CN105296559A - 制备麦角硫因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进的制备麦角硫因的方法，该方法包括如下步骤：(a)将糙皮侧耳(Pleurotus？ostreatus)CGMCC？No.6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和(b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。进一步，向发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：NH4Cl、NH4NO3、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温和司盘。

Description

制备麦角硫因的方法
技术领域
本发明属于生物资源、生物工程、发酵工程及天然产物的生物合成领域。更具体地，本发明涉及一种以更高的产量制备麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，作为生物体内重要的生理活性物质，起着抗氧化，防止紫外辐射损伤，调节细胞内的氧化还原反应，螯合二价金属离子，参与细胞内的能量调节等诸多生物学功能，是一种多功能的细胞生理保护剂(刘琦，姜文侠，杨萍，周涛.麦角硫因——多功能的生理细胞保护剂[J].天然产物研究与开发，2013，25(增刊)：160-164)。麦角硫因是通常认为安全的(generallyrecognizedassafe，GRAS)产品，性能稳定，在医药、生物医学、食品、保健食品、食品添加剂和化妆品等行业具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
由于目前麦角硫因的制备成本高，限制了其应用。与化学合成法和天然生物提取法相比，利用食用菌深层发酵制备麦角硫因，可以通过建立高强度发酵过程控制策略，提高麦角硫因的积累量，实现大规模的高效生产，降低生产成本，而且具有产品安全等优势，是合成麦角硫因的发展方向(刘琦，张维亚，姜文侠，梅保良，周涛.麦角硫因生物合成技术的研究进展[C].2013年国际氨基酸产业发展高峰论坛论文集.2013：22-27)。
日本PramvadeeTepwong等利用香菇(Lentinulaedodes)菌丝体深层发酵制备麦角硫因，发酵第15天时发酵液中麦角硫因的产量为23.6mg/L(PramvadeeTepwong,AnupamGiri,FumitoSasaki.Mycobialenhancementofergothioneinebysubmergedcultivationofediblemushroommyceliaanditsapplicationasanantioxidativecompound[J].FoodChemistry,2012,131:247–258)；韩国WiYoungLee等利用紫黑灵芝(Ganodermaneo-japonicum)菌丝体发酵合成麦角硫因，发酵结束时发酵液中麦角硫因的含量达57.5mg/L(WiYoungLee,Eung-JunPark,JinKwonAhn.SupplementationofmethionineenhancedtheergothioneineaccumulationintheGanodermaneo-japonicummycelia[J].ApplBiochemBiotechnol,2009,158:213-221)；台湾黄龄谊和Chih-HungLiang对杏鲍菇(Pleurotuseryngii)菌丝体进行液体发酵培养，培养结束后，发酵液中麦角硫因的产量分别达62.2mg/L(黄龄谊.高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾：中兴大学，2010)和60.4mg/L(Chih-HungLiang,Ling-YiHuang,Kung-JuiHo,etal.Submergedcultivationofmyceliumwithhighergothioneinecontentfromtheculinary-medicinalkingoystermushroomPleurotuseryngii(higherbasidiomycetes)anditscomposition[J].InternationalJournalofMedicinalMushrooms,2013,15(2):153-164)；姜文侠等利用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)菌丝体发酵制备麦角硫因，通过对发酵培养基和发酵控制工艺的优化，发酵液中麦角硫因的含量达到135.7mg/L(姜文侠，刘琦，周涛.生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法[P].CN201210392417.8)。
发明内容
本发明的目的是进一步提高中国发明专利申请CN201210392417.8中麦角硫因的发酵产量，提供一种改进的制备麦角硫因的方法。将中国发明专利申请CN201210392417.8的全部内容引入本文以供参考。
在中国发明专利申请CN201210392417.8中，公开了一种制备麦角硫因的方法，包括如下步骤：
1)将糙皮侧耳CGMCCNo.6232的固体菌种(优选PDA斜面菌种)接种至液体种子培养基，在19～31℃摇床100～200rpm培养至少3天，制备种子液；
2)将种子液按4～20％的接种量(V/V)接种至发酵培养基，然后在19～31℃摇床100～200rpm培养至少6天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液；
3)发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50～100℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中。
所述的液体种子培养基的组成为：玉米粉15～50g/L(优选25～40g/L)、豆粕粉10～35g/L(优选15～25g/L)、α-淀粉酶20～80U/L(优选30～65U/L)、磷酸二氢钾1～6g/L(优选2～4.5g/L)、硫酸镁0.2～5g/L(优选0.2～3g/L)，其余为水。
所述的发酵培养基的组成为：甘油10～80g/L，酪蛋白胨10～40g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
本发明的技术方案
根据本发明，使用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)TIB.BPE.10010，作为发酵菌种发酵制备麦角硫因。该菌种已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCCNo.6232。
根据本发明进一步提高麦角硫因发酵产量的制备方法包括如下步骤：
(a)将糙皮侧耳CGMCCNo.6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和
(b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。
优选地，糙皮侧耳CGMCCNo.6232获自PDA斜面培养基；种子培养基为：玉米粉15～50g/L(优选25～40g/L)、豆饼粉5～35g/L(优选15～35g/L)、α-淀粉酶20～80U/L(优选30～65U/L)、磷酸二氢钾1～6g/L(优选2～4.5g/L)、硫酸镁0.2～5g/L(优选0.2～3g/L)，其余为水；发酵基础培养基为：甘油10～95g/L、酪蛋白胨10～80g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
优选地，步骤(a)中的培养操作在19～31℃进行至少3天，步骤(b)中的培养操作在19～31℃进行至少6天，且步骤(b)中的接种量为4～20(V/V)％。
