CN114214215A - 一种菌菇发酵液的制备方法及化妆品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菌菇发酵液的制备方法及化妆品，制备方法包括：将菌菇接种于装有液体培养基的器具中，所述菌菇包括香菇、糙皮侧耳和牛肝菌；通气密封培养后得到发酵原液；将发酵原液高压均质至少一次；搅拌加热煮沸15～25min；对煮沸后发酵原液进行处理，得到菌菇发酵液。本发明制得的菌菇发酵液中麦角硫因含量高，活性强，具有显著的抗氧化和抗炎效果，能够促进细胞增殖与细胞自噬。

Description

一种菌菇发酵液的制备方法及化妆品
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种菌菇发酵液的制备方法及化妆品。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，又名巯基组氨酸三甲基内盐，是一种稀有的天然抗氧化剂，具有清除自由基，抑制脂质过氧化，抗辐射，美白及抗衰老，维持细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。此外，麦角硫因还能够阻止活性氧化物的生成、减少受辐射细胞的凋亡、具有显著的抗炎功能。因此，它在食品、化妆品及生物医药等行业具有广阔的应用前景。
现有麦角硫因的制备方法主要有化学合成法、天然生物提取法以及生物发酵合成法等三种。化学合成法产量低，价格高，且活性及安全性均难以得到保证，以至于限制了其应用。天然生物提取法是从食用菌的子实体、动物组织或谷物中提取麦角硫因，但是产量仍然很低，且存在杂质多，药物残留，提取成本高等问题，限制了麦角硫因的产业化及其应用。目前，生物发酵合成法最常用蕈菌菌丝体发酵法来生物合成麦角硫因，且已被广泛应用于化妆品领域，但其来源有限，且单独发酵提取麦角硫因生物利用度低。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有相关技术中存在的问题之一，为此，本发明提出一种菌菇发酵液的制备方法，菌菇发酵液中麦角硫因含量高，活性强，具有显著的抗氧化和抗炎效果，能够促进细胞增殖与细胞自噬。
本发明还提出了一种应用该菌菇发酵液的制备方法的化妆品。
根据上述提供的一种菌菇发酵液的制备方法，其通过如下技术方案来实现：
一种菌菇发酵液的制备方法，包括如下步骤：
S1，将菌菇接种于装有液体培养基的器具中，所述菌菇包括香菇、糙皮侧耳和牛肝菌；
S2，通气密封培养后得到发酵原液；
S3，将发酵原液高压均质至少一次；
S4，搅拌加热煮沸15～25min；
S5，对煮沸后发酵原液进行处理，得到菌菇发酵液。
在一些实施方式中，所述液体培养基与所述菌菇的体积比为100：1，所述菌菇在无菌条件下接种于所述液体培养基。
在一些实施方式中，所述菌菇按质量百分比包括：5～40％的香菇，2～30％的糙皮侧耳，20～60％的牛肝菌。
在一些实施方式中，所述菌菇按质量百分比包括：20～30％的香菇，15～25％的糙皮侧耳，45～60％的牛肝菌。
在一些实施方式中，所述液体培养基包括马铃薯汁，并且所述液体培养基还包括葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述液体培养基在加入器具之前，需经过110～130℃高压灭菌15～25min，并冷却至室温。
在一些实施方式中，在步骤S2中，所述通气密封培养具体为：通气密封后，在25～28℃温度下，摇床震荡培养7～15天。
在一些实施方式中，所述摇床震荡的转速为100～250rpm。
在一些实施方式中，所述高压均质的压力为20～40MPa；所述加热的温度为100～110℃。
根据上述提供的一种化妆品，其通过如下技术方案来实现：
化妆品，其应用如上所述的一种菌菇发酵液的制备方法。
与现有技术相比，本发明的至少包括以下有益效果：
1.本发明通过利用三种香菇、糙皮侧耳和牛肝菌协同发酵，并且依次经过多次高压均质、搅拌加热煮沸15～25min和过滤处理，得到菌菇发酵液，相比于采用蕈菌菌丝体发酵法，本发明菌菇发酵液中麦角硫因的产率高，活性强，生产成本低；
2.本发明制得的菌菇发酵液，具有显著的抗氧化和抗炎效果，能够促进HaCaT细胞增殖与HaCaT细胞自噬，对HaCaT细胞和Raw264.7细胞的毒性极低或不毒性。
附图说明
图1是本发明实施例1中菌菇发酵液的制备方法的流程图。
具体实施方式
