JP5038012B2

JP5038012B2 - ラムナン硫酸の製造方法

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Publication number: JP5038012B2
Application number: JP2007118726A
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Inventors: 淨治大谷; 元彦浜口
Original assignee: 江南化工株式会社
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2007-04-27
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Description

本発明は、ラムナン硫酸の製造方法に関するものである。

藻類には、各種の有用な多糖類（例えば、フコイダン、ラムナン硫酸など）が含まれている。このうち、ラムナン硫酸は、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖を意味しており、一部の藻類またはバクテリアなどに含まれている。また、緑藻の一種であるヒトエグサからラムナン硫酸を抽出する方法が知られている（非特許文献１）。このラムナン硫酸には、抗潰瘍効果（特許文献１）などの薬理作用が認められている。
本発明者らは、ラムナン硫酸の薬理作用を探求すると共に、その製造方法に関する研究開発を行ってきた。従来法としては、次のようなものが知られている。乾燥させたヒトエグサを水に懸濁し、加熱することによりラムナン硫酸を浸出させる。遠心分離して固形物を除いたあと、エタノールを添加することで、多糖類を沈殿させ、それを集めて水に溶解し、透析により低分子量成分を除くことによりラムナン硫酸を得る（特許文献１）。
しかし、ヒトエグサは食用にも供されるので高価であるため、ラムナン硫酸の生産を大量かつ安価に行うことが困難であった。

特開平６−２４７８６１号公報藻類の生化学的研究、共立出版、１９７９、ｐ６０２−６１９

本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも安価にラムナン硫酸を製造できる方法を提供することにある。

海藻の細胞は、個々の細分が分泌した細胞間物質で結着することで藻体を形成している。水中で生育する海藻の細胞間物質は、水に対して不溶性となっている。この細胞間物質は、細胞から分泌された物質により作られたものであるので、その成分は本来水溶性である。水溶性の各成分が細胞内で作られ、細胞外に排出され、細胞膜に存在する酵素の作用で、各成分が合成されて、水に不溶の細胞間物質が形成されていると推定される。
細胞間物質の構成成分はおよそ、セルロース（βグルカン）と蛋白質とその海藻固有の多糖である。このため、本発明者らは、セルラーゼとプロテアーゼで細胞間物質を処理すると、これらの酵素で分解されない多糖のみを溶出・取り出すことができるのではないかと推定した。なお、酵素を使用しない方法での抽出は、酸・アルカリ・熱で、構成成分の結合を切って溶出・抽出するので、必ずしも藻体の多糖を抽出できるとは限らなかった。

こうして、本発明者らは、鋭意検討の結果、従来はラムナン硫酸の製造用材料としては顧みられていなかった安価なアオサを材料とし、これをセルラーゼとプロテアーゼで処理することにより、ラムナン硫酸を製造できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして上記課題を解決するために、本発明に係るラムナン硫酸の製造方法は、アオサをセルラーゼ処理及びプロテアーゼ処理することを特徴とする。
ラムナン硫酸とは、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖類のことを意味している。天然のラムナン硫酸の分子量は、数十万〜数百万程度までに広く分布している。但し、精製中或いは精製後に、予期しないで酸処理、アルカリ処理などにより、容易に加水分解され、分子量が小さくなることがある。本発明の方法によれば、ほとんど加水分解を受けない大分子量のラムナン硫酸を製造することができる。また、大分子量のラムナン硫酸は、適当に処理することにより、所望の分子量としたラムナン硫酸又はラムナンを調製することもできる。