进一步，向发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：NH4Cl、NH4NO3、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温(tween，例如吐温60和吐温80)和司盘(span，例如司盘80)。该添加步骤可以在发酵前或发酵的过程中进行。
优选地，向发酵基础培养基中添加以下量的任一种或多种物质：NH4Cl0.5g/L～12g/L、NH4NO30.5g/L～10g/L、叶酸0.08g/L～2.56g/L、VB10.01g/L～0.8g/L、吲哚丁酸0.1mg/L～4mg/L、柠檬酸0.01g/L～0.8g/L、丙酮酸0.05g/L～4.5g/L、谷氨酸1μmol/L～100μmol/L、天冬氨酸0.05g/L～9g/L、甜菜碱50mmol/L～250mmol/L、组氨酸0.1mmol/L～3mmol/L、半胱氨酸2mmol/L～45mmol/L、蛋氨酸3mmol/L～45mmol/L、吐温0.5g/L～50g/L(例如吐温602g/L～50g/L、吐温800.5g/L～40g/L)和司盘0.2g/L～10g/L(例如司盘800.2g/L～10g/L)。
本发明的技术效果
使用豆饼粉作为糙皮侧耳CGMCCNo.6232发酵合成麦角硫因的种子培养基的氮源，适当提高发酵培养基中甘油和酪蛋白胨的含量，向发酵基础培养基中添加NH4Cl、NH4NO3、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温和司盘中的任意一种或多种化合物，可显著提高麦角硫因的发酵水平，产物的产率比对照组大幅度提高。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实验仪器、材料：摇床(IS-RDV3，美国精骐有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent1260，AgilentTechnologies)；水浴锅(TW20，Julabo公司)；数字式加热磁力搅拌器(MIXControl20，WIGGENS公司)；电子分析天平(AB204-S，METTLERTOLEDO)；活塞式真空泵(V610，ChemVak)；超声波清洗机(SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司)；0.22μm孔径微孔滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；中空纤维超滤膜(天津爱生膜过滤技术有限公司)。
主要试剂：麦角硫因对照品(纯度≥98％，BiomolInternationalInc.)；PDA培养基(Becton，DickinsonandCompany)；甲醇等试剂为市售色谱纯；磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；玉米粉购自梅河口市兴达米业有限责任公司；豆饼粉和豆粕粉购自北京中棉紫光生物科技有限公司；甘油购自天津市风船化学试剂科技有限公司；酪蛋白胨购自偃师市百家工贸有限公司；NH4Cl、NH4NO3、丙酮酸和司盘80购自天津市光复精细化工有限公司；α-淀粉酶、叶酸、VB1、吲哚丁酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸购自北京索莱宝科技有限公司；甜菜碱为潍坊祥维斯化学品有限公司产品；吐温60和吐温80购自北京索莱宝科技有限公司。
比较例1：麦角硫因菌丝体发酵液的制备及麦角硫因的检测
麦角硫因菌丝体发酵液的制备
种子培养基：玉米粉30g/L、豆粕粉15g/L、α-淀粉酶80U/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，500mL三角瓶中的装液量为150mL。
发酵基础培养基：甘油50g/L、酪蛋白胨35g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，500mL三角瓶中的装液量为150mL。
挑取PDA斜面菌种CGMCCNo.6232的菌苔接入种子培养基，25℃150rpm摇床培养4天，得到种子液。将种子液按体积比5％的接种量接入发酵基础培养基，25℃摇床150rpm培养15天，得菌丝体发酵液，麦角硫因积累于菌丝体的细胞内。
如此制备的发酵液中麦角硫因含量为110.8mg/L，测定方法如下所述。
发酵液中麦角硫因含量检测的待测样品的制备
糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体深层发酵结束后，将菌丝体发酵液置于90℃水浴，200rpm搅拌条件下浸提15min，使麦角硫因浸提到细胞外的发酵液中。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜过滤，得到的透过液即为发酵液中麦角硫因含量检测的待测样。
麦角硫因的测定
对照品溶液的制备：精密称取麦角硫因对照品10mg，于25mL容量瓶中加纯水配制成浓度为400mg/L的对照品贮备液。再精密吸取贮备液适量，加纯水制成浓度分别为40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L和200mg/L的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。
定性与定量检测：相同色谱条件下，对麦角硫因对照品溶液与待测样品进行HPLC测定，将待测样品的色谱图与麦角硫因对照品溶液的色谱图进行对比，根据保留时间确定待测样品中的麦角硫因色谱峰。以麦角硫因对照品溶液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，在对照品溶液与待测样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出待测样品中麦角硫因的含量，待测样品中麦角硫因的浓度即为发酵液中麦角硫因的浓度。
检测条件：色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18(4.6×250mm，5μm)，两根色谱柱串联使用；流动相为1％甲醇溶液，使用乙酸-乙酸钠缓冲液调节流动相的pH为5.0；检测波长257nm；流速0.7mL/min；柱温25℃；进样量5μL。
实施例1：种子培养基的氮源及其含量对麦角硫因发酵积累量的影响
按照比较例1的方法制备发酵液，不同之处在于分别使用5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L的豆饼粉替代比较例1中15g/L的豆粕粉作为种子培养基的氮源。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表1。
15g/L的豆饼粉试验组发酵液中麦角硫因的平均含量达125.5mg/L，与比较例1(110.8mg/L)相比提高了13.3％。
表1.种子培养基中氮源及其含量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例2：添加NH4Cl提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L、12g/L的NH4Cl，同时以不添加NH4Cl的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表2。
试验结果表明NH4Cl的添加量在0.5g/L～12g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以NH4Cl添加量为4g/L时麦角硫因的含量最高，达到155.4mg/L，比对照组提高了24.4％。
表2.NH4Cl的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例3：添加NH4NO3提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L的NH4NO3，同时以不添加NH4NO3的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表3。