以下实施例对本发明进行说明，但本发明并不受这些实施例所限制。对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，而不脱离本发明方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
本实施例中未注明具体技术或条件，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本实施例中，香菇Lentinula edodes(GDMCC：5.13)、糙皮侧耳(平菇)Pleurotus djamor(GDMCC：5.33)和牛肝菌Pulveroboletus sp.(GDMCC：5.340)均购自广东省微生物菌种保藏中心。
实施例1
参考图1，本实施例提供了一种菌菇发酵液的制备方法，包括如下步骤：
S1，将菌菇接种于装有液体培养基的器具中，菌菇包括香菇、糙皮侧耳和牛肝菌；
具体地，液体培养基与菌菇的体积比优选为100：1。将200份液体培养基加入到器具中，在无菌条件下，向盛装有200份液体培养基的器具中接入2份菌菇。由此，菌菇在无菌条件下接种于液体培养基中，避免接种过程中引入其他菌种，从而利于保证菌菇发酵液中麦角硫因的产率。
S2，通气密封培养后得到发酵原液；
具体地，通入空气并密封后，在25～28℃温度下，100～250rpm摇床震荡培养7～15天，以使菌菇的菌丝体长满液面，从而得到发酵原液。本实施例以在25℃温度下，150rpm摇床震荡培养15天为例。在其他实施例中，可以在26℃、27℃或28℃温度下，150rpm或200rpm摇床震荡培养7～15天。
在培养过程中，若菌丝体已经长满液面，而培养时间小于7天，则继续培养一定时间，直至培养时间达到7天或8天后再结束培养，以保证器具中菌菇已完全充分发酵。若菌丝体已经长满液面，培养时间大于7天且小于15天，可以马上停止培养，也可以适当延时结束培养，以确保器具中菌菇充分发酵。若培养时间大于15天，而菌丝体未长满液面，则结束培养，并舍弃培养物。
S3，将发酵原液高压均质至少一次；
具体地，高压均质的压力为20～40MPa，并且高压均质的次数大于或等于两次，以使细菌壁裂解更均匀，大大提升胞内麦角硫因的溶出，从而实现增大胞外麦角硫因含量，有效提升麦角硫因的产量。本实施例以发酵原液在30MPa压力下高压均质两次为例。
S4，搅拌加热煮沸15～25min；
具体地，搅拌加热煮沸15～25min具体为：搅拌加热至100～110℃，煮沸15～25min。发酵原液中胞内和胞外均含有麦角硫因，通过搅拌加热煮沸15～25min，一来影响菌的生长速度，二来便于收集胞内和胞外的麦角硫因，有效提升麦角硫因的产率。
S5，对煮沸后发酵原液进行处理，得到菌菇发酵液。
具体地，对煮沸后的发酵原液进行过滤、离心或超声波离心处理。若进行过滤处理，则采用纱布过滤，收集滤液，得到麦角硫因含量高的菌菇发酵液。若进行离心处理，则留取上清，得到麦角硫因含量高的菌菇发酵液。若先进行超声波处理，再进行离心处理后，留取上清，得到麦角硫因含量高的菌菇发酵液。
可见，本实施例菌菇发酵液的制备方法，通过利用三种香菇、糙皮侧耳和牛肝菌协同发酵，并且依次经过多次高压均质、搅拌加热煮沸15～25min和过滤处理，得到菌菇发酵液，相比于采用蕈菌菌丝体发酵法，本发明菌菇发酵液中麦角硫因的产率高，并且生产成本低。此外，具有显著的抗氧化和抗炎效果，能够促进HaCaT细胞增殖与HaCaT细胞自噬，对HaCaT细胞和Raw264.7细胞的毒性极低或不毒性。
进一步地，菌菇按质量百分比包括：5～40％的香菇，2～30％的糙皮侧耳，20～60％的牛肝菌。更进一步地，菌菇按质量百分比包括：20～30％的香菇，15～25％的糙皮侧耳，45～60％的牛肝菌。本实施例以30％的香菇、20％的糙皮侧耳和50％的牛肝菌为例。
进一步地，液体培养基包括马铃薯汁，并且液体培养基还包括葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。本实施例中，液体培养基的配制方法如下：
(1)20％马铃薯汁制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L；
(2)向步骤(1)得到的1.0L 20％马铃薯汁中分别加入20.0g葡萄糖、3.0g KH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)，搅拌均匀；