アオサとは、緑藻に属する藻類の一種である。アオサの仲間（アオサ属Ulvaceae）には、ヒメアオノリ属、ヒメボタンアオサ属、アオノリ属、ペルクルサリア属、アオサ属、クロヒトエグサ属などが含まれる。アオサの体のつくりは単純であり、比較できる形質が少なく、かつ同種であっても個体によって形態が大きく異なることから、その分類は非常に難しい。図１及び図２には、アオサの分類例を示した。従来、ラムナン硫酸を得るためには、ヒトエグサ（クロヒトエグサ属）を熱水で処理していた。ところが、アオサ属（ミナミアオサ、アナアオサを含む）は、熱水処理のみでは、ラムナン硫酸を得ることが困難であった。アオサ属は、成長速度及び栄養塩固定能力が高いことから、内湾の富栄養化海域において、しばしば大発生する。このため、水質浄化に対する取り組みが行われているものの、用途（食用・材料を含む）に乏しいことから、ほとんどは廃棄処分されている。本発明によれば、アオサ属に新たな付加価値を与えることができる。
本発明においては、Ulva fenestrata， U. armoricana， U. scandinavica， U. rigida， U. taeniata，リボンアオサ（U. fasciata），アミアオサ（U. reiculata），コツブアオサ（U. spinulosa），ナガアオサ（U. arasakii），アナアオサ（U. pertusa）， U. rotundata，オオバアオサ（U. lactuca），ミナミアオサ（U. ohnoi）などのアオサが好ましく用いられる。

セルラーゼとは、エンド−１，４−β−グルカナーゼとも称し、セルロースのβ１→４グルコシド結合を加水分解し、おもにセロビオースを生成する酵素を意味する。セルラーゼは、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、軟体動物などに存在する。本発明においては、セルラーゼの由来は問われず、上記いずれの生物から抽出・精製したもの、或いは分子生物学的に製造したものを用いることもできる。セルラーゼは、アオサの細胞壁を分解し、ラムナン硫酸をアオサから流出しやすくなるように作用すると考えられる。
プロテアーゼとは、タンパク質分解酵素あるいはタンパク分解酵素とも呼ばれる。ペプチド結合の加水分解を触媒するＥＣ３.４群の総称として用いられる。プロテアーゼは、動物、植物、微生物界に広く分布し、細胞内外のいずれにも存在する。本発明においては、プロテアーゼの由来は問われず、上記いずれの界から抽出・精製したもの、或いは分子生物学的に製造したものを用いることもできる。

プロテアーゼは、作用様式によって、末端からペプチド結合を切断するエキソペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼを含む）と、中間から切断するエンドペプチダーゼとに分類されるが、本発明においては、いずれのペプチダーゼも適用できる。また、活性発現機構によって、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、金属プロテアーゼなどに分類されるが、本発明においては、いずれのペプチダーゼも適用できる。但し、経済的な観点からすると、エキソペプチダーゼ、セリンプロテアーゼを用いることが好ましい。
ラムナン硫酸は、アオサの内部において、タンパク質成分と結合することにより、アオサ体内に留まっているものと考えられる。プロテアーゼは、ラムナン硫酸と結合しているタンパク質成分を分解し、ラムナン硫酸がアオサから容易に流出するように作用すると考えられる。

本発明においては、セルラーゼ処理、及びプロテアーゼ処理の順序は問われず、（１）セルラーゼ処理を行った後に、プロテアーゼ処理を行う、（２）プロテアーゼ処理を行った後に、セルラーゼ処理を行う、（３）セルラーゼ処理とプロテアーゼ処理とを同時に行う、のいずれでもよい。また、セルラーゼ処理およびプロテアーゼ処理の際には、それら酵素が作用可能な適当なｐＨ及び温度域において処理することができる。
適当なｐＨとは、用いる酵素（セルラーゼ及びプロテアーゼ）が作用できるｐＨを意味している。ｐＨの調節には、適当な酸（塩酸・硫酸などの無機酸、酢酸・シュウ酸・クエン酸などの有機酸を含む）または適当なアルカリ（アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素の水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、アルカリ金属炭酸塩、アンモニア、アミンなど）を用いることができる。また、使用するセルラーゼとプロテアーゼの作用ｐＨ域が異なる場合には、各酵素処理の際に、それぞれ適当なｐＨに調整することが好ましい。