试验结果表明NH4NO3的添加量在0.5g/L～10g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以NH4NO3添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到148mg/L，比对照组提高了18.5％。
表3.NH4NO3的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例4：添加叶酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.08g/L、0.16g/L、0.32g/L、0.64g/L、1.28g/L、2.56g/L的叶酸，同时以不添加叶酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表4。
试验结果表明叶酸的添加量在0.08g/L～2.56g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以叶酸添加量为0.64g/L时麦角硫因的含量最高，达到148.6mg/L，比对照组提高了25％。
表4.叶酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例5：添加VB1提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的VB1，同时以不添加VB1的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表5。
试验结果表明VB1的添加量在0.01g/L～0.8g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以VB1添加量为0.1g/L时麦角硫因的含量最高，达到132.2mg/L，比对照组提高了11.2％。
表5.VB1的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例6：添加吲哚丁酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L的吲哚丁酸，同时以不添加吲哚丁酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表6。
发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吲哚丁酸添加量为1mg/L时麦角硫因的含量最高，达到140.6mg/L，比对照组提高了9.33％。
表6.吲哚丁酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例7：添加柠檬酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.01g/L、0.05g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的柠檬酸，同时以不添加柠檬酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表7。
试验结果表明柠檬酸的添加量在0.01g/L～0.8g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以柠檬酸添加量为0.4g/L时麦角硫因的含量最高，达到138.3mg/L，比对照组提高了10.4％。
表7.柠檬酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例8：添加丙酮酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.2g/L、4.5g/L的丙酮酸，同时以不添加丙酮酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表8。
试验结果表明丙酮酸的添加量在0.05g/L～4.5g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以丙酮酸添加量为2.2g/L时麦角硫因的含量最高，达到132.7mg/L，比对照组提高了5.9％。
表8.丙酮酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例9：添加谷氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的谷氨酸，同时以不添加谷氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表9。
试验结果表明谷氨酸的添加量在1μmol/L～100μmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以谷氨酸添加量为10μmol/L时麦角硫因的含量最高，达到131.2mg/L，比对照组提高了9.1％。
表9.谷氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例10：添加天冬氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.05g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、7g/L、9g/L的天冬氨酸，同时以不添加天冬氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表10。
试验结果表明天冬氨酸的添加量在0.05g/L～9g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以天冬氨酸添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到135.9mg/L，比对照组提高了14.1％。
表10.天冬氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例11：添加甜菜碱提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L的甜菜碱，同时以不添加甜菜碱的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表11。
试验结果表明甜菜碱的添加量在50mmol/L～250mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以甜菜碱添加量为150mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到146.6mg/L，比对照组提高了22％。
表11.甜菜碱的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例12：添加组氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L的组氨酸，同时以不添加组氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表12。
试验结果表明组氨酸的添加量在0.1mmol/L～3mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以组氨酸添加量为1mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到129.5mg/L，比对照组提高了7.7％。
表12.组氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例13：添加半胱氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加2mmol/L、9mmol/L、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L的半胱氨酸，同时以不添加半胱氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表13。
