CN101914165B - 一种生物多糖的径向流色谱分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物多糖的径向流色谱分离纯化方法，首先将药用真菌液体发酵产物或菌丝体(子实体)酶解产物经离心后，收集上清液，或收集从植物、动物、细菌、酵母菌中提取的含多糖的上清液后，将上述上清液用60-120毫升/分钟的流速，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，然后，用蒸馏水或去离子水进行洗脱，流速为50-200毫升/分钟，收集洗脱液500-800毫升，即为含有纯化的多糖溶液。本发明实现了一步法直接从药用真菌菌丝体酶解上清液和发酵上清液、植物、动物、细菌和酵母菌提取上清液中直接分离纯化多糖，是一种工艺简单，操作方便，无有机溶剂使用，生产效率高，纯化效果显著的生物多糖分离纯化方法。

Description

一种生物多糖的径向流色谱分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及分离科学与工程、生物制药等技术领域，具体的说是一种利用大孔树脂径向流色谱技术分离纯化生物多糖的方法。
背景技术：
生物多糖(包括真菌、细菌、植物、动物等)因具有显著的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老等多种生物活性而受到国内外的广泛关注。目前生物多糖的分离纯化策略大多数都是多糖提取上清液经过加热浓缩—乙醇沉淀—离心—得粗多糖—透析除去小分子杂质—双氧水脱色或活性炭脱色—Sevage法或三氯乙酸法等除去杂蛋白—轴向流离子交换色谱或凝胶色谱纯化—洗脱液浓缩—乙醇沉淀—离心—沉淀冷冻干燥——最终得纯化多糖，由此可见，传统方法的分离纯化过程复杂、化学溶剂用量大、环保效果差、生产效率低、生产成本高、难于工业化生产，同时，在多糖的制备过程中由于使用大量的有机溶剂，不仅对操作者和环境造成危害，而且有害物质的残留对药物质量也造成一定程度的不良影响，因此，开发简便、高效、清洁、绿色的分离精制技术是当务之急。
径向流色谱技术是一种新型、高效色谱技术，由于其径向流动原理，可提高流速、降低压力，容量和负荷量大，操作方便，并且由实验室或中试获得的色谱参数稳定，可直接应用于工业化生产，目前，径向流色谱技术主要用于分离蛋白质类药物，遗憾的是目前尚没有利用径向流色谱技术分离纯化生物多糖的方法。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种工艺简单，操作方便，生产效率高，纯化效果显著的生物多糖分离纯化方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种生物多糖的径向流色谱分离纯化法，其包括如下步骤：
(1)将药用真菌发酵罐液体发酵产物，经4000-6000转/分钟离心10分钟，收集上清液，获得含有真菌多糖的发酵上清液；或将菌丝体(或子实体)酶解混合液，经4000-6000转/分钟离心10分钟，收集上清液，获得含有真菌多糖的酶解上清液；或从植物组织、动物组织中提取的含多糖的提取上清液；或从细菌、酵母菌中提取的含多糖的提取上清液；
(2)上述所得含有真菌多糖的发酵上清液或酶解上清液，或植物组织提取上清液、或动物组织提取上清液、或细菌提取上清液、或酵母菌提取上清液，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，上样流速为60-120毫升/分钟，上样量为400-600毫升；
(3)上样结束后，用蒸馏水或去离子水进行洗脱，洗脱流速为50-200毫升/分钟，自洗脱开始随时收集洗脱液500-800毫升，即为含有纯化的多糖溶液。
(4)洗脱结束后，用95％乙醇对大孔树脂进行再生，然后用于下一轮发酵上清液或酶解上清液中多糖的纯化。
本发明的多糖回收率可达85-98％，获得的多糖纯度显著增加，多糖中的色素含量减少可达70-82％，蛋白质含量减少可达75-85％。
本发明实现了利用径向流色谱技术一步法直接从药用真菌菌丝体酶解上清液和发酵上清液中分离纯化多糖，以及从植物组织提取上清液、或动物组织提取上清液、或细菌提取上清液、或酵母菌提取上清液中直接分离纯化多糖，代替了传统的步骤复杂、需要大量有机溶剂、耗能等的提取上清液先经浓缩，再经乙醇沉淀获得粗多糖、然后用双氧水或活性炭去除色素、有机溶剂等去除杂蛋白等的复杂工艺，显著提高多糖纯化工艺的生产效率和多糖的纯度；同时，本发明在不使用有机溶剂的条件下，可使多糖的纯度显著增加，从而消除了三氯甲烷等有机溶剂对操作者和环境造成的危害，以及其在多糖产品中的残留而造成的对药物质量的不良影响。