適当な温度とは、用いる酵素（セルラーゼ及びプロテアーゼ）が作用できる温度を意味している。一般的には、１０℃〜８０℃（好ましくは、２０℃〜７０℃、更に好ましくは２０℃〜６０℃）の温度域で用いることが好ましい。また、使用するセルラーゼとプロテアーゼの作用温度域が異なる場合には、各酵素処理の際に、それぞれ適当な温度に調整することが好ましい。
本発明においては、酵素処理の前に、アオサと水とを混合しておくことが好ましい。乾燥する前のアオサを用いた場合には、アオサに付着した水分、及びアオサに含まれる水分が存在するために、必ずしもアオサと水とを混合する必要はない。但し、アオサと水とを混合することにより、酵素処理時のｐＨ調整を行いやすいことから好ましい。

アオサと水とを混合する際には、アオサはそのままで用いることもできるし、適当な大きさに切断したものを用いることもできる。また、アオサは、海から採取したものを乾燥することなく用いることもできるし、乾燥させたものを用いることもできる。
アオサと水とは、任意の質量比率で混合することができる。但し、アオサに対して水が少なすぎる場合には、十分にラムナン硫酸が抽出されないおそれがある一方、水に対してアオサが少なすぎる場合には、ラムナン硫酸の濃度が低いために、ラムナン硫酸抽出後の処理に手間が掛かることになる。このため、アオサ：水＝１：１００〜１００：１（好ましくは１：１０〜１０：１、更に好ましくは１：５〜５：１）の質量比として混合することが好ましい。

本発明においては、セルラーゼ処理を行った後に、プロテアーゼ処理を行うことが好ましい。アオサにおけるラムナン硫酸の存在形態は必ずしも明確ではないが、まずセルラーゼ処理を行うことにより、アオサの外壁部分（セルロース）を分解し、その後にプロテアーゼ処理を施すことが、より好ましい形態となる。
また、セルラーゼ処理とプロテアーゼ処理とを同時に行うことが好ましい。そのようにすれば、酵素処理が一度で済むので、製造時間を短縮することができる。なお、本発明によれば、プロテアーゼ処理を行った後に、セルラーゼ処理を行う、こともできる。

本発明によれば、従来にはほとんど使用価値が認められなかったアオサから、ラムナン硫酸を抽出することができる。このため、安価かつ大量にラムナン硫酸を提供することができる。ラムナン硫酸には、各種の有用な生理活性があることから、産業上の利用価値が非常に大きい発明となる。

次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
アオサが有する多糖類は、従来文献（特許文献１、非特許文献１）に開示された方法（例えば、熱水加熱処理、熱希アルカリ処理、熱希酸処理）では抽出され難い。本発明者らは、上記方法に代えて、次の方法により、アオサから多糖類を調製することに成功した。

図３には、本実施形態の方法を示した。まず、アオサを適当な大きさ（例えば、数ｃｍ〜１０ｃｍ程度）に裁断する（Ｓ１００）。本発明によれば、裁断処理は必ずしも必要ではないが、適当な大きさとしておくことにより、各種処理を行いやすくなる。
次に、アオサに適量の水を加えて、アオサと水との混合液を調製する（Ｓ１１０）。本発明によれば、加水処理は必ずしも必要ではないが、水を加えることにより、酵素処理時のｐＨ調整を行いやすくなる。

