CN101649338B - 一种粒毛盘菌胞外多糖单一组分的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种粒毛盘菌多糖单一组分的制备方法，包括粒毛盘菌的培养、胞外多糖的提取纯化以及分级分离，其特征是用葡聚糖凝胶层析柱对提取纯化的胞外多糖进行分级分离，以双蒸馏水为洗脱剂，依序分管收集洗脱液，于490nm处测定吸光度，以吸光度对管编号作图得到洗脱曲线，根据洗脱曲线，合并曲线中单一高峰部分，真空干燥得到粒毛盘菌胞外多糖单一组分。本单一组分多糖可用于毛盘菌多糖的结构分析及构效关系的研究。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种真菌多糖的制备方法，确切地说是一种粒毛盘菌胞外多糖单一组分的制备方法。
二、背景技术：
粒毛盘菌，是广泛分布于世界的一类腐生性真菌，也是近几年来发现的具有重要经济价值的一类真菌。长期以来，世界各国学者在盘菌系统分类方面作了大量的研究工作，但大多学者尚未关注此类真菌纯培养物的分离及其培养条件研究。真菌多糖是一类重要的生物活性物质，是目前公认的有较高疗效的免疫增强剂，研究发现其还具有明显的抗衰老、消除人体过剩的自由基，抗肿瘤等药理功能，在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用。2009年，浙江大学学报公开了一种禾本科粒毛盘菌多糖的提取方法，并对提取的多糖进行了初步纯化，但未实现多糖的分级分离。
三、发明内容
本发明旨在为粒毛盘菌多糖的基础研究提供一种单一组分的粒毛盘菌多糖，所要解决的技术问题是对提取的胞外多糖实现分级分离。
本发明的技术方案包括粒毛盘菌的培养、胞外多糖的提取纯化以及分级分离，与现有技术的区别是所述的分级分离是对提取纯化的胞外多糖用葡聚糖凝胶层析柱进行分离，以双蒸馏水为洗脱剂，在苯酚-碳酸法跟踪检测下依次分管收集洗脱液，于490nm波长处测定吸光度，以吸光度对管编号作图得到洗脱曲线，如图1所示，合并曲线中单一高峰部分，经真空干燥得到粒毛盘菌多糖的单一组分。
本单一组分多糖可用于粒毛盘菌多糖的结构分析及构效关系的研究。
具体操作过程如下：
(一)培养基的配制
1、平板培养基：
2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母膏，1.5％琼脂，水余量，调pH值6.5后固化为固体培养基。
2、摇瓶培养基：
2％～3％葡萄糖，0.2％～0.5％蛋白胨，0.2％～0.5％酵母膏，0.05％～0.1％MgSO4，0.05％～0.1％KH2PO4，水余量。
3、发酵培养基：
3％～4％葡萄糖，0.2％～0.5％酵母膏，0.5％～1％玉米淀粉，0.05％～0.1％MgSO4，0.05％～0.1％KH2PO4，水余量。
(二)粒毛盘菌的培养
1、平板培养
将菌种转接到平板培养基中，于24～28℃培养3～4d。
2、摇瓶培养
于250ml三角瓶中装入50ml摇瓶培养基，高压灭菌后，接种平板菌种，于24～28℃、180～200r/min振荡培养3～4d。
3、发酵罐培养
采用5L自控发酵罐液态深层发酵，培养基采用发酵培养基，装料系数为0.6～0.7，接种量为10％～15％，培养温度为24～28℃，通气量为1.0～1.5L/min，搅拌转速为180～200r/min，发酵时间为8～10天。
(三)胞外多糖的提取及纯化
将发酵液抽滤得滤液，滤液浓缩到原来体积的1/3～1/4，加2～3倍体积95％的乙醇于4℃醇析8～24h，醇析液4000r/min离心10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤2～3遍，然后用蒸馏水溶解，三氯乙酸法脱蛋白，流水、蒸馏水透析，真空干燥得多糖粉末。
(四)多糖的分级分离及纯度鉴定
取10～20mg多糖粉末溶于双蒸水中，上Sephadex G-100(1.6cm×60cm)进行层析，洗脱剂为双蒸水，洗脱体积为70ml，流速为0.2ml/min，每管收集2～3ml，用苯酚-硫酸法跟踪检测，于490nm波长处测吸收度，以吸光度对管号作图，得洗脱曲线，如图1所示，合并单一高峰部分。
纯度鉴定：仪器为waters-2414型HPLC主机，配置waters-1515型视差遮光监测器；分析柱为UltrahydrogelTM2000和UltrahydrogelTM250(7.8mm×30cm)串联住，以双蒸水为流动相，流速为0.6-1.0mL/min，柱温为35℃，根据峰形判断纯度。结果如图2所示。真空干燥得到粒毛盘菌多糖单一组分。外观为白色粉末。
四、附图说明
1、图1是葡聚糖凝胶层析柱双蒸馏水洗脱曲线图，曲线中有两个单一峰，自左至右依次命为LEPS-1、LEPS-2。
2、图2是LEPS-1HPGPC色谱图。
五、具体实施方式
现以禾本科粒毛盘菌为例，非限定实施例叙述如下。
