CN114921510B - 珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域，特别涉及珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用。通过采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉复合菌（酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2:3:1的比例混合），充分发挥各个菌种的作用，真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解，从而释放出白首乌组织中的活性成分，同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖，降低白首乌粗多糖的分子量，使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离，因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高，杂质易分离的特点，而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域，特别涉及珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用。
背景技术
白首乌来源于萝藦科鹅绒藤属植物戟叶牛皮消Cynanchum bungei Decne.的干燥块根，具有补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发的功效，是一种传统的滋补类药材。古籍记载，白首乌用于晚唐，盛行于早明，沿用至今。因其补肾益肝、乌发生发、养血益精、抗衰老之功效，被历代名家视为摄生防老珍品。白首乌含有 C21甾苷类、多糖类、苯乙酮类等活性成分,这些成分与其抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化 以及免疫调节等药理活性密切相关。
白首乌多用于保健品行业，针对白首乌活性成分的研究报道主要为C21甾苷类、苯乙酮类等，但对白首乌多糖却报道甚少。多糖作为生物体内重要的活性物质，在控制机体细胞生长、分裂和维持生命个体的正常生理机能等方面具有重要作用。白首乌多糖具有降血脂功能，对酒精性肝损伤有保护作用。
白首乌多糖提取以传统的水提醇沉法为主，随着研究的深入，现多在水提醇沉的基础上多辅以超声和微波技术，通过优化料水比、提取温度及时间来提高白首乌多糖提取率，但此类方法提取周期长，提取量少且水提过程中温度过高会破坏多糖的结构。
发明内容
针对现阶段白首乌多糖提取存在的问题，本发明提供一种新的白首乌多糖的提取方法，通过采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉复合菌，充分发挥各个菌种的作用，真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解，从而释放出白首乌组织中的活性成分，同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖，降低白首乌粗多糖的分子量，使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离，因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高，杂质易分离的特点，而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
本发明的技术方案如下：
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉混合发酵白首乌，发酵液纯化脱色后得到白首乌多糖。
优选地，所述酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合。
优选地，具体过程包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，将酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌按比例接种于液体培养基中，摇床培养后得到含纤维素酶、淀粉酶的复合菌培养液；
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱烘干，用高速粉碎机粉碎，得到白首乌粉末；
（3）将步骤（2）的白首乌粉末加入水中，用胶体磨处理后加入到高压均质机中均质处理，离心喷雾干燥，灭菌后得到白首乌细粉；
（4）将步骤（3）制得的均质液投入步骤（1）制备的复合菌培养液中，充分搅拌，供氧发酵，继续培养得到发酵液；离心获得上清液；
（5）步骤（4）的上清液加脱色活性炭，静置吸附，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）步骤（5）的滤液中加入Sevage试剂，混合后充分振荡，离心，取上清液；
（7）将步骤（6）的上清液与乙醇混合，充分搅拌至产生沉淀，静置，离心后获得沉淀物，乙醇洗涤，真空干燥后得到白首乌多糖。
优选地，步骤（1）所述的液体培养基，按照质量百分比为：羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水；酵母菌的体积为培养基体积的1-10%；摇床培养的温度为26-30℃，转速160r/min，摇床培养时间为12h。
优选地，所述步骤（3）中，白首乌粉末与水的重量比为1:7；均质处理过程中，压力为25Mpa，处理时间为10-20min；喷雾干燥的温度为150-200℃。
优选地，所述步骤（4）中，在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）的白首乌粉末质量5-10倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-6.5，充分搅拌，发酵温度为25-35℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020-0.040mol/L，继续培养24-72h得到发酵液。
优选地，所述步骤（5）中，向上清液中加入上清液质量5-8%的脱色活性炭，静置吸附1h以上。
优选地，所述步骤（6）中，将滤液与Sevage试剂按照体积比4-6:1进行混合，混合后充分振荡，离心，取上清液。
优选地，所述步骤（7）中，将步骤（6）获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1-3进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置12-48h，离心，获得沉淀物，将沉淀物用乙醇洗涤3次，真空干燥，得到白首乌多糖。
菌种保藏信息
保藏时间：2017年6月1日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC No . 14129；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；
分类命名：Penicilliopsis clavariaeformis。
本发明的有益效果
本发明主要通过真菌及细菌发酵白首乌，再通过分离纯化得到白首乌多糖，发酵过程中真菌、细菌生长所产生的酶对白首乌进行分解，从而释放出白首乌组织中的活性成分，同时真菌产生的酶还能分解白首乌粗多糖，降低白首乌粗多糖的分子量，使得发酵后的白首乌利于后续的纯化分离，因此利用本发明提取的白首乌多糖具有提取物纯度高，杂质易分离的特点，而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。
本发明在发酵之前对白首乌粉末进行了高压均匀处理，该操作有利于白首乌多糖从白首乌中分离出来，能进一步提高本发明的得率。
珊瑚拟霉菌菌丝体中的多糖具有显著地还原力和清除自由基的能力，能够显著提高抗氧化酶活性；促进其他菌类成长的同时，提升白首乌多糖的得率。
附图说明
图1为不同体积复合菌对白首乌多糖提取率的影响图；
图2为不同体积复合菌培养液与粉末配比对白首乌多糖提取率的影响图；
图3为供氧发酵时不同氧浓度对白首乌多糖提取率的影响图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中，酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的5%，摇床培养12h，培养的温度为27℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中50℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa；得到均质液；
（4）在发酵罐中加入步骤（3）的均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为26℃，供氧发酵，氧浓度控制在0 .020mol/L继续培养68h得到发酵液；将发酵液3500r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量6%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:2进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置24h，3000r/min离心12min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
实施例2
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中，酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的7%，摇床培养12h，培养的温度为30℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中55℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa，得到均质液；
（4）在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为28℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020mol/L，继续培养60h得到发酵液；将获得的发酵液4000r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量6%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:2进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置20h，3000r/min离心10min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