次に、酵素の種類に応じて、ｐＨを調整した後（Ｓ１２０）、酵素を添加し、酵素処理を行う（Ｓ１３０）。このとき、セルラーゼ処理を行った後、プロテアーゼ処理を行うことが好ましいが、本発明によれば、必ずしもこの順で行う必要はなく、プロテアーゼ処理を行った後、セルラーゼ処理を行っても良いし、セルラーゼ処理とプロテアーゼ処理とを同時に行っても良い。このとき、使用する酵素に応じて、反応物を適当な温度域に保つ。また、酵素処理時には、混合液を撹拌することができる。本発明に使用できるセルラーゼとしては、セルロース分解活性を有しているものであればよい。市販品としてのセルラーゼには、不純物として別の酵素活性（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼなどの活性）を有しているものがあるが、これらのものも本発明に用いることができる。セルラーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばセルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４（天野エンザイム製）、スペザイムＣＰ、ＧＣ２２０、マルチフェクトＣＬ、インディエイジ４４Ｌ、プリマファースト、インディエイジＲＰＷ、インディエイジＭＡＸ、インディエイジスーパーＧＸプラス、インディエイジニュートラ、オプチマッシュＢＧ、マルチフェクトＡ４０、ピュラダックスＨＡ（ジェネンコア協和製）、ドリセラーゼＫＳＭ、セルロシンＡＣ４０、ＬａｍｉｎｅｘＢＧ（協和エンザイム製）、ＧＯＤＯ−ＴＣＦ、ＧＯＤＯ−ＴＣＬ、ＧＯＤＯＴＣＤーＨ、ベッセレックス（合同酒精製）、ソフィターゲン・Ｃ−１（タイショーテクノス製）、超耐熱性セルラーゼ（耐熱性酵素研究所）、セルライザー、セルラーゼＸＬ−５２２、セルチームＣ、セルライザーＨＴコンク、セルラーゼＸＬ−５３１（ナガセケムテックス製）、ベイクザイムＸＥ（日本シイベルヘグナー製）、セルソフト、デニマックス、セルザイム、セルクラスト、セルクラスト１.５ＬＦＧ、バイオフォードプラス、エネルジェックス（ノボザイムズ製）、セルロシンＡＣ４０、セルロシンＡＬ、セルロシンＴ２、セルロシンＭＥ（エイチビィアイ製）、セルラーゼ”オノヅカ”３Ｓ、セルラーゼ”オノヅカ”Ｐ１２Ｓ、セルラーゼＹ−ＮＣ、セルラーゼＹ−２ＮＣ、パンセラーゼＢＲ、マセロチーム２Ａ（ヤクルト薬品工業製）、スミチームＡＣ、スミチームＣ（新日本化学工業製）、エンチロンＣＭ、エンチロンＭＣＨ、バイオヒット、バイオスター、フェドラーゼ（洛東化成工業製）などが用いられる。