(3)110～130℃高压灭菌15～25min，冷却至室温即得构成液体培养基的综合马铃薯培养基。由此，通过110～130℃高压灭菌15～25min，防止液体培养基中的细菌干扰菌菇的发酵。
进一步地，本实施例还提供了一种化妆品，该化妆品应用如上所述的一种菌菇发酵液的制备方法。
实施例2
本实施例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：40％的香菇、20％的糙皮侧耳和40％的牛肝菌，其它部分均于实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：20％的香菇、30％的糙皮侧耳和50％的牛肝菌，其它部分均于实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：25％的香菇、15％的糙皮侧耳和60％的牛肝菌，其它部分均于实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：30％的香菇、25％的糙皮侧耳和60％的牛肝菌，其它部分均于实施例1相同。
对比例1
本对比例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：30％的香菇、20％的糙皮侧耳和50％的去离子水，其它部分均于实施例1相同。
对比例2
本对比例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：50％的牛肝菌和50％的去离子水，其它部分均于实施例1相同。
对比例3
本对比例与实施例1的不同点在于，菌菇按质量百分比包括：20％的糙皮侧耳、50％的牛肝菌和30％的去离子水，其它部分均于实施例1相同。
对比例4
本对比例与实施例1的不同点在于，省去步骤S3或省去步骤S4，或者采用搅拌加热至50℃加热煮15～25min替代搅拌加热煮沸15～25min，其它部分均于实施例1相同。
对实施例1-5、对比例1-4中菌菇发酵液进行如下性能测试：
(1)麦角硫因含量检测
试验方法：采用HPLC检测麦角硫因含量，分离条件为：C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈和水(1：9)，流速为0.8mL/min，30min，检测波长255nm，柱温25℃，进样量10μL。试验结果见表1。
表1受检样品的麦角硫因含量(mean±SD)
Figure BDA0003474438210000051
由表1可知，实施例1-5中麦角硫因含量明显高于对比例1-4。对比例1省略了牛肝菌，但其发酵液中麦角硫因含量与实施例1相比有明显的下降，表明牛肝菌的引入，能够显著提高菌菇发酵液中麦角硫因生物合成量。对比例2仅用牛肝菌发酵，但菌菇发酵液中麦角硫因产量明显下降，说明香菇和糙皮侧耳的引入，可以协同提高菌菇发酵液的麦角硫因生物合成量。对比例3仅用糙皮侧耳和牛肝菌发酵，其发酵液中麦角硫因含量与实施例1相比有明显的下降，说明香菇的引入，能够显著提高菌菇发酵液中麦角硫因生物合成量。可见，香菇、糙皮侧耳和牛肝菌协同发酵合成麦角硫因，实现有效提高麦角硫因的产率。
此外，对比例4通过省去步骤S3或步骤S4，或者采用搅拌加热至50℃加热煮15～25min替代搅拌加热煮沸15～25min，其发酵液中麦角硫因含量均明显低于实施例1，表明步骤S3中将发酵原液高压均质至少一次及步骤S4中搅拌加热煮沸15～25min，能够有效提高菌菇发酵液中麦角硫因的产率。
(2)DPPH自由基清除能力实验
试验方法：将上述实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液用无水乙醇稀释，得到50％(v/v)浓度的菌菇发酵液，作为受试样品。分别取400μL于1.5ml离心管中，加入1200μL101μM DPPH溶液，室温下避光反应30min；每管取出200μL转移至96孔板中，检测515nm处的反应吸光值，记为As。空白对照组用同等体积的无水乙醇代替上述受试样品，结果记为A0，阳性对照组用同等体积的100μg/mL VC溶液代替样品；阴性对照组用同等体积的无水乙醇代替DPPH溶液，As0作为阴性对照组结果。
Figure BDA0003474438210000061
式中：样品组的吸光度为As；阴性对照组的吸光度为As0；空白组的吸光度为A0。
