CN102199645A - 嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，涉及嗜冷红酵母的发酵生产和所产金属硫蛋白的制备工艺。自极地嗜冷红酵母中选育出拮抗重金属、并产生金属硫蛋白的菌株，该菌在添加Cu2+的优化2216E培养液中，较低温度下培养，经细胞破壁、凝胶过滤、离子层析、脱盐和冷冻干燥得纯化的铜金属硫蛋白。该红酵母所产金属硫蛋白络合重金属离子的能力较强，并且产量为常温酵母的5-60倍。采用本发明提取金属硫蛋白纯度可达95％以上。酵母以其生物安全性高、易培养和不受时空限制而具有独特的优势，并且产生的金属硫蛋白提取工艺简单，无污染无残毒，较动物金属硫蛋白易得。在医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业以及重金属回收等领域市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及嗜冷红酵母所产金属硫蛋白的制备工艺。
背景技术
金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、能被金属诱导的金属结合蛋白。具有很强的金属结合能力和氧化还原能力，在生物体内参与细胞内必要金属水平的稳态调节、非必要重金属解毒、清除自由基、抵抗电离辐射等，甚至参与激素和发育调节，增强机体应激反应，锌元素的贮存库，防止细胞癌变等，被科学界誉为“人体健康的卫士”。因此，MT在医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业、重金属回收等领域有广阔的应用前景。1995年联合国将其列入向世界各国推荐的生物技术产品。金属硫蛋白是我国863重大攻关课题、“火炬”计划、“八五”和“九五”重点科技推广计划之一。
金属硫蛋白提取及制备工艺相关专利绝大多数来源为动物肝脏，由于其产量较低，昂贵的价格和国外禁止使用动物肝脏制造金属硫蛋白等，限制了其进一步应用。酵母以其生物安全性高、易培养和不受时空限制而具有独特的优势，优于从动物脏器提取金属硫蛋白。自从1975年酵母产金属硫蛋白开展研究以来，科学家们已经在酿酒酵母、异常汉逊酵母、异常毕赤酵母、红酵母、假丝酵母等酵母中发现了金属硫蛋白，并且对其进行了分离纯化和性质的初步研究。涉及酵母产金属硫蛋白及其提取工艺的专利仅有北京大学林稚兰教授申请的“酿酒酵母金属硫蛋白产生菌的选育发酵与提取工艺(申请号：96100897.0)”，酿酒酵母BD101经细胞破碎，凝胶过滤、亲和层析获得纯化的铜金属硫蛋白。利用酵母菌生产MT已引起科学家们极大的兴趣，但这些菌株都为常温酵母，而嗜冷酵母具有特殊的生长条件和菌体结构，所产金属硫蛋白理化性质独特，常温酵母的金属硫蛋白提取工艺不适用于嗜冷酵母菌株。
发明内容
本发明(实用新型)的目的在于避免(克服论述......中的不足(缺点)而提供一种...产品(方法)”
本发明的目的在于克服以上论述中存在的技术问题，而提供一种快捷、简便的适于嗜冷红酵母金属硫蛋白制备的工艺。
本发明提供一种嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，其包括如下方案：
(1)嗜冷红酵母的发酵培养：将低温冷冻保存的红酵母菌种活化，2216E液体培养基5-15℃低温发酵，培养1-3天后CuSO4诱导，连续诱导2-4次，培养至稳定期。
(2)金属硫蛋白的提取：发酵液离心得菌体，预冷蒸馏水洗涤1-3次，反复冻融后加Tris-HCl缓冲液(pH8.6)研磨，超声波破碎。高速离心后收集上清液，热水浴处理后迅速冷却，离心得金属硫蛋白的粗提液；
(3)金属硫蛋白的纯化：将上述粗提液经凝胶分离，选取275nm吸收峰值的部分，收集巯基和Cu2+浓度均较高的层析液；然后进行离子层析分离、脱盐，得到金属硫蛋白的不同亚型；
(4)金属硫蛋白的干燥：将不同亚型样品液进行真空冷冻干燥，低温冷冻保存。
经功能分析，本发明所得金属硫蛋白对铜、锌、镉、汞离子有很强的结合能力，对羟基和超氧阴离子自由基的清除能力与兔肝源金属硫蛋白相近。