试验结果表明半胱氨酸的添加量在2mmol/L～45mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以半胱氨酸添加量为15mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到175.5mg/L，比对照组提高了46％。
表13.半胱氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例14：半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累的影响
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天、10天向发酵液中额外添加15mmol/L的半胱氨酸，同时以不添加半胱氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表14。
试验结果表明在发酵前至发酵第10天添加半胱氨酸均可促进麦角硫因的积累，发酵第6天添加半胱氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达193.8mg/L，比对照组提高了56％。
表14.半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例15：添加蛋氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加3mmol/L、9mmol/L、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L的蛋氨酸，同时以不添加蛋氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表15。
试验结果表明蛋氨酸的添加量在3mmol/L～45mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以蛋氨酸添加量为15mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到179.6mg/L，比对照组提高了49.4％。
表15.蛋氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例16：蛋氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累的影响
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天、10天向发酵液中额外添加15mmol/L的蛋氨酸，同时以不添加蛋氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表16。
试验结果表明在发酵前至发酵第10天添加蛋氨酸均可提高麦角硫因的积累量，发酵第4天添加蛋氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达202.6mg/L，比对照组提高了63.1％。
表16.蛋氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例17：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表17。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸与组氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加氨基酸组合物，发酵液中麦角硫因的含量最高，达179.8mg/L，比对照组提高了51.9％。
表17.蛋氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例18：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表18。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加半胱氨酸与组氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加氨基酸组合物，发酵液中麦角硫因的含量最高，达168.2mg/L，比对照组提高了42.1％。
表18.半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例19：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+15mmol/L半胱氨酸”与“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表19和表20。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸与半胱氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加7.5mmol/L蛋氨酸与7.5mmol/L半胱氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达208.3mg/L，比对照组提高了75.9％。
表19.蛋氨酸与半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
表20.蛋氨酸与半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例20：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+15mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”和“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表21和表22。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加7.5mmol/L蛋氨酸、7.5mmol/L半胱氨酸和1mmol/L组氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达206.8mg/L，比对照组提高了74.6％。
表21.蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
表22.蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例21：添加吐温60提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L、50g/L的吐温60，同时以不添加吐温60的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表23。
试验结果表明吐温60的添加量在2g/L～50g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吐温60添加量为10g/L时麦角硫因的含量最高，达到212.7mg/L，比对照组提高了74.9％。
表23.吐温60的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例22：添加吐温80提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L的吐温80，同时以不添加吐温80的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表24。
试验结果表明吐温80的添加量在0.5g/L～40g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吐温80添加量为10g/L时麦角硫因的含量最高，达到217mg/L，比对照组提高了78.5％。