实施例3
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中，酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的6%，摇床培养12h，培养的温度为27℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中57℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa，得到均质液；
（4）在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为30℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020mol/L继续培养55h得到发酵液；将获得的发酵液3200r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量7%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比5:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置32h，3000r/min离心15min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
实施例4
珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中，酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%，摇床培养12h，培养的温度为26℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中60℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa，得到均质液；
（4）在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为33℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液；将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量7%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置20h，3000r/min离心15min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
对比例1 与实施例4工艺相同，不加入珊瑚拟青霉
白首乌多糖提取方法，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与按2: 3的比例混合接种于培养基中，酵母菌及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%，摇床培养12h，培养的温度为26℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中60℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa，得到均质液；
（4）在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为33℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液；将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量7%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置20h，3000r/min离心15min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
与实施例4相比，对比例1得到白首乌多糖的得率少30%。
对比例2
烟曲霉在白首乌多糖提取上的应用，包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，液体培养基的重量百分比组成为羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水，酵母菌、枯草芽孢杆菌与烟曲霉按2: 3: 1的比例混合接种于培养基中，酵母菌、烟曲霉及枯草芽孢杆菌的总体积为培养基体积的9%，摇床培养12h，培养的温度为26℃，转速160r/min。
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱中60℃烘干20h，用高速粉碎机粉碎，过80目筛，得到白首乌粉末；
（3）将白首乌粉末加入水中，白首乌粉末与水的重量比为1:7，用胶体磨处理10min后加入到高压均质机中均质处理15min，压力为25Mpa得到均质液；
（4）在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）制得白首乌细粉质量7倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至6.5，充分搅拌10min，发酵温度为33℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020mol/L继续培养40h得到发酵液；将获得的发酵液5000r/min离心15min获得上清液；
（5）加入上清液质量7%的脱色活性炭，静置吸附1h，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）将滤液与Sevage试剂按照体积比4:1进行混合，混合后充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液。
（7）将获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:3进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置20h，3000r/min离心15min，获得沉淀物，将沉淀物用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得到白首乌多糖。
与实施例4相比，对比例1得到白首乌多糖的得率少40%。
Claims (9)
1.珊瑚拟青霉在白首乌多糖提取上的应用，其特征在于，采用酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉混合发酵白首乌，发酵液纯化脱色后得到白首乌多糖；所述珊瑚拟青霉（Penicilliopsis clavariaeformis）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 14129，保藏时间为2017年6月1日。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母菌、枯草芽孢杆菌与珊瑚拟青霉按2: 3: 1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体过程包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取适量液体培养基，将酵母菌、珊瑚拟青霉及枯草芽孢杆菌按比例接种于液体培养基中，摇床培养后得到含纤维素酶、淀粉酶的复合菌培养液；
（2）将新鲜白首乌切片，置于烘箱烘干，用高速粉碎机粉碎，得到白首乌粉末；
（3）将步骤（2）的白首乌粉末加入水中，用胶体磨处理后加入到高压均质机中均质处理；
（4）将步骤（3）制得的均质液投入步骤（1）制备的复合菌培养液中，充分搅拌，供氧发酵，继续培养得到发酵液；离心获得上清液；
（5）步骤（4）的上清液加脱色活性炭，静置吸附，真空抽滤去渣，得滤液；
（6）步骤（5）的滤液中加入Sevage试剂，混合后充分振荡，离心，取上清液；
（7）将步骤（6）的上清液与乙醇混合，充分搅拌至产生沉淀，静置，离心后获得沉淀物，乙醇洗涤，真空干燥后得到白首乌多糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的液体培养基，按照质量百分比为：羧甲基纤维素20%，葡萄糖2%，蔗糖2%，蛋白胨0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，其余为水；酵母菌的体积为培养基体积的1%-10%；摇床培养的温度为26-30℃，转速160r/min，摇床培养时间为12h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，白首乌粉末与水的重量比为1:7；均质处理过程中，压力为25Mpa，处理时间为10-20min；喷雾干燥的温度为150-200℃。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，在发酵罐中加入均质液并注入步骤（1）制备的复合菌培养液，量取步骤（2）白首乌粉末质量5-10倍的复合菌培养液加入发酵罐中，加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-6.5，充分搅拌，发酵温度为25-35℃，供氧发酵，氧浓度控制在0.020-0.040mol/L，继续培养24-72h得到发酵液。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（5）中，向上清液中加入上清液质量5%-8%的脱色活性炭，静置吸附1h以上。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（6）中，将滤液与Sevage试剂按照体积比4-6:1进行混合，混合后充分振荡，离心，取上清液。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（7）中，将步骤（6）获得的上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1:1-3进行混合，充分搅拌至产生沉淀，静置，离心，获得沉淀物，将沉淀物用乙醇洗涤，真空干燥，得到白首乌多糖。
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