗脱曲线。

图4为桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的分子量及纯度分布图。

图5为SSP-1-A的紫外全扫描光谱图。

图6为为混合标准品的IC色谱图。

图7为SSP-1-A的IC色谱图。

图8为SSP-1-A的扫描电镜图。

图9为SSP-1-A的FT-IR光谱图。

图10为桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A浓度对精氨酸酶抑制活性的曲线关系图。

图11为桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用曲线关系图。

图12为SSP-1-A抑制精氨酸酶的双倒数图。

图13为SSP-1-A对精氨酸酶抑制常数的测定。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1：

桑黄粗多糖SSP提取：

(1)称取桑黄子实体200g(本实施例以Sanghuangporus vaninii，QJF-3菌种为例)，粉碎，80目筛网过筛，用样品4倍体积的95％乙醇浸泡过夜，过滤收集残渣，自然风干，称取风干后的药渣粉末100g，按料液比1∶40g/mL加入去离子水置于沸水浴中提取2h，且期间间断性搅拌，8000rpm离心15min，收集上清液，反复提取3次，合并所有上清液，收集残渣，将所有上清液减压浓缩至原来体积的1/10，之后边搅拌边缓慢加入4倍体积的95％乙醇醇沉，静置24h，8000rpm离心15min收集沉淀，加适量去离子水溶解后旋蒸除去乙醇，冷冻干燥，制得桑黄水溶性粗多糖，命名为SSP。

采用苯酚-硫酸法测定所获得的桑黄水溶性粗多糖SSP的多糖含量，其结果如表1所示。多糖含量(wt％)＝总糖含量(wt％)-还原糖含量(wt％)。

表1桑黄粗多糖SSP的多糖含量及得率

指标	总糖	还原糖	得率	多糖
					含量(wt％)	55.84±0.12	6.57±0.04	1.29±0.11	49.27±0.16

实施例2：

桑黄水溶性粗多糖SSP的初步纯化：

将上述实施例1中所得的桑黄水溶性粗多糖SSP加入去离子水溶解，过0.45μm滤膜后通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和NaCl溶液进行洗脱，制得纯化后的桑黄多糖组分SSP-1，具体步骤为：

将实施例1所得的桑黄水溶性粗多糖SSP加入去离子水配制成10.0mg/mL的粗多糖溶液，通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析(XK 26mm×100cm)，分别先后采用去离子水、O.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，根据苯酚硫酸法检测，绘制洗脱曲线，收集0.1mol/L NaCl洗脱液，透析(截流分子量10000Da)48h，浓缩，冷冻干燥，该样品记作SSP-1。DEAESepharose Fast FlOW离子交换住层析洗脱曲线如图1所示。SSP-1的激光光散射图如图2所示。

将0.2mol/L NaCl洗脱液所得样品记作SSP-2，0.4mol/L NaCl洗脱液所得样品记作SP-4。

实施例3：

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的制备∶

具体步骤为∶将上述实施例2得到的多糖组分SSP-1使用凝胶柱层析纯化：将上述实施例2得到的多糖组分SSP-1配制成5.0mg/mL的粗多糖水溶液，将预活化好的SephacrylS-300凝胶填料装入柱内，去离子水洗脱，根据苯酚硫酸法法多糖检测，绘制洗脱曲线，根据峰形收集，浓缩，冷冻干燥，获得桑黄水溶性多糖均一组分，记作SSP-1-A。经SEC-MALLS-RI(激光光散射与示差折光仪)联用测定其纯度及分子量，使用紫外分光光度计对桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A进行全扫描分析并采用离子色谱法对SSP-1-A进行单糖组成分析。桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的凝胶柱洗脱曲线如图3所示，桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的纯度图如图4所示，其分子量分布宽度较窄，表明桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A有较高的多糖纯度。经SEC-MALLS-RI得到SSP-1-A的分子量：Mw为2.700×10⁴Da，Mn为2.356×10⁴Da，Mz为4.576×10⁴Da。紫外全扫描谱图(图5)显示260nm处无吸收峰，表明桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A不含游离的核酸，在280nm处没有吸收峰，表明SSP-1-A不含蛋白质或多肽等杂质。