また、プロテアーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばオリエンターゼ２０Ａ、テトラーゼＳ、オリエンターゼ９０Ｎ、ヌクレイシン、オリエンターゼ１０ＮＬ、オリエンターゼ０ＮＳ、オリエンターゼ２２ＢＦ、オリエンターゼ５ＢＬ（エイチビィアイ製）、モルシンＦ、ＩＰ酵素（キッコーマン製）、パパイン、ブロメライン、プロテックス７Ｌ、アルカリプロテアーゼＧＬ４４０、プロテックス６Ｌ、ピュラフェクト、ピュラフェクト０Ｘ、プロペラーゼ、プロテックス０ＸＧ（ジェネンコア協和製）、ソフターゲンＭ、ソフターゲン・Ｍ２（タイショーテクノス製）、グリンドアミルＰＲ５９、グリンドアミルＰＲ４３（ダニスコカルタージャパン製）、デナプシン２Ｐ、食品用精製パパイン、デナチームＡＰ、ビオプラーゼＡＬ−１５ＦＧ、ビオプラーゼ３０Ｌ、ビオプラーゼＡＰＬ−３０、ビオプラーゼＸＬ−４１６Ｆ、ビオプラーゼＳＰ−１５ＦＧ、ビオプラーゼＳＰ−４ＦＧ、プロテアーゼＣＬ−１５（ナガセケムテックス製）、ＰＴＮ、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、ＮＵＥ、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、カンナーゼ、ノボザイムＦＭ、フレーバーザイム、プロタメックス、ノボラン（ノボザイムズ製）、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ、パンチダーゼＮＰ−２、パンチダーゼＰ、アロアーゼＡＰ−１０、アロアーゼＮＰ−１０、アロアーゼＮＳ、アロアーゼＸＡ−１０、プロテアーゼＡＬ（ヤクルト薬品工業製）、マキシレン、フロメーズ（ロビン製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＡＦ（科研ファルマ製）、精製パパイン、コクラーゼ・Ｐ（三共ライフテック製）、スミチームＡＰ、スミチームＬＰ、スミチームＦＰ、スミチームＬＰＬ、スミチームＭＰ（新日本化学工業製）、プロチンＰ、デスキン、プロチンＡ、サモアーゼ（大和化成製）、ニューラーゼＦ３Ｇ、ニューラーゼＡ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、パパインＷ−４０、プロメラインＦ、プロレザーＦＧ−Ｆ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム製）、ベイクザイムＢ５００（日本シイベルヘグナー製）、ＰａｐａｉｎＦ.、Ｔｒｙｐｓｉｎ４.０Ｔ、ＣＯＲＯＬＡＳＥＮ、ＶＥＲＯＮＬ１０、ＣＯＲＯＬＡＳＥＬ１０、ＣＯＲＯＬＡＳＥ７０８９、ＶＥＲＯＮＷ（樋口商会製）、名糖レンネット、名糖レンネットスーパー（名糖産業製）、エンチロンＮＢＳ、エンチロンＳＡ、マグナックスＭＴ（洛東化成工業製）、アクチナーゼＥ（科研製薬株式会社製）などが用いられる。
酵素処理が終了したら、必要に応じて加熱・ｐＨ調整等の方法での酵素失活処理等の後処理を行ってから反応物をろ過し、水溶液画分と残渣画分とに分ける（Ｓ１４０）。このとき、多糖類のほとんどは水溶液側に抽出されているので、水溶液画分を回収する（Ｓ１５０）。ここで、水溶液画分を乾燥処理することにより（Ｓ１６０）、多糖類の粗抽出物とすることができる（Ｓ１７０）。
また、水溶液画分或いは粗抽出物については、当業者に周知の生化学的な手法（例えば、イオン交換、透析、電気透析、活性炭吸着、カラム分離、限外ろ過、ゲルろ過など）を単独で、或いは適当に組み合わせることにより、更に精製処理を行い（Ｓ１８０）、乾燥することにより（Ｓ１９０）、精製抽出物とすることができる（Ｓ２００）。

＜実施例１＞アオサからの粗抽出物及び精製抽出物の調製
次に、アオサから多糖類を調製する際の具体的な方法について、実施例を参照しつつ詳細に説明する。
まず、海岸でアオサを採取した。顕微鏡観察等により、このアオサはアナアオサであることが判った。
アオサを軽く水洗して、表面に付着したゴミ等を取り除いた後、適当な大きさ（約５ｃｍ〜１０ｃｍ程度）に裁断した。裁断後のアオサ（約３００ｇ）をビーカに入れ、ここに水を注ぎ、約１０００ｇの混合液とした。混合液のｐＨは６であった。本実施形態に用いたセルラーゼの至適ｐＨは６付近である。もし、混合液のｐＨが至適ｐＨから外れるようであれば、リン酸、クエン酸などの酸を用いてｐＨを下げる、或いは炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリを用いてｐＨで上げることができる。
ここに１ｇのセルラーゼ（セルロシンＴ２（エイチビーアイ株式会社製））を添加し、良く混合して酵素を溶解した。