经测试发现，实施例1-5和对比例1-4制得的菌菇发酵液对DPPH自由基均具有显著的清除作用。对比例1省略了牛肝菌，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明牛肝菌的引入，能够显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力。对比例2仅用牛肝菌发酵，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明香菇和糙皮侧耳的引入，能够显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力。对比例3仅用糙皮侧耳和牛肝菌发酵，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明香菇的引入，可以显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力。对比例4通过省去步骤S3或步骤S4，或者采用搅拌加热至50℃加热煮15～25min替代搅拌加热煮沸15～25min，其发酵液对DPPH自由基清除能力均明显低于实施例1，表明步骤S3中将发酵原液高压均质至少一次及步骤S4中搅拌加热煮沸15～25min，能够显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力。
(3)HaCaT细胞毒性试验
试验方法：取对数生长期HaCaT细胞，用胰酶消化，离心(1000rpm，5min)，计数，以3×103cells/孔密度接种于96孔板，每孔100μL细胞悬液。铺板24h后，加入含有不同浓度实施例1所制得的菌菇发酵的DMEM完全培养基，以DMEM完全培养基作为空白对照，每个浓度设置3个复孔，48h后每孔加入10μL CCK8，孵育2h后，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果，具体试验结果见表2。
Figure BDA0003474438210000071
式中：样品组的吸光度为AS,450nm-AS,630nm；空白组的吸光度为A0,450nm-A0,630nm。
表2不同浓度试验样品对HaCaT细胞毒性的影响对比(mean，n＝3)
Figure BDA0003474438210000072
由表2可知，本发明实施例1-5和对比例1-4制得的菌菇发酵液在所测定的体积分数浓度下(5-20％)，对HaCaT细胞活率均有促进作用；10％体积分数浓度下促进作用最强，在20％体积分数浓度下，对HaCaT细胞活率促进作用略有下降。根据欧盟国家实验室化妆品毒性的判定标准，本发明发酵液在所测定的浓度范围内均对HaCaT细胞的毒性极小或无毒性。
(4)HaCaT细胞增殖试验
试验方法：分别取上述实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液用DMEM基础培养基稀释至10％(v/v)，作为受检溶液。将对数生长期的HaCaT细胞以5×104cells/mL，100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃在5％的CO2培养箱中培养24h；弃去旧的培养基，用PBS溶液清洗一遍，然后向每孔细胞溶液中分别加入受检溶液100μL，空白组加入等体积DMEM基础培养基，置于37℃恒温中培养48h；每孔加入10μL CCK8溶液，于37℃恒温避光孵育2h；以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。
Figure BDA0003474438210000073
式中：样品组的吸光度为As，450nm-As，630nm；空白组的吸光度为A0，450nm-A0，630nm。
经测试发现，10％浓度的实施例1-5和对比例1-4制得的菌菇发酵液均对HaCaT细胞无毒；对HaCaT细胞增殖具有显著的促进作用，且实施例1菌菇发酵液的促增殖效果最为显著。
(5)HaCaT细胞自噬相关基因表达检测
试验材料：实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液；DMEM基础培养基(DMEM培养基：青霉素/链霉素溶液＝99：1，v：v)、胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25％，含EDTA)、PBS溶液、DMEM完全培养基(DMEM培养基：FBS：青霉素/链霉素溶液＝89：10：1，v/v/v)、ELISA试剂盒(p62，Atg5，Beclin 1，HPRT)；