单糖混合标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、古罗糖醛酸、甘露糖、果糖、核糖、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、甘露糖醛酸)的IC图谱如图6所示，桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的IC色谱图如图7所示，对比单糖标准品的出峰顺序，可推断得出SSP-1-A其单糖组成主要由葡萄糖组成，含有半乳糖、甘露糖、岩藻糖和木糖以及少量的盐酸氨基葡萄糖，它们之间的摩尔比为0.360∶0.305∶0.168∶0.130∶0.034∶0.004。桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的单糖组成IC分析结果如表2所示。

表2桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的IC分析结果

序号	峰名称	保留时间/min	峰面积/nC×min	摩尔比
					1	岩藻糖	5.9	1.175	0.130
2	盐酸氨基葡萄糖	13.525	0.212	0.004
					3	半乳糖	14.917	4.457	0.305
4	葡萄糖	16.992	6.493	0.360
					5	木糖	20.084	0.334	0.034
6	甘露糖	20.525	2.2	0.168

实施例4：

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的扫描电镜及红外分析：

取适量的多糖SSP-1-A用导电胶粘在样品板上，用气球吹去多余的样品，放入真空喷镀仪中喷金(加速电压15kV)，通过扫描电镜观察SSP-1-A的形态结构；此外，取适量样品SSP-1-A与溴化钾(KBr)混合，研磨均匀后压片置于红外测定(4000-500cm^-1)，观察其结构。SSP-1-A的扫描电镜图如图8所示，观察到SSP-1-A主要以不规则的碎屑状或片状堆积的形式存在，在10000和5000倍分辨率下观察到SSP-1-A的表面较光滑且无孔隙结构，质地较紧密，表明分子间作用力较强，多糖分子间的排斥力较小。SSP-1-A的傅里叶红外光谱图(FT-IR)如图9所示，根据峰形图谱发现SSP-1-A在3384.74cm^-1处出现较强的吸收峰信号，主要表现为-OH基团的伸缩振动；在2927.62cm^-1和1414.83cm^-1处的吸收峰信号表现为C-H基团的伸缩振动；在1634.44cm^-1处的吸收峰表现为多糖水合的振动吸收峰，而在1361.13cm^-1处的吸收峰表现为变角振动；在1730.00cm^-1和1259.00cm^-1左右无明显的吸收峰，表明SSP-1-A中不含糖醛酸，这与实施例3中的单糖组成分析结果是一致的，据此初步判断SSP-1-A为中性多糖；在1200.00-1000.00cm^-1范围内的吸收峰主要是吡喃糖环的C-O-H和C-O-C的拉伸振动引起的，此外在914.15cm^-1处也存在一个吸收峰，综上表明SSP-1-A的结构为β-构型多糖。

实施例5：

桑黄水溶性多糖组分SSP-1对精氨酸酶抑制活性的筛选∶

称取上述实施例2所得的多糖组分SSP-15.0mg，用Tris-HCl缓冲液溶解，配制成浓度为5.0mg/mL的多糖待测液，待用；

取0.1％的牛血清蛋白缓冲溶液50μL(含或不含20U/mL精氨酸酶)，依次加入10mmol/L MnCl₂的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.5)150μL，50μL含有桑黄多糖的溶液或其溶剂作对照，L-精氨酸(pH 9.70.1mmol/L)100μL，将上述溶液混合均匀后置于37℃水浴锅中反应5、15、30、45、60、75min后置于冰上，迅速加入600μLH₂SO₄/H₃PO₄/H₂O(体积比1∶3∶7)终止反应，之后添加α-异亚硝基苯丙酮(5％无水乙醇配制)50μL，置于100℃下避光反应45min(保持黑暗直至读数)，冷却后离心(5min)于550nm处测定吸光值。

多糖组分对精氨酸酶活性的抑制率公式(1)为：

其中：Aa：不含多糖的精氨酸酶活性的吸光值；Ac1：0.1％牛血清蛋白缓冲液代替精氨酸酶的对照1吸光值；Ab：含桑黄多糖和酶反应的吸光值；Ac2：含桑黄多糖和不含酶反应的对照2吸光值。