上記ビーカを５５℃の温水槽に付けて、４８時間に渡って酵素処理（セルラーゼ処理）を行った。セルラーゼ処理後の混合液中のアオサには、外観上は大きな変化は認められず、少し柔らかくなった程度であった。
セルラーゼ処理後の混合液をトリスヒドロキシメチルアミノメタンと希塩酸とを用いて、ｐＨを９程度に調整した。本実施形態で得られる多糖類を食品として用いる場合には、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどを用いてｐＨを調整することが好ましい。ｐＨ調整後、１ｇのプロテアーゼ（アクチナーゼＥ（科研製薬株式会社製））を添加し、良く混合して酵素を溶解した。
上記ビーカを５５℃の温水槽に付けて、４８時間に渡って酵素処理（プロテアーゼ処理）を行った。プロテアーゼ処理後の混合液中のアオサは、大半が溶解しており、少量の未分解物が残っている程度であった。

両酵素処理が完了した混合液を８５℃で３０分間加熱した後、布を使ってろ過し、水溶液画分と残渣画分とに分けた。水溶性画分を凍結乾燥処理することにより、多糖類の粗抽出物（約８ｇ）を得た。
１ｇの粗抽出物を７Ｍ尿素・０.１５Ｍ塩化カリウム溶液（以下、「溶液Ａ」という）に溶解した。予め溶液Ａにて平衡化したＤＥＡＥカラムに、粗抽出物溶液をアプライし、カラム容積の３倍以上の溶液Ａを通液した。
次いで、溶液Ａに代えて、７Ｍ尿素・２.３Ｍ塩化カリウム溶液をカラムに通液し、塩化カリウムが０.１５Ｍから２.３Ｍとなるステップグラジエントを行った。

カラムの溶出側にフラクションコレクターを設け、各フラクションを回収した。各フラクションについて、一部（０.５ｍＬ）を用い、これに５％フェノール（０.５ｍＬ）と硫酸（２.５ｍＬ）を添加し、フェノール発色が認められるか否かを確認した。ここで黄色〜茶色に発色したフラクションには、多糖類が存在していることから、これらのフラクションを合わせて、透析膜中に入れ、透析・脱塩処理を行った。
透析後の溶液を凍結乾燥し、３００ｍｇの精製抽出物を得た。

＜実施例２＞粗抽出物及び精製抽出物の分析
粗抽出物及び精製抽出物については、上記フェノール硫酸発色による多糖類の検出に加えて、ＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析、糖組成の分析、硫酸基含量の分析を行った。
ＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析は、次の条件で行った。
カラムは、ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｃｋＳＢ−８０６ＭＨＱ直列２本を用い、溶離液は０.１ＭＮａＣｌ溶液を使用し、流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。また、カラム温度は４０℃とした。
１０ｍｇのサンプルを１０ｍＬの０.１ＭＮａＣｌ溶液に溶解し、０.２μｍまたは０.４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものを分析に供した。このサンプル液５０μＬをＨＰＬＣ装置に注入し分析した。

糖組成の分析は、次の条件で行った。
カラムは、ＳｈｏｄｅｘＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−５０４Ｅを用い、溶離液は、アセトニトリル：水＝７５：２５を使用し、流量を１.０ｍｌ／ｍｉｎとした。また、カラム温度は４０℃とした。
２０ｍｇのサンプルを１０ｍＬの２Ｎ硫酸液に添加し、沸騰水中で２時間、加熱・分解した。これに飽和塩化バリウム溶液を加えて中和した後、遠心分離して硫酸バリウムを沈降・除去した。上澄液を回収し、乾固するまで減圧乾燥した。この乾固物に１０ｍＬのアセトニトリル／水（７５／２５）液を加え溶解した後、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過したものを分析に供した。このサンプル液をＨＰＬＣ装置に注入・分析し、スタンダードとの比較により、糖組成を計算した。
スタンダード（検量線）には、適量（１〜２０ｍｇ）の標品の糖(試薬)に１０ｍＬのアセトニトリル／水（７５／２５）液を加え溶解した後、０.２μｍのメンブランフィルターでろ過したものを用いた。分析結果から、ｔ_Ｒ（リテンションタイム：保持時間）と検量線を得た。