本发明与传统的轴向流色谱技术相比，具有上样流速快、洗脱剂用量少、多糖回收率高的显著特点，从而能显著降低生产成本、缩短分离纯化时间、提高产品质量。
本发明不仅可用于真菌多糖的分离纯化，也可用于细菌多糖、植物多糖、动物多糖等各种生物多糖的分离纯化。本发明工艺简单，操作方便，生产效率高，纯化效果显著的生物多糖分离纯化方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种从药用真菌发酵上清液中直接分离纯化胞外多糖的大孔树脂径向流色谱法，首先将药用真菌液体发酵产物经4000转/分钟离心10分钟，收集上清液，而后，将含有真菌多糖的发酵上清液用60毫升/分钟的流速，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，上样量为400毫升，然后，用蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为50毫升/分钟，收集洗脱液530毫升，即为含有纯化的多糖溶液，经用苯酚-硫酸法测定，多糖的回收率为85.2％，经分光光度法测定，回收多糖中的色素含量减少可达82.3％，经Bradford法测定，回收多糖中的蛋白质含量减少可达85.6％，从而使多糖的回收率和纯度均得到显著增加。
实施例2
一种从菌丝体酶解上清液中直接分离纯化胞内多糖的大孔树脂径向流色谱法，首先将菌丝体酶解产物经6000转/分钟离心10分钟，收集上清液，而后，将含有真菌多糖的酶解上清液用120毫升/分钟的流速，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，上样量为600毫升，然后，用蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为200毫升/分钟，收集洗脱液800毫升，即为含有纯化的多糖溶液，经用苯酚-硫酸法测定，多糖的回收率为98.1％，经分光光度法测定，回收多糖中的色素含量减少可达70.2％，经Bradford法测定，回收多糖中的蛋白质含量减少可达75.6％，从而使多糖的回收率和纯度均得到显著增加。
实施例3
一种从真菌发酵上清液中直接分离纯化多糖的大孔树脂径向流色谱法，首先将真菌液体发酵产物经5000转/分钟离心10分钟，收集上清液，而后，将含有真菌多糖的发酵上清液用90毫升/分钟的流速，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，上样量为500毫升，然后，用蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为100毫升/分钟，收集洗脱液650毫升，即为含有纯化的多糖溶液，经用苯酚-硫酸法测定，多糖的回收率为94.9％，经分光光度法测定，回收多糖中的色素含量减少可达79.2％，经Bradford法测定，回收多糖中的蛋白质含量减少可达82.6％，从而使多糖的回收率和纯度均得到显著增加。

Claims (1)

1.一种生物多糖的径向流色谱分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将药用真菌发酵罐液体发酵产物，经4000-6000转/分钟离心10分钟，收集上清液，获得含有真菌多糖的发酵上清液；或将菌丝体或子实体酶解混合液，经4000-6000转/分钟离心10分钟，收集上清液，获得含有真菌多糖的酶解上清液；或从植物组织、动物组织中提取获得含多糖的提取上清液；或从细菌、酵母菌中提取获得含多糖的提取上清液；
(2)上述所得含有真菌多糖的发酵上清液或酶解上清液、或植物组织提取上清液、或动物组织提取上清液、或细菌提取上清液、或酵母菌提取上清液，直接上样于500毫升的大孔树脂径向色谱柱，上样流速为60-120毫升/分钟，上样量为400-600毫升；
(3)上样结束后，用蒸馏水或去离子水进行洗脱，洗脱流速为50-200毫升/分钟，自洗脱开始随时收集洗脱液500-800毫升，得到纯化的多糖溶液。
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