实施例5对比1∶

按照实施例5的方法进行精氨酸酶抑制活性的筛选，其区别在于所使用的多糖组分为SSP-2。

实施例5对比2∶

按照实施例5的方法对精氨酸酶抑制活性进行筛选，其区别在于所使用的多糖组分为SSP-4。

测定结果如表3所示，3种多糖组分对精氨酸酶均具有抑制活性，抑制率越高表明桑黄多糖对精氨酸酶的抑制活性越强，尽管SSP-2在5min对精氨酸酶的抑制活性是最强的，为14.12％，在30min时抑制率为53.33％，到75min时其抑制率仅为33.61％；而SSP-1对精氨酸酶的抑制率呈先升后降的趋势，在反应时间5min时度精氨酸酶的抑制率为11.26％，在反应时间30min时，其抑制率达到最大为64.29％，超过30min后(45-75min)其抑制率虽在下降，但是其整体的抑制率仍保持在50％以上，故本发明选用SSP-1多糖组分继续进行后续的实验研究。

表3桑黄3种水溶性多糖组分对精氨酸酶的抑制率

实施例6：

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制活性研究：

精确称取桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A，分别配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg/mL的多糖待测水溶液1mL，根据实施例5方法和公式(1)计算不同浓度的均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制率。

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A不同浓度下对精氨酸酶的抑制效果如图10所示，在0-1.2mg/mL浓度范围内，SSP-1-A多糖浓度对精氨酸酶的抑制活性表现出较强的浓度依赖性，且对精氨酸酶的抑制率随着多糖浓度的升高而逐渐增强；当多糖浓度在0.8mg/mL后，抑制率增长篇幅明显减小，当多糖浓度为1.2mg/mL时，SSP-1-A对精氨酸酶活性的抑制率高达70.85±3.0％，SSP-1-A浓度继续增大时，其对精氨酸酶活性的抑制率基本保持稳定。且经回归分析发现，其SSP-1-A对精氨酸酶的IC₅₀值为0.737mg/mL。

先前的研究显示精氨酸酶抑制剂可抑制表达高精氨酸酶的癌细胞增殖并诱导凋亡。因而桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A具有抗肿瘤效果。

实施例7：

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶抑制类型的判断∶

包括以下步骤：分别配制浓度为0.0、0.6、0.8、1.0mg/mL的桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A溶液1mL，之后在各个多糖浓度下改变精氨酸酶的浓度，根据实施例5的方法，计算酶反应速率，确定SSP-1-A对精氨酸酶的抑制类型。

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用，其测定结果如图11所示，根据图中所展示的结果可知，在0.4-0.8mg/mL多糖浓度范围内，随着SSP-1-A多糖浓度的增加，其对精氨酸酶的酶促反应速率与酶浓度的关系拟合直线的斜率逐步降低，且发现其在每一个多糖浓度下的拟合直线均经过原点，表明桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用是可逆的，即均一多糖SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用属于可逆抑制。

实施例8：

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶抑制动力学研究∶

具体步骤如下：精确称取桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A，分别配制成0.0、0.6、0.8、1.0mg/mL的多糖溶液各1mL，待用；在各个多糖浓度下改变底物浓度，根据实施例5的方法计算酶反应速率，确定桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制类型及酶促抑制动力学反应的抑制常数。以不同底物浓度为横坐标、酶反应速率的倒数为纵坐标，绘制线性直线，通过不同抑制剂浓度各直线的交点来判断其抑制类型，根据公式(2)计算出其抑制常数。

式中，Km表示米氏常数，Ki表示抑制剂的抑制常数，Vm表示酶促反应速率，S表示反应时间。

通过酶促动力学反应来探究底物浓度与酶反应速率的关系，桑黄水溶性均一多糖SSP-1-A对精氨酸酶的抑制动力学实验结果分析如图12和图13所示，由图12可知，桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A分别在0.0、0.6、0.8、1.0mg/mL的浓度条件下，它们之间4组直线相交于y轴，同时直线与×轴的交点随着其多糖浓度的增加其斜率越来越大，表明桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A浓度对精氨酸酶的酶促反应的速率与抑制剂的浓度不成正比，即酶促反应速率不随抑制剂的浓度发生改变，表明SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用属于竞争性可逆抑制。

桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制动力学抑制常数分析结果如图13所示，根据实施例7中的公式(2)计算出桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制常数，其抑制常数为0.794mg/mL。

综上，本声明所提供的技术方案的制备方法制备的桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A分子量小、纯度较高，分子量分布宽度较窄，利于被人体吸收。本发明所制得的桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的分子量为：Mw为2.700×10⁴Da，Mn为2.356×10⁴Da，Mz为4.576×10⁴Da。本发明所制得的桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A的单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖和盐酸氨基葡萄糖，它们之间的摩尔比为0.360∶0.305∶0.168∶0.130∶0.034∶0.004。