本发明金属硫蛋白来源于极地嗜冷红酵母，酵母菌株长期生活在极地低温、高盐、强辐射、寡营养等极端环境条件下，能够诱导产生大量的金属硫蛋白。本发明采用反复冻融及超声波破碎，层析分离和冷冻干燥等先进生物技术手段，制备所得Cu-MT分子量约为8kDa，与其它常温酵母类似，但每分子MT可结合12个Cu2+，络合金属离子的能力远超过常温酵母菌的4个或8个，并且产量为2.1-6.3mg/g湿菌体，显著高于常温酵母菌，达到了动物产金属硫蛋白的水平，并且具有较强的结合重金属和抗氧化的能力。
本发明嗜冷红酵母发酵生产及金属硫蛋白的提取工艺，所得金属硫蛋白产量高，活性强，且提取方法简便。同时，本提取工艺得到的副产物——色素，是一种很好的食品添加剂，是其他提取方法不能得到的。
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
实施例1：
(1)红酵母菌株的发酵生产：取-40℃甘油中保存的红酵母菌种，划线接种于2216E斜面培养基上，10℃培养15天，活化菌种。接入摇瓶扩大培养至对数生长末期，调整菌液浓度为109cfu/ml，按体积比接种1％的嗜冷红酵母发酵液，10℃恒温摇床中培养，至对数生长期加入0.5mM的CuSO4诱导，每天定时诱导1次，连续3次；
(2)金属硫蛋白的提取：经离心(5000r/min，10min，4℃)，预冷蒸馏水洗涤2次，得Cu2+诱导的菌体，取菌体15g，-20℃反复冻融3次后加pH8.6的Tris-HCl缓冲液15mL研磨，超声波破碎10min。15000r/min离心30min后收集上清液，75℃水浴3min，迅速冰浴冷却，离心得金属硫蛋白的粗提液；
(3)金属硫蛋白的纯化：将上述粗提液经SephadexG-75凝胶分离，分离柱的规格为3×90cm，0.1mol/l的Tris-HCl(pH 8.6)洗脱，流速为5mL/min，每分钟收集1管，选取275nm吸收峰值的部分，收集巯基和Cu2+浓度均较高的层析液；然后进行DEAE-52离子层析分离，层析柱规格为1×20cm，0.01-0.3mol/L的NaCl梯度洗脱，自动收集器收集，每管5mL，收集巯基含量高的收集管，再进行Sephadex G-25脱盐，得到金属硫蛋白亚型I和亚型II；
(4)金属硫蛋白的干燥：将2种亚型样品液进行真空冷冻干燥，重量分别为24.4mg和12.4mg，-40℃保存。
经功能分析，每个金属硫蛋白分别可以结合12个铜离子、10个锌离子、10个镉离子，结合重金属离子的能力较强；一定浓度的金属硫蛋白对羟基和超氧阴离子自由基的清除率分别可达85％和90％，与兔肝源同浓度金属硫蛋白功能相当(对二者的清除率分别为91％和86％)。
实施例2：
(1)红酵母菌株的发酵生产：取-40℃甘油中保存的红酵母菌种，划线接种于2216E斜面培养基上，10℃培养15天，活化菌种。接入摇瓶扩大培养至对数生长末期，调整菌液浓度为109cfu/ml，按体积比接种1％的嗜冷红酵母发酵液，10℃恒温摇床中培养，至对数生长期加入0.5mM的CuSO4诱导，每天定时诱导1次，连续3次；
(2)金属硫蛋白的提取：经离心(5000r/min，10min，4℃)，预冷蒸馏水洗涤2次，得Cu2+诱导的菌体，取菌体15g，-20℃反复冻融3次后加pH8.6的Tris-HCl缓冲液15mL研磨，超声波破碎10min。15000r/min离心30min后收集上清液，75℃水浴3min，迅速冰浴冷却，离心得金属硫蛋白的粗提液；
(3)金属硫蛋白的纯化：将上述粗提液经Sephadex G-75凝胶分离，分离柱的规格为3×90cm，0.1mol/l的Tris-HCl(pH 8.6)洗脱，流速为5mL/min，每分钟收集1管，选取275nm吸收峰值的部分，收集巯基和Cu2+浓度均较高的层析液；然后进行DEAE-52离子层析分离，层析柱规格为1×20cm，0.01-0.3mol/L的NaCl梯度洗脱，自动收集器收集，每管5mL，收集巯基含量高的收集管，再进行Sephadex G-25脱盐，得到金属硫蛋白亚型I和亚型II；
(4)金属硫蛋白的干燥：将2种亚型样品液进行真空冷冻干燥，重量分别为22.8mg和11.6mg，得率分别为1.52mg/g湿菌体和0.77mg/g湿菌体，-40℃保存。