表24.吐温80的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例23：添加司盘80提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.2g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、5g/L、10g/L的司盘80，同时以不添加司盘80的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表25。
试验结果表明司盘80的添加量在0.2g/L～10g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以司盘80添加量为3g/L时麦角硫因的含量最高，达到196.5mg/L，比对照组提高了69.7％。
表25.司盘80的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例24：添加组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加4g/LNH4Cl+0.64g/L叶酸、4g/LNH4Cl+0.64g/L叶酸+0.1g/LVB1、7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸三种不同的组合物，同时以不添加组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表26。
试验结果表明三种组合物的添加促进了麦角硫因的积累，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以添加7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸的组合物时发酵液中麦角硫因的含量最高，达到210.7mg/L，比对照组提高了80.2％。
表26.组合物的添加对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例25：增大培养基中酪蛋白胨的含量提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于增大发酵基础培养基中酪蛋白胨的含量分别达到40g/L、50g/L、60g/L、70g/L和80g/L，同时以酪蛋白胨含量为35g/L的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表27。
试验结果表明培养基中酪蛋白胨的含量在40g/L～80g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以酪蛋白胨的含量为60g/L时麦角硫因的含量最高，达到157.5mg/L，比对照组提高了33.6％。
表27.培养基中酪蛋白胨的含量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例26：增大培养基中甘油的含量提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于将发酵基础培养基中酪蛋白胨的含量调整为60g/L，同时增大发酵基础培养基中甘油的含量分别达到65g/L、75g/L、85g/L和95g/L，以酪蛋白胨含量为60g/L和甘油含量为50g/L的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表28。
试验结果表明培养基中甘油的含量在65g/L～95g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以甘油的含量为75g/L时麦角硫因的含量最高，达到170.2mg/L，比对照组提高了8.5％。
表28.培养基中甘油的含量对麦角硫因发酵积累量的影响
实施例27：添加蛋氨酸+半胱氨酸的组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于将发酵基础培养基中甘油的含量调整为75g/L，酪蛋白胨的含量调整为60g/L，再分别向该发酵基础培养基额外添加不同浓度的蛋氨酸与半胱氨酸的组合物，同时以不添加组合物且甘油和酪蛋白胨含量经调整的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表29。
试验结果表明添加不同浓度的蛋氨酸与半胱氨酸的组合物促进了麦角硫因的积累，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以添加14mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸的组合物时发酵液中麦角硫因的含量最高，达到315.7mg/L，比对照组提高了82.1％。
表29.蛋氨酸与半胱氨酸组合物的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
以上实施例说明，使用豆饼粉作为糙皮侧耳CGMCCNo.6232发酵合成麦角硫因的种子培养基的氮源，适当提高发酵培养基中碳源和氮源的含量，向发酵基础培养基中添加上述的任意一种或多种化合物，可显著提高麦角硫因的发酵水平。以上实施例仅示例说明了部分化合物组合添加的实例，但本领域技术人员能够理解，上述其它化合物的不同组合也能显著提高麦角硫因的发酵水平，甚至具有协同效应。

Claims (7)

1.一种制备麦角硫因的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)CGMCCNo.6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和
(b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的培养操作在19～31℃进行至少3天，步骤(b)中的培养操作在19～31℃进行至少6天，且步骤(b)中的接种量为4～20(V/V)％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述种子培养基包括玉米粉15～50g/L、豆饼粉5～35g/L、α-淀粉酶20～80U/L、磷酸二氢钾1～6g/L、硫酸镁0.2～5g/L，其余为水。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述豆饼粉的含量为15～35g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵基础培养基包括甘油10～95g/L、酪蛋白胨10～80g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中在所述发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：NH4Cl、NH4NO3、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温和司盘。
7.根据权利要求1-5所述的方法，其中在所述发酵基础培养基中添加以下量的任一种或多种物质：NH4Cl0.5g/L～12g/L、NH4NO30.5g/L～10g/L、叶酸0.08g/L～2.56g/L、VB10.01g/L～0.8g/L、吲哚丁酸0.1mg/L～4mg/L、柠檬酸0.01g/L～0.8g/L、丙酮酸0.05g/L～4.5g/L、谷氨酸1μmol/L～100μmol/L、天冬氨酸0.05g/L～9g/L、甜菜碱50mmol/L～250mmol/L、组氨酸0.1mmol/L～3mmol/L、半胱氨酸2mmol/L～45mmol/L、蛋氨酸3mmol/L～45mmol/L、吐温0.5g/L～50g/L和司盘0.2g/L～10g/L。
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