试验方法：分别取上述菌菇发酵液用DMEM完全培养基稀释至10％(v/v)作为受检溶液，然后进行如下操作：
①铺板与加样：取生长状态良好的HaCaT细胞以5×104cells/mL的密度，2mL/孔铺6孔板培养24h后，更换为同体积受检样品的DMEM完全培养基孵育24h时。DMEM完全培养基仅用作未处理的对照。
②提取RNA：用TRIzon裂解细胞，通过RNA提取试剂盒(康为世纪永津生物)提取细胞裂解溶液，收集细胞中的RNA，采用NanoDrop进行RNA纯度和浓度检测，用无酶水稀释至100ng/μL，作为模板RNA；
③合成cDNA并进行PCR扩增：按照FastKing一步法按基因组cDNA第一链合成预混试剂盒(广州真知生物科技有限公司)说明书进行试剂混合，最后利用PCR仪合成cDNA，具体PCR程序为42℃15min，95℃3min，4℃1min；
④将cDNA用于Real-Time PCR定量检测：将(3)得到的cDNA稀释10倍作为模板使用，按照
Figure BDA0003474438210000081
qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明书将Taq DNA聚合酶液和上、下游引物进行混合(5μL：0.5μL)，其中：
p62上游引物：AGGCGCACTACCGCGAT，下游引物：CGTCACTGGAAAAGGCAACC；
Atg5上游引物：GCAGATGGACAGTTGCACACA，下游引物：TTTCCCCATCTTCAGGATCAA；
Beclin 1上游引物：CTGGACACGAGTTTCAAGATCCT，下游引物：TGTGGTAAGTAATGGAGCTGTGAGTT；
HPRT上游引物：TGACACTGGCAAA ACAATGCA，下游引物：GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT；
以上各引物均稀释至10μM，上、下游引物按1：1体积比混合；最后，在96孔板中分别加入6μL混合液和4μL cDNA，共10μL体系进行qPCR反应，反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，55℃退火/延伸15s(重复49个循环)；60℃退火/延伸20s；
⑤采用2^-ΔΔCT法进行数据处理：
A＝2^(Cq内参-Cq基因)：其中A代表空白对照的基因表达量，Cq为原始数值。
B＝2^(Cq内参-Cq基因)；其中B代表检测样品的基因表达量，Cq为原始数值。
样品基因相对表达量＝B平均值/A平均值*100％。
经测试发现，10％浓度的本发明实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液有显著的促HaCaT细胞自噬功能，且实施例1菌菇发酵液最为显著。因此，菌菇发酵液能够促进HaCaT细胞自噬，进而促进其对皮肤的抗衰功效。
(6)Raw264.7细胞毒性试验
试验材料：实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液，DMEM完全培养基(DMEM培养基：FBS：青霉素/链霉素溶液＝89：10：1，v/v/v)，胰酶。
试验对象：Raw264.7细胞
试验方法：除了将细胞更换为Raw264.7细胞，及铺板密度更换为1*106cells/mL外，其它同HaCaT细胞毒性试验，具体试验结果见表3。
表3不同浓度试验样品对Raw264.7细胞毒性的影响对比(mean，n＝3)
Figure BDA0003474438210000091
由表3可知，本发明实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液在所测定的体积分数浓度下(5-20％)，对HaCaT细胞活率均有促进作用；10％体积分数浓度下促进作用最强，在20％体积分数浓度下，对HaCaT细胞活率促进作用略有下降。根据欧盟国家实验室化妆品毒性的判定标准，本发明发酵液在所测定的浓度范围内对Raw264.7细胞的毒性极小或无毒性。
(7)抗炎相关基因表达检测