1、平板培养
取菌种转接到平板培养基中，于25℃培养3～4d，平板培养基为2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母膏，1.5％琼脂，PH值6.5。
2、摇瓶培养
于250ml三角瓶中装入50ml摇瓶培养基，高压灭菌后，用打孔器接种9mm菌块，25℃、200r/min振荡培养4d得种子液，摇瓶培养基为2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母膏，0.1％MgSO4，0.1％KH2PO4。
3、发酵罐培养
采用5L自控发酵罐液态深层发酵，培养基采用发酵培养基，装料系数为0.7，接种量为10％，培养温度为(25±1)℃，通气量为1.5L/min，搅拌转速为200r/min，发酵时间为8天，发酵培养基为3％葡萄糖，0.5％酵母膏，0.5％玉米淀粉，0.1％MgSO4，0.1％KH2PO4。
4、多糖的提取及纯化
将发酵液抽滤得滤液，滤液浓缩到原来体积的1/3～1/4，加三倍体积95％的乙醇于4℃醇析12h，醇析液4000r/min离心10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，然后用蒸馏水溶解，三氯乙酸法脱蛋白：多糖溶液中加入等体积5％三氯乙酸，搅拌10min，4℃放置4h，调pH值至中性，浓缩至原体积，离心，取上清液重复以上操作2次。流水透析24h，蒸馏水透析12h，真空干燥得多糖粉末。
5、多糖的分级分离及纯度鉴定
取15mg多糖粉末溶于双蒸水中，上Sephadex G-100(1.6cm×60cm)进行层析，洗脱剂为双蒸水，洗脱体积为70ml，流速为0.2ml/min，每管收集2ml，用苯酚-硫酸法跟踪检测，于490nm波长处测吸收度，以吸光度对管号作图，得洗脱曲线如图1，由图中可知洗脱曲线出现两个单一峰，按其先后顺序命为LEPS-1、LEPS-2，合并LEPS-1单一高峰部分。纯度鉴定：仪器为waters-2414型HPLC主机，配置waters-1515型视差遮光监测器；分析柱为UltrahydrogelTM2000和UltrahydrogelTM250(7.8mm×30cm)串联住，以双蒸水为流动相，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，由图2可知HPGPC谱中出现的单一对称峰的多糖组分是单一组分。真空干燥得到粒毛盘菌多糖单一组分LEPS-1。
研究表明，本培养、提取分离方法，同样适用于其他粒毛盘菌，如萼状粒毛盘菌、洁白粒毛盘菌等。
Claims (1)
1.一种粒毛盘菌胞外多糖单一组分制备方法，包括粒毛盘菌的培养、胞外多糖的提取纯化以及分级分离，其特征在于：
所述的粒毛盘菌的培养：
(1)、平板培养
取菌种转接到平板培养基中，于25℃培养3～4d，平板培养基为2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母膏，1.5％琼脂，PH值6.5；
(2)、摇瓶培养
于250ml三角瓶中装入50ml摇瓶培养基，高压灭菌后，用打孔器接种9mm菌块，25℃、200r/min振荡培养4d得种子液，摇瓶培养基为2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母膏，0.1％MgSO4，0.1％KH2PO4；
(3)、发酵罐培养
采用5L自控发酵罐液态深层发酵，培养基采用发酵培养基，装料系数为0.7，接种量为10％，培养温度为25±1℃，通气量为1.5L/min，搅拌转速为200r/min，发酵时间为8天，发酵培养基为3％葡萄糖，0.5％酵母膏，0.5％玉米淀粉，0.1％MgSO4，0.1％KH2PO4；
所述的胞外多糖的提取纯化：
(4)、将发酵液抽滤得滤液，滤液浓缩到原来体积的1/3～1/4，加三倍体积95％的乙醇于4℃醇析12h，醇析液4000r/min离心10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，然后用蒸馏水溶解，三氯乙酸法脱蛋白：多糖溶液中加入等体积5％三氯乙酸，搅拌10min，4℃放置4h，调pH值至中性，浓缩至原体积，离心，取上清液重复以上操作2次；流水透析24h，蒸馏水透析12h，真空干燥得多糖粉末；
所述的多糖分级分离：
(5)、取15mg多糖粉末溶于双蒸水中，上1.6cm×60cm Sephadex G-100进行层析，洗脱剂为双蒸水，洗脱体积为70ml，流速为0.2ml/min，每管收集2ml，用苯酚-硫酸法跟踪检测，于490nm波长处测吸收度，以吸光度对管号作图，得洗脱曲线，根据洗脱曲线合并单一高峰部分，真空干燥得到粒毛盘菌多糖单一组分。
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