经功能分析，每个金属硫蛋白分别可以结合12个铜离子、10个锌离子、10个镉离子，结合重金属离子的能力较强；一定浓度的金属硫蛋白对羟基和超氧阴离子自由基的清除率分别可达87％和89％，与兔肝源同浓度金属硫蛋白功能相当(对二者的清除率分别为92％和90％)。
实施例3：
(1)红酵母菌株的发酵生产：取-40℃甘油中保存的红酵母菌种，划线接种于2216E斜面培养基上，5-15℃培养10-15天，活化菌种。接入摇瓶扩大培养至对数生长末期，调整菌液浓度109cfu/ml，按体积比接种1-5％的嗜冷红酵母发酵液，10-15℃恒温摇床中培养，至对数生长期加入0.1-0.5mM的CuSO4诱导，每天定时诱导1次，连续3次；
(2)金属硫蛋白的提取：经离心(5000r/min，10min，4℃)，预冷蒸馏水洗涤2次，得Cu2+诱导的菌体，取菌体15g，-20℃反复冻融4次后加pH8.6的Tris-HCl缓冲液15mL研磨，超声波破碎15min。15000r/min离心30min后收集上清液，80℃水浴3min，迅速冰浴冷却，离心得金属硫蛋白的粗提液；
(3)金属硫蛋白的纯化：将上述粗提液经Sephadex G-75凝胶分离，用0.1mol/l的Tris-HCl(pH 8.6)洗脱，流速为4mL/min，每分钟收集1管，选取275nm吸收峰值的部分，收集巯基和Cu2+浓度均较高的层析液；然后进行DEAE-52离子层析分离，用0.01-0.3mol/L的NaCl梯度洗脱，自动收集器收集，每管4mL，收集巯基含量高的收集管，再进行Sephadex G-25脱盐，得到金属硫蛋白亚型I和亚型II；
(4)金属硫蛋白的干燥：将2种亚型样品液进行真空冷冻干燥，重量分别为21.4mg和13.2mg，-40℃保存。
经功能分析，每个金属硫蛋白分别可以结合12个铜离子、10个锌离子、10个镉离子，结合重金属离子的能力较强；一定浓度的金属硫蛋白对羟基和超氧阴离子自由基的清除率分别可达81％和86％，与兔肝源同浓度金属硫蛋白功能相当(对二者的清除率分别为86％和90％)。
Claims (3)
1.一种嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，其特征在于利用嗜冷红酵母作为供体，发酵生产并提取、纯化胞内的金属硫蛋白，具体步骤是：
(1)诱导：所用诱导剂为硫酸铜，按终浓度0.1-0.5mmol/L在嗜冷红酵母对数生长期(接种后约1-3d)开始诱导，且连续诱导2-4次。
(2)发酵生产：以2216E为基本培养基，5-15℃培养，菌液浓度109cfu/ml，接种量为1-5％(体积比)，对数生长期加入CuSO4诱导。
(3)提取：菌体预冷蒸馏水洗涤1-3次，破碎时反复冻融1-4次，且超声波破碎。75℃水浴3min除去不耐热杂蛋白，然后迅速冷却。
(4)纯化：金属硫蛋白粗提液经凝胶分离，洗脱液的流速为3-6mL/min，离子层析分离，用0.01-0.3mol/L的NaCl梯度洗脱，柱层析脱盐，得到金属硫蛋白的不同亚型。以275nm吸光度值、巯基含量和Cu2+浓度来检测金属硫蛋白。
(5)干燥：将层析液冷冻干燥后得到金属硫蛋白粉末。
2.按权利要求1所述的嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，其特征是：保存在低温甘油中的红酵母菌首先经5-15℃活化10-15天，然后在2216E培养基中发酵，5-15℃培养，当菌液浓度约为109cfu/ml时扩大培养(接种量为1-5％)，3-5天培养后加入0.1-0.5mmol/L CuSO4诱导，连续诱导3天。
3.按权利要求1所述的嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，其特征是：发酵所得菌体需预冷蒸馏水洗涤1-2次，除去表面的杂质和盐分，破碎时反复冻融与超声波破碎相结合，可以充分破碎红酵母细胞；除去不耐热杂蛋白时，75℃水浴3min即可，低于常温酵母80℃的操作温度；经凝胶层析纯化的金属硫蛋白再经离子层析，可以得到金属硫蛋白的不同亚型，使其纯度更高。
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