试验材料：实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液；DMEM基础培养基(DMEM培养基：青霉素/链霉素溶液＝99：1，v：v)、胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25％，含EDTA)、PBS溶液、DMEM完全培养基(DMEM培养基：FBS：青霉素/链霉素溶液＝89：10：1，v/v/v)、ELISA试剂盒(COX-2，IL-1α，NF-κB)；
试验方法：分别取上述菌菇发酵液用DMEM基础培养基稀释至10％(v/v)作为受检溶液；然后进行如下操作：
①铺板与加样：取生长状态良好的RAW264.7细胞以1×106cells/mL的密度，2mL/孔铺6孔板培养16h后，更换为同体积含不同浓度受检样品的培养基，1h后加入LPS诱导6h；以DMEM完全培养基作为空白对照，80μM地塞米松作为阳性对照。
②提取RNA：同试验例5；
③合成cDNA并进行PCR扩增：同试验例5；
④将cDNA用于Real-Time PCR定量检测：除了将引物更换为：
COX-2上游引物：ATTCCAAACCAGCAGACTCATA，下游引物：CTTGAGTTTGAAGTGGTAACCG；
IL-1α上游引物：CGCTTGAGTCGGCAAAGAAAT，下游引物：AGATGGTCAATGGCAGAACTGT；
NF-κB上游引物：TCTCAGCTGCGACCCCG，下游引物：TGGGCTGCTCAATGATCTCC；
内参基因GAPDH上游引物：TGCACCACCAACTGCTTAGC，下游引物：GGCATGGACTGTGGTCATGAG；其它同HaCaT细胞毒性试验；
⑤采用2^-ΔΔCT法进行数据处理。
经测试发现，10％浓度的本发明实施例1-5及对比例1-4制得的菌菇发酵液抑制了炎症相关基因(COX-2，IL-1α，NF-κB)的表达，且实施例1菌菇发酵液的抗炎效果最为显著。可见，本发明麦角硫因发酵液能够抑制炎症相关基因的表达，进而发挥抗炎功效。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将菌菇接种于装有液体培养基的器具中，所述菌菇包括香菇、糙皮侧耳和牛肝菌；
S2，通气密封培养后得到发酵原液；
S3，将发酵原液高压均质至少一次；
S4，搅拌加热煮沸15～25min；
S5，对煮沸后发酵原液进行处理，得到菌菇发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基与所述菌菇的体积比为100：1，所述菌菇在无菌条件下接种于所述液体培养基。
3.根据权利要求1或2所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述菌菇按质量百分比包括：5～40％的香菇，2～30％的糙皮侧耳，20～60％的牛肝菌。
4.根据权利要求3所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述菌菇按质量百分比包括：20～30％的香菇，15～25％的糙皮侧耳，45～60％的牛肝菌。
5.根据权利要求1或2所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基包括马铃薯汁，并且所述液体培养基还包括葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基在加入器具之前，需经过110～130℃高压灭菌15～25min，并冷却至室温。
7.根据权利要求1所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述通气密封培养具体为：通气密封后，在25～28℃温度下，摇床震荡培养7～15天。
8.根据权利要求7所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述摇床震荡的转速为100～250rpm。
9.根据权利要求1所述的一种菌菇发酵液的制备方法，其特征在于，所述高压均质的压力为20～40MPa；所述加热的温度为100～110℃。
10.化妆品，其特征在于，其应用权利要求1-9中任一项所述的一种菌菇发酵液的制备方法。
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