参见图1，图1为桑黄粗多糖SSP的初步纯化分布图，从图中可看出桑黄粗多糖SSP包含多个多糖组分，实施例2对所得的桑黄粗多糖SSP进行了初步纯化，分别得到3种多糖组分，各记为SSP-1、SSP-2、SSP-4。

对初步纯化获得的3种桑黄多糖组分进行了精氨酸酶抑制活性的筛选，得到3种多糖组分对精氨酸酶具有抑制作用，SSP-1多糖组分对精氨酸酶的抑制活性随反应时间增加呈现先上升后下降的趋势，在30min时达到64.29％，SSP-2和SSP-4两种多糖组分对精氨酸酶的抑制效果相对SSP-1的抑制率较低，因此选择SSP-1继续进行后续实验的研究，由图2可以看出实施例2所制得的SSP-1多糖组分的分子量分布均一性不高，其成分峰型且不对称，表明SSP-1多糖需要进一步进行纯化。

图3是SSP-1经凝胶柱层析纯化后获得的多糖组分，得到其凝胶柱洗脱曲线图(图3)其呈现单峰且峰型对称，表明此时获得的多糖是均一多糖，记为SSP-1-A。经激光光散射与示差折光仪鉴定其纯度和测定重均分子量(图4)。

参见图5，图5是SSP-1-A的紫外全扫描光谱图，结果表明SSP-1-A不含蛋白质和核酸。

图8显示了SSP-1-A的扫描电镜图，其主要以碎屑状或片状堆积的形式存在，且表明较光滑无孔状结构、质地紧密。图9为SSP-1-A的FT-IR谱图，根据吸收峰基团的振动形式推断其构型为β-构型。

图10显示了桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制活性，测定结果发现SSP-1-A浓度为1.2mg/mL时对精氨酸酶活性的抑制率达到70.85±3.0％，其对精氨酸酶的IC₅₀为0.737mg/mL，说明桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶具有较强的抑制活性。

图11显示了桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用，根据测定结果发现随着多糖浓度的增加，酶促速率与酶浓度的关系拟合曲线逐渐降低且都经过原点，表明SSP-1-A对精氨酸酶的抑制作用是可逆的。

图12和图13显示了桑黄水溶性均一多糖组分SSP-1-A对精氨酸酶的酶促动力学实验，根据测定结果发现其对精氨酸酶的抑制作用属于竞争性抑制，且其抑制常数为0.794mg/mL，说明其对精氨酸酶有良好的抑制效果。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种桑黄多糖在制备精氨酸酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述桑黄多糖的制备方法包括以下步骤，

（1）桑黄水溶性粗多糖的制备：将桑黄子实体粉碎后，脱脂，采用水提醇沉法提取粗多糖，得到桑黄水溶性粗多糖SSP；所述水提为沸水浴提取；所述醇沉为向多糖浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇；

（2）将步骤（1）得到的桑黄水溶性粗多糖SSP加入水配制成粗多糖溶液，通过DEAESepharose Fast Flow离子交换柱层析，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，透析，浓缩，冷冻干燥得到桑黄多糖SSP-1；

（3）将步骤（2）得到的桑黄多糖SSP-1使用凝胶柱层析纯化，用去离子水洗脱，浓缩，冷冻干燥，得到桑黄多糖SSP-1-A；所述凝胶柱的填料为 Sephacryl S-300。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述脱脂，是将桑黄子实体粉碎后，按料液比1：3~6 g/mL加入到乙醇溶液中，混合均匀后浸泡12~24 h，过滤，收集残渣，将残渣风干，去除乙醇，得到脱脂后的粉末。

3. 根据权利要求1或2所述应用，其特征在于：步骤（1）中，所述水提的料液比为1：30~50 g/mL，提取时间为1~3 h。

4. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述粗多糖溶液浓度为10.0 mg/mL；所述透析的截流分子量为10000 Da，透析时间为48 h。

5. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述桑黄多糖SSP-1的水溶液浓度为5.0 mg/mL。

6. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤（3）得到的桑黄多糖SSP-1-A，由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖组成，葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.360：0.305：0.130：0.168：0.034：0.004，所述桑黄多糖重均分子量为2.700×10⁴ Da，数均分子量为2.356×10⁴ Da。