硫酸基含量の測定は、次の方法で行った（この方法は、日本薬局法に記載されている燃焼フラスコ法と同じデータが得られる）。
２０ｍｇのサンプルに５ｍＬの１Ｎ塩酸を加え溶解した後、沸騰水中で５時間加熱・分解した。１ｍＬの分解液を採取し、ロータリーエバポレーターを用いて６０℃で減圧濃縮・乾固した。乾固物に２ｍＬの純水を加えて溶解し、再度ロータリーエバポレーターにて６０℃で減圧濃縮・乾固した。添加した塩酸を蒸散させるため、純水添加と減圧濃縮・乾固の操作を５回繰り返した。最終的な乾固物に１０ｍＬの純水を添加・溶解し、サンプル液とした。
０.５ｍＬのサンプル液（硫酸基濃度に応じて純水で適当に希釈したもの）に、２ｍＬのエタノール、１ｍＬの塩化バリウム緩衝液、１.５ｍＬのロジソン酸Ｎａ液を添加し、１０分間暗室で発色させた後、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
スタンダード（検量線）には、硫酸ナトリウムを標品として用い、適当な濃度の水溶液を調整した後、上記と同様の操作を行って発色させ、その吸光度を測定し、検量線を作成した。

粗抽出物の分析結果を図４及び図５に示した。図４には、ＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析チャートを示した。図中のピーク１（ｔ_Ｒ＝１６.１８３ｍｉｎ．）がアオサ由来の多糖類であると判断した。標品との比較から、この多糖類の分子量は、数十万〜数百万程度の範囲であることが判った。
また、図５には、糖組成分析チャートを示した。チャートより、粗抽出物には、多糖類以外のアオサ由来水溶性物質（例えば、アミノ酸など）が多く含まれていることが判った。また、糖類として、ラムノースを主とし、他にキシロース、マンノース、グルコースなどが含まれていることが判った。
また、ロジソン酸法による硫酸基含量の分析結果から、粗抽出物には、８〜９％（ＳＯ_４換算）の硫酸基が含まれることが判った。

精製抽出物の分析結果を図６及び図７に示した。図６には、ＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析チャートを示した。図中のピーク１（ｔ_Ｒ＝１６.４３８ｍｉｎ．）がアオサ由来の多糖類であると判断した。標品との比較から、この多糖類の分子量は、数十万〜数百万程度の範囲であることが判った。
また、図７には、糖組成分析チャートを示した。チャートより、精製抽出物には、主にラムノース、他にキシロース、マンノース、グルコースなどが含まれていることが判った。比較品として、図８には、従来法によりヒトエグサからの精製抽出物の糖組成分析チャートを示した。両抽出物の糖組成は、類似しているものの、それらの組成比は異なっていることが判った。
また、ロジソン酸法による硫酸基含量の分析結果から、精製抽出物には、約１６％（ＳＯ_４換算）の硫酸基が含まれていることが判った。

＜実施例３＞抗トロンビン活性（血液抗凝固活性）の測定
（１）試薬の調製
下記６種類の溶液をそれぞれ調製した。
Ａ液：バルビタール緩衝液（ｐＨ７.３）
２.８８ｇのバルビタールと１.８８ｇのバルビタールＮａを水に溶解して、１ＬとしたものをＡ液とした。
Ｂ液：生理食塩水
９ｇの塩化ナトリウムを水に溶解し、１ＬとしたものをＢ液とした。
Ｃ液：牛胎児血清希釈液
２ｍＬの牛胎児血清にＢ液を加え、５０ｍＬとしたものとＣ液とした。
Ｄ液：１％フィブリノーゲン液
５００ｍｇのフィブリノーゲンをＢ液で溶解し、５０ｍＬとしたものをＤ液とした。
Ｅ液：０.０１％トロンビン液
５ｍｇのトロンビンをＢ液で溶解し、５０ｍＬとしたものをＥ液とした。
一般にトロンビンは、質量ではなく、ＵＮＩＴ量で販売されている（例えば、１０００ＵＮＩＴ／本）。トロンビン溶液は保存が効かないので、実際の試験では、市販品のトロンビンの一部を計量して採取し、Ｂ液で溶かして使用した。
Ｆ液：サンプル液
所定量のサンプルを１０ｍＬのＡ液に溶解したものをＦ液とした。また、コントロールとして、サンプルを含まないＡ液のみを用いた。

（２）抗トロンビン活性の測定
１ｍＬのＡ液、０.５ｍＬのＦ液、０.７５ｍＬのＣ液、及び０.７５ｍＬのＥ液の全量３ｍＬを試験管に混合し、３７℃の温水槽で１５分間インキュベートした。
これに１ｍＬのＤ液を加えて全量を４ｍＬとし、３７℃の温水槽でインキュベートしながら、溶液の白濁・凝固までの時間を観察した。
測定は各サンプルで７回行い、その平均値を白濁・凝固時間とした。
（３）比活性
サンプルとして、ヘパリン（Heparin Sodium関東化学：市販試薬）とアオサ精製抽出物を用いた。Ｆ液中のサンプル濃度を同じにして、ヘパリンに対する抗トロンビン比活性を求めた。比活性は、上記（２）の溶液の白濁・凝固までの時間から、次式で求めた。
Ｔ０：コントロールの白濁・凝固までの時間
Ｔ１：ヘパリン添加時の白濁・凝固までの時間
Ｔ２：アオサ精製抽出物添加時の白濁・凝固までの時間
比活性（％）＝（Ｔ２−Ｔ０）／（Ｔ１−Ｔ０）×１００

（４）結果
アオサ精製抽出物のヘパリンに対する、抗トロンビン比活性は、約１５％であった。

（５）考察
アオサ精製抽出物には抗トロンビン活性があり、ヘパリン様の血液凝固阻害作用を有していることが判った。ただし、その活性は、ヘパリンの約１５％の比活性にとどまった。
特許第２５２１０８３号によれば、抗トロンビン活性は、ヒトエグサ由来のラムナン硫酸では、ヘパリン以上の比活性があるとされている。
このことと、構成糖の差異を考慮すると、アオサ由来のラムナン硫酸は、ヒトエグサ由来のラムナン硫酸とは別の物質であると考えられる。
このように本実施形態によれば、従来にはほとんど使用価値が認められなかったアオサから、ラムナン硫酸を抽出することができた。このため、安価かつ大量にラムナン硫酸を提供することが可能となった。ラムナン硫酸には、各種の有用な生理活性があることから、産業上の利用価値が非常に大きい発明である。

アオサ類の分類図である（アオサ類の分子情報による集団生態学的解析と応用、２００３、成山堂書店、ｐ７０−８７から引用）。アオサ類の分類図である（蒲郡市三河湾環境チャレンジ、第３回シンポジウム（Ｈ１７．９）、第２章．１より引用）。アオサ由来多糖類の製造方法を示す工程図である。アオサ粗抽出物のＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析チャートである。アオサ粗抽出物の糖組成分析チャートである。アオサ精製抽出物のＧＰＣ（ＨＰＬＣ）分析チャートである。アオサ精製抽出物の糖組成分析チャートである。ヒトエグサ精製抽出物の糖組成分析チャートである。

Claims

アナアオサをセルラーゼ処理及びプロテアーゼ処理することを特徴とするラムナン硫酸の製造方法。
セルラーゼ処理を行った後に、プロテアーゼ処理を行うことを特徴とする請求項１に記載のラムナン硫酸の製造方法。
前記セルラーゼ処理及びプロテアーゼ処理の前に、アナアオサと水とを混合しておくことを特徴とする請求項１または２に記載のラムナン硫酸の製造方法。